XÁC ĐỊNH đột BIẾN GEN SCN5A TRÊN một số BỆNH NHÂN mắc hội CHỨNG BRUGADA BẰNG kỹ THUẬT GIẢI TRÌNH tự GEN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
--------***--------

TRẦN YẾN THẢO

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN SCN5A TRÊN MỘT SỐ
BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG BRUGADA
BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2014 - 2018

HÀ NỘI-2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
--------***--------

TRẦN YẾN THẢO

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN SCN5A TRÊN MỘT SỐ
BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG BRUGADA
BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN

Ngành đào tạo: Cử nhân Xét nghiệm Y học
Mã ngành: 52720332
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2014 - 2018

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. TRẦN VÂN KHÁNH

HÀ NỘI-2018


3

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp chính là một trong những cột mốc đáng nhớ nhất,
đánh dấu cho quá trình học tập và nghiên cứu của sinh viên tại trường đại học.
Việc tiến hành nghiên cứu, làm khóa luận tốt nghiệp đã giúp em học hỏi được
rất nhiều, không chỉ là kiến thức mà còn là tác phong và kinh nghiệm làm
việc.
Với tất cả tấm lòng trân trọng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
PGS.TS Trần Vân Khánh, Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử - Khoa Kỹ
Thuật Y Học, Phó Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường
Đại học Y Hà Nội, người đã tận tình giúp đỡ, luôn đưa ra những lời khuyên
hữu ích cũng như những lời góp ý tâm huyết giúp em hoàn thiện bài khóa
luận.
Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Tạ Thành Văn, Giám đốc Trung
tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội,
người Thầy đã tạo điều kiện cho em thực hiện khóa luận tại Trung tâm.
Em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý Đào tạo Đại học,
Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành

khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn CN. Nguyễn Quý Hoài, là người đã trực
tiếp hướng dẫn, chia sẻ cho em những kỹ thuật và kinh nghiệm hữu ích trong
quá trình thực hiện khóa luận, cùng các anh chị tại Trung tâm Nghiên cứu
Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, đã giúp em hoàn chỉnh khóa luận.
Lời cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới người thân, bạn bè đã quan
tâm, động viên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Trần Yến Thảo


4

Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
------****------

LỜI CAM ĐOAN
Kính gửi: Phòng Quản lý Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội
Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi với sự giúp đỡ
của thầy cô và các anh chị tại Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, tất cả các
số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất
cứ công trình nghiên cứu nào khác.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2018
Người viết khóa luận

Trần Yến Thảo

5

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DNA
RNA
bp
BrS
NST
dNTP
ddNTP
ECG
EDTA
OD
SNP
PCR
Tgm
Nav1.5

Deoxyribonucleic Acid
Ribonucleic Acid
Base pair
Brugada Syndrome (Hội chứng Brugada)
Nhiễm sắc thể
Deoxyribonucleotid triphosphat
Dideoxyribonucleotid triphosphat
Electrocardiogram (Điện tâm đồ)
Ethylen diamine tetraacetic acid
Optical Density (Độ hấp thụ quang)

Single Nucleotide Polymorphism
(Hiện tượng đa hình đơn nucleotid)
Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase)
Nhiệt độ gắn mồi
Voltage-gated sodium channel
(Kênh natri có tính chất cổng điện thế)


6

MỤC LỤC


7

ĐẶT VẤN ĐỀ
Xu hướng bệnh tật trên thế giới đang có sự thay đổi với sự gia tăng về
tỷ lệ và mức độ nghiêm trọng của các bệnh mạn tính so với các bệnh lây
nhiễm. Điều này dẫn đến dự đoán rằng đến năm 2030 các bệnh không lây
nhiễm sẽ chiếm hơn ba phần tư số ca tử vong trên toàn thế giới [1]. Một trong
những bệnh mạn tính nguy hiểm được coi là nguyên nhân gây tử vong hàng
đầu là bệnh tim mạch [2].
Năm 2015, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính có khoảng 20 triệu
ca tử vong do các bệnh về tim mạch, chiếm 30% tổng số ca tử vong trên toàn
thế giới [1]. Bên cạnh một số căn bệnh quen thuộc như bệnh mạch vành, đột
quỵ, rối loạn nhịp tim hay suy tim thì gần đây, các nhà khoa học đặc biệt quan
tâm đến Hội chứng Brugada. Căn bệnh còn được gọi là “cái chết thầm lặng”
với đặc điểm gây ra chứng đột tử về đêm trong khi ngủ, vô cùng nguy hiểm.
Brugada là tên một hội chứng bệnh của tim do giảm tổng hợp hay giảm

