Tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất tubulysin

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

LÊ VĂN HẢI

TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG
THƢ CỦA CÁC DẪN XUẤT TUBULYSIN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI, 2020


ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

LÊ VĂN HẢI

TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG
THƢ CỦA CÁC DẪN XUẤT TUBULYSIN
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HOÁ HỮU CƠ
MÃ SỐ: 9 44 01 14

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Trần Văn Lộc
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học 2: TS. Trần Văn Chiến

HÀ NỘI, 2020


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và các cộng sự.
Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực, các kết quả mới của luận án
chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào khác.

Hà Nội, ngày

tháng 10 năm 2020

Tác giả luận án

Lê Văn Hải

ii

LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trần Văn Lộc
và TS. Trần Văn Chiến, ngƣời đã giao đề tài và tận tình hƣớng dẫn tôi thực hiện
luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn GS. TSKH. Trần Văn Sung, PGS. TS. Nguyễn
Quyết Chiến, TS. Trần Thị Phƣơng Thảo đã cho tôi những góp ý hữu ích trong thời
gian học tập và thực hiện luận án. Xin cảm ơn các cán bộ phòng Tổng hợp Hữu cơViện Hóa học đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm của luận án.
Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện Hóa học, Ban lãnh đạo Học viện Khoa
học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, cán bộ Viện
Hóa học, cán bộ phòng Đào tạo - Học viện Khoa học và Công nghệ, đã tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án. Xin cảm ơn quỹ
phát triển Khoa học và Công nghệ quốc gia (Nafosted) đã tài trợ cho nghiên cứu
này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Bố mẹ, anh chị em của tôi, đã hỗ trợ
và động viên tôi hoàn thành luận án này. Xin cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn
cổ vũ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu.
Và cuối cùng, luận án này không thể hoàn thành nếu không có sự đồng hành
của Vợ và các con tôi. Xin dành sự biết ơn sâu sắc và trân quý nhất đến Vợ tôi,
ngƣời đã luôn hỗ trợ và chia sẻ cùng tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Hà Nội, ngày

tháng 10 năm 2020
Tác giả

Lê Văn Hải

iii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................
ii
MỤC LỤC ....................................................................................................................
iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...............................................
vi
viii
DANH MỤC CÁC BẢNG ..........................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH ...........................................................................................
ix
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ .........................................................................................
xi
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 3
1.1. NIÊM KHUẨN, CÁC HOẠT CHẤT VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC .................. 3
1.1.1. Niêm khuẩn ....................................................................................................... 3
1.1.2. Một số hoạt chất và hoạt tính sinh học từ niêm khuẩn ..................................... 3
1.2. VI ỐNG VÀ VAI TRÒ TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC ..................................8
1.2.1. Vi ống (microtube) ............................................................................................ 8
1.2.2. Tác dụng ức chế trùng hợp vi ống..................................................................... 9
1.3. TUBULYSIN ..................................................................................................... 10
1.3.1. Phân lập và xác định cấu trúc .......................................................................... 10
1.3.2. Hoạt tính sinh học của các tubulysin .............................................................. 12
1.3.3. Sinh tổng hợp các tubulysin ............................................................................ 15
1.4. TỔNG HỢP CÁC ɤ -AMINO ACID CỦA TUBULYSIN ..................................17

1.4.1. Tổng hợp tubuvaline (Tuv) ............................................................................. 17
1.4.2. Tổng hợp tubuphenylalanine (Tup) ................................................................ 20
1.5. TƢƠNG QUAN GIỮA CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC
DẪN XUẤT TUBULYSIN ............................................................................... 23
1.6. MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN ............................................................................. 28
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM............. 29
2.1. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 29
2.1.1. Phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ ........................................................................ 29
2.1.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ ............................................ 29
2.1.3. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ............................................. 30


iv

2.2. THỰC NGHIỆM ................................................................................................ 31
2.2.1. Hóa chất và dung môi ..................................................................................... 31
2.2.2. Sơ đồ tổng quát tổng hợp các tetrapeptide ...................................................... 31
2.2.3. Tổng hợp tubuphenylalanine ........................................................................... 32
2.2.4. Tổng hợp tubuvaline ....................................................................................... 35
2.2.5. Loại bỏ nhóm bảo vệ Boc của Tuv (79) và Tup (47a) .................................... 42
2.2.6. Tổng hợp dipeptide ......................................................................................... 43
2.2.7. Tổng hợp tripeptide. ........................................................................................ 45
2.2.8. Tổng hợp các dẫn xuất tubulysin .................................................................... 48
2.2.9. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin............................................................. 52
2.2.10. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất và chất tƣơng tự
tubulysin ........................................................................................................ 65
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 66
3.1. ĐỊNH HƢỚNG TỔNG HỢP TUBULYSIN VÀ DẪN XUẤT .......................... 66
3.2. TỔNG HỢP TUBUPHENYLALANINE ........................................................... 67
3.3. TỔNG HỢP TUBUVALINE ............................................................................. 72

