ÁP DỤNG HƯỚNG dẫn EP15 a3 của CLSI TRONG THẨM ĐỊNH một số xét NGHIỆM hóa SINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN

ÁP DỤNG HƯỚNG DẪN EP15-A3 CỦA CLSI
TRONG THẨM ĐỊNH MỘT SỐ XÉT NGHIỆM HÓA SINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2015 – 2019

Hà Nội - 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN

ÁP DỤNG HƯỚNG DẪN EP15-A3 CỦA CLSI
TRONG THẨM ĐỊNH MỘT SỐ XÉT NGHIỆM HÓA SINH
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2015 – 2019
Chuyên ngành

: Xét Nghiệm Y Học

Mã ngành

: 52720332

Người hướng dẫn khoa học:
ThS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THÚY

Hà Nội - 2019


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới Th.S Nguyễn Thị
Phương Thúy - Giảng viên bộ môn Hóa sinh lâm sàng- Khoa Kỹ Thuật Y
Học, trường Đại học Y Hà Nội đã luôn tận tình hướng dẫn nghiên cứu, giảng
giải kiến thức và tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các anh chị nhân
viên trong khoa Xét nghiệm Sinh Hóa Bệnh viện Nhi Trung Ương đã nhiệt
tình hướng dẫn, giúp đỡ, giải đáp mọi thắc mắc để em có thể thực hiện tốt
nhất khóa luận.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, Phòng Quản lý đào tạo
đại học, Bộ môn Hóa sinh lâm sàng, Khoa Kỹ thuật y học, trường Đại Học Y
Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian em học tập ở
trường. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới cha mẹ, những người đã sinh
thành, nuôi dưỡng em, cùng người thân, bạn bè đã luôn ở bên động viên, chia
sẻ, giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.
Dù đã rất cố gắng để thực hiện khóa luận một cách hoàn chỉnh nhất,
nhưng do mới lần đầu tiên thực hiện nghiên cứu cũng như kiến thức còn hạn

chế nên khóa luận của em chắc hẳn vẫn còn có những thiếu sót. Em rất mong
nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của thầy cô và các bạn để khóa
luận được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Thị Thanh Huyền


LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan tất cả số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa
từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.
Hà Nội, tháng 5 năm 2019
Sinh viên
Nguyễn Thị Thanh Huyền


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt
Ý Nghĩa
CLSI
Clinical and Laboratory Standards Institute
ISO
International Organization for Standardization
CV
Coeficient of Variation- Hệ số biến thiên
PXN
Phòng xét nghiệm

QC
Quality Control- Kiểm tra chất lượng
SD
Standard Deviation- Độ lệch chuẩn
PT
Proficiency Testing - Thử nghiệm độ thành thạo
TEa
Total Analytical error - Sai số toàn bộ cho phép
ALP
Alkaline Phosphatase
LDL-C
Low Density Lipoprotein - Cholesterol
HDL-C
High Density Lipoprotein - Cholesterol
HbA1c
Hemoglobin A1c
VI
Verification Interval - Khoảng xác minh
TV
Target Value - Giá trị đích
PI
Package Insert - Gói kèm của nhà sản xuất
UVL
Upper Verification Limit - Giới hạn xác minh trên
SR
User estimate for repeatability (độ lặp lại của người dùng trong
SWL

lần chạy)
User estimate for within - Laboratory imprecision (độ không

R
WL

chính xác của người dùng trong PXN)
Độ lệch PXN trong lần chạy theo yêu cầu nhà sản xuất
Độ lệch của PXN theo yêu cầu của nhà sản xuất

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................3
1. Thẩm định phương pháp...............................................................................3
1.1. Khái niệm...............................................................................................3


1.2. Mục đích của thẩm định phương pháp...................................................5
1.3. Khi nào cần tiến hành thẩm định phương pháp......................................6
1.4. Nội dung của thẩm định phương pháp...................................................7
1.4.1. Độ tập trung (Precision)...................................................................8
1.4.2. Độ đúng (Trueness)..........................................................................9
1.4.3. Độ không đảm bảo đo (Uncertainty of measurement).....................9
2. Hướng dẫn của CLSI..................................................................................10
2.1. EP 05- Đánh giá độ tập trung...............................................................11
2.2. EP 06- Đánh giá tính tuyến tính...........................................................12
2.3. EP 09- Đánh giá độ lệch và so sánh phương pháp sử dụng mẫu bệnh
phẩm.....................................................................................................13
2.4. EP 15A3- Đánh giá độ tập trung và ước tính độ lệch...........................14
2.4.1. Đánh giá độ tập trung.....................................................................15
2.4.2. Ước tính độ lệch.............................................................................16
3. Máy phân tích hóa sinh tự động BECKMAN COULTER AU 5800..........17

3.1. Giới thiệu..............................................................................................17
3.2. Các phương pháp được tiến hành trên máy..........................................19
3.2.1. Phương pháp điện cực chọn lọc ion...............................................19
3.2.2. Phương pháp đo quang...................................................................21
3.2.3. Phương pháp miễn dịch đo độ đục.................................................22
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................24
1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................24
2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu..............................................................24
3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................24
3.1. Thiết kế nghiên cứu:.............................................................................24
3.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................24


