tách chiết Enzym

Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC&THỰC PHẨM
HÓA SINH THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI:
CHIẾT, TINH CHẾ VÀ ỨNG DỤNG
CỦA ENZYME
Trang 1/101
GVHD:
LỚP:
NHÓM : 1
SVTH: LÊ THANH NGUYÊN 09248781
VŨ THỊ NINH 09248861
ĐOÀN THỊ PHƯỢNG 09247521
NGUYỄN THỊ THỦY 09246191
TẠ PHI VŨ 09258231
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME
1.1Khái niệm về enzyme
Trong các phản ứng hóa học, nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó phản ứng
sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần. Chất cho thêm vào này gọi là chất xúc tác.
Chất xúc tác hóa học có hai đặc điểm quan trọng:
1- Làm tăng phản ứng hóa học.
2- Bản than chất xúc tác không có sự thay đổi nào sau phản ứng.
Sau này các nhà khoa học thấy rằng các chất xúc tác hóa học chỉ làm tăng tốc độ phản
ứng, chứ không tham gia làm thay đổi chiều hướng phản ứng, trạng thái phản ứng hay
năng lượng sử dụng trong phản ứng. Trong các phản ứng sinh học (các phản ứng xảy ra
trong cơ thể sinh vật) cũng có chất làm tăng các phản ứng, chất đó gọi là enzyme.
Chữ “enzyme” được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là chất trong nấu men.
Enzyme được các cơ thể sinh vật tổng hợp nên và tham gia các phản ứng hóa học trong cơ
thể. Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi đó các chất xúc tác hóa học thường là chất vô

cơ. Sau này, các nhà khoa học xác định chúng là protein.
Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học
trong và ngoài cơ thể. Điểm rất đặc biệt của enzyme là chúng hoạt động trong diều kiện ôn
hòa giống như nhiệt độ ôn hòa của cơ thể sinh vật. Trong khi đó, các chất hóa học cần phải
có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Nhiệt độ càng cao, tốc độ xúc tác phản ứng hóa học
càng cao. Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh hóa có thể tóm tắt
như sau:
1- Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để
giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất.
2- Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao.
Trang 2/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
3- Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản ứng đầu
sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.
4- Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít.
5- Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lượng enzyme được
tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy ra trong cơ
thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi enzyme.
6- Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Ngày nay, các nhà khoa học đã tìm
ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này là rất nhỏ
so với số lượng có thật trong mỗi tế bào. Trong hơn 1000 loại enzyme đã biết, loài
người mới thu nhận và kết tinh được khoảng 200 loại.
1.2 Cấu tạo của enzyme
Enzyme là những protein có phân tử lượng từ 20000 đến 1000000 dalton.
Các enzyme được cấu tạo từ L – axit amin. Các axi tamin này liên kết với nhau bởi liên kết
peptit. Khi thủy phân protein enzyme, ta sẽ thu nhận được các axitamin. Trong một số
trường hợp, ngoài axit amin ra người ta còn thu được những thành phần khác.
- Nếu một enzyme, khi bị thủy phân, ta chỉ thu được các axit amin thì enzyme này
được gọi là enzyme đơn cấu tử hay còn gọi là enzyme đơn giản.
- Nếu một enzyme, khi bị thủy phân, ta thu được ngoài axit amin còn các thành phần

khác thì enzyme này được gọi là enzyme đa cấu tử hay còn gọi là enzyme phức tạp.
Các enzyme phức tạp, ngoài protein ra còn có các thành phần khác như ion kim loại,
vitamin, glutation dạng khử, … đa số enzyme có trong cơ thể thuộc enzyme đa cấu tử.
Trong thành phần enzyme đa cấu tử người ta phân biệt rõ các phần như sau:
- Phần protein được gọi là feron hay apoenzyme.
- Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại “agon”.
Nhóm ngoại, khi được tách ra khỏi enzyme, có thể tồn tại độc lập.Trong khi tham gia
xúc tác, không phải toàn bộ tất cả các phần trong cấu trúc của enzyme tham gia mà chỉ có
một phần giới hạn của phân tử enzyme tham gia phản ứng. Phần giới hạn tham gia phản
ứng này được gọi là trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt đông của enzyme do một số axit
amin đảm trách. Như vậy, trong trường hợp cơ thể bị đột biến thì không phải bất kỳ đột
Trang 3/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
biến nào cũng dẫn tới hiện tượng làm sai lệch các phản ứng sinh hóa của tế bào, chỉ có
những đột biến làm thay đổi axit amin hoặc làm thay đổi thứ tự sắp xếp của các axit amin
thì mới có ý nghĩa.
Trung tâm hoạt động của các enzyme đơn cấu tử thường bao gồm một tổ hợp các nhóm
định chức của axit amin không tham gia vào trục chính của sợi polypeptit. Các nhóm này
có thể ở xa nhau trong mạch polypeptit nhưng chúng lại gần nhau trong không gian.
Khoảng cách này được xác định sao cho chúng có thể tương tác với nhau trong quá trình
xúc tác. Cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động thường giống cấu trúc không gian
của cơ chất mà chúng tham gia xúc tác.
Trung tâm hoạt động của các enzyme đa cấu tử là nhóm ngoại và nhóm định chức của
axitamin nằm ở apoenzyme. Khi enzyme tương tác với cơ chất các nhóm định chức của
trung tâm hoạt động sẽ thay đổi cấu trúc không gian sao cho tương ứng với cấu trúc không
gian của cơ chất.
Ở tế bào động vật tồn tại một loại enzyme không có khả năng tham gia phản ứng ngay,
muốn có khả năng hoạt động chúng phải được hoạt hóa. Trung tâm hoạt động của loại
enzyme này tồn tại ở dạng chưa được hoạt hóa và được gọi là zymogen hay proenzym, ví
dụ như enzyme pepxinogen, tripxinogen, kimotripxinogen hay protrombin. Các enzyme

