Nghiên cứu đặc điểm và ứng dụng của hệ Enzym Pectinase

LÔØI GIÔÙI THIEÄU

PHAN I


ẹAậC ẹIEM CUA HE
ENZYM PECTINASE

















I.Cơ chất pectin :[ I ]

Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của các
acid galacturonic qua các liên kết α–-1,4 glucoside. Tùy thuộc nguồn pectin mà
pectin có khối lượng phân tử 800000-200000. Pectin hoà tan trong nước,
ammoniac, dung dòch kiềm, carbonate natri và trong glycerine nóng. Độ hoà
tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hoá trong phân tử pectin
tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm.

Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất khác
nhau, trong đó pectinic acid là thành phần chủ yếu. Các pectin tự nhiên đònh vò
trong thành phần của tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polyssacharide và
protein để tạo thành các protopectim không tan. Có thể phân hủy để làm pectin
tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid. Vì thế, các
pectin tan thu nhận được là kết quả của sự phân hủy phân tử pectin không tan
và chúng không đồng dạng với nhau.
Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng: pectin hoà tan, pectin acid và
protopectin.
Pectin hoà tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự
nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester
hoá bằng methanol. Pectin được ester hoá cao sẽ tạo gel đặc trong dung dòch
acid và trong dung dòch đường có nồng độ 65%. Enzyme pectinase tác động lên
các hợp chất pectin có khối lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học không
đồng dạng. Cấu trúc hoá học cơ bản của pectin là α–– D-galacturonan hay α––
D-galacturonoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ các đơn vò D-
galactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu α -1,4). Mặt khác, mức độ oxy
hoá trong các phân tử polymer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất đònh
các nhóm carboxyl bò ester hoá bởi các nhóm methoxyl. Trong một số trường
hợp, chẳng hạn trong pectin củ cải đường, có sự ester hoá giữa các nhóm
carboxyl và các nhóm acetyl.
Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl
được ester hoá bằng methanol. Pectinase là muối của pectinic acid. Pectic acid
là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi một đơn vò galacturonic
acid. Pectate là muối của pectic acid.
Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo
hoá học phức tạp. Trong pectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và
các ion Ca
2+
, Mg

2+
, các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường. Protopectin
khi bò thủy phân bằng acid thì giải phóng pectin hoà tan.








II. Pectinase:[I]

Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin.
Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những
enzyme này vì vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản
trái cây và rau quả. Việc kiểm soát các enzyme này trong cà chua chuyển gen
là một ví dụ điển hình trong việc ứng dụng RNA đối mã để thao tác sự biểu
hiện gen. Enzyme pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong quá trình chế
biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả. Việc kiểm soát hoạt
động của enzyme pectinase cũng có thể kiểm soát được độ nhớt của sản phẩm.
Enzyme pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng.
• Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl ester.
Enzyme thường tấn công vào các nhóm ester methyl của đơn vò
galaturonate nằm kề đơn vò không bò ester hoá, phân cắt các nhóm methoxy
(COOCH
3
) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc
acid pectic và methanol. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có
giá trò pH tối ưu khác nhau. Nếu thu từ nguồn VSV thì PH tối ưu từ 4,5-5,5,

còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối ưu từ 5,0-8,5. Pectinesterase từ nấm
mốc có nhiệt độ tối ưu là 30-40
o
C và bò vô hoạt ở 55-62
o
C. Pectinesterase
thường được hoạt hoá bởi các ion Ca
2+
và Møg
2+
.
• Polygalacturonase còn có tên gọi là poly -1,4-galacturoniglucanohydrolase,
xúc tác sự phân cắt các mối liên kết α–1,4-glycosid. Các exo-PG (exo-poly
1,4-α-D-galacturonide) galacturonohydrolase, phân cắt từ các đầu không
khử, và endo-PG (endo-poly1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, tấn
công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase ít gặp trong
thực vật nhưng có chủ yếu ở một số nấm mốc và vi khuẩn.
Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường
có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác
dụng với cơ chất, enzym polygalacturonase được chia làm bốn loại:
 Polymethylgalacturonase hay còn gọi là α-1,4-galacturonite-
methylesglucanohydrolase, tác dụng trên polygalactorunic acid đã được
methoxyl hoá (tức là pectin). Enzyme này lại được phân thành hai nhóm
nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối mạch trong phân
tử pectin, đó là endo-glucosidáe-polymethyl galacturonase kiểu I và
exo-glucosidase-polymethylgalaturonase kiểu III.
 Polygalacturonase, enzyme tác dụng trên pectic acid hoặc pectinic,
cũng được chia thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidase-
polygalacturonase kiểu II và exo-glucosidase-polygalacturonase kiểu
IV. Enzyme endo-glucosidase-Polymethyl-galacturonase kiểu I là

enzyme polymethylgalacturonase dòch hoá pectin có mức độ methyl hoá
càng cao thì bò thủy phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu
quả. Trong dung dòch, khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ
của enzyme này thường bò giảm. Enzyme này rất phổ biến trong các
VSV, đặc biệt là nấm mốc A. niger, A, awamori.
• Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vò galacturonate không bò
ester hoá. Cả hai enzyme exo-PEL (exo-Poly(1,4-α-D-galacturonide)
lyase) và endo-PEL (endo-poly(1,4-α-D-galacturonic) lyase) đều tồn tại.
Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp hơn cả
cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối
đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca
2+
để hoạt động. Pectate
lyase không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm.
Các enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá
trình gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm
mềm và làm mục mô thực vật.
Ngoài ra còn có:
• Pectin-transeliminase hay còn được gọi là poly α–-1,4-galaturonite –
methylesteglucanoliase, là enyme tác dụng trên pectin và pectinic acid.
• Polygalactorunate-transeliminase còn được gọi là poly α -1,4D-galaturonite
–glucanoliase, là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid.
•
Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vò galacturonate đã bò ester
hoá. Tất cả các PNL đều là endo-enzyme


III. Đặc điểm của các pectinase từ các nguồn khác
nhau:[ I ]

1. Pectinesterase
:

Bên cạnh pectineaterase (PE) VSV, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa
enyme PE. Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm
trong phần vỏ tế bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng
pH hơi kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca
2+
chẳng hạn, có
khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme
.

