BÁO CÁO KHOA HỌC: "XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HOÁ SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS VAR. AIZAWAI H1 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM" pptx

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HOÁ SINH VÀ
SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG BACILLUS
THURINGIENSIS VAR. AIZAWAI H1 PHÂN LẬP Ở
VIỆT NAM

Bùi Thị Hương, Nguyễn Thuỳ Châu
Bộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu Hoạch
Đinh Duy Kháng
Phòng Vi Sinh phân tử, Viện Công Nghệ Sinh Học

Bacillus thuringiensis (gọi tắt là Bt) là vi khuẩn gram
dương được phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, chúng chứa
các gen cry sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố
có khả năng diệt nhiều loại côn trùng, vì thế chế phẩm
thuốc trừ sâu vi sinh Bt đã được sử dụng để phòng trừ các
côn trùng dịch hại thuộc các bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ
cánh cứng và các động vật không xương sống khác. Trong
những năm gần đây các nhà khoa học đã tập trung nghiên
cứu, sưu tập, phân tích và sàng lọc các chủng B.
thuringiensis thu nhận được ở các mẫu phân lập từ môi
trường, với mục đích tìm ra những chủng mới có hoạt tính
diệt sâu cao, phổ diệt sâu rộng đối với nhiều loài côn trùng.
Việc xác định sự tồn tại các nguồn gen quý từ những chủng
này là công việc rất cần thiết, làm cơ sở tiền đề cho các
nghiên cứu đi sâu tiếp theo đối với những gen cry này như:
việc gây đột biến vị trí có định hướng đối với gen cry nhằm
tạo chủng B. thuringiensis mới chống khả năng kháng
thuốc của các loại côn trùng; việc tạo ra các chủng B.
thuringiensis tái tổ hợp mới có phổ diệt sâu rộng, hoạt lực
diệt sâu cao hơn đối với nhiều loài côn trùng quan trọng;
việc biến nạp các gen độc tố cry thích hợp vào từng loại

cây trồng để bảo vệ chúng trước sự tấn công của côn
trùng Trong khuôn khổ bài báo này chúng tôi đã tiến
hành thử hoạt tính diệt sâu, thăm dò sự tồn tại gen cry1C và
cry1Ab của chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân
lập ở Việt Nam. Tiến hành tạo dòng và đọc trình tự đoạn
ADN đặc hiệu thuộc gen cry 1C đồng thời so sánh với trình
tự cùng đoạn gen này đã được công bố trong Ngân hàng dữ
liệu gen Quốc tế.

I.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I.1.Thử sinh học hoạt tính diệt sâu:

Tiến hành theo phương pháp của S.H.Park: Đối tượng sâu
được thử là sâu tơ (Plutella xylostella), sâu keo
(Spodoptera exiqua) và sâu khoang (Spodoptera litura): lá
bắp cải tươi được cắt thành các khoanh tròn có đường kính
3cm vào hỗn dịch bào tử tinh thể B. thuringiensis có nồng
độ 5x107 bào tử/ml, sau đó đặt vào đĩa petri và cho vào
mỗi đĩa 10 con sâu; mỗi mẫu thử với 30 con sâu. Đối với
sâu bông ( Helicoverpa armigera) cũng được tiến hành
tương tự trên lá bông. Hoạt tính diệt sâu ngài gạo (Corrcyra
cephalonia) được đánh giá như sau: bỏ 30 con sâu ngài gạo
vào bình thuỷ tinh 400g gạo đã được nhiễm bào tử và tinh
thể của B. thuringiensis với liều 5x107 bào tử/gam gạo,
nuôi ở 30
0
C với độ ẩm 70-80%.

I.2. Điện di protein (SDS-PAGE) bào tử và tinh thể của

chủng B. thuringiensis var. aizawai H1

Chủng B. thuringiensis phát triển trên môi trường thạch T3
đã được tạo hỗn dịch trong 5 ml dịch 0,02% Triton X-100.
Ly tâm trong 1 phút. Cắn được hoà tan với 30 l đệm SDS
(1x SDS gel- loading buffer). Các mẫu được đun sôi trong
5 phút, ly tâm ở 8000vòng/phút trong 5 phút, lấy dịch nổi
và chạy điện di trên gel polyacryamide 10% ở 30mA theo
phương pháp của Sambrook và Maniatis [5].

I.3. Xác định sự tồn tại gen cry1Ab, cry1C bằng kỹ thuật
PCR.

Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25l đựng
trong ống Eppendorf bao gồm các thành phần: nước khử
ion 13,6l, dNTP 2,5l, buffer 2,5l, primer 2l, enzim
Tag-polymeraza 0,4l, MgCl2: 2l, ADN 2l ( nồng độ
50ng/l).

Sử dụng cặp mồi TY6(5’-
GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’) và
TY14(5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’); TYIC
(5’-CAACCTCTATTTGGTGC AGGTTC-3’) và TYIUNI
(5’-ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC-
3’) theo thứ tự, để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong
gen cry1Ab và cry1C. Các sản phẩm PCR được phân tích
bằng điện di trên gel agaroza 1%.

I.4. Tạo dòng đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1C.