3.3.1. Tổng hợp 2-bromo-4-((tert-butyldimethylsilyloxy)methyl)thiazole (14) ....... 73
3.3.2. Tổng hợp N-methyltubuvaline-OMe (79) ....................................................... 76
3.4. LOẠI BỎ NHÓM BẢO VỆ BOC CỦA TUV VÀ TUP ..................................... 84
3.5. TỔNG HƠP DIPEPTIDE ................................................................................... 85
3.6. TỔNG HỢP TRIPEPTIDE ................................................................................. 89
3.6.1. Tổng hợp tripeptide 88 .................................................................................... 89
3.6.2. Tổng hợp tripeptide 89 .................................................................................... 90
3.6.3. Tổng hợp tripeptide 90, 90b ............................................................................ 92
3.6.4. Tổng hợp các tripeptide 91, 92........................................................................ 94
3.7. TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT TUBULYSIN .................................................. 96
3.8. TỔNG HỢP CÁC CHẤT TƢƠNG TỰ TUBULYSIN ...................................... 99
3.8.1. Tổng hợp chất tƣơng tự tubulysin với thay thế isoleucine bằng leucine ........ 99
3.8.2. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu Nterminal ......................................................................................................... 101
3.8.3. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu Cterminal ......................................................................................................... 105


v

3.8.4. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu N- và Cterminal ......................................................................................................... 108
3.9. HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÁC DẪN XUẤT VÀ CHẤT TƢƠNG
TỰ TUBULYSIN ............................................................................................. 117
KẾT LUẬN ............................................................................................................ 121
ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN ................................................................................ 122
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ........................................... 123
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 124


vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Các phƣơng pháp phổ và sắc ký
Thin Layer Chromatography: Sắc ký bản mỏng
High resolution electrospray ionization mass spectrometry: Phổ
ESI-HRMS
khối phân giải cao ion hóa phun điện tử
Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng
1
H-NMR
hƣởng từ hạt nhân proton
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Phổ cộng
13
C-NMR
hƣởng từ hạt nhân carbon 13
DEPT
Distortioless Enhancement by Polarisation Transfer: Phổ DEPT
Rotational Frame Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy: Phổ
ROESY
hiệu ứng Overhauser hạt nhân khung xoay.
s: singlet; d: doublet; t: triplet; q: quartet; qui: quintet; m: multiplet;
dd: double doublet; br: broad; td: triplet of doublets; dt: doublet of triplets
TLC

Các dòng tế bào ung thƣ
HL-60
MCF-7
A549
HT29
SW480

Human leukemia cell line: Tế bào ung thƣ bạch cầu ngƣời

Human mammary adenocarcinoma cell: Tế bào ung thƣ vú
Bronchogenic carcinoma cell lines: Tế bào ung thƣ phế quản
Human colorectal adenocarcinoma: Tế bào ung thƣ ruột kết
Human colon carcinoma: Tế bào ung thƣ đại tràng ở ngƣời

Các chữ viết tắt khác
CTPT
tub
Tuv
Tup
Mep
TBSCl
DIPEA
IC50
r.t
DMF
THF
EtOAc
Me
TEA
TFA
eq
DMAP
HATU

Công thức phân tử
Tubulysin
Tubuvline
Tubuphenylalanine
N-methylpipecolic acid

tert-Butyldimethylsilyl chloride
N,N-Diisopropylethylamine
The half maximal inhibitory concentration: Nồng độ tác dụng ức
chế 50% sự tăng sinh dòng tế bào thử nghiệm
Room temperature: nhiệt độ phòng
N,N-Dimethylformamide
Tetrahydrofuran
Ethylacetate
Methyl
Triethylamine
Trifluoroacetic acid
Equivalent: Đƣơng lƣợng
4-Dimethylaminopyridine
N-[(Dimethylamino)-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridin-1ylmethylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate Noxide


vii

Ac
h
HBTU
DCM
TIPS
Boc
IBX
NRPS
PKS

Acetyl
Giờ

(2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
hexafluorophosphate
Dichloromethane
Triisopropylsilane
tert-Butyloxycarbonyl
2-Iodoxybenzoic acid
Enzym nonribosomal peptide synthetases
Enzym polyketide synthase


viii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Khả năng ức chế phát triển tế bào ung thƣ của các tubulysin…….. 13
Bảng 1.2: Ức chế sự phát triển tế bào ung thƣ của tub A,D…………………. 14
Bảng 1.3: Độc tính tế bào của tubulysin A và D………………………...........14
Bảng 1.4: Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất 56-59……………………....... 24
Bảng 1.5: Hoạt tính gây độc tế bào của các tubugi………………………....... 25
Bảng 1.6: Độc tính tế bào của các dẫn xuất tub 63, 64……………………..... 25
Bảng 1.7: Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tub 65……………………...... 26
Bảng 1.8: Các dẫn xuất thế đầu C của tub 66……………………………....... 26
Bảng 1.9: Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất 67………………………........ 27
Bảng 3.1: Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất và chất tƣơng tự
119
tubulysin tổng hợp đƣợc ……….…………………………………