a.Đặc điểm của pectineaterase thực vật: Cà chua chứa ít nhất hai loại PE.
Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của quá trình chín. Khi bước vào
giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống, nhưng PE2 tích luỹ dần cho
đến khi trái cây có màu đặc trưng của trái chín. PE2 có khối lượng phân tử
23kD, pH tối ưu 7,6. Enzyme này bò bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67
o
C. Các
ion Ca
2+
và Na
+
làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0,005M
và 0,05M, theo thứ tự.
PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưu
tại pH gần 8. Polygalacturonic acid, sản phẩm hình thành do quá trình để
methyl hoá, là một chất ức chế cạnh tranh.
Trong thòt quả chuối có hai isoenzyme PE. Cả hai có cùng khối lượng phân
tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 và 9,3. Các enzyme này

hoạt động ở pH tối đa là 7,5. Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dòch
NaCl ở nồng độ 0,2M, và đưa pH của dung dòch về 6,0. Các enzyme này bò ức
chế bởi nhiều loại polyol có khối lượng phân tử thấp, như glycerol, sucrose,
glucose, maltose và galactose.
PE trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzyme PE1 và PE2 có khối
lượng phân tử 36,kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và $11,0,
theo thứ tự. pH tối ưu của PE1 là 7,6, còn của PE2 là 8,0.
Thòt quả cũng chứa hai isoenzymem, một trong hai enzyme này có tính
bền nhiệt hơn, còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi bò tác động của protease.
Độ ổn đònh của enzyme có thể liên quan đến mức độ glycosyl hoá của các phân
tử enzyme. Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme còn lại có khối lượng là 51kD và
36kD, theo thứ tự.
Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzyme. Các isoenzyme của kiwi
có cùng khối lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3. Tuy nhiên,
chúng khác nhau về mức độ bền nhiệt.
b.Đặc điểm của pectineaterase vi sinh vật:Một điểm đáng lưu ý là tất cả
enzyme VSV đều không phải là protein kiềm. PE của Trichoderma reerei có
điểm đẳng điện nằm trong khoảng 8,3-9,5 và pH tối ưu là 7,6. Tuy nhiên, PE
của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu trong khoảng acid. Hoạt động
của enzyme PE sinh ra bởi A. niger đạt tối đa ở pH 4,5 ở 40
o
C. Các PE acid và
kiềm có thể đề methyl hoá cơ chất pectin theo cùng một kiểu. PE kiềm làm
hình thành các pectin được đề ester hoá và pectin này có thể tạo gel yếu với
ion calcium; PE acid tạo ra pectin bò đề ester hoá có khả năng tạo gel mạnh với
ion calcium.
c.Trình tự amino acid: Cấu trúc bậc một của PE cà chua chứa 305
amino acid với khối lượng phân tử 33 239. Enzyme này có chứa hai cầu nối
disulfide (Cys98-Cys125 và Cys166-Cys200). Cys 166 có mặt trong tất cả các
enzyme pectinesterase. Trình tự amino acid suy luận trên cơ sở các nucleotide

cDNA cho thấy sự không nhất quán, 18 trong 27 vò trí khác nhau, có thể làm
thay đổi điện tích của protein. Mặt khác, chỉ có khoảng 94% trình tự amino acid
trong một phần chuỗi amino acid có tính đồng dạng với toàn bộ trình tự của
cDNA. Sự không nhất quán này có thể phản ánh sự tồn tại của các isoenzyme,
mặc dù chỉ có hai isoenzyme trong cà chua được biết đến. Một số gen mã hoá
cho các enzyme PE đã được tách dòng và nghiên cứu đặc điểm. Gen tách dòng
từ Pseudomonas mã hoá cho PE có chứa 396 amino acid với khối lượng phân tử
là 41 004.
d.Cơ chế để methyl hoá: PE loại bỏ các nhóm methoxyl trong phân tử
pectin bằng tương tác ái nhân của enzyme lên ester, làm hình thành hợp chất
trung gian acyl-enzyme và phóng thích methanol. Tiếp theo sau là phản ứng
deayl hoá, là phản ứng thủy phân của hợp chất trung gian acyl-enzyme, để giải
phóng enzyme và carboxylic acid(H.6.7).
E-N
Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu làm hình thành các
khối pectin chứa các nhóm carboxylate dọc theo mạch pectin. Enzyme của
Trichoderma reesei là một protein cơ bản cho kiểu phản ứng tương tự. Enzyme
của các loài Asperillus với pH tối đa trong vùng acid, xúc tác phản ứng từ bên
trong.
nh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme pectinesterase có
thể có liên quan đến tương tác của nó với cơ chất. Polygalacturonic acid là một
chất ức chế cạnh tranh trong phản ứng thủy phân nhờ sự xúc tác của PE. Pectin
chứa các nhóm cacboxylate được sắp xếp như hình khối có thể tác dụng theo
cách tương tự. Sự liên kết của các ion kim loại vào các nhóm carboxylate trong
trường hợp này có khuynh hướng trung hoà ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin
lên enzyme. Tuy nhiên. Lượng dư các ion này trên thực tế gây ra sự bất hoạt
của PE vì các ion kim loại bò vây quanh bởi các nhóm carboxylate nằm kế cận
với các liên kết ester cần thiết cho phản ứng thủy phân xảy ra.