chức năng các protein vận chuyển ion natri, kali, canxi qua màng, gây rối loạn
nhịp tim và tăng nguy cơ đột tử do tim. Hội chứng Brugada được công bố trên
y văn thế giới lần đầu tiên vào năm 1992 với những mô tả đặc trưng: block
nhánh phải, đoạn ST trên hình ảnh điện tâm đồ chêch cao và hiện tượng đột tử
do tim không rõ nguyên nhân. Người mắc hội chứng Brugada thường không
có triệu chứng lâm sàng điển hình mà chỉ có một vài biểu hiện khó phân biệt
với các bệnh tim mạch khác như ngất, ngừng tim đột ngột, rung thất,… Do
vậy việc chẩn đoán sớm và điều trị hiệu quả cho bệnh nhân mắc hội chứng
Brugada gặp rất nhiều khó khăn.
Một căn bệnh mới được phát hiện đã thu hút nhiều đề tài nghiên cứu
nhằm hiểu rõ các khía cạnh của bệnh với hi vọng tìm ra phương pháp điều trị
hiệu quả cũng như phòng ngừa, ngăn chặn kịp thời sự phát triển của nó. Hội


8

chứng Brugada chủ yếu do đột biến gen gây ra, gần 20 gen đã được phát hiện
và cho rằng có liên quan đến bệnh. Gen SCN5A là gen được phát hiện đầu tiên
và cũng là gen được các nhà nghiên cứu quan tâm nhất. Gen có chức năng mã
hóa cho tiểu đơn vị alpha của kênh natri tim Na v1.5 (Voltage-gated sodium
channel) – một protein màng quan trọng, tham gia vào quá trình dẫn truyền
xung điện của cơ tim giúp tim co bóp nhịp nhàng. Ở những bệnh nhân mắc
hội chứng Brugada, đột biến gen SCN5A gây giảm tổng hợp hoặc giảm chức
năng kênh natri tim Nav1.5, dẫn đến rối loạn nhịp tim, nguy hiểm nhất là
chứng đột tử.
Hơn hai thập kỷ qua đã có rất nhiều nghiên cứu về khía cạnh lâm sàng
cũng như cơ chế bệnh học phân tử của hội chứng Brugada trên thế giới, tuy
nhiên tại Việt Nam hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu chính thức nào về đột
biến gen liên quan đến bệnh. Vì vậy, đề tài nghiên cứu: “Xác định đột biến
gen SCN5A trên một số bệnh nhân mắc hội chứng Brugada bằng kỹ

thuật giải trình tự gen” được thực hiện với mục tiêu: Sử dụng kỹ thuật giải
trình tự gen phát hiện đột biến gen SCN5A trong hội chứng Brugada.


9

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về hội chứng Brugada
1.1.1. Lịch sử phát hiện và tình hình nghiên cứu Hội chứng Brugada
Vào giữa thế kỷ 20 (1953), Osher và Woff đã phát hiện ra mô hình điện
tâm đồ với block nhánh phải, kết hợp với độ cao phân đoạn ST, tuy nhiên tại
thời điểm lúc bấy giờ dấu hiệu đó được coi là bình thường, không liên quan
đến đột tử do tim.
Trong những năm 80 của thế kỷ 20, Trung tâm kiểm soát dịch bệnh
(CDC – Center for Disease Control) ở Atlanta đã quan sát thấy tỷ lệ đột tử cao
bất thường ở những người tị nạn châu Á di cư đến Hoa Kỳ, chủ yếu ở đông
bắc Thái Lan. Cái chết đột ngột chủ yếu vào ban đêm ở những người đàn ông
trẻ và trung niên được biết đến ở các nước châu Á bằng nhiều cái tên khác
nhau như “Pokkuri” ở Nhật Bản, “Lai-tai” ở Thái Lan, “Bangungut” ở Philip-pin, “Dream Disease” ở Hawaii [3].
Năm 1992, hai anh em người Tây Ban Nha Pedro và Josep Brugada đã
phát hiện một mô hình điện tâm đồ riêng biệt chưa từng được mô tả trước đó
ở một nhóm gồm 8 bệnh nhân. Cả 8 bệnh nhân đều không có bất thường về
cấu trúc tim, nhưng lại có triệu chứng tái phát nhiều lần của sự ngừng tim đột
ngột, block nhánh phải, đoạn ST trên hình ảnh điện tâm đồ chênh cao và trong
gia đình có người tử vong đột ngột do tim không rõ chính xác nguyên nhân.
Những bất thường này được mô tả, khẳng định có liên quan đến một mô hình
bệnh tật và lần đầu tiên được đưa vào y văn thế giới.
Năm 1996, thuật ngữ “Hội chứng Brugada” được sử dụng để mô tả tình
trạng block nhánh phải, đoạn ST chênh lên và tử vong đột ngột do tim.
Năm 1998, một số nghiên cứu đã chỉ ra sự liên quan giữa đột biến gen