3.3. Các chỉ số và biến số trong nghiên cứu................................................27
3.4. Quy trình nghiên cứu............................................................................29
3.4.1. Thực nghiệm đánh giá độ tập trung................................................30
3.4.2. Thực nghiệm ước tính độ lệch........................................................33
3.5. Bộ công cụ nghiên cứu và kỹ thuật thu thập số liệu..............................35
3.6. Phân tích sô liệu và xử lý số liệu...........................................................36
3.7. Đạo đức nghiên cứu...............................................................................36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................37
1. Kết quả đánh giá độ tập trung của các xét nghiệm.....................................37
a. Cách đánh giá độ tập trung.....................................................................37
b. Kết quả đánh giá độ tập trung của các xét nghiệm.................................41
2. Kết quả ước tính độ lệch của các xét nghiệm.............................................42
a. Cách ước tính độ lệch.............................................................................42
b. Kết quả ước tính độ lệch của các xét nghiệm.........................................43
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN.............................................................................45
KẾT LUẬN....................................................................................................51
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4
DANH MỤC BẢN
Bảng 2.1. ANOVA tính toán phương sai một chiều.......................................31
YBảng 3.1. Kết quả ANOVA và ước tính về sự không chính xác của xét
nghiệm HbA1c ở 2 mức nồng ……………………………..…….….39
Bảng 3.2. Giá trị UVL được ước tính cho yêu cầu về sự chính xác của PI của
PXN.....................................................................................................40


Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ tập trung của một số xét nghiệm trên máy hóa
sinh tự động AU 5800.........................................................................41
Bảng 3.4. Kết quả ước tính độ lệch của một số xét nghiệm trên máy hóa sinh
tự động AU 5800.................................................................................43

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Máy phân tích hóa sinh tự động Beckman Coulter AU5800...........19
Hình 1.2 Sơ đồ minh họa phương pháp điện thế phân tích các chất điện giải 20
Hình 1.3. Cấu tạo máy đo quang.....................................................................21
Hình 1.4. Turbidimetry và Nephlometry.........................................................23
YHình

2.1. Biểu đồ quy trình xử lý đánh giá độ tập trung và ước tính độ lệch
29


Hình 2.2. Biểu đồ luồng quy trình thử nghiệm đánh giá độ tập trung.............30
Hình 2.3. Tổng quan về ước tính độ lệch sử dụng vật liệu với nồng độ đã

biết...................................................................................................33
YHình

3.1. Cách xử lý số liệu để đánh giá độ tập trung của xét nghiệm HbA1c
trên chất chứng mức QC1 với ANOVA..........................................37

Hình 3.2. Cách xử lý số liệu để đánh giá độ tập trung của xét nghiệm HbA1c
trên chất chứng mức QC2 với ANOVA...........................................38
Hình 3.3. Cách ước tính độ lệch của xét nghiệm HbA1c................................42


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự phát triển của khoa học công nghệ, kinh tế và xã hội kéo theo các
gánh nặng sức khỏe ngày càng gia tăng. Chính vì vậy nhu cầu chăm sóc sức
khỏe, nâng cao chất lượng cuộc sống ngày càng được quan tâm đặt lên hàng
đầu và cũng là thách thức đối với ngành Y Tế. Để có một kết quả chẩn đoán
chính xác không chỉ dựa vào phán đoán chủ quan mà đòi hỏi cần có những
bằng chứng khách quan. Do đó xét nghiệm y học trở thành một lĩnh vực ngày
càng quan trọng và cần thiết. Xét nghiệm đóng vai trò quan trọng trong việc
chẩn đoán, xác định bệnh, căn nguyên gây bệnh để quyết định phương pháp
điều trị, đánh giá hiệu quả điều trị và tiên lượng bệnh. Các kết quả xét nghiệm
là tiêu chuẩn, căn cứ để hỗ trợ các bác sĩ trong công tác điều trị cho bệnh
nhân. Do vậy, việc thiết lập một hệ thống kiểm soát chất lượng phòng xét
nghiệm cũng được chú trọng nhằm đưa ra kết quả xét nghiệm có độ tin cậy
cao. Kiểm soát chất lượng phòng xét nghiệm được đưa ra nhằm phát hiện,
giảm thiểu và chỉnh sửa những sai sót trong quy trình phân tích tại phòng xét
nghiệm trước khi trả kết quả cho bệnh nhân, nhằm nâng cao chất lượng kết
quả xét nghiệm của phòng xét nghiệm.
Thẩm định phương pháp xét nghiệm (Validation) là sự khẳng định bằng

kiểm tra cung cấp các bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp
xét nghiệm đó đáp ứng các yêu cầu đặt ra. Kết quả của thẩm định phương
pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân
tích. Thẩm định phương pháp là một phần không thể thiếu nếu muốn có một
kết quả đáng tin cậy [1]. Việc thẩm định phương pháp cần thiết trước khi đưa
thiết bị mới, kỹ thuật mới vào sử dụng nhằm xác nhận các tiêu chuẩn kỹ thuật
mà nhà sản xuất đã công bố là đúng trong điều kiện phòng xét nghiệm [2],
[3]. Đây là một đòi hỏi bắt buộc cho hệ thống các phòng xét nghiệm để có thể