ix

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 : Một số hình thể dạng quả đa bào của niêm khuẩn……………... 3
Hình 1.2 : Một số cấu trúc macrolide từ niêm khuẩn……………………… 5
Hình 1.3 : Một số cấu trúc liên hợp thuốc- kháng thể của tubulysin……… 6
Hình 1.4 : Một số cấu trúc peptide từ niêm khuẩn………………………… 7
Hình 1.5 : Cấu trúc hóa học của eliamide và ratjadone …………………... 7
Hình 1.6 : Quá trình hình thành vi ống…………………………………….. 8
Hình 1.7 : Vi ống trong quá trình phân bào………………………………... 9
Hình 1.8 : Vùng liên kết của các tác nhân trên vi ống……………………... 10
Hình 1.9 : Chuỗi amino acid của tub A and D…………………………….. 11
Hình 1.10: Công thức hóa học của các tubulysin thiên nhiên……………… 12
Hình 1.11: Các dẫn xuất tub 56-59…………………………………………. 24
Hình 1.12: Các dẫn xuất tubugi…………………………………………….. 25
Hình 1.13: Các dẫn xuất tub 63, 64………………………………………… 25
Hình 1.14: Các dẫn xuất 65 ………………………………………………... 26
Hình 1.15: Các dẫn xuất tub 66 ……………………………………………. 26
Hình 1.16: Các dẫn xuất 67 ………………………………………………... 27
Hình 1.17: Tƣơng quan hoạt tính - cấu trúc của tubulysin ……………….. 27
Hình 3.1 : Phổ 1H-NMR hợp chất 42 ……………………………………... 70
Hình 3.2 : Phổ 1H-NMR hợp chất 47a ……………………………………. 72
Hình 3.3 : Phổ 1H-NMR hợp chất 70 ……………………………………... 74
Hình 3.4 : Phổ 1H-NMR hợp chất 14 ……………………………………... 76
Hình 3.5 : Phổ 1H-NMR Weinreb amide 22a …………………………….. 78
Hình 3.6 : Phổ 1H-NMR hợp chất 74 ……………………………….......... 79
Hình 3.7 : Phổ 1H-NMR hợp chất 15a …………………………………… 81
Hình 3.8 : Phổ 1H-NMR hợp chất 78 ……………………………………... 83
Hình 3.9 : Phổ 1H-NMR hợp chất 83 ……………………………………... 83
Hình 3.10: Phổ 1H-NMR hợp chất 81 …………………………………….. 85
Hình 3.11: Phổ 1H-NMR hợp chất 84 ……………………………………... 87

Hình 3.12: Phổ 1H-NMR hợp chất 85 ……………………………………... 88


x

Hình 3.13: Phổ 1H-NMR hợp chất 88 …………………………………….. 90
Hình 3.14: Phổ 1H-NMR hợp chất 89 ……………………………………... 92
Hình 3.15: Phổ 1H-NMR hợp chất 90 ……………………………………... 93
Hình 3.16: Phổ 13C-NMR hợp chất 90 …………………………………….. 94
Hình 3.17: Phổ 1H-NMR hợp chất 91 ……………………………………... 95
Hình 3.18: Phổ HRMS hợp chất 95 ……………………………………….. 97
Hình 3.19: Phổ 1H-NMR hợp chất 95 ……………………………………... 97
Hình 3.20: Phổ 13C-NMR hợp chất 95 …………………………………….. 98
Hình 3.21: Phổ 1H-NMR hợp chất 96……………………………………… 100
Hình 3.22: Phổ 1H-NMR hợp chất 97 ……………………………………... 102
Hình 3.23: Phổ 1H-NMR hợp chất 100 ……………………………………. 104
Hình 3.24: Phổ 13C-NMR hợp chất 100 …………………………………… 105
Hình 3.25: Phổ 1H-NMR hợp chất 102 ……………………………………. 106
Hình 3.26: Phổ 1H-NMR hợp chất 104 ……………………………………. 108
Hình 3.27: Phổ 1H-NMR hợp chất 105 ……………………………………. 109
Hình 3.28: Phổ 13C-NMR hợp chất 105 …………………………………… 110
Hình 3.29: Phổ 1H-NMR hợp chất 106 ……………………………………. 111
Hình 3.30: Phổ 1H-NMR hợp chất 107 ……………………………………. 112
Hình 3.31: Phổ 1H-NMR hợp chất 108 …………………………………… 113
Hình 3.32: Phổ 1H-NMR hợp chất 109 ……………………………………. 115
Hình 3.33: Phổ MS hợp chất 110…………………………………………... 116
Hình 3.34: Phổ 1H-NMR hợp chất 110…………………………………….. 116
Hình 3.35: Các dẫn xuất và chất tƣơng tự tubulysin tổng hợp đƣợc ………. 118

xi

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 1.1 : Quá trình sinh tổng hợp tubulysin trong niêm khuẩn…………… 16
Sơ đồ 1.2 : Tổng hợp N,N-Boc, Me-tubuvaline theo Colombo và Wipf……. 18
Sơ đồ 1.3 : Tổng hợp N-Boc-tubuvaline-OMe theo DÖ mling………………. 18
Sơ đồ 1.4 : Tổng hợp N,N-Boc-tubuvaline theo Raghavan ………………… 19
Sơ đồ 1.5 : Tổng hợp N,N-Boc,Me-tubuvaline theo Nicolaou……………… 19
Sơ đồ 1.6 : Tổng hợp dẫn xuất N-Cbz-tubuvaline-OEt (36) theo Wipf…….. 20
Sơ đồ 1.7 : Tổng hợp Tubutyrosine hydrochloride theo Pando…………….. 21
Sơ đồ 1.8 : Tổng hợp Tup-OTBDPS theo Wipf…………………………….. 21
Sơ đồ 1.9 : Tổng hợp Tup-OH*HCl theo Muller……………………………. 22
Sơ đồ 1.10: Tổng hợp Tup-OH*HCl theo Zanda……………………………. 22
Sơ đồ 1.11: Tổng hợp Tup-OH*HCl theo Tamure…………………………... 23
Sơ đồ 2.1 : Sơ đồ tổng quát tổng hợp các tetrapeptide……………………… 32
Sơ đồ 3.1 : Định hƣớng tổng hợp tubulysin…………………………………. 67
Sơ đồ 3.2 : Tổng hợp ester 42 ………………………………………………. 68
Sơ đồ 3.3 : Cơ chế tạo thành chất 42 ……………………………………….. 69
Sơ đồ 3.4 : Phản ứng tổng hợp Tup 47a …………………………………….. 71
Sơ đồ 3.5 : Sơ đồ tổng hợp ngƣợc của Tuv 79…………………………….... 73
Sơ đồ 3.6 : Tổng hợp dẫn xuất thiazole 14 …………………………………. 73
Sơ đồ 3.7 : Cơ chế tạo thành chất 70 ………………………………………... 75
Sơ đồ 3.8 : Phản ứng gắn mạch giữa Weinred amide và 2-bromothiazole…. 75
Sơ đồ 3.9 : Tổng hợp Weinreb amide 73 …………………………………… 77
Sơ đồ 3.10: Cơ chế tạo thành hợp Weinreb amide 22a ……………………… 77
Sơ đồ 3.11: Phản ứng tổng hợp ketone 74 …………………………………... 79
Sơ đồ 3.12: Cơ chế tạo thành hợp chất 74 …………………………………... 80
Sơ đồ 3.13: Phản ứng tổng hợp tuv 15a ……………………………………... 80
Sơ đồ 3.14: Phản ứng tổng hợp chất 79 ……………………………………... 82