SCN5A-gen mã hóa tiểu đơn vị alpha của kênh natri tim Na v1.5 và hội chứng


10

Brugada. Các nghiên cứu sau đó đã phát hiện ra nhiều gen liên quan đến
bệnh, hầu hết mã hóa cho các kênh ion natri, kali, canxi hoặc protein liên
quan đến các kênh đó.
Theo thống kê, tỷ lệ mắc hội chứng Brugada trên thế giới là 5/10.000,
tỷ lệ có sự dao động ở nhiều vùng trên thế giới, ước tính khoảng 0,15% ở các
nước châu Á, từ 0,1% đến 0,02% ở các nước Trung Đông và dưới 0,02% ở
các nước phương Tây [4], [5]. Hội chứng thường được phát hiện ở những
người đàn ông trẻ tuổi (độ tuổi <40 đến 45), tỷ lệ mắc ở nam gấp 8-10 lần so
với nữ giới [6]. Tỷ lệ tử vong do hội chứng Brugada chiếm khoảng 4-12%
tổng số ca tử vong bất ngờ và khoảng 20% tổng số ca tử vong ở những bệnh
nhân tim mạch bình thường, do vậy Brugada được xếp vào nhóm những
nguyên nhân gây tử vong hàng đầu cho nam giới dưới 40 tuổi [7].
Tại Việt Nam hiện chưa có báo cáo chính thức nào về tỷ lệ hiện mắc cũng
như các nghiên cứu về đột biến gen liên quan đến hội chứng Brugada.
1.1.2. Lâm sàng của hội chứng Brugada
Hình ảnh bất thường trên điện tâm đồ (Electrocardiography - ECG) trở
thành một trong những dấu hiệu của hội chứng Brugada do sự tái cực và khử
cực bất thường của tế bào cơ tim. Bất thường này xảy ra khi bệnh nhân không
có biểu hiện thiếu máu cục bộ, rối loạn điện giải hay bất kì bất thường nào về
cấu trúc tim đã được mô tả như các bệnh tim mạch đã biết. Bệnh nhân mắc
hội chứng Brugada có hình dạng ECG đặc trưng bởi độ chênh của đoạn ST
trong chuyển đạo trước tim V1, V2, V3 với ba type ECG:
• Type 1: điển hình với đoạn ST hình vòm, chênh lên ≥ 2 mm (0,2 mV),
kèm theo sóng T âm.
• Type 2: đoạn ST hình yên ngựa, với độ chênh cao nhất ≥ 2 mm, theo

sau là dạng hình máng có độ chênh ≥ 1mm.
• Type 3: có thể có hình thái của một trong hai loại 1 hoặc loại 2, nhưng
với ST chênh < 1mm.


11

Hình 1.1. Ba dạng đoạn ST chênh thường thấy ở bệnh nhân mắc hội
chứng Brugada
(Nguồn: />Chẩn đoán lâm sàng phân biệt hội chứng Brugada:
1. ECG thuộc type 1 xuất hiện ở nhiều hơn một chuyển đạo (V1-V3),
không liên quan đến các bệnh tim cấu trúc đã được mô tả, đồng thời
có một trong các biểu hiện: rung thất, nhịp nhanh thất đa hình, ngất,
ngừng hô hấp ban đêm, tiền sử gia đình về tử vong đột ngột do tim
(< 45 tuổi) với ECG dạng đặc trưng của hội chứng Brugada.
Bệnh nhân có ECG type 1 nhưng không có những triệu chứng lâm
sàng như trên, gọi là mô hình ECG tự phát (không phải hội chứng
Brugada).
2. ECG thuộc type 2 xuất hiện ở nhiều hơn một chuyển đạo (V1-V3),
sau khi bệnh nhân sử dụng một số thuốc chẹn kênh natri: Ajimaline


12

(1 mg/kg thể trọng, 10 mg/phút), flecanide (2 mg/kg thể trọng, tối đa
150 mg, trong 10 phút) và procainamide (10 mg/kg, 100 mg/phút)
thì hình dạng ECG chuyển sang type 1. Bệnh nhân có các chỉ tiêu
lâm sàng tương tự như mục (1). Nếu bệnh nhân không có sự thay
đổi trong phân đoạn ST khi đáp ứng với thuốc chẹn kênh natri sẽ
không được coi là mắc hội chứng Brugada.