2
được công nhận ISO 15189 [3], [4]. Tuy nhiên thẩm định phương pháp là việc
làm khá tốn kém, đòi hỏi nhiều thời gian, nhân lực, vật lực. Do vậy vấn đề
cấp thiết đặt ra là cần phải giảm thiểu tối đa chi phí và thời gian cho công tác
thẩm định phương pháp nói riêng và quản lý chất lượng xét nghiệm nói chung
nhưng đảm bảo chất lượng xét nghiệm [5]. Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét
nghiệm Hoa Kỳ (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI) xây
dựng hướng dẫn EP 15A3 trong đánh giá độ tập trung và ước tính độ lệch
nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn đặt ra. Hướng dẫn EP 15A3 được xây
dựng với mục tiêu xây dựng quy trình kỹ thuật đơn giản và nghiêm ngặt có
thể áp dụng trong các phòng xét nghiệm khác nhau về trang thiết bị, kỹ
thuật, nguồn lực.
Tại khoa Hóa Sinh bệnh viện Nhi Trung Ương đang triển khai hệ thống
máy hóa sinh tự động với số lượng mẫu lớn mà mẫu bệnh phẩm là của bệnh
nhi nên yêu cầu về chất lượng xét nghiệm càng cao. Để đảm bảo sự chính xác,
tin cậy và giảm thiểu sai sót của kết quả xét nghiệm cần thực hiện phương
pháp thẩm định quy trình đo lường tại khoa. Việc tiến hành thực hiện nghiên
cứu “Áp dụng hướng dẫn EP15-A3 của CLSI trong thẩm định một số xét
nghiệm hoá sinh” tại Khoa Hóa sinh – Bệnh viện Nhi Trung Ương với các
mục tiêu:

1. Đánh giá độ tập trung của một số xét nghiệm hóa sinh trên máy AU
5800.
2. Ước tính độ lệch một số xét nghiệm trên máy AU 5800.


3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Thẩm định phương pháp
1.1.

Khái niệm
Trước khi áp dụng một phương pháp phân tích mới vào phòng xét

nghiệm thì cần phải chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu
cầu đặt ra, nghĩa là phải thực hiện các nghiệm pháp đánh giá phương pháp.
Hiện nay có nhiều thuật ngữ khác nhau được sử dụng để mô tả phạm vi của
các thực nghiệm đánh giá phương pháp như: thẩm định phương pháp
(Validation), đánh giá phương pháp (Evaluation), xác nhận phương pháp
(Verification) hay chứng minh phương pháp (Demonstration).
Thẩm định phương pháp (Validation) là sự khẳng định bằng việc kiểm
tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp
ứng được các yêu cầu đặt ra (fitness for the purpose). Kết quả của thẩm định
phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết
quả phân tích. Thẩm định phương pháp phân tích là một phần không thể thiếu
nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy.
Đánh giá (Evaluation) là xác định các đặc tính hiệu năng kỹ thuật của
một phương pháp mới.
Xác nhận (Verification) là khẳng định bằng kiểm tra các bằng chứng
khách quan cho thấy các yêu cầu cụ thể của một phương pháp định sử dụng

có thể đáp ứng được.
Chứng minh (Demonstration) là sự đánh giá tối thiểu mà PXN sử dụng
để cho thấy phương pháp có thể đạt được kết quả như trông đợi bằng cách
theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Điều này thích hợp cho các hệ thống


4
xét nghiệm mà các đặc tính về hiệu năng đã được đánh giá kỹ lưỡng và được
công bố.
Xác nhận phương pháp và/hoặc thẩm định phương pháp là một quá
trình mà một phương pháp được xác định là phù hợp với mục đích và dự định
sử dụng. Mặc dù thẩm định và xác nhận đôi khi được dùng như nhau nhưng
xác nhận (verification) áp dụng để kiểm tra lại khả năng thực hiện của các
phương pháp được công bố hoặc phương pháp không có cải tiến, còn thẩm
định (validation) thường được áp dụng đối với các phương pháp tự chế hoặc
được cải tiến [6], [7]. Hơn nữa, thẩm định phương pháp là một quá trình khắt
khe và phức tạp với nhiều thực nghiệm cần được tiến hành nhằm đảm bảo
phương pháp phân tích thực hiện đáng tin cậy, chính xác. Xác nhận phương
pháp là công cụ khác nhau dùng để đánh giá tính tin cậy của phương pháp tuy
hạn chế hơn thẩm định phương pháp nhưng lại không khắt khe và phức tạp
như thẩm định phương pháp [8].
Phòng thử nghiệm thường sử dụng nhiều phương pháp khác nhau. Dựa
vào nguồn gốc có thể phân loại các phương pháp thành hai nhóm:
- Các phương pháp tiêu chuẩn: các phương pháp thử theo tiêu chuẩn quốc
gia, quốc tế, hiệp hội khoa học được chấp nhận rộng rãi trên thế giới như
TCVN, ISO, ASTM, AOAC…
- Các phương pháp không tiêu chuẩn hay phương pháp nội bộ (nonstandard/alternative/in-house method): là các phương pháp do phòng thử
nghiệm tự xây dựng, phương pháp theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị,
phương pháp theo các tạp chí, tài liệu chuyên ngành...