2. Polygalacturonase

Hầu hết các nghiên cứu về PG đều trên cơ sở các nguồn VSV. PG
thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các loài nấm và vi
khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger,
Lactobacillus plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, các loài
Ascomycete, Phizopus arrchizus, và Fusarium osyporum. Tuy nhiên, trong thực
tế, PG của thực vật bậc cao được nghiên cứu rất nhiều ở cà chua chín.
a.Các enzyme trong cà chua chín: Các enzyme PG trong cà chua chín
tồn tại dưới hai dạng, và cả hai đều là endo-enzyme. PG1 có khối lượng phân
tử 84kD và có khoảng 50% bò bất hoạt ở nhiệt độ 78
o
C. PG2 có khối lượng
phân tử 44kD và có khoảng 50% bò bất hoạt ở 57
o
C. PG1 có độ ổn đònh tối đa ở
pH 4,3, trái lại PG2 ổn đònh tối đa ở pH 5,6. Sự phân tích sử dụng SDS-PAGE
cho rằng PG1 là một dimer của PG2, tuy nhiên các nghiên cứu khác lại cho
rằng PG1 hình thành là do sự kết hợp của PG2 với một $–subunit. Các chuỗi
polypeptide của PG đều bò glycosyl hoá. PG2 chứa 4,6 đường trung tính (D-
mannose, L-gucose, D-xylose) liên kết với nhau thông qua cầu nối N-
acetylglucosaminylasparaginyl. Có sự khác nhau chút ít về khối lượng phân tử,
chẳng hạn các isoenzyme của PG2, PG2A va PG2B có khối lượng phân tử
tương ứng là 43 và 46kD. Sự khác nhau này có thể là do quá trình sửa sai hoặc
quá trình glycosyl hoá sau dòch mã. Trong thực tế, các nghiên cứu sau đó cũng
đã chứng minh được rằng PG2A và PG2B là các dạng glycosyl hoá khác nhau
của cùng các polypeptide.
b. Trình tự amino acid: Các trình tự amino acid được suy luận trên cơ
sở các nucleotic của cDNA phân lập không những từ trái cà chua mà còn từ
phấn của các loài Pseudomonas solanacearum, Oenothera organesis, phấn hoa
bắp, và từ trái bơ. Gen của PG2 phân lập từ trái cà chua mã hoá cho protein

hoàn chỉnh có 373 amino acid, với khối lượng phân tử là 40 279. Enzyme này
được tổng hợp từ một tiền chất, sau đó đi qua quá trình sửa chửa sau dòch mã,
gồm cả các quá trình loại bỏ các peptide tín hiệu, bò glycosyl hoá tại bốn điểm
có khả năng glycosyl, và sửa chữa ở đầu C cuối. Các gen PG đơn mã hoá cho
các loại isoenzyme khác nhau, dẫn đến kết luận rằng PG1 và PG2 đều xuất
phát từ cùng một chuỗi polypeptide, và rằng PG1 được tạo thành nhờ sự kết hợp
của PG2 với β-subunit.

β
-subunit. Sự chuyển đổi PG2 và PG1 trong quá trình chín của cà chua
là một vấn đề gây được nhiều chú ý. β-subunit, một yếu tố bền nhiệt, đầu tiên
được phân lập từ cà chua xanh, có khả năng chuyển đổi PG2 thành PG1 trong
ống nghiệm. Yếu tố này sau đó được xác minh là một glycoprotein rất đặc
trưng với polypeptide PG về mặt miễn dòch. Phân tử PG1 được tạo thành từ một
phân tử PG2 và một phân tử β-subunit; tuy nhiên, chỉ có polypeptide PG có
hoạt tính enzyme.
cDNA mã hoá cho –subunit có trong cà chua là một tiền chất có kích
thước phân tử lớn (69kD, 630 amino acid). Trong phân tử này, thêm vào phân
tử protein hoàn chỉnh là một trình tự tín hiệu kò nước (30 amino acid), một
polypeptide chứa đầu cuối N-(78 amino acid), và một tiền peptide chứa đầu
cuối C-(233 amino acid). Protein hoàn chỉnh chứa glycosyl hoá là chứa 289
amino acid nặng 31,5 kD, điểm đẳng điện 4,9. Protein này chứa lượng lớn
amino acid gly, tyr, phe, và một motif lặp có cấu trúc liên ứng
FTNYGxxGNGGxxx, trong đó “x” phần lớn là các amino acid phân cực. Chức
năng của motif này trong protein vẫn chưa được biết rõ.
c.Vai trò của PG trong quá trình làm chín trái cây. Hoạt độ của
enzyme trong giai đoạn đầu của quá trình làm chín chủ yếu là nhờ PG1. PG1
tiếp tục tăng trong quá trình chín, và có mặt trong tất cả các giai đoạn của quá
trình chín. PG2 có khối lượng phân tử thấp hơn và ít bền nhiệt, PG2 xuất hiện
trong giai đoạn cuối của quá trình, và chiếm lượng lớn trong giai đoạn chín. Sự

xuất hiện kế tiếp nhau của hai enzyme này là kết quả của hoạt động điều hoà
của –subunit, yếu tố này được tìm thấy với lượng ít trong cà chua xanh, sau đó
tăng lên trong giai đoạn chín.
PG2 được coi như một endo-enzyme trong cà chua chín, PG1 được hình
thành trong suốt quá trình chín khi β–subunit được sinh ra để phản ứng với
PG2. Bằng cách điều chỉnh những thay đổi trong các phân tử PG trong các dòch
chiết khác nhau có các nồng độ khác nhau của NaCl và pH đệm khác nhau.
Trên thực tế gen mã hoá cho polypeptide PG trong một số nghiên cứu trước đây
đã chứng minh điều này. Gần đây, các nghiên cứu về các kiểu biểu hiện gen
của β–subunit và các phân tử PG cho thấy mRNA của β–subunit xuất hiện sớm
trong quá trình phát triển của trái cây(10 ngày sau khi thụ phấn) và tăng đến
mức tối đa trong 30 ngày, cũng là lúc trái cây chín. Sau đó, lượng mRNA của β-
subunit giảm nhanh chóng, trong khi lượng mRNA của PG tăng một cách đáng
kể.
Vì tất cả các kết quả nghiên cứu đạt được ở trên, ta có thể cho rằng
endo-enzyme PG2 được hình thành trong các giai đoạn sớm của quá trình chín
phải được chuyển về PG1 do sự có mặt của β–subunit. Sự tích lũy của PG2
trong các giai đoạn sau của quá trình chín là do β–subunit bò cạn kiệt. Vai trò
của quá trình chuyển đổi này là nhằm điều hoà hoạt động của PG trong các giai
đoạn của quá trình chín. β–subunit phản ứng và neo phân tử PG2 vào thành tế
bào, tạo ra phân tử PG1 dưới dạng hoạt động để phân hủy pectin. Một số
nghiên cứu khác cũng chứng minh được rằng PG1, chứ không phải PG2 có chức
năng trong việc làm phân huỷ và ổn đònh polyuronide, có nghóa là sự phân hủy
của polyuronide dưới tác động của enzyme PG là nguyên nhân dẫn đến quá
trình mềm của cà chua.Tuy nhiên, khi nghiên cứu về sự xen đoạn và biểu hiện
của gen PG trong cà chua chuyển gen thì kết quả cho thấy polyuronide bò phân
hủy nhưng không làm cho trái cà chua mềm đi.
d.Cơ chế và kiểu tác dụng: Exo-PG thủy phân các đầu không khử của
chuỗi polygalacturonic, tạo ra galacturonic acid là sản phẩm thủy phân chiếm
ưu thế(H.6.8). Sự thủy phân polymer này bò gián đoạn của sự tồn tại của các