này có thể tự hoạt hóa hoặc nhờ tác dụng của một enzyme nào đó hoặc một yếu tố nào đó.
Khi đó một số liên kết peptit trong phân tử zymogen bị mất, enzyme sẽ được hoạt hóa.
Trong một số trường hợp khác có sự sắp xếp lại các nhóm chức trong phân tử enzyme. Khi
đó trung tâm hoạt động của enzyme ở trạng thái hoạt hóa.
Ở những enzyme dị lập thể hay enzyme điều hòa còn có trung tâm dị lập thể (enzyme
điều hòa). Các trung tâm này có khả năng tương tác với cơ chất khác. Các cơ chất tương
tác với trung tâm này gọi là chất điều hòa. Khi trung tâm điều hòa này tương tác với chất
điều hòa, chúng sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động, khi đó tốc độ
phản ứng enzyme sẽ bị thay đổi. Trong trường hợp phản ứng enzyme được tăng lên khi
Trang 4/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
chất điều hòa tương tác với trung tâm điều hòa thì chất điều hòa này được gọi là chất điều
hòa dương. Ngược lại nếu phản ứng enzyme giảm đi khi chất điều hòa tương tác với trung
tâm điều hòa thì chất diều hòa này được gọi là chất điều hòa âm. Các chất điều hòa hoàn
toàn không biến đổi khi chúng tương tác với enzyme.
Các nhóm chức năng của axit amin thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzyme
bao gồm:
- Nhóm sulfridril của xistein.
- Nhóm amin ở đầu N hoặc nhóm ε – amin của lizin.
- Nhóm cacboxyl của axit aspartic và axit glutamiz.
- Nhóm hydroxyl của serin, treonin, và trirozin.
Trung tâm hoạt động của các enzyme một thành phần bao gồm từ 3 – 7 nhóm chức
năng trên. Các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động được định hướng xác định sau
đó để đảm bảo cho chúng có khả năng tương tác với nhau trong khi phản ứng.
Trung tâm hoạt động của enzyme hai thành phần bao gồm một số nhóm chức năng của
axit amin trong thành phần apoenzyme và trong nhiều trường hợp còn cần cả ion kim loại.
Các kim loại thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzyme là nhũng ion kim loại hóa
trị 2 như Fe, Co, Mn, Zn, Cu …chúng có mặt ở cả trung tâm hoạt động của enzyme một
thành phần và enzyme hai thành phần. Các kim loại này có thể tham gia trực tiếp trong các
phản ứng xúc tác, chúng liên kết bền với phân tử enzyme. Trong nhiều trường hợp enzyme

bị mất hoàn toàn hoạt tính khi bị loại bỏ kim loại ra khỏi thành phần của enzyme. Trong
trường hợp này enzyme này được gọi là metaloenzyme. Hoạt động của enzyme này sẽ
được phục hồi khi cho kim loại vào.
1.3Cách gọi tên và phân loại enzyme
Trước kia thường gọi tên enzyme một cách tùy tiện, tùy theo tác giả. Các tên đã quen
dùng như tripxin, pepxin, kimotripxin, …hiện nay vẫn được dùng gọi là tên thông dụng.
Trang 5/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
Tên gọi đầy đủ, chính xác theo quy ước quốc tế - tên gọi hệ thống của enzyme được gọi
theo tên cơ chất đặc hiệu của nó cùng với tên của kiểu phản ứng mà nó xúc tác, cộng thêm
đuôi “aza”.
Tên gọi hệ thống thường gồm hai phần:
- Phần thứ nhất là tên gọi cơ chất (nếu phản ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là tên gọi
của hai cơ chất viết cách nhau bằng hai chấm);
- Chỉ một cách khái quát bản chất của phản ứng xúc tác.
Ví dụ: + Tên thông dụng: ureaza
+ Tên gọi hệ thống: cacbamit – amidohydrolaza
Nếu phản ứng bao gồm hai sự chuyển hóa tương hổ thì người ta còn thêm vào sau phần thứ
hai của tên gọi một phần tương ứng trong dấu ngoặc.
Ví dụ, enzyme xúc tác oxy hóa axit amin trong phản ứng:

L – axit amin
Có tên gọi: L – axit amin: oxydoreductaza (deamin)
Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, từ năm 1960 Hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã
thống nhất phân loại enzyme thành sáu lớp, đánh số từ 1- 6. Các số thứ tự này là cố định
cho mỗi lớp:
1- Oxydoreductaza
2- Transpheraza
3- Hydolaza
4- Liaza

5- Izomeraza
6- Ligaza
Trang 6/101
COOH COOH
H
2
N CH + O
2
C = O + NH
3
+ H
2
R R
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
Mỗi lớp lại chia thành nhiều tổ. Mỗi tổ lại chia thành nhiều nhóm. Do đó trong bảng
phân loại, đứng trước tên enzyme thường có 4 con số: số thứ nhất chỉ lớp, số thứ hai chỉ tổ,
số thứ ba chỉ nhóm, số thứ tư chỉ enzyme.
Ví dụ, 2.6.1.1. L – aspartat: α – xetoglutarat aminotranspheraza xúc tác cho phản ứng
chuyển vị (lớp 2) nhóm chứa nitơ (tổ 6), nhóm chứa nitow ấy là nhóm amin (nhóm 1);
phản ứng do enzyme này xúc tác:
L – aspartat + α – xetoglutarat = oxaloaxetat + glutamate
(Nhóm amin được chuyển từ L – aspactat đến α – xetoglutarct)
1.3.1 Oxydoreductaza
Có tác động đến phản ứng oxy hóa khử. Có khả năng chuyển e
-
, H
+
…
Phản ứng tổng quát: A
-