 Thẩm định phương pháp tiêu chuẩn (method verification)
Một phương pháp phân tích trước khi được áp dụng cần có các chứng
minh rằng phương pháp đó đáp ứng yêu cầu đặt ra, tức là phương pháp phải
được thẩm định. Yêu cầu này không chỉ cho các phương pháp thử nội bộ mà


5
còn cần cho các phương pháp tiêu chuẩn. Việc thẩm định phương pháp tiêu
chuẩn và phương pháp nội bộ có sự khác nhau, do đó cần chú ý khi lập kế
hoạch thẩm định.

 Thẩm định phương pháp không tiêu chuẩn (method validation)
Đối với phương pháp không tiêu chuẩn, việc thẩm định phải trải qua
nhiều bước hơn bắt đầu từ quá trình nghiên cứu khảo sát phương pháp, tối ưu
hóa phương pháp đến khi hoàn thiện phương pháp. Thẩm định phương pháp
là một yêu cầu bắt buộc phải thực hiện đi kèm với việc phát triển phương
pháp mới và áp dụng các phương pháp không tiêu chuẩn vào thực hiện thành
thường quy.

 Thẩm định lại
Công việc thẩm định không phải chỉ cần thực hiện một lần khi phát
triển phương pháp ban đầu mà cần thực hiện trong suốt quá trình áp dụng. Vì
đa số các điều kiện thực hiện phương pháp có sự thay đổi trong suốt quá trình
áp dụng. Trong trường hợp kết quả phân tích mẫu kiểm tra (QC) hoặc kết quả
đánh giá sự phù hợp của hệ thống nằm ngoài giới hạn cho phép thì phương
pháp cũng cần phải thẩm định lại. Phòng thử nghiệm nên phối hợp quá trình
tính độ ổn định (độ vững) với quá trình thẩm định lại các phương pháp phân
tích hàng ngày (routine method).
1.2.

Mục đích của thẩm định phương pháp
Việc áp dụng đưa các phương pháp mới hay các phương pháp đã được

hiệu chỉnh lại vào PXN lâm sàng là một việc diễn ra thường xuyên. Lựa chọn
và đánh giá phương pháp là những bước chủ yếu trong quá trình đưa vào ứng
dụng các phương pháp mới. Khi phương pháp mới trước khi được sử dụng
trong phòng PXN thì cần được xác nhận hiệu năng có phù hợp với mục đích
sử dụng hay không. Mục đích chính là đánh giá sai số, để chứng minh rằng
trước khi trả kết quả xét nghiệm cho bệnh nhân, phương pháp đã được đánh


6
giá các tiêu chuẩn hiệu năng như độ xác thực, độ chính xác, khoảng tuyến tính
có thể so sách với các thông số nhà sản xuất công bố. Phòng xét nghiệm phải
kiểm tra khoảng tham chiếu của nhà sản xuất có thích hợp không.
Ngay cả khi nhà sản xuất đã đưa ra các thông số kỹ thuật và áp dụng
vào phòng xét nghiệm thì cũng phải kiểm tra xem các thông số có đúng với
các điều kiện của phòng xét nghiệm hay không. Để xác định về mặt định
lượng hiệu năng của phương pháp, của hệ thống khi áp dụng phương pháp
mới. Ngoài ra còn để xác định sự khác nhau giữa các phương pháp được áp
dụng trong phòng xét nghiệm [8].
1.3.

Khi nào cần tiến hành thẩm định phương pháp
Kết quả xét nghiệm bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố như: điều kiện

tiện nghi môi trường thay đổi, thay đổi thiết bị, nhân viên, thay đổi địa điểm
phòng xét nghiệm, ở các điều kiện môi trường khác nhau thì đem lại một kết
quả xét nghiệm khác nhau. Sự khác nhau này thường không đáng kể, tuy
nhiên cần phải chứng minh các phương pháp được sử dụng trong phòng xét

nghiệm của bạn phù hợp với yêu cầu của nhà sản xuất. Trước khi đưa vào sử
dụng máy móc thiết bị, cũng cần phải chứng minh những kết quả của nhà sản
xuất báo cáo là đáng tin cậy [6], [7].
Việc thẩm định không chỉ diễn trong một lần khi mới phát triển phương
pháp ban đầu vào sử dụng mà còn được thực hiện định kỳ hàng năm trong
suốt quá trình sử dụng vì sự thay đổi của điều kiện thực hiện phương pháp
như: thay đổi điều kiện vật chất, nhân viên, thiết bị và hóa chất thuốc thử….
Hay trong trường hợp các giá trị kết quả phân tích mẫu kiểm tra chất lượng
hoặc kết quả đánh giá sự phù hợp của hệ thống nằm ngoài giới hạn cho phép
của nhà sản xuất thì cần phải xác nhận lại phương pháp. Do vậy, xác nhận
phương pháp cần được tiến hành trước khi đưa máy xét nghiệm vào phục vụ
cho bệnh nhận, khi có sự thay đổi thiết bị, cải tiến/hiệu chỉnh trang thiết bị


7
của PXN hay định kỳ tại các khoảng thời gian nhất định để đánh giá hiệu
năng phương pháp đang sử dụng. Tuy nhiên, các thông số cần xác nhận lại
phụ thuộc vào mức độ ảnh hưởng của các thiết bị thay đổi đến các thông số
của phương pháp. Để tiết kiệm chi phí, đơn giản hóa quy trình xác nhận mà
vẫn đảm bảo được tính chính xác, CLSI đã thiết kế, xây dựng quy trình
EP15A3 để đánh giá độ tập trung và ước tính sai lệch [5].
1.4.