mạch nhánh trong cơ chất. Mức độ thuỷ phân tăng tỉ lệ với kích thước cơ chất,
đạt tối đa với mức polymer hoá 20 đối với các exo-PG ở cà rốt và đào. Hoạt
động của các exo-enzyme làm tăng nhanh sự tạo thành các nhóm khử và làm
tăng chậm độ nhớt của dung dòch cơ chất. Sự phân hủy polyuronide trong quá
trình chín không gây ra sự tích lũy galacturonic acid, và chỉ có endo-enzyme
PG là có liên quan.
Các endo-PG phân hủy pectic acid từ bên trong mạch, làm giảm nhanh
độ nhớt của dung dòch cơ chất. Tính đặc hiệu và kiểu tác dụng của endo-
enzyme được xác đònh bởi trạng thái của điểm hoạt động. Mức độ thủy phân
của endo-PG ở nấm men giảm cùng với sự giảm độ dài mạch cơ chất. Vò trí liên
kết của endo-PG ở Aspergillus niger được cấu thành từ 4 điểm và sự phân cắt
xảy ra giữa các điểm 1 và 2(H.6.9). Một cơ chất tetramer chòu sự phân cắt(3+1)
thành trigalacturonic acid galacturonic. Một cơ chất pentamer cho ra hai sản
phẩm phức tạp hơn, cả hai đều đáp ứng sự chiếm giữ hoàn toàn của 4 điểm liên
kết, tạo sự phân cắt (4+1) và (3+2). Cũng tương tự, đối với cơ chất là
hexagalacturonic acid, sản phẩm sẽ tạo thành lối phân cắt (5+1), (4+2) và
(3+3). Trigalacturonic acid bám vào điểm hoạt động để tạo thành các phức hợp
hữu ích hoặc không hữu ích. Liên kết hữu ích trong trường hợp này làm sinh ra
sự phân cắt (2+1). Liên kết không hữu ích được tạo thành khi ba đơn vò đơn lẽ
bám vào ba điểm 2, 3 và 4 là không hề tương tác với các nhóm xúc tác đònh vò
bên trong điểm 1 và 2. Cơ chất trong trường hợp này đóng vai trò là một chất ức
chế cạnh tranh (K = 0,67mM).
3.Pectate lyase:

Pectate lyase (PEL) là các enzyme VSV ngoại bào. Các enzyme của
giống Erwina và Bacillus được biết đến là tác nhân gây ra triệu chứng soft-rod
ở thực vật. Tuy nhiên, chúng cũng được tìm thấy phổ biến ở Aeromonas,
Pseudomonas, Xanthomonas, Aspergillus và Fusarium.
Erwinia chrysanthemi sinh ra các enzyme pectate lyase ở dạng
isoenzyme có thể được phân thành các nhóm trên cơ sở điểm đẳng điện của

chúng: acid (pH 4-5), trung hoà (pH 7-8,5) và kiềm (pH 9-10). Số lượng các
isoenzyme trong mỗi nhóm có thể thay đổi tùy theo loài. Đa số các loài được
nghiên cứu cho năm hay ít nhất bốn isoenzyme: một acid (PELA), hai trung
hoà (PELA và C), hai kiềm (PELD và E). Tất cả các isoenzyme này đều cần
Ca
++
để làm tăng độ hoạt động và có pH tối ưu 8-10. Các nghiên cứu trên
chủng EC16 cho thấy rằng tất cả 4 isoenzyme trên đều là endo-enzyme
(PELA(pI 4,2), PELA (pI 8,8), PELC (pI 9,0), và PELD (pI 10,0)). Các PEL
kiềm rất đặc hiệu trong việc gây ra sự giầm nước của các mô thực vật, tiếp theo
là các isoenzyme trung hoà, trái lại các PEL acid không gây ảnh hưởng gì.
Ở các chủng Erwinia carotovara, có ít nhất ba PEL được tiết ra, tất cả
đều có điểm đẳng điện ở pH kiềm: PELI (pI 9,7), PELII (pI 10,2), và PELIII (pI
10,35). Cả ba isoenzyme này đều có pH tối ưu là 9,0. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt
động của PELII và PELIII là 50 và 60
o
C, theo thứ tự. PELI có độ bền nhiệt
thấp. Ở chủng GIR726, có bốn loại endo-PEL isoenzyme với các điểm đẳng
điện ở các pH rất kiềm (10,0, 10,6, 10,3 và 10,9) và khối lượng phân tử nằm
trong khoảng từ 28-33 kD. pH tối ưu cho hoạt động là 9,3 cho PELII 9,5 cho
PELIV và 9,7 cho PEL I và III. Cũng như với các PEL từ các nguồn khác,
những isoenzyme này được kích hoạt bởi Ca
++
. Hoạt độ enzyme tăng 50-70%
khi có mặt của Ca
++
ồng độ 0,5mM. Isoenzyme với pI>10 chứa 2,5-4.8% đường
trung tính. Các PEL từ một số loài Bacillus cũng có khả năng gây ra sự giảm
nước ở mô thực vật.
IV. Các đặc tính kỹ thuật quan trọng của enzyme

pectinase:[ I ]