3. ECG type 3 xuất hiện ở nhiều hơn một chuyển đạo (V1-V3), và có
khả năng chuyển dạng ECG type 1 khi kích thích bởi thuốc chẹn
kênh natri. Bệnh nhân có các chỉ tiêu lâm sàng như mục (1). Sự
chuyển đổi dạng ECG do thuốc từ type 3 sang type 2 không được
kết luận hội chứng Brugada [6].
1.1.3. Cơ chế bệnh sinh của hội chứng Brugada
Hội chứng Brugada chủ yếu do đột biến gen gây ra. Sự xuất hiện của
đột biến dẫn đến giảm tổng hợp hoặc giảm chức năng các protein – kênh ion
tim natri, kali, canxi, đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia hoạt động co
bóp của cơ tim thông qua quá trình điện học. Quá trình này diễn ra do sự biến
đổi hiệu điện thế giữa mặt trong và mặt ngoài của tế bào cơ tim nhờ sự di
chuyển của các ion (chủ yếu là ion K + và Na+). Ở trạng thái nghỉ, màng tế bào
đang ở trạng thái cực hóa do phía trong màng tế bào mang điện tích âm hơn
phía ngoài màng tế bào. Ở trạng thái điện thế hoạt động sẽ xuất hiện hai giai
đoạn là giai đoạn khử cực và giai đoạn tái cực. Giai đoạn khử cực là giai đoạn
khử bỏ trạng thái cực hóa của cơ tim nhờ lượng lớn ion Na + ồ ạt di chuyển vào
bên trong màng tế bào, khiến điện thế trong màng tế bào trở nên dương tính
tương đối so với phía trong màng tế bào. Sau giai đoạn khử cực, tế bào có xu
hướng lặp lại các thăng bằng ion về trạng thái nghỉ nhờ sự khuếch tán của ion
K+, khi đó điện thế ngoài màng tế bào trở lại dương tính tương đối so với mặt
trong tế bào, giai đoạn này là tái cực.


13

Trong hội chứng Brugada, việc thiếu hụt cũng như khiếm khuyết về cấu
trúc và chức năng các kênh ion gây ảnh hưởng đến quá trình điện thế hoạt
động, dẫn đến rối loạn nhịp tim. Kết quả là tim bơm máu không hiệu quả,
không đủ máu di chuyển đến các cơ quan của cơ thể, điều này có thể dẫn đến
tình trạng ngất xỉu nếu nhịp bất thường đó kéo dài trong thời gian ngắn hoặc

đột tử do tim nếu nhịp bất thường xuất hiện trong thời gian dài.
Hội chứng Brugada do đột biến gen trội trên nhiễm sắc thể (NST)
thường, có thể di truyền từ bố mẹ cho con cái. Tuy nhiên, theo các nghiên cứu
gần đây thì chỉ dưới 40% trường hợp mắc hội chứng Brugada có liên quan
đến di truyền từ gia đình [4], các trường hợp còn lại chủ yếu do tự phát và cho
đến nay cơ chế vẫn chưa hoàn toàn được hiểu rõ.
Hình ảnh phân đoạn ST chênh cao trên điện tâm đồ không chỉ xuất hiện
trong hội chứng Brugada mà còn xuất hiện trên một số bệnh như: mất cân
bằng điện giải (do hạ thân nhiệt, suy thượng thận, giảm kali máu, tăng calci
huyết,…), các bệnh thần kinh (loạn dưỡng cơ Duchenne, loạn dưỡng cơ tim,
chứng Friendreich,…), các độc tố hoặc chất độc (cocaine, ethanol, heroin,…),
bệnh cơ tim và màng ngoài tim (viêm cơ tim, viêm màng ngoài tim, loạn sản
thất phải, loạn nhịp thất,…),… Để phân biệt các chứng bệnh này với hội
chứng Brugada cần tiến hành làm test kiểm tra với các thuốc chẹn kênh natri
như: flecanide, ajmaline, procainamide,… Khi làm test này nếu test âm tính
(ECG trở về dạng bình thường) thì không phải hội chứng Brugada, nếu test
dương tính (ECG vẫn giữ nguyên dạng điển hình của Brugada) cùng với các
triệu chứng đề cập ở mục 1.1.2 có thể kết luận hội chứng Brugada.
Gần 20 gen đã được phát hiện liên quan đến hội chứng Brugada, chủ
yếu là các gen liên quan đến mã hóa kênh natri và protein liên kết với kênh
natri, trong đó SCN5A là gen được các nhà khoa học quan tâm nhiều nhất.