Nội dung của thẩm định phương pháp
Thẩm định phương pháp là một công việc rất khó khăn và tốn kém, tuy

nhiên lại là một nội dung quan trọng ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả
xét nghiệm. Cần phải cân nhắc mục đích yêu cầu của từng phương pháp và
nguồn lực để lựa chọn thống số thẩm định cho phù hợp [1],[6],[7],[9].
Các thông số kỹ thuật đánh giá hiệu năng phương pháp xét nghiệm bao

gồm:
- Độ đặc hiệu, tính chọn lọc (Specificity/Selectivity)
- Độ nhạy (Sensitivity)
- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn (Linearity and Calibration curve)
- Giới hạn phát hiện (Limit of Detection- LOD)
- Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation- LOQ)
- Độ lệch/ độ đúng (Bias/Truness)
- Độ tập trung (Precision)
- Độ xác thực (Accuracy)
- Độ ổn định của phương pháp (Robustness/Ruggedness)
- Độ không đảm bảo đo (The measurement uncertainty)
Việc lựa chọn các thông số thẩm định, đánh giá tùy thuộc vào kỹ thuật áp
dụng trong PXN, yêu cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn lực của
PXN… Từng trường hợp cụ thể các thông số thẩm định có thể có sự khác
nhau [3].


8


9
1.4.1. Độ tập trung (Precision)
Độ tập trung là mức độ gần đúng giữa các kết quả thực hiện độc lập
trên cùng một mẫu và trong cùng điều kiện thực hiện; được biểu thị dưới dạng
độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên (CV) [1].
Độ tập trung chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan
đến giá trị thực. Độ tập trung là các kết quả xét nghiệm thu được gần nhau, ít
phân tán. Sự phân tán của các kết quả thu được càng nhỏ thì độ tập trung càng
cao và ngược lại.
Nguyên tắc kiểm tra độ tập trung là kiểm tra tính (lặp lại) của các kết

quả xét nghiệm (làm nhiều lần xét nghiệm với cùng một kỹ thuật trên cùng
một mẫu xét nghiệm) đây được xem như thực nghiệm đầu tiên của đánh giá
phương pháp mới. Một phương pháp không tập trung thì có thể không chính
xác do vậy không cần phải tiến hành các thực nghiệm khác nữa. Có hai loại
độ tập trung cần kiểm tra là: độ tập trung ngắn hạn (short - term precision)
hay độ tập trung trong lần chạy (within - run precision) và độ tập trung dài
hạn (long - term precision) hay độ tập trung giữa các lần chạy (between - run
precision).
- Độ tập trung ngắn hạn:
Kiểm tra khả năng của một phương pháp lặp lại kết quả của chính mẫu
đó cho dù nó được đặt ở bất kỳ vị trí nào trong lần chạy. Để đánh giá tính lặp
lại kết quả trong một khoảng thời gian ngắn, hoặc mẫu bệnh phẩm hoặc QC
được đặt ở các vị trí bất kỳ trong lần chạy đó [6],[7].
- Độ tập trung dài hạn:
Đánh giá khả năng của một phương pháp lặp lại kết quả của một mẫu
khi chạy nhiều lần khác nhau. Giả thiết là không có sự can thiệp y tế nào hoặc
thay đổi tình trạng sức khỏe của bệnh nhân giữa các lần lấy mẫu. Độ tập trung
dài hạn giúp kiểm tra PXN có đạt kết quả cơ bản là không thay đổi cho một


10
chất phân tích trên một bệnh nhân cụ thể cho dù mẫu có được chạy ở các ngày
khác nhau. Độ tập trung giữa các lần chạy cũng cần được kiểm tra ít nhất ở
các nồng độ khác nhau. Các nồng độ này đặc trưng cho các giá trị thấp, trung
bình, cao trong khoảng tuyến tính đã thiết lập được và tương ứng với các giá
trị gặp ở bệnh nhân. Các nồng độ này thường liên quan đến các điểm có tính
quyết định về y học [6], [7].
1.4.2.