Sơ đồ 3.15: Loại bỏ nhóm bảo vệ Boc của hợp chất 42, 47a, 79 …………… 84
Sơ đồ 3.16: Phản ứng tổng hợp tripeptide từ dipeptide 78………………….. 86
Sơ đồ 3.17: Quy trình tổng hợp dipeptide 84, 85, 86 ……………………….. 87


xii

Sơ đồ 3.18: Phản ứng tổng hợp tripeptide 88 ……………………………….. 89
Sơ đồ 3.19: Phản ứng tổng hợp tripeptide 89………………………………… 91
Sơ đồ 3.20: Phản ứng tổng hợp tripeptide 90, 90b ………………………….. 92
Sơ đồ 3.21: Phản ứng tổng hợp các tripeptide 91, 92 ……………………….. 94
Sơ đồ 3.22: Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất 93, 93a, 94, 95……………….. 96
Sơ đồ 3.23: Phản ứng tổng hợp dẫn xuất 93 từ tripeptide 88………………… 99
Sơ đồ 3.24: Phản ứng tổng hợp hợp chất 96 ………………………………… 100
Sơ đồ 3.25: Phản ứng tổng hợp các hợp chất 97, 98 ………………………… 102
Sơ đồ 3.26: Phản ứng tổng hợp hợp chất 99 ………………………………… 103
Sơ đồ 3.27: Phản ứng tổng hợp hợp chất 100, 101…………………………... 103
Sơ đồ 3.28: Phản ứng tổng hợp hợp chất 102, 103 ………………………….. 106
Sơ đồ 3.29: Phản ứng tổng hợp hợp chất 104………………………………... 107
Sơ đồ 3.30: Phản ứng tổng hợp hợp chất 105, 106 ………………………….. 109
Sơ đồ 3.31: Phản ứng tổng hợp hợp chất 107 ……………………………….. 111
Sơ đồ 3.32: Phản ứng tổng hợp hợp chất 108 ……………………………….. 113
Sơ đồ 3.33: Phản ứng tổng hợp tetrapeptide 109 ……………………………. 114
Sơ đồ 3.34: Phản ứng tổng hợp dẫn xuất 110 ……………………………….. 115


1

MỞ ĐẦU
Các hợp chất thiên nhiên đƣợc xem là nguồn cung cấp vô hạn các lớp chất có

hoạt tính sinh học lý thú phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng trong y học. Sự
phong phú và đa dạng về các lớp khung chất có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt là
cơ chế tác dụng của mỗi lớp khung chất này, đã thu hút đƣợc sự quan tâm của các
nhà nghiên cứu từ trƣớc đến nay. Cho đến nay, việc nghiên cứu các hoạt chất từ các
nguồn vi sinh vật đã và đang thu đƣợc các kết quả tốt trong việc phát triển thuốc.
Các nghiên cứu từ vi khuẩn cho thấy, niêm khuẩn cung cấp số lƣợng đáng kể các
hoạt chất có hoạt tính sinh học (chiếm khoảng 5%) [1-4]. Với lƣợng lớn các chất thể
hiện hoạt tính kháng tế bào ung thƣ mạnh, trong đó một số hoạt chất đã đƣợc phát
triển thành thuốc ứng dụng trong điều trị bệnh ung thƣ nhƣ epothilone và một số
dẫn xuất [5,6]. Tuy nhiên, một trong các hạn chế từ lớp niêm khuẩn là các hoạt chất
đều chứa hàm lƣợng rất nhỏ, không đáp ứng đƣợc nhu cầu của việc nghiên cứu
chuyên sâu. Do đó để phục vụ cho mục đích nghiên cứu phát triển thuốc, các hợp
chất từ các nguồn vi sinh vật này thƣờng đạt đƣợc bằng cách tổng hợp toàn phần
hoặc sẽ đƣợc biến đổi về cấu trúc hóa học nhằm tạo ra lƣợng lớn sản phẩm cũng
nhƣ các dẫn xuất mới.
Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào sàng lọc, phát triển các lớp
chất có hoạt tính gây độc tế bào cao, nhằm phát triển các thuốc kháng ung thƣ. Cho
đến nay các hoạt chất can thiệp vào chu trình của tế bào, quá trình hình thành hoặc
phân rã của vi ống, đã cho hiệu quả cao trong hóa trị liệu ung thƣ. Điều này do vai
trò đặc biệt quan trọng của vi ống cho sự sống của tế bào ung thƣ, giữ vai trò thiết
yếu cho sự phát triển và phân bào, duy trì hình thái học và có thể gây cảm ứng dẫn
đến chết tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) [7,8]. Do vậy, các nghiên cứu phát
triển thuốc dựa trên đích là vi ống hứa hẹn nhiều triển vọng với hiệu quả tốt.
Tubulysin là một lớp chất tetrapeptide, đƣợc phân lập lần đầu tiên năm 2000
từ 2 dòng niêm khuẩn là Angiococcus disciformis An d48 và Archangium gephyra
Ar 315 [9]. Các nghiên cứu đã cho thấy tubulysin là lớp chất kháng phân bào tốt
nhất đƣợc biết đến cho tới nay. Hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ của các tubulysin
thể hiện trong phạm vi rộng trên nhiều dòng tế bào ung thƣ ngƣời nhƣ: ung thƣ
buồng trứng, ung thƣ vú, ung thƣ tuyến tiền liệt, ruột kết, phổi và ung thƣ máu
[10,11].