+ B  A + B
-
Các dạng thông dụng:
- Dehydrogenase: tách H
+.
Ví dụ: alcol dehydrogenase (1.1.1.1.), glutamate dehydrogenase
(1.4.3)
- Reductase: tác động khử
- Oxygenase: tác động oxy hóa
-
Peroxydase: tác động khi có H
2
O
2
, có tác dụng loại khả năng gây độc của H
2
O
2
trong cơ
thể.
1.3.2 Transferase
Có tác động lên phản ứng chuyển nhóm chức. Phương trình phản ứng tổng quát:
A – B + C  A + B – C
Các dạng thông dụng:
- Acyltransferase: có nhóm acyl (coenzyme A)
- Glucosyltransferase: chuyển nhóm glucose. Enzyme chuyển hóa tinh bột.
- Amino transferase: chuyển nhóm amin.
- Photpho transferase: ATP  ADP
Trang 7/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme

ATP + AMP  ADP + ADP
1.3.3 Hydrolase
Có tác động lên phản ứng thủy phân. Phương trình phản ứng tổng quát:
A – B + H
2
O  A – H + B – OH
Các dạng thông dụng:
- Amylase:
+ α – amylase: có trong nước bọt, mầm hạt ngũ cốc, nấm, vi khuẩn. Có khả năng phân
giải 1- 4-glucozit tại vị trí giữa mạch.
+ ß – amylase: có trong thực vật (hạt củ). Phân giải 1-4 glucozit tại vị trí đầu mạch. Bền
hơn α – amylase (bền tính acid).
- Peptit hydroláe: có khả năng thủy phân liên kết peptit
- Lipase có khả năng thủy phân lipit. Ví dụ triacylglycerol lipase (3.1.1.3)
1.3.4 Lyase
Có tác động đến phản ứng nhờ bổ sung nhóm chức vào nối đôi hoặc tạo nối đôi nhờ lấy
đi nhóm chức. Phương trình phản ứng tổng quát:
AX – BY  A = B + X – Y
Ví dụ: Pyruvat decarboxylase: loại CO
2
ra khỏi acid pyruvic tạo thành acetaldehyde
1.3.5 Isomerase
Có khả năng chuyển các nhóm chứctrong phân tử tạo thành các đồng phân.
Phương trình phản ứng tổng quát: AX – BY  AY - BX
Ví dụ chuyển đổi galactose thành glucose
1.3.6 Ligase
Có khả năng tổng hợp liên kết C – C, C – S, C – O, C – N nhờ vào phản ứng trùng
ngưng liên hợp với sự thủy phân ATP và tác dụng của enzyme.
Ví dụ: dưới tác dụng của pyruvat carboxylase (6.4.1.1), từ acid pyruvit tạo thành
oxaloacetic.

Trang 8/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
CHƯƠNG II: TÁCH CHIẾT VÀ LÀM SẠCH ENZYME
1 Các phương pháp phá vỡ tế bào
1.1 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học
Mục đích của phá vỡ tế bào là giải phóng các chất có trong tế bào và đảm bảo được
hoạt tính enzyme nội bào. Việc phá vỡ tế bào sinh vật bao gồm cả phá vỡ tế bào động vật,
Trang 9/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
thực vật và VSV. Đối với tế bào động vật, người ta thường sử dụng toàn bộ cơ quan (hay
mô bào) của động vật có chứa enzyme và cần phải loại bỏ mỡ hoặc các thành phần khác
bám theo mô bào đó, các mẫu cần được xử lý nhanh và phải được thu nhận enzyme trong
thời gian không quá 4 giờ kể từ khi giết mỗ. Đối với tế bào và mô bào thực vật, cần phải
được làm sạch và phải được trữ lạnh nếu chưa tiến hành thu nhận enzyme ngay.
Tế bào động vật và thực vật thường rất dễ phá vỡ bằng các phương pháp cơ học. Riêng
tế bào vi sinh vật, việc phá vỡ tế bào có những khó khăn nhất định.
- Tế bào vi sinh vật có kích thước quá nhỏ, việc phá vỡ tế bào bằng phương pháp
nghiền nếu không có chất trợ nghiền sẽ không có hiệu quả.
- Vi sinh vật là cơ thể đơn bào, khi phát triển trong môi trường, đặc biệt là môi trường
lỏng có nhiều cơ chất thủy phân, chúng sẽ tạo ra nhiều enzyme ngoại bào tương ứng.
Các enzyme ngoại bào này được hòa tan trong môi trường và dễ dàng tách chúng ra
khỏi dung dịch nuôi cấy, do đó trong công nghiệp người ta ít khi tiến hành nghiền tế
bào (trừ trường hợp phải thu nhận enzyme nội bào). Tuy nhiên, trong thời gian gần
đây, việc nghiên cứu enzyme nội bào ở VSV ngày càng nhiều, do đó phương pháp cơ
học được ứng dụng để phá vỡ tế bào VSV ngày càng nhiều.
* Phương pháp đồng hóa áp lực cao:
Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất để phá vỡ tế bào quy mô công
nghiệp. Theo phương pháp này, huyền phù tế bào sẽ được nén với một áp suất cao, chúng
va chạm rất mạnh vào vành ống (máy đồng hóa maton-gaulin). Tế bào bị phá vỡ bởi lực
cắt và sức nén. Tùy thuộc vào loại máy, công suất từ 50 – 5000 lít/giờ mà áp lực cần có