1. Pectinesterase:

Các PE ở thực vật tấn công vào hoặc đầu không khử hoặc gần với nhóm
carboxyl tự do và tiến dọc theo phân tử bằng cơ chế chuỗi đơn, tạo ra các khối
galacturonic acid không bò ester hoá rất mẫn cảm với calcium. Các cấu trúc
khác nhau của chuỗi galacturonan, chẳng hạn như các monomer acetyl hoá, các
nhóm ester bò chuyển đổi thành amide hay bò khử đến rượu bậc một, hay sự tồn
tại của các vùng có nhiều mạch nhánh, ức chế hoạt động của PE. PE có tính đặc
hiệu cao đối với nhóm methylester của polygalacturonic acid. Các ester khác
chỉ bò tấn công rất chậm, còn các nhóm methylester của polymanuronic acid thì
không hề bò tấn công. Tốc độ đề ester hoá trên mạch pectin phụ thuộc vào độ
dài của mạch; trimethyl trigalacturonate không bò tấn công. Các PE của nấm
khác với PE của thực vật theo cơ chế đa mạch, các nhóm mehtoxyl bò lấy đi
một cách ngẫu nhiên
.


2. Polygalacturonase
:

Việc xác đònh hoạt tính của enzyme này bằng cách đo độ nhớt của dung
dòch pectic acid gồm methylester và glycolester cho thấy sự giảm nhanh tốc độ
và mức độ thuỷ phân, đồng thới tăng mức độ ester hoá. Các nhóm acetyl có mặt
làm giảm mức độ thủy phân bằng cách giảm ái lực của các phân tử cơ chất qua
các khối chứa các điểm liên kết. Sự thủy phân bò hạn chế do sự có mặt của các
nhóm acetyl có thể được xác minh bằng cách sử dụng pectin củ cải đường làm
cơ chất. PG tạo bởi nấm có thể thủy phân đến 70% pectin bò acetyl hoá. Tuy

nhiên, kiểu tác dụng lên cơ chất của các PG có từ các nguồn khác nhau thì khác
nhau.
Cơ chất tốt nhất cho sự phân hủy của endo-pectin-lyase ở pH>7 là
pectin hoàn toàn bò ester hóa. Tuy nhiên,ở các giá trò pH nhỏ hơn, enzyme này
vẫn hoạt động đối với pectin bò ester hóa ít hơn, đồng thời cần Ca
++
để kích
hoạt. Điều này có ý nghóa thực sự đối với các quá trình chế biến trái cây.
Những enzyme này cần các nhóm methylester để hoạt động, trái lại chúng bò
bất hoạt khi có mặt các nhóm glycolester và các pectate bò amidate hóa.
3.Endo-pectate lyates
:

Trái lại, endo-pectate lyates không phân biệt methylester và glycolester
của pectic acid. Điều thú vò là pectate không phải là cơ chất tốt nhất cho vi
khuẩn PAL từ vi khuẩn. Chúng có hoạt độ cực đại (tốc độ ban đầu và mức độ
phân hủy) nên pectin có hàm lượng methoxyl thấp
.
4.Rhamno-galacturonase:

Gần đây, rhamno-galacturonase là enzyme được phát hiện có khả năng
phân cắt liên kết glucoside trong các vùng phân nhánh nhiều của phân tử
galacturonic rhamnose acid có trong pectin của quả táo với hoạt tính rất cao khi
những phân tử này bò đề ester hoá và arabinose bò lấy đi do bò thủy phân bởi
acid (vùng phân nhánh nhiều bò sửa chữa). Enzyme này có mặt trong các chế
phẩm thương mại của pectinase và chắc chắn phải được phân loại là pectinase.
Sản phẩm cuối là các oligomer có các đơn vò rhamnose và galacturonic acid,
trong đó rhamnose làm hình thành đầu không khử.
5. Pectinase thương mại:

Enzyme thương mại là các chế phẩm enzyme của nấm mốc, được điều
chế chủ yếu từ các loại Aspergillus. Chúng thường là hỗn hợp của các PE, PG
và Pl, hemicellulase và endo-β -glucanase (C-x-cellulase). Hoạt tính của ba
chế phẩm thương mại khác nhau được trình bày ở bảng 6.13. Các enzyme đều
được thu nhận từ nấm mốc được sử dụng để sản xuất chế phẩm pectinase, trừ
enzyme C-1-dellulase (cellobiohydrolase) là được thêm vào để chế phẩm đạt
được mục đích kỹ thuật. Enzyme arabinanase đóng vai trò rất quan trọng trong
quá trình chế biến nước ép trái cây.

Bảng 1:Hoạt tính riêng của các phức hợp đa enzyme trong các chế phẩm
pectinase được sản xuất từ nấm

Hoạt tính enzyme Cơ chất A B C
PG
PL
PE
Combined pectolytic
C-α-cellulase
C-l-cellulase
Arabanase: lineararabinan
Arabanase: branched arabinan

α-L-Arabinofuranosidase
Galactomannanase
Mannanase
Galactanase
Xylanase
Polygalacturonic acid
Pectin DE 90
Pectin DE 65

Pectin DE 75
CMC
A vicel
1-5-α-L-arabinan
1,3; 1,2; 1,5-α-L-
arabinan
PNP-Arabinofuranoside
Galactomannan
1,4-β-D-Mannan
1,4-β-D-Galactan
1,4-β-D-Xylan
1982

43
548
498
998
99
9
14
35
3
7
11
4
3314

53
448
290

180
1
10
14
37
4
0
58
0
1878

74
227
274
1228

22
16
16
333
9
0
91
2
Có một điều chắc chắn là kỹ thuật gen sẽ được sử dụng nhằm mục đích
sản xuất các chế phẩm enzyme, mở ra những khả năng mới cho các ứng dụng
công nghiệp của các chế phẩm enzyme này.
V. Thu nhận:[ I ]

Hiện nay, người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV. Có hai phương

pháp sản xuất pectinase
:
1.
Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt:


Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase thường là
cám gạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm. Nguồn dinh dưỡng bổ sung
thường là các muối ammonium, phosphoric… Độ ẩm môi trường phải nằm trong
khoảng 60%. Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 30
o
C và trong thời
gian 40h, sau đó giảm xuống 24
o
C và nuôi trong 48-52h. Sản phẩm lên men
được sấy khô thành chế phẩm enzyme thô và đem tinh chế.
Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô
phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối
ammonium sulfate. Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa enzyme pectinase có
thể là rượu ethanol (72,5-75%) hoặc isopropanol (55-57%). Muối ammonium
sulfat sử dụng có độ bảo hoà 0,79. Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm
enzyme thu được có độ tinh khiết khoảng 90%, còn nếu bằng muối thì độ tinh
khiết đạt khoảng 75%. Nhiệt độ kết tủa tối ưu với rượu là 2-5
o
C, thời gian tiếp
xúc với rượu càng ngắn càng tốt. Sau đó, ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dòch,
sấy kết tủa trong thiết bò sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và
đem bảo quản.
2. Thu nhận chế phẩm enzyme từ canh trường bề sâu:

Phương pháp hiếu khí: Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt
đầu khi sự phát triển của VSV gần đạt đến pha ổn đònh, khi môi trường bò acid
hoá mạnh và khi lượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn. pH của môi
trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7,2 là thích hợp. Đối với nấm mốc, pH kiềm
kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích lũy enzyme pectinase. pH=4 ức chế
hoàn toàn sự tích lũy enzyme pectinase. Khi pH dòch về phía acid, ngay cả khi
pH nằm trong khoảng 4,5-5,0, tuy sự tạo thành sinh khối không bò ảnh hưởng
nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bò kìm hãm. Tuy nhiên, pH của các
trường nuôi cấu A. niger và A. awamori 16 có thể dòch về 3,5-3,8 và 2,9-3,2,
theo thứ tự.
Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi và với hàm lượng
từ 2-10%. Đối với A. niger và A. awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ
sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử. Thời
gian ủ sơ bộ thường là38-42h. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%.
Trong quá trình nuôi cấy, hàm lượng các chất hoà tan trong môi trường thường
giảm từ 6% xuống còn 1,5-1,8%.
Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô
đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy
khô trên thiết bò sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào
phải đạt 165-180
o
C và đi ra đạt 60-70
o
C. Thời gian lưu của chế phẩm enzyme
trong thiết bò sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy
phải không quá 40
o
C. Chế phẩm thu được cần phải được đóng gói kín để tránh
hút ẩm. Có thể thu chết phẩm pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa enzyme
trong dòch lọc canh trường với ethanol theo tỉ lệ 4:1, với aceton theo tỉ lệ 2:1 và

isopropanol thưo tỉ lệ 1,3:1, hoặc với muối ammonium sulfate (50-80% trong
muối kết). Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào
khoảng 88-90% so với hoạt độ của dòch canh trường ban đầu. Nếu kết tủa bằng
muối ammonium sulfate, cần tách muối ra khỏi enzyme bằng phương pháp
thẩm tích (với nước hoặc dung dòch đệm), sau đó sấy khô. Khi độ bão hoà của
(NH
4
)
2
SO
4
bằng 0,5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp (đoạn
này chiếm 0,25% trọng lượng khô), nhưng nếu kết tủa bằng (NH
4
)
2
SO
4
có độ
bão hoà 1.0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0,11% nhưng lại có hoạt độ
pectinase cao.
Phương pháp yếm khí
Môi trường: Bã củ cải:2%; (NH
4
)
2
HPO
4
0,75%
KH

2
PO
4
:0,1%; CaCO3: 0,3%; nước chiết ngô: 0,5%
Clostridium pectinopermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một
cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời
với sự tích lũy sinh khối. Sự tích lũy enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn
đònh của sự sinh trưởng qua 55-60h. pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng là
6,5-7,0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bò ở dạng canh trường chứa bào
tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở
nhiệt độ 35
o
C.
Cl. Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase.
Thành phần môi trường gồm có: Lactose:2%; pectin củ cải:1%; (NH
4
)
2
HPO
4
:
0,4%; K
2
HPO
4
: 0,7%; KH
2
PO
4
:0,3%; NaCl:0,1%; MgSO

4
: 0,025%; FeSO
4
:
dạng vết; CaCO
3
: 0,5%; dòch nấm men tự phân: 0,05%; ascorbic acid: 0,5%.
Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dòch lọc canh trường bằng cách kết tủa
enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfate. Nếu kết tủa
bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dòch đã xử lí là: 6,5-6,8. Nếu kết tủa bằng
2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ của enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với
hoạt độ ban đầu.
Khi kết tủa bằng ammonium sulfate có độ bão hoà bằng 0,2 thì sẽ thu
được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase; khi độ bão hoà
là 0,9-1 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintranseliminase và
exopolygalacturonase.
Phương pháp hiện đại trong chuẩn bò chế phẩm enzyme pectinase
thường theo các bước cơ bản sau đây:
- Khử muối bằng phương pháp lọc gel(Biogel P100)
- Tách protein bằng phương pháp trao đổi anion (DEAE Biogel
A), hay trao đổi cation (CM Biogel A)
- Tách enzyme pectinase bằng alginate liên kết ngang
- Tinh sạch bằng FPLC.
Alginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởng
tónh điện và thay thế pectate liên kết ngang.


3. Ý nghóa về mặt kỹ thuật của các endo-enzyme
3.1-Pectinesterase: Ethanol có mặt trong phần chưng cất được từ thòt quả
lên men là do pectin methylester bò phân cắt bởi endo-enzyme PE. Trong suốt