2

Nghiên cứu trong ống nghiệm (in vitro) và cơ thể sống (in vivo) cho thấy các
tubulysin có độc tính với tế bào ung thƣ cao, giá trị IC50 trên một số dòng tế bào ung
thƣ từ vài chục picomol đến vài nanomol. Tubulysin ức chế sự phát triển tế bào u
vƣợt trội khoảng 20-1000 lần so với các thuốc chống ung thƣ đang sử dụng nhƣ
vinblastine, epothilone hay taxol [10,12].
Các tubulysin thể hiện hoạt tính gây độc tế bào qua cơ chế ức chế trùng hợp
vi ống, dẫn đến bắt giữ phân bào (G2/M) và gây chết tế bào theo chƣơng trình
[10,13].
Theo đánh giá của các nhà hóa dƣợc, tubulysin thiên nhiên là hợp chất hàng
đầu cho nghiên cứu và phát triển thuốc chống ung thƣ mới. Tuy nhiên, hàm lƣợng
của chúng trong niêm khuẩn rất thấp, do đó hƣớng nghiên cứu tổng hợp toàn phần
các tubulysin và các dẫn xuất của chúng là rất cần thiết và có ý nghĩa khoa học.
Đề tài “Tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất
tubulysin” tiến hành nghiên cứu tổng hợp toàn phần các dẫn xuất và chất tƣơng tự
tubulysin mới dựa trên biến đổi hóa học của các amino acid ở đầu N- và C-terminal,
thay thế nhóm N,O- acetyl bằng nhóm methyl. Nhằm góp phần làm sáng tỏ tƣơng
quan giữa hoạt tính và cấu trúc hóa học của lớp chất tubulysin, đồng thời tìm kiếm
những hợp chất mới có hoạt tính sinh học đáng chú ý.


3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. NIÊM KHUẨN, CÁC HOẠT CHẤT VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
1.1.1. Niêm khuẩn
Niêm khuẩn (vi khuẩn nhớt) là nhóm vi khuẩn gram âm thuộc bộ

δ-proteobacteria, sống chủ yếu trong đất, xác thực vật, phân động vật và trong môi
trƣờng biển. Hầu hết các loài niêm khuẩn có các biểu hiện khác biệt về hình dạng so
với các vi khuẩn khác là khả năng tập hợp lại với nhau để tạo thành kiểu hình thể
dạng quả đa bào phức tạp trong điều kiện thiếu thức ăn (Hình 1.1) [1-3].
Đặc tính sinh học nổi bật của niêm khuẩn là khả năng tạo ra các lớp chất
chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học lý thú. Đến nay, đã có hơn 500 hợp chất,
dựa trên 100 cấu trúc khung cơ sở khác nhau đã đƣợc phân lập và xác định cấu trúc
hóa học. Các hợp chất này đều thể hiện các hoạt tính sinh học đa dạng nhƣ: hoạt
tính kháng nấm, kháng khuẩn, gây độc tế bào, kháng vi-rút, ức chế miễn dịch và
chống oxy hóa. Trong đó hoạt tính gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thƣ
thể hiện nổi trội nhất, hứa hẹn nhiều tiềm năng trong nghiên cứu và phát triển thuốc
[3,5,14,15].

Hình 1.1: Một số hình thể dạng quả đa bào của niêm khuẩn [2,3].
1.1.2. Một số hoạt chất và hoạt tính sinh học từ niêm khuẩn
Niêm khuẩn đƣợc xem là nguồn sản xuất các lớp chất thứ cấp đa dạng về cấu
trúc với những hoạt tính sinh học lý thú. Các lớp chất từ niêm khuẩn đã góp phần
quan trọng trong phát triển các thuốc mới điều trị các bệnh truyền nhiễm và đặc biệt
là các bệnh liên quan đến khối u [16,17]. Trong đó, nhóm các hợp chất có hoạt tính


4

mạnh đã đƣợc quan tâm nghiên cứu và cho một số kết quả tốt, nhƣ tubulysin (1),
epothilone (2), disorazol (3). Một dẫn xuất bán tổng hợp từ epothilone là
ixabepilone đã đƣợc Cục quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê
chuẩn cho phép sử dụng là thuốc điều trị ung thƣ vú di căn kháng taxane vào năm
2007 [6]. Bên cạnh đó, một lƣợng lớn các lớp chất đã và đang đƣợc nghiên cứu để
phát triển thành các thuốc chống ung thƣ mới.
Lớp chất macrolide: Nhiều macrolide có hoạt tính gây độc tế bào mạnh đƣợc