khác nhau. Mặt khác, tính chất, cấu tạo của tế bào khác nhau đòi hỏi áp lực khác nhau. Ví
dụ đối với tế bào vi khuẩn người ta cần áp lực khoảng 550 bar. Phương pháp đồng hóa áp
lực cao thường được áp dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tế bào động vật và tế bào
thực vật ít khi phải dùng phương pháp này.
* Phương pháp nghiền ẩm: Đây cũng là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công
nghiệp sản xuất enzyme. Trong quá trình nghiền, người ta thường sử dụng những viên bi
thủy tinh có kích thước 0.2 – 1mm để tăng quá trình phá vỡ tế bào. Trong nhiều trường
Trang 10/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
hợp, người ta không dùng viên bi thủy tinh mà người ta dùng hạt thủy tinh, vì hạt thủy tinh
có độ ma sát cao hơn viên bi thủy tinh nên hiệu suất nghiền tốt hơn.
1.2 Phá vỡ tế bào không phải bằng phương pháp cơ học
Ngoài hai phương pháp cơ học trên, người ta còn phá vỡ tế bào bằng phương pháp
không phải là phương pháp cơ học. Các phương pháp bao gồm phương pháp hóa học,
phương pháp nhiệt và phương pháp enzyme (ở một số tài liệu người ta còn gọi là phương
pháp hóa học, phương pháp vật lý và phương pháp sinh học).
Phương pháp hóa học: Là phương pháp dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh,
hoặc khả năng oxy hóa mạnh của các chất hóa học để phá vỡ thành tế bào. Phương pháp
này không đòi hỏi áp suất cao, nên ít chi phí và dễ thực hiện. Tuy nhiên vì trong quá trình
thực hiện, người ta sử dụng các hóa chất nên các hóa chất này thường lẫn vào trong hỗn
hợp, đòi hỏi quá trình tách rất phức tạp. Một trong những hóa chất sử dụng nhiều là
acetone.
Phương pháp vật lý: Là phương pháp sử dụng siêu âm, phương pháp này thường được sử
dụng trong các phòng thí nghiệm, chưa thấy sử dụng trong quy mô công nghiệp. Một
phương pháp vật lý khác cũng được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất ở
dạng thử nghiệm là tạo shock nhiệt hay shock thẩm thấu. Nguyên tắc của phương pháp này
là, khi đưa nhiệt độ của tế bào huyền phù xuống nhiệt độ rất thấp, ngay lập tức nâng nhiệt
đến 40
0
C (thao tác nâng nhiệt rất nhanh), khi đó thành tế bào sẽ bị phá vỡ và người ta thu

được huyền phù tế bào vỡ. Phương pháp này thường dễ thực hiện, đảm bảo được hoạt tính
của enzyme nhưng hiệu suất phá vỡ tế bào không cao.
Phương pháp sinh học (phương pháp enzyme). Có hai phương pháp hiện đang được sử
dụng rộng rãi là phương pháp tự phân và phương pháp thủy phân bằng enzyme đưa từ bên
ngoài vào.
Phương pháp tự phân là phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả năng
phân giải cho một số thành phần của thành tế bào, các enzyme này phải là những enzyme
có trong tế bào và là của tế bào đó. Bình thường các enzyme này không hoạt động mạnh,
Trang 11/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
nhưng nếu điều kiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài tế bào mà trùng với mức hoạt động tối
ưu của chúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân thành tế bào, làm chết tế bào. Tự
phân là quá trình được áp dụng nhiều trong quá trình phá vỡ thành tế bào các loại nấm
men. Người ta thường tiến hành quá trình tự phân huyền phù tế bào nấm men ở nhiệt độ 48
– 52
0
C, trong khoảng thời gian 6 – 24 giờ. Phương pháp này có nhiều nhược điểm vì trong
quá trình thủy phân, các enzyme có trong tế bào không chỉ thủy phân các chất ở thành tế
bào mà cả những chất có trong tế bào, thậm chí các enzyme cũng bị phá hủy. Phương pháp
này hiện nay không được sử dụng nhiều trong công nghiệp.
Một phương pháp khác đang được nghiên cứu nhiều là phương pháp sử dụng enzyme từ
ngoài tế bào. Các enzyme này được đưa vào huyền phù tế bào để tiến hành các quá trình
thủy phân có định hướng các chất nhất định trong thành tế bào. Người ta thường sử dụng
hệ enzyme cellulase để phá vỡ thành tế bào nấm men và thành tế bào thực vật. Phương
pháp này không gây hư hỏng các chất có trong tế bào và thực hiện dễ dàng trong mọi điều
kiện (phòng thí nghiệm, sản xuất thử nghiệm, và sản xuất công nghiệp). Ngoài ra, người ta
còn sử dụng lysozym trong các loại tế bào khác.
2.2 Các Phương pháp cơ học tách enzyme
Các phương pháp cơ học được ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào và các thành
phần khác gồm hai phương pháp:

- Phương pháp ly tâm
- Phương pháp lọc
2.2.1 Phương pháp ly tâm
Ly tâm là quá trình tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme,
phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận dung dịch enzyme,
dung dịch này chứa các enzyme ngoại bào. Enzyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật,
muốn thu nhân enzyme nội bào ta phải tiến hành một giai đoạn phá vỡ tế bào.
Trang 12/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
Phần lớn các enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan. Như vậy khi
tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô,
dung dịch enzyme thô này còn chứa các thành phần sau:
- Protein có hoạt tính sinh học
- Các chất hòa tan khác
- Nước
Phương pháp ly tâm chỉ tách được thành phần rắn có tỷ trọng lớn hơn dung dịch. Dịch
thu được chưa phải là chế phẩm enzyme tinh khiết mà là chế phẩm enzyme thô, vì còn
chứa protein không hoạt động, nước và các chất hòa tan khác.
Đối với sinh khối động vật và thực vật, sau khi nghiền ta thu được hỗn hợp nhiều thành
phần. Ly tâm hỗn hợp này ta thu được dung dịch enzyme thô tương tự như ở VSV. Để
tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người ta thường tiến
hành ly tâm lạnh, còn trong sản xuất theo quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành
trong điều kiện nhiệt độ thấp.
Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịch
enzyme bằng máy ly tâm liên tục. Phương pháp ly tâm liên tục có những ưu điểm là thời
gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục, và không gây ảnh lớn đến hoạt tính của enzyme.
Hiện nay, trong công nghệ enzyme, người ta đang sử dụng rông rãi ba kiểu ly tâm: ly tâm
hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa.
Ngoài ba kiểu ly tâm điển hình trên, ở một số nhà máy sản xuất enzyme có sử dụng một số
kiểu ly tâm khác. Việc chọn kiểu ly tâm này hay ly tâm khác phải xem xét đến hai yếu tố