quá trình lên men, ethanol được sinh ra và các đơn vò sản xuất cần phải thanh
trùng thòt quả trước khi lên men để nồng độ ethanol có mặt trong sản phẩm
không vượt quá giới hạn cho phép. Sự có mặt của PE trong trái cây họ citrus là
nguyên nhân gây ra các vấn đề cần được giải quyết trong công nghiệp thực
phẩm, tức là sự mất đi của các vết vẫn đục trong dòch ép. Nếu PE không bò ức
chế trực tiếp sau khi tách chiết dòch quả bằng cách bất hoạt bởi nhiệt hay làm
đông, các phân tử pectin sẽ bò đề ester hoá và sẽ bò đông tụ bởi sự có mặt của
các ion Ca
++
trong dòch ép. Để ngăn điều này, nước ép được tách thành phần
cặn và phần trong. Nếu nước ép quá đặc, gel pectate sẽ được hình thành và do
đó nước ép sẽ không được hoàn nguyên lại nữa. Những vấn đề này làm giảm
chất lượng sản phẩm một cách nghiêm trọng. Các chất tạo hương của trái cây
họ citrus cực kỳ mẫn cảm với nhiệt, vì thế các phương pháp sản xuất sản phẩm
trái cây đông lạnh đang rất cần thiết. Phức hợp của ion Ca
++
có thể ngăn ngừa
sự biến mất của các đám mây vẫn đục do hoạt động của PE, nhưng lại làm phát
sinh các vấn đề mang tính chất pháp lý. Polyphenol có thể ức chế hoạt động
của PE nhưng lai gây ảnh hưởng đến vấn đề cảm quan, chẳng hạn về vò trí và
tính đồng nhất của sản phẩm. PE đồng thời là một chất ức chế sản phẩm cuối,
nhưng nếu thêm pectic acid vào lại làm nước ép bò phân lớp, thế là lại tạo ra
một vấn đề không mong muốn khác. Tuy nhiên, việc thủy phân pectic acid, đến
mức polymer hoá 8-10, có ảnh hưởng ức chế của các chế phẩm polymer cao
phân tử nhưng lại không đông tụ với Ca
++
. Việc thêm các chế phẩm như thế sẽ
không ngăn ngừa được nhưng sẽ trì hoãn được quá trình tự phân lớp, có lẽ đủ
lâu để phân phối nhanh các loại nước ép trái cây tươi được làm tan giá. Một
khả năng khác là việc thêm các exo-enzyme (H.6.10): PG làm phân hủy pectin

có mức ester thấp hình thành trước khi sự đông tụ với Ca
++
xảy ra, hay PL phân
hủy các pectin trong nước ép trái cây đến các sản phẩm có khối lượng phân tử
thấp hơn, là các hợp chất không mẫn cảm với Ca
++
, dù là đề ester hoá và thực
tế cũng có thể hiện chức năng ức chế PE. Hoạt động phân hủy pectin bởi
enzyme như thế đã được ứng dụng trong việc làm giảm độ nhớt trong nước trái
cây, vì thế làm tăng nồng độ của các thành phần chất chiết đến các giá trò Brix
cao hơn như bình thường có thể. Cũng cần phải lưu ý việc sử dụng các giai đoạn
bay hơi nhiều lần nhằm tối ưu hoá quá trình xử lý nhiệt và khôi phục hương vò
sản phẩm, kết hợp với việc bảo quản trong điều kiện đông lạnh và vận chuyển
sản phẩm nước ép cô đặc giúp tránh được phần lớn PE bò bất hoạt do tác động
của nhiệt độ.Tuy nhiên, đối với các nước đang phát triển, vẫn đang tồn tại vấn
đề này trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây họ citrus và các loại nước
ép vẩn đục khác có hoạt lực PE cao và các chất tạo hương rất mẫn cảm với
nhiệt, chẳng hạn như ổi và xoài.
Các PE được phân lập từ cam có hình thức khác nhau và có ái lực khác
nhau đối với pectin và pectate. Mặt khác, chúng cũng khác nhau về độ bền
nhiệt, và cũng dễ hiểu rằng chúng đóng vai trò khác nhau trong hiện tượng làm
trong dòch quả ép. Một loại được phân biệt bởi khối lượng phân tử của nó rất
cao, chỉ chiếm khoảng 5% hoạt tính toàn phần và mang một số đặc điểm nổi
bật. Loại này bền nhiệt và vì thế đóng vai trò chính yếu trong việc làm trong
dòch quả ép đã thanh trùng với lượng nhiệt không đủ. Enzyme này cũng hoạt
động ở nhiệt độ thấp và pH thấp và do đó được coi là có vai trò quan trọng
trong quá trình tự tách lớp của nước chanh trong và nước ép từ quả chanh thu
được bằng cách để lắng nước ép trong tank có chất bảo quản là sulfur dioxide.
Những dòch trong từ quả ép như thế vẫn đang là những sản phẩm có giá trò
thương mại được sản xuất với việc ứng dụng các chế phẩm pectinase thương

mại.
Trong số hai isoenzyme trong bảng 6.13, chỉ có isoenzyme PE loại I có
khả năng làm tách lớp. PE loại II không có khả năng này; lượng methanol tự do
được thoát ra ít hơn so với methanol tạo ra bởi các enzyme tách lớp. Bảng 6 cho
thấy khả năng ức chế rất cao của pectate có lẽ đã ức chế sự hoạt động của
enzyme ở một mức nhất đònh trong quá trình ester hoá. nh hưởng này được
tăng lên bởi sự đóng góp của các nhóm acid tạo thành. Hình 6.11 cho thấy, nếu
thêm PG vào thì khối pectate lại bò phân hủy tiếp và trên thực tế tốc độ phản
ứng mà tại đó methanol tự do hình thành trong nước cam ép có PE hoạt động
được tăng lên bởi PG. Các sự khác nhau về mặt động học như thế cũng có thể
giải thích tính ức chế không hoàn toàn bởi oligogalacturonate. Một loại PE
khác trong nước cam ép không gây ra sự tự phân lớp, thậm chí ngay cả sau khi
giải phóng một lượng methanol bằng với lượng methanol mà PE phóng thích.
Các kiểu tấn công của enzyme phải được giả đònh sao đó để pectin với hàm
lượng ester thấp được sinh ra mà có tính mẫn cảm với Ca
++
giảm đi, có lẽ bởi sự
phân bố ngẫu nhiên của các nhóm carboxyl tự do. Cơ chế này thường thấy ở
các PE của nấm, chẳng hạn như ở A. japonicus, enzyme này được sử dụng để
sản xuất pectin có mức ester hoá thấp dùng trong chế biến mức ít đường.
Những pectin như vậy thường được sản xuất nhờ quá trình thủy phân nhờ acid.
Pectinesterase của nấm cũng được sử dụng để tách lớp rượu táo Pháp. Hai
isoenzyme với đặc tính làm tách lớp nước cam này được tìm thấy trong tất cả
các thành phần của quả cam. Có đến 12 loại PE được tìm thấy trong quả cam
trồng và các loại quả họ citrus khác và chúng được tách trên cơ sở ái lực của
chúng đối với pectate. Điều cần chú ý là hoạt động của các PE bò ức chế bởi
nồng độ cao của đường để tạo nước ép cô đặc đến 60
o
Bx, tại đó các enzyme
này không hoạt động nhưng lại có thể hoạt động sau khi hoàn nguyên (pha