14

Bảng 1.1. Các đột biến gen liên quan đến hội chứng Brugada [4]
ST
T

Kênh ion

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

Kênh Natri

Liên kết
với kênh
Natri
Kênh
Canxi

Kênh Kali

Gen liên
quan đến
hội chứng
Brugada

Vị trí của
gen

SCN5A

3p21

SCN1B
SCN2B
SCN3B
SCN10A
HEY2
RANGRF
GPD1-L
SLMAP
PKP2
TRPM4
CACNA1C
CACNB2b
CACNA2D1
ABCC9
KCND3
KCNE3
KCNJ8

KCNH2

19q13.1
11q23
11q24.1
3p22.2
6q22
17p13.1
3p24
3p21.2-p14.3
12p11.21
19q13.33
12p13.3
10p12.33
7q21.11
12p12.1
1p13.2
11q13-14
12p12.1
7q35

Tỷ lệ đột biến
trong số những
Protein do
người mắc hội
gen mã hóa
chứng Brugada
(%)
Nav1.5
20-25 (người Da

trắng), 10-15
(người châu Á).
Navβ1
1-2
Navβ2
Hiếm gặp
Navβ3
Hiếm gặp
Navβ1.8
2,5-16
Nav1.5
Chưa rõ tỷ lệ
MOG1
Hiếm gặp
G3PD1L
Hiếm gặp
SLMAP
Hiếm gặp
Plakophilin-2 2,5
NSCCa
8
Cav1.2
6-7
Cavβ2
4-5
Cavα2δ-1
Hiếm gặp
SUR2A
4-5
Kv4.3

Hiếm gặp
MiRP2
<1
Kir6.1
Hiếm gặp
Kv11.1
1-2

1.1.4. Điều trị hội chứng Brugada
Bản chất của nhịp tim bất thường trong hội chứng Brugada liên quan
đến cấu trúc các kênh ion tim, do đó việc sử dụng các thuốc chống loạn nhịp
như amiodarone, β-blockers là không hiệu quả trong việc điều trị bệnh, các
thuốc như flecainide, propafenone, procainamide là chống chỉ định. Vậy nên
để điều trị hội chứng Brugada, chủ yếu sử dụng phương pháp cấy ghép máy
khử rung tim (ICD, Implantable cardioverter-defibrillator), đây được xem là


15

phương pháp hiệu quả nhất vì nó tự phá rung khi có rối loạn nhịp thất hay khi
có rung thất xuất hiện.
Tuy nhiên, đôi khi các loại thuốc như quinidine, tedisamil cũng được sử
dụng để ngăn chặn sự nguy hiểm tiềm ẩn của rối loạn nhịp tim. Điều trị bằng
thuốc này cũng là phương pháp hữu ích bổ sung cho phương pháp cấy ghép
ICD [9].
1.2. Tổng quan về gen SCN5A
1.2.1. Vị trí của gen SCN5A
Gen SCN5A có tên đầy đủ là “sodium voltage-gated channel alpha subunit
5”. Ngoài ra, gen còn có các tên gọi khác như: HB1; HB2; HH1; IVF; VF1;
HBBD; ICCD; LQT3; SSS1; CDCD2; CMD1E; CMPD2; PFHB1; Nav1.5.

Gen SCN5A nằm trên nhánh ngắn của NST số 3, vị trí: 3p22.2, từ cặp
base 38.548.061 đến cặp base 38.649.673, với kích thước 101.612 bp và gồm
29 exon [10].

Hình 1.2. Vị trí gen SCN5A trên nhánh ngắn NST số 3
(Nguồn: />1.2.2. Chức năng của gen SCN5A và protein Nav1.5
Chức năng của gen SCN5A là mã hóa cho tiểu đơn vị alpha của kênh
natri tim (Nav1.5), và là gen liên quan đến nhiều rối loạn nhịp tim có tính chất
di truyền.
1.2.2.1. Cấu trúc protein Nav1.5