rất quan trọng: nồng độ chất rắn (%), kích thước vật lắng.
2.2.2 Phương pháp lọc
Trang 13/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lên men,
người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme
ngoại bào hòa tan.
Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch. Lọc là một phương
pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế bào thường
rất nhỏ, và độ nhớt của dung dịch thường rất cao. Cả hai yếu tố này đều làm cản trở quá
trình lọc. Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc; độ nhớt dịch lọc;
sức đề kháng.
Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng các kiểu sau:
- Lọc ép: Lọc ép (lọc đĩa, buồng lọc) thường được sử dụng trong trường hợp dung dịch
cần lọc có khối lượng nhỏ. Phương pháp này sử dụng để lọc enzyme rất có hiệu quả.
- Lọc chân không: Là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu và
trong sản xuất các sản phẩm sinh học có hoạt tính. Trong đó, lọc chân không quay
được sử dụng nhiều hơn cả.
- Lọc theo dòng chảy cắt ngang. Trong những năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất
enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang. Theo đó, dòng dung dịch
lọc sẽ chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc. Phần lọc sẽ được thoát qua vật liệu lọc
và đi xuống phía dưới. Phương pháp này có ưu điểm là giảm sức đề kháng quá trình
lọc của vật liệu chất rắn.
- Lọc thông thường. Phương pháp lọc thông thường đã có từ rất lâu, hiện nay ở một số
nhà máy vẫn còn sử dụng. Phương pháp lọc này đang được thay thế dần bằng những
phương pháp khác nhanh hơn, có hiệu quả hơn.
2.3 Phương pháp cô đặc
Dung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều. Để xử lý một khối lớn
dung dịch enzyme phải tốn rất nhiều công sức và chi phí cho xử lý này rất cao. Mặt khác
Trang 14/101

Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
lượng enzyme có trong dịch enzyme thô quá ít, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì thế,
người ta phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm một số mục đích sau:
- Làm tăng hoạt tính của enzyme trong một khối lượng dung dịch enzyme
- Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này
- Tăng khả năng bảo quản enzyme
- Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản
- Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất
Để đạt được mục đích đó, người ta tiến hành cô đặc enzyme bằng một trong những
phương pháp sau:
2.3.1 Phương pháp nhiệt
Chúng ta có thể tiến hành cô đặc enzyme bằng phương pháp nhiệt, nhưng sử dụng nhiệt
để cô đặc enzyme thường gặp rất nhiều khó khăn vì enzyme là protein rất nhạy cảm với
nhiệt độ, nguyên nhân là hầu hết enzyme đều được tổng hợp trong tế bào (trừ enzyme nhân
tạo). Trong cơ thể, enzyme thường hoạt động trong điều kiện nhiệt hoạt động của tế bào
sống. Trường hợp nhiệt độ vượt quá nhiệt độ hoạt động của tế bào sống, thì tế bào sẽ chết.
Enzyme mất hoạt tính là một trong những nguyên nhân làm tế bào chết, là vì khi đó các
phản ứng trao đổi chất của tế bào sẽ không còn xảy ra nữa, sự trao đổi chất của tế bào bị
ngưng trệ, tế bào không thể tồn tại.
Khi enzyme được tách ra khỏi tế bào thường hoạt động ở nhiệt tối ưu cao hơn nhiệt độ
sinh lý của tế bào, hiện tượng này thấy ở hầu hết các loại enzyme. Tùy theo nguồn thu
nhận enzyme và tính chất của từng loại enzyme mà quyết định chế độ gia nhiệt trong quá
trình cô đặc.
Quá trình cô đặc là quá trình làm bốc hơi nước, làm cho lượng nước trong dung dịch
giảm đi, hàm lượng enzyme trong dung dịch sẽ tăng lên, hoạt tính enzyme cũng tăng cao.
Tuy nhiên nếu không chú ý đến điều kiện nhiệt độ để khống chế nó trong một khoảng cho
phép thì hoạt tính của enzyme có thể sẽ bị mất nhiều, thậm chí có thể dẫn đến triệt tiêu
Trang 15/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
hoạt tính. Do đó, việc khống chế nhiệt độ cùng với thời gian cần thiết trong quá trình cô

đặc là điều rất cần thiết.
Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng những phương pháp sau:
- Bốc hơi lớp mỏng
- Bốc hơi ly tâm lớp mỏng
- Bốc hơi ống dài
2.3.2 Phương pháp kết tủa
Kết tủa là phương pháp được sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu enzyme trong
phòng thí nghiệm và sản xuất enzyme trong quy mô sản xuất công nghiệp. Phương pháp
kết tủa dựa trên nguyên tắc, enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với
một số dung môi. Trong quá trình kết tủa, người ta phân biệt hai thuật ngữ: kết tủa âm và
kết tủa dương.
- Kết tủa âm: là sự kết tủa protein tạp. Phần protein cần thiết nằm trong dung dịch chứ
không nằm trong phần tủa.
- Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm trong phần kết
tủa còn protein tạp nằm trong phần dung dịch.
* Phương pháp kết tủa bằng muối: Muối nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao
quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme.
Trong công nghiệp enzyme người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate. Các thiết bị
dùng trong quá trình kết tủa bằng muối ammonium sulfate thường được chế tạo bằng thép
không rỉ. Tuy nhiên, thép không rỉ có nhiều loại, do đó nhiều trường hợp thiết bị chế tạo từ
thép không rỉ cũng bị ăn mòn bởi ammonium sulfate. Sau này người ta thay ammonium
sulfate bằng sodium sulfate, muối này tuy không gây hư hỏng thiết bị, song chúng lại
không có tính hòa tan tốt. Nhiệt độ tiến hành kết tủa có thể ở 35 – 40
0
C, nhưng để tránh
khả năng làm mất hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và
Trang 16/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này với nhau. Khoảng tối ưu của nồng
độ muối dùng trong kết tủa enzyme rất rộng, khoảng 20 – 80%.

* Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có ảnh hưỡng rất
lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvate hóa của phân tử nước xung
quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử enzyme sẽ bị tăng lên. Trong
công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng ethanol và acetone để kết tủa
enzyme. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý đến
nhiệt độ. Do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt của các chất như ethanol hoặc
acetone, nên bắt buộc ta khi tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và
dung dịch enzyme. Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt các dung môi hữu
cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô
cơ. Người ta thường kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 – 10
0
C. Tỷ lệ và
nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm
cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme.
* Kết tủa enzyme bằng polymer: Polyethylene glycol là một polymer cao phân tử được ứng
dụng rộng rãi trong kết tủa protein, enzyme. Nhiều tác giả cho rằng cơ chế lắng của chúng
gần giống dung môi hữu cơ. Phương pháp này có ưu điểm là ta có thể thực hiện quá trình
kết tủa enzyme ở nhiệt độ bình thường (nhiệt độ phòng thí nghiệm) và lượng polyethylene
glycol cần sử dụng để kết tủa không nhiều (khoảng 5 – 15 %). Nếu sử dụng nồng độ cao sẽ
làm độ nhớt của dung dịch rất cao và như thế sẽ tạo ra nhiều khó khăn cho kỹ thuật làm
sạch sau này. Polymer được sử dụng rất rộng rãi để kết tủa enzyme cả trong nghiên cứu và
trong sản xuất theo quy mô công nghiệp. Các polymer được sử dụng nhiều là
polyethylenamin và polyethylene glycol với những khối lượng phân tử khác nhau. Trong
công nghiệp, người ta thường sử dụng nồng độ polymer khoảng 15 – 20% để kết tủa
enzyme.
* Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện của protein-enzyme: Protein là chất lưỡng cực, chúng
có cả nhóm acid và nhóm base. Mức độ hòa tan của enzyme phụ thuộc vào pH, mức độ
Trang 17/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳng điện, phần lớn protein có điểm đẳng điện ở khoảng

acid, vì thế quá trình này gọi là kết tủa acid. Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường
được thực hiện ở quy mô nhỏ, chứ không thực hiện ở quy mô công nghiệp. Thời gian tạo
điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính
enzyme. Như vậy thiết bị phản ứng càng lớn. Khi đó, thời gian khuấy trộn và thời gian
lắng kết tủa càng dài, enzyme càng dễ bị biến tính.
2.3.3 Phương pháp siêu lọc
Phương pháp siêu lọc là phương pháp sử dụng những màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ.
Phương pháp này được ứng dụng rất nhiều trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Phương pháp
tách vật chất bằng màng siêu lọc hiện nay có ba loại là: lọc dòng chảy cắt ngang, siêu lọc,
thẩm thấu ngược.
Trong những phương pháp trên, phương pháp lọc dòng chảy cắt ngang để thu nhận sinh
khối vi khuẩn, tách vi khuẩn khỏi dung dịch enzyme. Phương pháp thẩm thấu ngược dùng
để thu nhận các chất có khối lượng phân tử thấp và có khả năng hòa tan. Trong khi đó, siêu
lọc lại được sử dụng rất rộng rãi để thu nhận enzyme, siêu lọc có thể giúp ta thu nhận các
chất có khối lượng phân tử trong khoảng1.000 – 300.000 dalton. Người ta sử dụng
cellulose acetate và các loại polymer hữu cơ như poly sulfone, poly-vinylidene và poly
propylene làm nguyên liệu màng lọc. Trừ cellulose acetate ra, các loại nguyên liệu màng
lọc khác kể trên có thể rửa bằng kiềm, acid hoặc bằng hơi nóng. Ngoài ra, người ta còn
tách muối trong dung dịch enzyme bằng lọc thẩm tích.
2.4 Phương pháp tinh sạch enzyme
2.4.1 Phương pháp kết tinh
Trong nghiên cứu và trong sản xuất, người ta dùng dung dịch ammonium sulfate để kết
tinh enzyme, dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme đòi hỏi độ tinh sạch phải rất
cao là rất khó, vì vậy phương pháp này ít được phổ biến
2.4.2 Phương pháp điện di
Trang 18/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
Phương pháp điện di chỉ được ứng dụng nhiều trong phòng thí nghiệm. Người ta cũng
đã tiến hành áp dụng thử phương pháp này theo quy mô công nghiệp nhưng cho đến nay
vẫn chưa được phát triển rộng rãi.