Độ đúng (Trueness)

Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá

trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp
nhận là đúng. Mỗi chất trong mẫu thử đều có trị số thực của nó, việc xác định
trị số thực của mỗi thành phần trong một mẫu huyết thanh hay mẫu chuẩn hết
sức khó khăn. Những kết quả có trị số gần đến thực là trị số có độ xác thực
cao [10]. Mục đích của kiểm tra độ đúng của kỹ thuật nhằm phát hiện và loại
bỏ những sai số hệ thống có thể xảy ra trong quá trình làm xét nghiệm. Sai số
hệ thống luôn có chiều hướng và gây ra tất cả các kết quả xét nghiệm hoặc
cao hơn hoặc thấp hơn giá trị thực.
Một phương pháp xét nghiệm thu được kết quả đúng khi kết quả xấp xỉ
bằng trị số thực của nó. Trị số thực là khái niệm lý tưởng rất khó thực hiện
được trên thực tế mà chỉ có giá trị thực theo quy ước. Người ta phải lặp lại
nhiều lần trên cùng một mẫu và kết quả cũng phải lặp lại nhiều lần được coi là
số thực. Nếu một phương pháp không đảm bảo được độ đúng thì nó không
được xác nhận [8].
1.4.3. Độ không đảm bảo đo (Uncertainty of measurement)
Công việc định lượng là một quá trình thực nghiệm để thu được một
giá trị về lượng bằng cách sử dụng quy trình đo lường bao gồm nhiều bước.
Nếu hệ thống đo lường đủ nhạy, các phép đo lặp lại trên cùng một mẫu thì
cũng luôn cho các giá trị khác nhau ngay cả khi điều kiện thực hiện đều giống


11
nhau. Như vậy, việc đo lặp lại không cho một giá trị duy nhất, do đó tồn tại
một độ không đảm bảo về giá trị thực của mẫu được đo. Tính toán độ
không đảm bảo đo là rất cần thiết đối với các xét nghiệm định lượng, ngoài
ra cũng có thể dựa vào thông số này để so sánh với một phương pháp khác.
Việc đánh giá toàn diện các thành phần để tính độ không đảm bảo đo có thể
phát hiện ra phương pháp khác tương tự để cải thiện quy trình cũng như độ

tin cậy cao hơn [11].
Khái niệm: Độ không đảm bảo đo của phép đo là thông số gắn với kết
quả của phép đo, thông số này đặc trưng cho mức độ phân tán của các giá trị
có thể chấp nhận được quy cho đại lượng đo của phép đo. Với các phòng xét
nghiệm lâm sàng, điểm cuối cùng trong ước tính độ không đảm bảo đo là xác
định khoảng giá trị mà giá trị thật của phép đo nằm trong đó ở một độ tin cậy
nhất định.
Trong một phép thử có rất nhiều nguồn gây ra độ không đảm bảo đo:
Mẫu thử, lấy mẫu, điều kiện bảo quản, chuẩn bị mẫu, dung môi và thuốc thử,
thiết bị, điều kiện môi trường, con người, nguồn ngẫu nhiên khác.
2.

Hướng dẫn của CLSI
Viện tiêu chuẩn phòng xét nghiệm và lâm sàng (CLSI) là tổ chức phi

chính phủ, phi lợi nhuận với mục đích hỗ trợ các phòng xét nghiệm và lâm
sàng trong việc xây dựng, phát triển và sử dụng các tiêu chuẩn, hướng dẫn
đồng thuận tự nguyện trong phòng xét nghiệm. Các hướng dẫn của CLSI xây
dựng và phát triển với mục đích cải thiện chất lượng xét nghiệm và dịch vụ
chăm sóc bệnh nhân nhằm nâng cao sức khỏe cộng đồng trên khắp thế giới.
Các hướng dẫn này được công nhận bởi Viện Tiêu chuẩn Quốc gia Hoa Kỳ
(American National Standards Institute –ANSI) và được tham chiếu trong các
quy định của chính phủ cũng như các tiêu chuẩn quốc tế. CLSI có trên 25
mục tiêu chuẩn, hướng dẫn đánh giá, trong đó có một số đánh giá cần thực


12
hiện trước khi báo cáo kết quả của một phương pháp mới bao gồm: độ tập
trung, độ chính xác, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định
lượng, độ nhạy…

2.1.

EP05 - Đánh giá độ tập trung
Tài liệu EP05 cung cấp những hướng dẫn cho các nghiên cứu nhằm

thiết lập các đặc tính hiệu suất chính xác tại chỗ đối với các quy trình đo định
lượng được sử dụng trong các phòng xét nghiệm lâm sàng. Rất nhiều giao
thức trong thực nghiệm được mô tả, cùng với việc cân nhắc cách lựa chọn
cùng với sự tối ưu hóa các giao thức phù hợp nhất đối với một quy trình đo
lường cụ thể (hoặc các xét nghiệm) và tùy vào mục đích sử dụng của nó.
Thiết kế thử nghiệm các quy trình phù hợp nhằm thiết lập hoặc xác
nhận các đặc tính hiệu suất chính xác. Do vậy, EP05 giải quyết được nhu cầu
cho các nhà sản xuất và phát triển. Các khuyến nghị trong phòng thí nghiệm
của người dùng để xác minh độ lặp lại và yêu cầu độ chính xác trong phòng
thí nghiệm có thể tìm thấy trong tài liệu EP15. Giao thức xác minh chính xác
trong hướng dẫn điều chỉnh thích hợp với các nghiên cứu tại chỗ của EP05.
Thực hiện trong 20 ngày, với 2 lần chạy mỗi ngày và lặp lại hai lần đối
với mỗi một lần chạy cho một mẫu nhất định, cùng lô thuốc thử,... như một
thực nghiệm tiêu chuẩn hóa để các nhà sản xuất và nhà phát triển sử dụng để
đánh giá độ lặp và độ chính xác trong phòng thí nghiệm của một quy trình đo
lường hoặc các thử nghiệm xác nhận. Tính toán độ trung bình, SD, và CV%
của kết quả thu được để đánh giá độ tập trung ngắn hạn và độ tập trung dài
hạn. Tiêu chuẩn chấp nhận là: CV độ tập trung ngắn hạn 0.25x TEa, CV độ
tập trung dài hạn 0.33 x TEa (TEa là sai số toàn bộ cho phép - Total
Analytical error) [12].