16

Có 9 loại kênh natri (Nav1.1-1.9) phân bố ở các mô khác nhau trong cơ
thể, các kênh này đều gồm hai tiểu phần: alpha và beta. Tiểu đơn vị alpha có
cấu trúc lỗ rỗng cho phép các dòng ion Na+ đi qua màng tế bào. Và được mã
hóa bởi 9 gen (SCN1-5A và SCN8-11A) tương ứng với tiểu phần alpha của 9
loại kênh (Nav1.1-1.9), trình tự các acid amin của các protein tương đồng đến
hơn 50% [11]. Tiểu đơn vị beta không trực tiếp cho dòng ion Na + đi qua
nhưng có chức năng tương tác, hỗ trợ hoạt động cho tiểu đơn vị alpha. Ở
người có 4 loại tiểu đơn vị beta (β1-β4 và β1B) được mã hóa bởi 4 gen tương
ứng (SCN1B-SCN4B).
Tiểu đơn vị alpha của kênh natri tim Na v1.5 được mã hóa bởi gen
SCN5A, gồm 2016 acid amin, trọng lượng phân tử vào khoảng 227 kDa. Tiểu
đơn vị alpha được cấu thành bởi một chuỗi liên tục gồm bốn miền D1-D4.
Trong mỗi miền chứa sáu phân đoạn xuyên màng S1-S6 và được liên kết với
miền liền kề bởi các vòng liên kết (ID1-2, ID2-3, ID3-4) [12].

17

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử protein Nav1.5
(Nguồn: />Các phân đoạn từ S1 đến S4 tạo thành miền VSD (Voltage sensing
domain) – miền cảm biến điện áp. Phân đoạn S4 của mỗi miền chứa các acid
amin tích điện dương có vai trò cảm biến điện áp, giúp mở kênh trong giai
đoạn khử cực. P-loop là vùng hình thành lỗ rỗng nằm giữa phân đoạn S5 và
S6 của mỗi miền, quyết định tính thấm của ion Na + qua màng tế bào. Do vậy
chỉ cần một thay đổi acid amin trong vùng P-loop cũng có thể sẽ ảnh hưởng
tới quá trình điện thế hoạt động của cơ tim. IFM (isoleucine-phenylalaninemethionine) là vùng khử hoạt tính nhanh. Còn tiểu đơn vị beta nằm giữa vùng
P-loop, đóng vai trò kích hoạt sau khi kênh natri ngừng hoạt động [13].
1.2.2.2. Hoạt động của kênh Nav1.5
Kênh natri tim Nav1.5 tham gia vào giai đoạn khử cực của quá trình
điện thế hoạt động, đồng thời cũng đóng vai trò quan trọng trong việc dẫn
truyền tim.
Hoạt động của kênh Nav1.5 phụ thuộc cơ bản vào cảm biến điện áp,
nhờ sự thay đổi điện thế màng sẽ làm thay đổi cấu trúc kênh, nên còn được
gọi là kênh có cánh cổng điện thế (voltage – gate channel). Kênh có hai cổng,
cổng hướng về phía ngoài màng tế bào là cổng hoạt hóa, cổng hướng về phía
trong gọi là cổng khử hoạt [14].


18

Hình 1.4. Mô tả hoạt động của kênh natri tim Nav1.5
(Nguồn: />Ở trạng thái nghỉ, cổng hoạt hóa đóng, cổng khử hoạt mở, ion Na +
không vào được bên trong màng tế bào.
Ở trạng thái hoạt hóa kênh natri: điện thế màng tăng dần từ -90mV về
phía 0, đến ngưỡng nhất định sẽ làm biến đổi đột ngột hình dáng cổng hoạt
hóa, khiến cổng chuyển sang vị trí mở, tính thấm màng tế bào cũng tăng lên

gấp nhiều lần giúp ion Na+ ồ ạt di chuyển qua kênh vào trong màng tế bào.
Trạng thái này kéo dài khoảng vài phần vạn giây.
Ở trạng thái khử hoạt kênh natri: sự tăng điện thế làm mở cổng hoạt
hóa thì đồng thời cũng làm đóng cổng khử hoạt chỉ sau vài phần vạn giây.
Cổng khử hoạt đóng lại từ từ, khiến kênh natri đóng, ion Na + không vào trong
tế bào được, điện thế màng dần trở về trạng thái nghỉ. Chỉ khi điện thế màng
đã quay trở về tới hoặc gần tới mức điện thế nghỉ lúc đầu thì cổng khử hoạt
mới có thể bắt đầu trạng thái mở ra, đó là cơ sở của việc kế tiếp đóng mở
kênh natri tạo nên một xung điện [15].
1.2.3. Một số đột biến gen SCN5A liên quan đến hội chứng Brugada
Đột biến gen SCN5A được tìm thấy ở ít nhất 10 bệnh tim khác nhau,
ảnh hưởng đến cấu trúc, chức năng hoặc mức độ biểu hiện của kênh natri