2.4.3 Phương pháp sắc ký
* Phương pháp sắc ký lọc gel. Theo phương pháp này, các loại gel được nạp vào trong cột
dùng để tách enzyme. Các loại gel được sử dụng rộng rãi trong phương pháp sắc ký cột là:
polycryamide, ararose, vinyl polymer, dextran …Trong lọc gel, các phân tử được tách ra
dựa theo kích thước và hình dáng của chúng.
* Sắc ký trao đổi ion. Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên sự tích điện của phân tử
protein. Phương pháp trao đỏi ion được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme theo quy
mô công nghiệp. Tính chất tích điện của protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH.
Từ đó, người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation.
* Sắc ký kỵ nước. Phương pháp này dựa trên sự tương tác của vùng kỵ nước của phân tử
protein với nhóm kỵ nước trên chất nền, sự hấp thụ xảy ra ở nồng độ muối cao và quá trình
phân đoạn với muối. Phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với những enzyme đã được
làm cô đặc trước đó bằng phương pháp kết tủa với muối ammonium sulfate.
* Sắc ký đồng hóa trị. Liên kết đồng hóa trị được tạo thành giữa các protein ở trạng thái
tĩnh.
* Sắc ký ái lực. Phương pháp này dựa trên khả năng giữ enzyme bằng những chất nền
không hòa
tan, được nhồi vào trong các cột sắc ký.
2.5 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật
Trang 19/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
2.5.1 Thu nhận enzyme amylase
Hiện nay, người ta biết có sáu loại amylase, trong đó α-amylase, β-amylase, γ-amylase
(hay glucose) thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột, glycogen và các
polysaccharide đồng loại. Các amylase còn lại: dextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase)
thủy phân các liên kết α-1,6-glucoside. Sáu loại amylase này được xếp thành hai nhóm:
endoamylase (enzyme nội bào), và exoamylase (enzyme ngoại bào). Enzyme amylase được
thu nhận chủ yếu từ các hạt nảy mầm như: malt đại mạch, malt thóc và ngô. Có hai phương
pháp tinh sạch enzyme amylase là phương pháp sắc ký và phương pháp điện di trên gel
polyacrylamide

* Tinh sạch enzyme amylase bằng phương pháp sắc ký
Hạt lúa được cho hút ẩm và ủ trong tối ở 30
0
C trong 8 ngày. Hạt nảy mầm được đồng hóa
trong một máy trộn và một polytron với 800ml dung dịch đệm TRIS/HCl 50mM (pH 8,5)
(dung dịch đệm A). Sản phẩm đồng hóa được ép qua hai lớp lưới nylon và dịch lọc thô
được đưa vào ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút. Phần ở trên được xem như dịch
enzyme thô. Dịch enzyme thô được cho kết tủa với (NH
4
)
2
SO
4
(25 – 60%). Phần kết tủa
thu được đem hòa tan trong 10ml dung dịch đệm A và ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong
20 phút.
Sau khi sử dụng phương pháp thẩm tích thì phần nổi ở trên trong dung dịch đệm A thì
sẽ được cho qua cột DEAE cellulose, DE 52 và được cân bằng với dung dịch đệm A;
enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng độ 0 – 0,5M. Dung dịch được thẩm tích và được lôi
cuốn qua cột CHA (ancyclodextrin), cột này đặc biệt được sử dụng để lôi cuốn amylase.
Các phân đoạn qua cột thu được sẽ được chuyển qua 12 sắc ký cột superpose. Những
phân đoạn này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
* Thu nhận enzyme amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (PAGE)
Trang 20/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
Hạt lúa được ngâm nước và ủ cho nảy mầm. Sau 14 ngày, cây mầm được xay nhuyễn
với đệm Tris-HCl 0,05M (pH 8,0). Tỷ lệ mô đệm là 1:2 (trọng lượng/thể tích). Hỗn hợp
sau khi đồng hóa được ly tâm với tốc độ 10.000rpm trong 15 phút ở nhiệt độ 4
0
C. Phần nổi

ở trên được chuyển sang một ống ly tâm khác và được xem là dịch enzyme.
Gel được chuẩn bị sẵn sàng và được đưa vào điện di với cường độ dòng điện 70V. Sau khi
hoàn tất việc chạy điện di, gel được đưa ra nhuộm với dung dịch nhuộm màu để xác định
sự hiện diện của amylase.
2.5.2 Thu nhận enzyme bromelin từ dứa
Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng
phân giải protein, được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt ở cây dứa (thân và trái).
 Phương pháp thu nhận
Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzyme bromelin
 Thu dịch enzyme thô
Quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, ly tâm dịch lọc với
tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịch chiết có chứa
bromelin.
Trang 21/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
 Các phương pháp tách bromelin
Phương pháp kết tủa enzyme
Nguyên tắc: điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH 7, do đó trong điều kiện sinh
lý, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này đã kết
hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở trong dung dịch,
protein liên kết với một lượng nước khá lớn) cũng như các ion dương. Sự kết hợp với nước
tạo ra một lớp nước bao xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng. Đối
với enzyme protein cũng như các protein enzyme khác, để có thể kết tủa được enzyme,
điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này bằng cách bổ sung
vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặc các chất ưa nước có ái lực với nước
mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein tủa xuống.
Cách thực hiện:
- Tủa bằng muối ammonium sulfate: chuẩn bị một lít dung dịch nước dứa sau ly tâm,
cho từ từ 532g ammonium sulfate vào và khuấy đều (dung dịch đạt được độ bão hòa
ammonium sulfate là 70%). Để yên ở nhiệt độ phòng 10 – 15 phút, sau đó ly tâm với

tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận tủa.
- Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 96% (cũng đã
được làm lạnh) vào theo tỷ lệ 4:1 (4 nước dứa, 1 cồn), trộn đều, để ở nhiệt độ 0
0
C
trong 3-4 giờ. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút. Rửa tủa bằng
acetone và thu nhận tủa.
- Tủa bằng acetone: thêm một thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào 1 thể
tích dung dịch nước dứa sau ly tâm. Để yên trong 1 giờ ở nhiệt độ 0-4
0
C. Ly tâm hốn
hợp với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ tủa. Thêm 2 thể tích acetone
lạnh vào, để 1 giờ ở 0-4
0
C, ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh.
Phương pháp hấp phụ
Trang 22/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
Có nhiều chất được sử dụng để làm chất hấp phụ enzyme. Có thể sử dụng kaolin hay
betonite để hấp phụ bromelin. Trình tự thực hiện tương tự nhau. Cách làm: cho kaolin khô
(hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau ly tâm với tỷ lệ 25mg kaolin/ml
dung dịch nước dứa. Khuấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa. Tủa được
gọi là bromelin-kaolin.
Phương pháp siêu lọc
- Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất để tách
các thành phần trong chất lỏng đó. Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích
thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua. Tùy theo kích
thước của lỗ trên màng mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ thu được nước và
những chất có phân tử nhỏ còn những các phân tử lớn sẽ bị giữ trên màng.
- Cách thực hiện: Sử dụng màng FS 50PP có giá trị loại trừ 30.000, diện tích màng