phân lập từ niêm khuẩn.
Epothilone (2) (Hình 1.2). Đƣợc phân lập năm 1993 bởi Höfle và cộng sự từ
chi Sorangium cellitlosum SMP44 [18,19], epothilone có cấu trúc khung macrolide.
Hợp chất macrolactone này có chứa vòng thiazole ở mạch nhánh thể hiện hoạt tính
kháng nấm và khả năng gây độc tế bào mạnh. Năm 1995, Bollag và cộng sự chứng
minh cơ chế hoạt động của epothilone tƣơng tự nhƣ taxol, đó là thúc đẩy trùng hợp
và làm bền hóa vi ống dẫn đến cảm ứng gây chết tế bào theo chƣơng trình.
Epothilone đã đƣợc nghiên cứu thử nghiệm in vivo từ năm 2003 và nếu vƣợt
qua các đánh giá của thử nghiệm lâm sàng dẫn chất này sẽ thay thế taxol trong điều
trị các khối u đa kháng thuốc [5].
Disorazole (3) (Hình 1.2), đƣợc phân lập từ chi Sorangium cellulosum
Soce12 bởi Jansen và cộng sự năm 1993 [20,21]. Lớp chất disorazole là những
macrodilactone của hai hợp chất 2-pentadecyloxazol-4-carboxylic acid, với một số
sự thay đổi vị trí và cấu hình của các liên kết đôi và các nhóm thế oxi nhƣ epoxi,
hydroxyl hoặc methyl ether trong mạch carbon. Các hợp chất macrodilactone thể
hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên các dòng tế bào ung thƣ ngƣời. Disorazol
A1 gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thƣ biểu mô phổi, với giá trị IC50 = 2 pM và
trên dòng tế bào nguyên bào sợi (L-929) của chuột với IC50 = 3 pM [20-22]. Trong
một kết quả nghiên cứu khác, disorazol C1 thể hiện hoạt tính chống tăng sinh với
nhiều tế bào khối u, gây ra sự lão hóa tế bào sớm và cảm ứng dẫn đến quá trình chết
tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) [23].
Các archazolid (4) (Hình 1.2) đƣợc phân lập bởi Sasse và cộng sự năm 2003
từ việc nuôi cấy các niêm khuẩn chủng Archangium gephyra và Cystobacter sp..
Các hợp chất này cũng bao gồm một vòng macrolactone có chứa vòng thiazole ở
mạch nhánh. Nghiên cứu về tác dụng sinh học cho thấy các chất thể hiện hoạt tính


5

mạnh trên nhiều dòng tế bào ung thƣ của động vật có vú, với các giá trị IC50 trên

các dòng tế bào khác nhau từ 0,1 đến 1 ng/ml [24].

Hình 1.2. Một số cấu trúc macrolide từ niêm khuẩn
Chivosazol (5) (Hình 1.2) đƣợc phân lập bởi Irschik và cộng sự năm
1995 từ chi Sorangium cellulosumstrain Soeel2. Chất 5 có cấu trúc vòng lớn
với một vòng oxazol và liên kết glycoside với 6-deoxyglucose tại C-11.
Chivosazol cho thấy hoạt tính với các loại nấm men và nấm sợi, và biểu hiện hoạt
tính mạnh với các dòng tế bào của động vật có vú [25].
Lớp chất peptide: Tiêu biểu cho lớp chất peptide phân lập từ niêm khuẩn có
thể kể đến nhƣ tubulysin (1), chondramide (6), bengamide (7), nannocystin (8)
Tubulysin (1).(Hình 1.3), là tetrapeptide đƣợc phân lập năm 2000 từ 2 dòng
niêm khuẩn Archangium gephyra và Cystobacter sp. Lớp chất tubulysin đƣợc đánh
giá có hoạt tính với một số dòng tế bào ung thƣ mạnh hơn từ 20 đến 100 lần
vinblastine và taxol [10,13]. Tubulysin D thể hiện tác dụng độc tính đối với dòng tế
bào ung thƣ bạch cầu ngƣời (HL-60), và dòng tế bào U-lympho mô bào ngƣời (U937) ở giá trị IC50 = 3 pM.
Các tubulysin đang đƣợc nghiên cứu tiền lâm sàng và nghiên cứu thử nghiệm
kết hợp với các kháng thể đơn dòng bằng cách tạo các liên hợp thuốc- kháng thể
(antibody-drug conjugates) nhằm giảm độc tính đối với các tế bào thƣờng, trong khi


6

vẫn duy trì đƣợc hoạt tính mạnh đối với các dòng tế bào ƣng thƣ (Hình 1.3). Sự phát
triển tiền lâm sàng của tubulysin là chất chống ung thƣ mới hứa hẹn thu đƣợc nhiều
kết quả đáng chú ý [10,26,27].

Hình 1.3. Một số cấu trúc liên hợp thuốc- kháng thể (ADCs) của tubulysin [27]
Cấu trúc depsipeptide trong chondramide (6) (Hình 1.4) đƣợc phân lập từ
loài Chondromyces crocatus bởi Jansen và cộng sự năm 1995 [28], thể hiện hoạt
tính kháng nấm và gây độc tế bào ở nồng độ vài nanomol. Cấu trúc vòng lớn của

chondramide chứa ba amino acid và một polyketide: alanine, N-methyltryptophan,
α-methoxy-β-tyrosine và 7-hydroxytrimethyloctenoic acid.
Bengamide (7) (Hình 1.4), đƣợc phân lập từ loài Myxococcus virescens và
loài bọt biển Jaspis coriacea [29,30]. Bengamide chứa các yếu tố cấu trúc bất
thƣờng, bao gồm các hợp chất sinh tổng hợp ketide và amino acid cùng nhau tạo ra
các chất kháng khuẩn và gây độc tế bào thú vị. Nghiên cứu trong ống nghiệm (in
vitro) trên dòng tế bào ung thƣ biểu mô tuyến vú ở ngƣời (MDA-MB-435) cho thấy,
các bengamide A và O thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC50 lần lƣợt là 1 nM và
0,3 nM.
Đƣợc phân lập từ chi Nannocystis sp., có cấu trúc vòng lớn với 9 trung tâm
lập thể bao gồm một tripeptide, một phần polyketide và một nữa epoxyamide.
Nannocystin (8) (Hình 1.4) đƣợc biết đến với tác dụng ức chế sự tăng sinh tế bào
ở nồng độ nanomol thông qua việc gây chết tế bào theo chƣơng trình [31].