19

Nav1.5 [16]. Đột biến gen SCN5A có thể dẫn đến mất, giảm hoặc tăng chức
năng của kênh Nav1.5 liên quan đến một loạt các bệnh về tim. Đột biến mất
hoặc giảm chức năng gen SCN5A có thể gây ra hội chứng Brugada, bệnh giãn
cơ tim, hội chứng viêm xoang, rung tâm nhĩ bệnh Lev- Lenègre,… Đột biến
tăng chức năng là nguyên nhân gây ra hội chứng QT kéo dài type 3 và một số
bệnh khác.
Trong hội chứng Brugada đột biến gen SCN5A dẫn đến giảm chức năng
protein kênh natri tim Nav1.5, dẫn đến thay đổi tính chất cổng điện thế (hoạt
hóa chậm, bất hoạt chậm, phục hồi hoạt động cho kênh natri chậm) hoặc giảm
tính thấm đối với ion Na+ [7].
Tỷ lệ đột biến gen SCN5A trong cộng đồng khoảng 0% đến 0,08% [17].
Trong quần thể người Da trắng, tỷ lệ đột biến gen SCN5A xuất hiện trong
khoảng 20-25% [4] trường hợp mắc hội chứng Brugada. Còn ở châu Á, tỷ lệ
đột biến gen này khoảng 10-15% [4] trường hợp mắc hội chứng Brugada,

trong đó ở Nhật Bản tỷ lệ đột biến khoảng 11-14%, còn ở Đài Loan là khoảng
8% [18]. Đến năm 2010, gần 300 đột biến SCN5A được báo cáo liên quan đến
hội chứng Brugada, bao gồm: đột biến mất hoặc thêm nucleotid, đột biến tạo
mã kết thúc sớm, đột biến thay thế cặp nucleotid, đột biến splice-site (thay đổi
quá trình cắt nối exon hoàn thiện RNA) [4].
Năm 2010, Kapplinger J.D và Cs khi nghiên cứu hồi cứu trên 2111
bệnh nhân mắc hội chứng Brugada (78% nam, tuổi trung bình 39 ± 15 năm),
qua việc thu thập thông tin từ 9 trung tâm trên khắp thế giới (5 trung tâm ở
châu Âu, 3 trung tâm ở Hoa Kỳ, 1 trung tâm ở Nhật Bản) đã xác định được
293 đột biến trên gen SCN5A (274 đột biến xuất hiện trên các exon, 19 đột
biến trên các intron). Theo nghiên cứu này, các exon trên gen SCN5A có số
lượng đột biến khác nhau và không đồng đều, trong đó exon 28 có số lượng


20

đột biến cao nhất; các exon 9, exon 16, exon 23 cũng có số lượng đột biến
tương đối cao [19].
1.3. Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen SCN5A
1.3.1. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh
học phân tử nhằm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm ra nhiều bản
sao. Phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính của DNA và
nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA polymerase. Phản ứng
đòi hỏi sự có mặt của mồi xuôi, mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của
trình tự DNA khuôn và bốn loại nucleotid, enzym DNA polymerase xúc tác
cho sự tổng hợp hai mạch DNA mới từ mạch khuôn.
Thành phần của phản ứng PCR
• DNA khuôn: Đoạn DNA khuôn tinh sạch, không đứt gãy là một yếu tố
quan trọng giúp phản ứng PCR tạo được các sản phẩm chính xác.

• Mồi: Là những đoạn oligonucleotid mạch đơn dài 20-30 nucleotid có
trình tự bazơ nitơ bổ sung với trình tự bazơ nitơ của hai đầu đoạn DNA
khuôn. Mỗi cặp mồi có một mồi xuôi và một mồi ngược.
• Các nucleotid (dNTPs): Là hỗn hợp của 4 loại dATP, dCTP, dTTP,
dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA.
• Enzym DNA polymerase: Enzym thường được sử dụng hiện nay là Taq
polymerase, được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở nhiệt
độ cao.
• Dung dịch đệm: Thành phần của dung dịch đệm có thể thay đổi tùy
theo loại enzym được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg 2+. Nó hình
thành một phức hợp hòa tan với dNTP, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của
DNA mạch đôi và tăng khả năng bắt cặp, khả năng gắn của mồi vào
khuôn.