336cm
2
. Dịch nước sau khi ly tâm được cho qua siêu lọc, trong quá trình này thêm
nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc. Thu nhận tủa bằng cách sử
dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc.
- Tách chiết protein từ dịch chứa bằng CMC: CMC vải màng được tẩm ướt bằng dung
dịch đệm phosphate 0,005M, pH 6,1, sau đó cho dịch chiết dứa vào thỉnh thoảng
khuấy trộn. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt, vẩy sạch chất bẩn bám vào CMC. Rửa protein
bằng đệm phosphate 0,05M, pH5,6. Sau đó, tiến hành phản ứng hấp phụ lần thứ nhất,
cho dung dịch phản ứng hấp phụ là đệm phosphate 0,05M, pH 7,1 và NaCl 0,5M
khuấy trộn 3-4 lần. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt thì thu được dung dịch đậm đặc chứa
bromelin. Tiếp tục phản ứng hấp phụ lần thứ hai như lần thứ nhất. Sau đó, góp các
dịch chiết lại và tủa bằng acetone hay cồn lạnh để tách lấy enzyme.
 Phương pháp tinh sạch enzyme bromelin
 Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích
Trang 23/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
Cân 1g enzyme thô, pha trong 10ml dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M có pH 7,2.
Sau khi tất cả enzyme hòa tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc có
chứa 1 lít dung dịch đệm sodium phosphate 0,03M, pH 7,2. Túi cellophane được chuẩn bị
bằng cách trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương tự như trên. Tiến
hành thẩm tích trong 6 giờ và cứ sau hai giờ thay dung dịch đệm bên ngoài 1 lần. Dung
dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng một máy khuấy từ.
 Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50
Sephadex G-50 được đun cách thủy ở 100
0
C trong một giờ rồi nhồi vào cột (kích thước
cột 23,5x0,9cm). Đặt 1 cái phễu thủy tinh phía trên cột, cho sephadex từ từ vào phễu và
khuấy liên tục. Các hạt sẽ lắng từ từ xuống cột, chú ý phải khuấy liên tục cho đến khi nhồi
xong cột. Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi sao cho mật độ hạt đồng nhất và không có bọt

khí. Trong quá trình nhồi cột vẫn phải xả cột trong một giờ, với vận tốc khoảng 1ml/7
phút.
Cân 100mg enzyme thô hòa vào trong một ml dung dịch đệm sodium phosphate
0,02M, pH 7,2. Khi enzyme đã hòa tan hoàn toàn thì cho hỗn hợp enzyme từ từ vào cột.
Cho dung môi enzyme phân ly qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7 phút. Loại
bỏ 5ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme. Dịch enzyme được thu đến khi dùng
Ba(NO
3
)
2
để thử (NH
4
)
2
SO
4
và thấy có xuất hiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình thu dịch
enzyme. Dịch enzyme thu nhận được làm đông khô. Quá trình lọc enzyme qua sephadex
G-50 nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp do nhiệt độ thấp có khả năng giảm
thiểu sự biến tính của enzyme. Quá trình lọc enzyme qua sephadex diễn ra trong khoảng
thời gian 1 giờ.
 Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký
Trang 24/101
Chiết ,tinh chế và ứng dụng của enzyme
Bromelin thân được cho chạy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05 cho hai phân đoạn
khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein và glucagons.
Sắc ký bromelin thân trên Bio Rex ở pH 6,1 sẽ thu được 5 phân đoạn khác nhau về thành
phần amino acid. Khi sắc ký trên sephadex G-75 ở pH 7 cũng nhận được 5 thành phần có
hoạt tính enzyme. Trọng lượng phân tử của 5 thành phần này ở trong khoảng từ 17.800 –
20.000 Dalton.

2.5.3 Thu nhận enzyme papain
Papain là một endoprotease có chứa 16,1%N và 1,2%S. Papain là một protease thiol, là
một chuỗi popeptit gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 dalton. Quá trình
thu nhận papain tinh khiêt gồm các bước sau:
- Chuẩn bị: thành phần nhựa đu đủ tươi ngoài enzyme papain, chymopapain còn chứa
một số loại enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo,… và các chất tạp khác.
Để có được quy trình tách và tinh sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì phải có
quy trình hòa tan nhựa đu đủ, mục đích là để loại bỏ các chất nhựa, cặn tạp lớn…
Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150 cát sạch, nghiền kỹ trong cối ở
nhiệt độ phòng 200-300ml dung dịch cysteine 0,04M (hòa tan 6,3g cystein
hydrochloride trong 1.000 ml dung dịch NaOH 0,054M, kiềm được sử dụng để đưa
pH dịch chiết tới pH 5,7). Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù, gạn bỏ lớp nổi ở
trên. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300ml dung dịch cysteine Sau đó rửa
cối với dung dịch cystein để điều chỉnh thể tích dịch chiết lên 1 lít. Dịch huyền phù
sau cùng được lọc lạnh trên giấy lọc Whatman số 1. Thời gian lọc phụ thuộc vào
nhựa khô được sử dụng và quá trình này có thể rất chậm. Nước lọc có màu trắng sữa
hoặc màu xanh, pH gần 5,7. Các bước còn lại của quá trình làm tinh sạch được tiến
hành trong điều kiện lạnh.
- Loại bỏ các chất không tan ở pH 9: Dịch chiết thu được ở bước 1 được điều chỉnh
lên pH 9 bằng cách thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110ml dung dịch
Trang 25/101