7

Hình 1.4. Một số cấu trúc peptide từ niêm khuẩn
Một số cấu trúc khác: Polyketide mạch dài Eliamid (9) (Hình 1.5) một đầu
có chứa nhóm tetramic acid amide, đƣợc phân lập năm 2012 từ chi Sorangium
cellulosum bởi Höfle và cộng sự. Chất 9 ức chế mạnh phức hợp I (NADHubiquinone oxyoreductase) của chuỗi hô hấp ty thể với IC50 tƣơng ứng 20 nM.
Nghiên cứu hoạt tính sinh học của 9 cho thấy các tác động đặc biệt trên dòng tế bào
ung thƣ hạch (U-937), ung thƣ biểu mô (A-431) và tế bào ung thƣ cổ tử cung (KB3.1) ở ngƣời; dòng tế bào nguyên bào sợi ở chuột (L-929), với giá trị IC50 lần lƣợt là
0,5; 3,0; 1,0 và 0,5 ng/mL [32].
Ratjadone (10) (Hình 1.5) đƣợc phân lập năm 1995 với khung α-pyrone.
Chất 10 thể hiện khả năng ức chế mạnh sự phát triển của tế bào, đặc biệt ratjadone
C có tác dụng ức chế tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt (PC-3) và tế bào ung thƣ biểu
mô (KB-V1) ở nồng độ 0,08 ng/mL [33].

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của eliamide và ratjadone

8

1.2. VI ỐNG VÀ VAI TRÕ TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC
1.2.1. Vi ống (microtube)
Vi ống là thành phần chính của tế bào nhân chuẩn và có vai trò quan trọng
trong các chức năng tế bào khác nhau nhƣ di chuyển và vận chuyển nội bào, duy trì
hình dạng tế bào, truyền tín hiệu tế bào [34]. Bên cạnh đó vi ống còn đóng một vai
trò quan trọng trong việc phân chia tế bào bằng cách tham gia vào sự di chuyển của
tế bào và gắn vào các nhiễm sắc thể trong các giai đoạn phân bào [35].
Về mặt cấu trúc, các vi ống đƣợc tạo bởi hai tiểu đơn vị protein hình cầu là
α- và β-tubulin (Hình 1.6). Hai tiểu đơn vị này kết hợp với nhau tạo thành một
dimer dị thể (α,β-heterodimer), các dimer sau đó lắp ráp thành dạng cấu trúc hình
ống (sự trùng hợp tubulin). Các dimer tubulin tự sắp xếp theo kiểu đầu - đuôi với
tiểu đơn vị α của dimer này liên kết với tiểu đơn vị β của dimer kia, sự sắp xếp này
dẫn đến sự hình thành các sợi protein hay còn gọi là sợi tơ giao thức
(protofilaments). Các sợi tơ tự sắp xếp song song tạo thành một tấm protein hình
chữ C, sau đó cuộn lại để tạo thành cấu trúc hình ống gọi là vi ống (microtubule).

Hình 1.6. Quá trình hình thành vi ống [36]
Sự sắp xếp đầu-đuôi của các dimer dị thể (heterodimer) dẫn đến sự phân cực
của vi ống, với tiểu đơn vị α ở một đầu và tiểu đơn vị β- ở đầu kia. Đơn vị α-tubulin
kết thúc mang điện âm (-), trong khi β-tubulin kết thúc mang điện dƣơng (+) [34].
Các vi ống ở trạng thái cân bằng động với các tế bào bên trong của α- và
β -tubulin, chúng liên tục xảy quá trình phát triển và rút ngắn bởi sự liên kết thuận


9

nghịch và sự phân ly của các dị thể dimer α /β -tubulin ở cả hai đầu. Điều này dẫn
đến sự di chuyển ngƣợc nhau của nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào [37].
1.2.2. Tác dụng ức chế trùng hợp vi ống
Các vi ống tham gia vào các giai đoạn khác nhau của chu kỳ tế bào. Trong
giai đoạn đầu-pha trƣớc (prophase), các vi ống bắt đầu hình thành và phát triển về
phía các nhiễm sắc thể mới, tạo thành trục phân bào (gồm một bó các vi ống) (Hình
1.7). Giai đoạn bắt đầu của pha giữa (prometaphase) và ở pha giữa (metaphase),
trục phân bào tự gắn vào nhiễm sắc thể tại một điểm đặc biệt gọi là kinetochore, tại
đây các vi ống trải qua nhiều chu kỳ phát triển và rút ngắn tƣơng ứng với các dao
động qua lại của nhiễm sắc thể. Các quá trình này tiếp tục đƣợc diễn ra trong pha
sau (anaphase). Do đó, sự hiện diện của một tác nhân có tác dụng vào động học của
vi ống là có thể ngăn chặn chu kỳ tế bào và dẫn đến tế bào chết theo chƣơng trình
(apoptosis) [35,38].
Quá trình trùng hợp vi ống bắt đầu xảy ra khi nồng độ các đơn vị α/β -tubulin
đạt đến bảo hòa. Sự trùng hợp theo cơ chế kéo dài mầm (nhân), bắt đầu bằng việc
hình thành chậm một vi ống „hạt nhân‟ ngắn, sau đó là quá trình kéo dài nhanh
chóng các vi ống ở đầu của nó bằng sự bổ sung tubulin dimer không thể đảo ngƣợc
[36].