13
2.2.

EP06 - Đánh giá tính tuyến tính
Tài liệu cung cấp hướng dẫn mô tả đặc tính tuyến tính của một phương

pháp trong quá trình đánh giá phương pháp; kiểm tra tuyến tính như là một
phần của đảm bảo chất lượng; và để xác định và nêu rõ yêu cầu của nhà sản
xuất đối với phạm vi tuyến tính. Nó còn được sử dụng để chứng minh mức độ
và một phương pháp phân tích định lượng đáp ứng các yêu cầu lâm sàng hoặc
yêu cầu phạm vi tuyến tính của nhà sản xuất.
Khoảng tuyến tính (Linearity range) của một phương pháp phân tích là
khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa các đại lượng đo được
và nồng độ chất phân tích, nói một cách đơn giản hơn là các kết quả xét
nghiệm nhỏ nhất và cao nhất có thể đủ tin cậy để thông báo. Khoảng tuyến
tính còn gọi là khoảng đo lường phân tích (Analytical Measurement RangeAMR) là khoảng giá trị đo của thiết bị có thể sử dụng để báo cáo trực tiếp
(reportable range), không đòi hỏi phải pha loãng hay cô đặc mẫu xét nghiệm.
Đối với hầu hết các phương pháp định lượng, cần phải thực hiện để xác định
khoảng tuyến tính. Kiểm tra khoảng tuyến tính là bước đầu tiên về độ xác
thực của phương pháp mới. Đánh giá khoảng tuyến tính của một phương pháp
còn là phương pháp giúp nhân viên PXN làm quen với các yêu cầu đặc biệt
của quy trình mới. Hướng dẫn EP06 của CLSI phát triển quy trình xác nhận
hoặc thiết lập khoảng tuyến tính của một phương pháp đo bằng cách đánh giá
một loạt các dung dịch chuẩn có độ tinh sạch đã biết và có nồng độ khoảng
tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo
sát sự phụ thuộc của trị số đo được và nồng độ. Sau khi các dung dịch chuẩn
hoặc các mẫu bệnh phẩm được lựa chọn và phân tích, thường lặp lại 3 lần,
tính giá trị trung bình của mỗi nồng độ. Xác định giá trị mong đợi (lý thuyết)
cho mỗi nồng độ: sử dụng nồng độ biết trước nếu có. Khi vật liệu sử dụng là
mẫu bệnh phẩm chưa biết nồng độ thì nồng độ trung bình của hỗn hợp có


14

nồng độ thấp nhất và hỗn hợp có nồng độ cao nhất được dùng để tính nồng độ
của hỗn hợp còn lại. Sử dụng phương pháp phân tích hồi quy đa thức để đánh
giá xem khoảng giá trị đánh giá có tuyến tính hay không [8], [9].
2.3.

EP09 - Đánh giá độ lệch và so sánh phương pháp sử dụng mẫu

bệnh phẩm (Evaluation of Bias and Comparability Using Patient
Samples)
Hướng dẫn EP09 của CLSI xây dựng và phát triển quy trình đánh giá
độ chính xác của phương pháp bằng thực nghiệm đánh giá độ lệch và so sánh
phương pháp sử dụng mẫu bệnh phẩm. Một số mẫu bệnh phẩm được chia ra
làm hai, một dùng để xét nghiệm bằng phương pháp mới (phương pháp cần
xác nhận), phần còn lại phân tích bằng phương pháp đang sử dụng. So sánh
kết quả thu được của hai phương pháp nhằm kiểm tra xem phương pháp mới
có tốt hơn không hay tương tự phương pháp đang sử dụng. Để tiến hành thực
nghiệm đòi hỏi tối thiểu 40 mẫu bệnh phẩm. Các mẫu bệnh phẩm này phải
dặc trưng cho dải nồng độ rộng, ít nhất 50% giá trị nằm ngoài khoảng tham
chiếu. Tỷ lệ phần trăm các mẫu có nồng độ cao và thấp tốt nhất phản ánh
đúng tỉ lệ hay gặp tại PXN. Mỗi mẫu bệnh phẩm được phân tích 2 lần một
phương pháp việc phân tích bằng 2 phương pháp nên đồng thời hoặc chỉ cách
nhau 2 đến 4 giờ, tiến hành phân tích trong tối thiểu là 5 ngày. Sử dụng các
thuật toán thống kê để phân tích kết quả sau đó đánh giá sai số hệ thống dựa
trên sự khác biệt của hai phương pháp. Sự khác biệt giữa phương pháp cần
thẩm định và phương pháp tham chiếu cần được phân tích, đánh giá một cách
thận trọng. Nếu sự khác biệt nhỏ, có thể xem như hai phương pháp có độ
chính xác tương đương nhau. Nếu sự khác biết lớn và không thể chấp nhận
được về y khoa, cần phải đánh giá lại xem phương pháp nào chính xác hơn
[8], [13], [14].