21

Các giai đoạn của phản ứng PCR
• Giai đoạn 1 (giai đoạn biến tính): giai đoạn này được thực hiện với
nhiệt độ cao từ 94-95°C. Quá trình này tách DNA mạch kép thành 2
mạch đơn bằng cách làm đứt các liên kết hidro tạo mạch khuôn cho quá
trình tổng hợp.
• Giai đoạn 2 (giai đoạn gắn mồi): trong giai đoạn này nhiệt độ hạ thấp
hơn so với giai đoạn biến tính, thường duy trì nhiệt độ 50-60 ºC cho
phép mồi bắt cặp với mạch khuôn.
• Giai đoạn 3 (giai đoạn kéo dài): nhiệt độ được tăng lên đến 72 °C là
nhiệt độ hoạt động tối ưu nhất của enzym Taq polymerase, dưới tác
động của enzym này các mạch đơn được tổng hợp theo nguyên tắc bổ
sung [20].
Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR nhằm khuếch đại các đoạn gen mong

muốn để phục vụ cho kỹ thuật giải trình tự gen ở bước sau.


22

Hình 1.5. Các giai đoạn của phản ứng PCR
(Nguồn: />1.3.2. Kỹ thuật giải trình tự gen
Giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp
xếp của 4 loại nucleotid A (Adenine), C (Cytosine), G (Guanine), T
(Thymine) trong phân tử DNA.


23

Năm 1977, Frederick Sanger cùng các cộng sự đã phát minh ra kỹ thuật
giải trình tự gen bằng phương pháp enzym, với nguyên lý: Sử dụng
dideoxynucleotid (ddNTP) là một phân tử nhân tạo, cấu trúc tương tự như
phân tử deoxynucleotid (dNTP), tuy nhiên ở carbon số 3 của đường
deoxyribose không phải là hydroxyl (-OH) mà là (-H), để dừng việc tổng hợp
mạch bổ sung do không hình thành được liên kết phosphodieste.

Hình 1.6. Cấu trúc ddNTP và dNTP
(Nguồn: )
Trong quá trình tổng hợp mạch đơn bổ sung, một ddNTP tự do gắn vào
chuỗi đang tổng hợp bằng liên kết phosphodieste giữa 5’phosphat với nhóm
3’hydroxyl của nucleotid cuối cùng của chuỗi. Tuy nhiên, nếu một ddNTP
được gắn vào đầu 3’ của chuỗi đang tổng hợp thì sự tổng hợp DNA sẽ dừng
lại do không hình thành được liên kết phosphodieste với nucleotid tiếp theo,
tạo ra các đoạn DNA có kích thước khác nhau hơn kém nhau 1 nucleotid. Dựa
vào đó người ta đã sử dụng 4 ống phản ứng khác nhau, trong mỗi ống chứa

chứa 4 loại nucleotid (A, T, G, C) và một trong 4 loại ddNTP (ddATP, ddCTP,
ddGTP, ddTTP); sau một thời gian phản ứng, điện di sản phẩm của 4 ống
nghiệm trên gel agarose sẽ xác định được trình tự của DNA ban đầu [21].


24

Hình 1.7. Phương pháp giải trình tự gen của Sanger
(Nguồn: />Hiện nay trong các phòng thí nghiệm thường sử dụng phương pháp giải
trình tự gen bằng máy tự động. Nguyên lý của phương pháp này giống với
phương pháp enzym của Sanger. Tuy nhiên, các ddNTP trong phương pháp
này được đánh dấu huỳnh quang với 4 màu khác nhau và được thực hiện
trong cùng một ống nghiệm. Máy giải trình tự gồm 2 phần: phần điện di với
gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Trong suốt quá trình
điện di mỗi khi có vạch điện di xuất hiện, máy sẽ ghi nhận và lưu lại thành
đỉnh cường độ sáng trên biểu đồ. Từ biểu đồ này, máy sẽ phân tích các đỉnh
cường độ sáng, so sánh với các màu và cho ra trình tự DNA tương ứng [22].


25

Hình 1.8. Phương pháp giải trình tự gen bằng máy tự động
(Nguồn: />Ưu điểm của phương pháp này là phản ứng giải trình tự có thể thực
hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng mà không phải
trên bốn hàng khác nhau như phương pháp enzym của Sanger, phần mềm máy
tính sẽ tự động giải trình tự dữ liệu từ hệ thống điện di và cho hình ảnh kết
quả giải trình tự, từ đó tiết kiệm thời gian, công sức của người làm kỹ thuật.
Việc sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen sẽ phát hiện được chính xác các biến
đổi trên gen, đồng thời cũng phát hiện được nhiều biến đổi cùng lúc, các biến
đổi mới cũng như các biến đổi nằm rải rác trên gen, do vậy tối ưu hơn so với

các kỹ thuật khác.