loãng trong nước).
Hiện tượng đông tụ với calcium của pectin bò đề ester hoá bởi PE được
khai thác khi sấy khô vỏ trái cây họ citrus sau khi ép làm thức ăn cho gia súc.
Chất vữa calcium hydroxide được thêm vào khối vỏ trong khi nghiền để đưa pH
ve giá trò trung tính hay cao hơn. pH cao, và nồng độ ion Ca
++
cao, làm kích
hoạt PE, quá trình đề ester hoá xảy ra nhanh và sự đông tụ của pectate với
calcium xảy ra. Chất lỏng được tiết ra và được ép, để chỉ có một phần ít nước
còn lại cần được loại bỏ nhờ quá trình sấy bởi nhiệt. Phần nước ép có thành
phần tương tự như nước ép từ quả được cô thành mật và cũng được làm thức ăn
cho gia súc. Dó nhiên, vỏ trái cây họ citrus khô được sử dụng làm nguyên liệu
thô để trích chiết pectin, do đó cần phải ngăn chăn hoạt tính của PE bằng cách
tẩy trắng vỏ ngay lập tức, nếu không, pectin được chiết ra, cho dù bò đề ester
hoá ít thôi, sẽ chứa các khối galacturonic acid tự do và sẽ rất mẫn cảm với Ca
++

và vì vậy không sử dụng được để làm yếu tố tạo đông.
Endo-PE cũng được khai thác để bảo vệ và cải tạo kết cấu và độ chắc
của nhiều loại rau quả chế biến, như táo cắt lát, cà chua đóng hộp, súp lơ, cà
rốt, khoai tây và đậu. Quá trình làm trắng ở nhiệt độ thấp, thời gian dài kích
hoạt PE, làm cho pectin bò đề ester hoá một phần, sau đó pectin bò đề ester hoá
này phản ứng với Ca
++
, tạo nên sự kết dính nội bào mạnh hơn.
Sự kích thích mạnh hơn đối với PG và mạnh hơn trong thí nghiệm b,
trong đó enzyme, esterase bò ức chế mạnh hơn bởi sản phẩm cuối so với trong
thí nghiệm a. Rõ ràng PL (----) không phân hủy được các vùng ức chế đề ester
hoá nên không có ảnh hưởng gì.

3.2-Pectinesterase và polygalacturonase:
Hai enzyme này có mặt cùng nhau rất nhiều trong cà chua, có ảnh
hưởng rất lớn trong quá trình chế biến cà chua. Việc gây bất hoạt các enzyme
này bởi nhiệt ngay lập tức là cần thiết để có được nước ép có độ nhớt cao như
người tiêu dùng mong muốn hay nước ép dạng paste, sử dụng làm nước chấm,
soup, nước sốt cà chua nấm và một số sản phẩm tương tự. Những loại nước quả
này được xử lý nhiệt trong một thiết bò đặc biệt mà trong đó cà chua được
nghiền trực tiếp thành cà chua nóng dạng nhão. Rõ ràng, quá trình xử lý nhiệt
tạo ra một số các hương vò đặc trưng cho sản phẩm cà chua chế biến. Trong
trường hợp các thành phần cà chua được sử dụng để tạo màu và hương vò, còn
phần chính của sản phẩm là do các thành phần khác, như tinh bột tạo nên thì
nguyên liệu nước ép phải ở trạng thái nguội hơn, đồng thời phải có một thời
gian nghỉ giữa hai giai đoạn nghiền ép và xử lý nhiệt để pectin có thể bò phân
hủy nhiều hơn nhờ tác động kết hợp của PG và PE. Còn trong những trái cà
chua được cải tạo gen để giảm hàm lượng PG, phần rắn và độ chắc cũng như độ
nhớt của quả được tăng lên.
3.3-Hoạt tính pectinase từ nguồn VSV gây nhiễm
PG từ nấm men và PAL từ vi khuẩn cùng với các endo-PE đều có liên
quan đến quá trình làm chín dưa chuột và ô liu ngâm trong nước muối. Sự hao
hụt về chất lượng này có thể tránh được bằng cách sử dụng các chất ức chế,
chẳng hạn như các polyphenol rò rỉ ra từ lá nho vào trong nước muối. Nước
muối có thể được sử dụng để thanh trùng nấm mốc bền nhiệt Byssochlamys
fulva. Nấm mốc này sinh enzyme làm hỏng dâu tây trong sirô (syrup) hay mứt.
Một loại PG bền nhiệt có từ loài Rhizobium có thể làm hỏng kết cấu của thòt
quả mơ đóng hộp. Sự nhiễm nấm có thể gây ra hiện tượng tách lớp của nước
cam vô khuẩn và đã đóng chai, không rõ là do tác động của PE, PG hay cả hai,
nhưng một lượng lớn methanol tự do được tìm thấy trong loại nước quả phân lớp
này. PG nấm men có thể phân hủy pectin trong quá trình lên men bột táo
nghiền, làm cho bã táo bò mất đi một lượng lớn pectin nếu được đem làm
nguyên liệu thô để sản xuất pectin.

Lên men cà phê và cacao là một lónh vực ứng dụng nhiều triển vọng của
enzyme pectinase có từ nguồn VSV. Trong quá trình len men, lớp chất nhầy
xung quanh các hạt này bò phân hủy nhanh hơn và bò rửa khỏi hạt trước khi hạt
được sấy khô. Một ứng dụng khác là sự tạo hương đặc biệt cho sản phẩm rượu
do sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc nhiễm vào trái nho
chín có hàm lượng đường cao bằng cách đâm thủng vỏ trái nho và để nước
trong nho bay hơi, và để nho bò nhiễm nấm.