15
2.4.

EP15A3 - Đánh giá độ tập trung và ước tính độ lệch
Trong phiên bản này, phòng xét nghiệm xác nhận một phương pháp

hoạt động trong sự phù hợp với công bố của nhà sản xuất về độ chính xác và
ước tính độ lệch đã được thiết kế. Hầu hết các nhà sản xuất tuân theo tài liệu
CLSI EP05 để đánh giá về độ tập trung, và các tuyên bố này tương đối dễ
dàng kiểm chứng bằng cách sử dụng phương pháp được quy định trong
EP15A3. Với thiết kế thử nghiệm trong 5 ngày, và tăng số lần lặp lại lên 5 lần
mỗi ngày để có được ước tính đáng tin cậy hơn về độ lặp lại và sự thiếu chính
xác trong phòng thí nghiệm. Đồng thời các phép tính phức tạp được thay thế
bằng các bảng để tính toán dễ dàng hơn và giảm thiểu lỗi.
Hướng dẫn như một giao thức để đồng thời xác minh tuyên bố của nhà
sản xuất về độ tập trung của quy trình đo và tính đúng đắn của quy trình đo
tương ứng với giá trị được gán của vật liệu có nồng độ đã biết. Phần xác minh
độ tập trung của hướng dẫn được phát triển cho các tình huống trong đó hiệu
suất của quy trình đã được thiết lập trước đó và được ghi lại bằng các giao
thức thử nghiệm với phạm vi và thời lượng lớn hơn.
Hướng dẫn EP 15A3 của CLSI được thiết kế với 2 mục tiêu chính:
- Thứ nhất: phát triển một giao thức thử nghiệm phù hợp được sử dụng
trong lâm sàng lớn nhưng đủ đơn giản để có thể áp dụng trong phòng thí
nghiệm hoặc điểm chăm sóc.
- Thứ hai: phát triển một giao thức đủ nghiêm ngặt để đưa ra các kết luận
hợp lệ về mặt thống kê cho các nghiên cứu xác minh.
EP 15A3 mô tả hai quy trình.
- Xác nhận độ tập trung dựa trên phân tích lặp lại 5 lần trong một ngày
tối thiểu hai mức nồng độ chất chứng trong 5 ngày.

- Ước tính độ lệch dựa trên kết quả phân tích tối thiểu 2 mức nồng độ đã
xác nhận độ tập trung.


16
2.4.1.

Đánh giá độ tập trung
Trước khi đánh giá độ tập trung, EP15A3 yêu cầu người dùng làm quen

với phòng xét nghiệm, từ quy trình hiệu chuẩn, bảo dưỡng thiết bị, quy trình
quản lý chất lượng để có thể hiểu rõ về hệ thống xét nghiệm đang sử dụng.
Quy trình nội kiểm khuyến cáo bởi nhà sản xuất phải được thực hiện xuyên
suốt trong thực nghiệm đánh giá độ tập trung bằng EP15A3. Vật liệu nội kiểm
nên được lựa chọn có nồng độ gần với điểm quyết định lâm sàng. Vật liệu
kiểm tra dùng trong xác nhận phương pháp cũng nên được lựa chọn có nồng
độ gần với điểm quyết định lâm sàng và gần với nồng độ nội kiểm. Vật liệu
kiểm tra dùng trong đánh giá độ tập trung có thể là mẫu nội kiểm, mẫu bệnh
nhân hoặc vật liệu ngoại kiểm đã biết trước giá trị. Nếu có thể, nên lựa chọn
vật liệu kiểm tra tương tự với vật liệu tham chiếu của nhà sản xuất trong xác
nhận phương pháp hoặc các vật liệu có chất nền tương tự với vật liệu tham
chiếu [14], [15].
EP15A3 phát triển quy trình thử nghiệm trong 5 ngày, mỗi ngày phân tích
lặp lại 5 lần tối thiểu 2 mức nồng độ. Kết quả nội kiểm không đạt hay gặp khó
khăn trong quá trình vận hành hệ thống xét nghiệm, cần loại bỏ kết quả của
lần chạy đó và tiến hành chạy lặp lại xét nghiệm đó. Trong suốt quá trình thực
nghiệm cần phải thực hiện nội kiểm hàng ngày và ghi lại các kết quả của mỗi
lần chạy lại để tiến hành cho việc tính toán tiếp theo. Kết quả thu được sử
dụng thuật toán thống kê để phân tích kết quả. EP15A3 cung cấp cách tính
toán độ tập trung, độ lệch trong phòng xét nghiệm. Các tính toán bao gồm

phương sai ngắn hạn, phương sai dài hạn sau đó kết hợp hai thông số này để
tính toán phương sai tổng. Từ phương sai tổng có thể tính toán ra độ lệch
chuẩn trong phòng xét nghiệm. EP15A3 khuyến cáo rằng giá trị UVL được
tính toán để cung cấp giới hạn trên cho các tuyên bố của nhà sản xuất. Nếu độ
lệch chuẩn trong lần chạy và độ lệch chuẩn của phòng xét nghiệm thấp hơn độ