Hình 1.7. Vi ống trong quá trình phân bào [37]
Các chất can thiệp vào động học của vi ống, tức là tác động vào quá trình
phát triển (polymerization) hoặc rút ngắn (depolymerization) của vi ống. Nhóm các
chất ức chế trùng hợp tubulin (chất ức chế trùng hợp) làm giảm khối lƣợng vi ống
trong các tế bào ở nồng độ cao, chúng hoạt động nhƣ các tác nhân gây bất ổn vi
ống, tiêu biểu là: colchine, dolastatins, lớp chất vinca alkaloids (vinblastine,
vincristine, vinorelbine), lớp chất tubulysin [34,36].


10

Hình 1.8. Vùng liên kết của các tác nhân trên vi ống [39]
Các vinca alkaloids liên kết với β-tubulin, ngăn chặn sự trùng hợp của β tubulin thành các vi ống dẫn đến làm mất ổn định vi ống. Các vinca tạo ra vùng liên
kết vinca trên tubulin với hai vị trí liên kết riêng biệt trên các vi ống (Hình 1.8): liên
kết ái lực cao với tubulin ở đầu vi ống, và ái lực thấp với tubulin dọc theo bề mặt vi
ống. Đồng thời chúng cũng tự làm tăng ái lực của tubulin cho chính nó, dẫn đến sự
hình thành các tổ hợp xoắn ốc ngăn cản sự trùng hợp. Các vinca đƣợc xem là lớp
chất gây ra quá trình khử polyme hóa vi ống, ức chế tiến trình phân bào và dẫn đến
chết tế bào theo chƣơng trình (apoptosis) [34].
Tƣơng tự dolastatin, các tubulysin thiên nhiên ức chế mạnh sự phát triển trên
nhiều dòng tế bào ung thƣ ngƣời cũng theo cơ chế ức chế trùng hợp tubulin.
Tubulysin chiếm vị trí liên kết vinca trên β-tubulin, ức chế sự trùng hợp của βtubulin dẫn đến gây chết tế bào theo chƣơng trình [12]. Cơ chế này ngƣợc lại với
epothilone, có tác dụng thúc đẩy sự trùng hợp tubulin, làm bền hóa vi ống và do đó
ngăn chặn sự phân chia tế bào [9,13,40].
1.3. TUBULYSIN
1.3.1. Phân lập và xác định cấu trúc
Tubulysin (1) (Hình 1.10) là các tetrapeptide thiên nhiên, đƣợc phân lập bởi
Höfle và cộng sự năm 2000 từ 2 dòng niêm khuẩn là Angiococcus disciformis An
d48 và Archangium gephyra Ar 315 [9].
Các tubulysin chứa 4 amino acid khác nhau gồm: isoleucin (Ile), các amino
acid ít gặp trong tự nhiên nhƣ N-methyl pipecolinic acid (Mep), tubuvaline (Tuv)


11

[sự lai hóa của cặp amino acid Valine và Cystein], tubuphenylalanine (Tup), hoặc
tubutyrosin (Tut) [sự kéo dài mạch của phenylalanine hoặc tyrosin] (Hình 1.9).

Hình 1.9: Chuỗi amino acid của tub A and D
Sự khác nhau về số lƣợng và bản chất của các nhóm thế dẫn đến sự đa dạng
về cấu trúc và hoạt tính sinh học của lớp chất tubulysin.

Năm 2000, 4 tubulysin (A, B, D, E) đƣợc Höfle và cộng sự phân lập từ 2
dòng niêm khuẩn Angiococcus disciformis và Archangium gephyra [9]. Năm 2004,
cũng từ 2 dòng niêm khuẩn đó Steinmetz, Höfle và cộng sự đã phân lập đƣợc thêm
5 tubulysin mới gồm các tubulysin C, F, H, I, G) [10].
Đến năm 2009, tiền chất tubulysin D (pretubulysin D) đƣợc A. Ullrich và
cộng sự phân lập từ dòng niêm khuẩn Angiococcus disciformis [41].
Tiếp nối các nghiên cứu về tubulysin trên các chủng niêm khuẩn, năm 2010
Yi Chai và cộng sự đã phân lập đƣợc thêm 5 tubulysin ký hiệu U, X, W, V, Z, tiền
chất của tubulysin A (pretubulysin A) và 3 dẫn xuất của tubulysin A, E, D từ 2
chủng niêm khuẩn Angiococcus disciformis An d48 và Cystobacter sp. SBCb004
[42].
Đến nay đã có 14 tubulysin, 3 dẫn xuất và 2 tiền chất tubulysin đƣợc phân
lập và xác định cấu trúc (Hình 1.10). Các tubulysin và tiền chất đã đƣợc phân lập
trên 3 dòng niêm khuẩn là Archangium gephyra Ar 315 (tubulysin A, B, C, I, G),
Angiococcus disciformis An d48 (tubulysin A, B, D, E, F, H, U, pretubulysin D) và
Cystobacter sp. SBCb004 (tubulysin X, W, pretubulysin A).