Tạo vectơ tái tổ hợp: tiến hành theo phương pháp của
Sambrook và cs [5]: gắn trực tiếp sản phẩm PCR được tạo
ra ở mục I.3 vào vectơ tách dòng PCR
TM
2.1. Phản ứng gắn
gồm: nước khử ion: 3l; Dung dịch đệm gắn: 1l; Sản
phẩm PCR:3l; vectơ PCR
TM
2.1: 2l; T4- ligaza: 1l. Ủ
qua đêm ở nhiệt độ 14
0
C. Sau đó biến nạp sản phẩm gắn
vào vi khuẩn E. coli chủng DH5. Các khuẩn lạc E. coli
chứa vectơ pCRTM 2.1 tái tổ hợp được chọn lọc trên môi
trường LB chứa ampixillin, IPTG (Isopropyl- -D-
Thiogalactopyranoside) và X-gal. Sau đó tách chiết ADN
plasmit từ tế bào vi khuẩn bằng cách xử lý với dung dịch
chứa NaOH, SDS để phá vỡ tế bào. Thu dịch nổi chứa
ADN plasmit, kết tủa bằng cồn rồi hoà lại cặn trong dung
dịch đệm TE, ARN được loại bằng RNaza nồng độ
100g/ml.

I.5. Phân tích trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C.

Sau khi tách chiết và tinh sạch vectơ tái tổ hợp từ tế bào
chủ, gen được xác định trình tự theo phương pháp enzim
học của Sanger nhờ bộ kit của Hãng Amersham-Pharmacia
Biotech với máy đọc trình tự ADN tự động ALF-Express
của Hãng Pharmacia. Phân tích kết quả được tiến hành với
chương trình PC/Gene.

II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

II.1. Thử sinh học hoạt tính diệt sâu của chủng B.
thuringiensis var. aizawai H1 phân lập

Chủng B. thuringiensis phân lập đã được phân loại là chủng
B. thuringiensis var. aizawai theo phương pháp định typ
huyết thanh của Ohba và Aizawai [1].

Chúng tôi đã tiến hành thử sinh học hoạt tính diệt sâu của
chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập có tinh thể
hình quả trám đối với một số côn trùng phổ biến thuộc bộ
cánh vảy như sâu ngài gạo, sâu tơ, sâu keo, sâu khoang và
sâu bông kết quả được chỉ ra ở bảng 1:
Bảng 1: Hoạt tính diệt sâu của các chủng B. thuringiensis
var. aizawai H1 phân lập đối với sâu tơ (Plutella
xylostella), sâu keo (Spodoptera exiqua), sâu khoang
(Spodoptera litura), sâu bông (Helicoverpa armigera) và
sâu ngài gạo (Corrcyra cephalonica)



Kết quả bảng 1 cho thấy: chủng B. thuringiensis var.
aizawai H1 phân lập có hiệu lực diệt đặc hiệu cao là 100%
đối với sâu ngài gạo, sâu tơ và sâu keo. Hiệu quả diệt giảm
hơn đối với sâu khoang (90%) và giảm hơn nữa trên đối
tượng sâu bông (30%). Như vậy chủng B. thuringiensis var.
aizawai H1 có ý nghĩa rất quan trọng để bổ sung vào bộ
sưu tập chủng giống phục vụ cho công nghệ sản xuất thuốc

trừ sâu vi sinh B. thuringiensis.

Kết quả thử sinh học cho thấy sâu bông là loài rất khó diệt.
Chúng tôi cho rằng cần phải có những nghiên cứu sâu hơn
về mặt sinh học phân tử đối với chủng B. thuringiensis var.
aizawai H1 có hiệu lực diệt sâu bông nói trên như: phân
tích sự tồn tại các gen cry, tạo dòng và đọc trình tự các gen
cry mã hoá protein tinh thể độc tố có hiệu lực diệt sâu
bông, từ đó tạo ra chủng B. thuringiensis tái tổ hợp mới có
hiệu lực diệt sâu bông là rất cần thiết và có ý nghĩa thực
tiễn cho công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu B. thuringiensis
diệt trừ sâu bông H. armigera tại Việt nam.

II.2. Phân tích protein tinh thể và bào tử của các chủng
B. thuringiensis var. aizawai phân lập bằng phương pháp
điện di protein.

Hình 1: Điện di đồ protein trên gel 10% polyacrylamit
(PAGE) của chủng
B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập và chủng chuẩn.

Chú thích: Kênh 1: Maker (chỉ thị với phosphorylase có
trọng lượng phân tử 97,4kDa, Bovin serum albumin – 66
kDa, Ovalbumin – 42,7 kDa, Carbonic anhydrase – 31kDa,
Soybean tripsin inhibitor – 21,5 kDa, -Lactalbumin – 14,4
kDa); Kênh 2: chủng chuẩn Bt. var aizawai ; Kênh 3: chủng
Bt. var. aizawai H1 phân lập.

Kết quả điện di protein tinh thể của chủng Bt. var aizawai
H1 phân lập được chỉ ra ở hình 1 cho thấy: Chủng Bt. var

aizawai phân lập có khuôn mẫu protein giống với chủng Bt.
var aizawai chuẩn gồm có các băng protein với trọng lượng
phân tử là: 130, 81, 71 kDa.

II.3.Xác định sự tồn tại gen cry1Ab và cry1C của chủng
B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập:

Chúng tôi đã tiến hành sử dụng cặp mồi TYIC và TYIUNI
để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong gen cry1C của
chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập và chủng
chuẩn B. thuringiensis var. aizawai M1, kết quả được thể
hiện ở hình 2

Hình 2. Điện di đồ sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry 1C
của chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập và
chủng chuẩn B. thuringiensis var. aizawai M1

Chú thích: Kênh 1: Sản phẩm PCR chủng chuẩn Bt.
aizawai cắt bằnglM1; Kênh 2: Chỉ thị phân tử (ADN Hind
III và EcoR I) từ trên xuống 21226, 5148, 4973, 4277,
3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564 bp). Kênh 3:
sản phẩm PCR chủng B. thuringiensis var. aizawai H1
phân lập.

Kết quả ở hình 2 cho thấy: sản phẩm PCR thu được rất đặc
hiệu, không có sản phẩm phụ. Chủng B. thuringiensis var.
aizawai H1 phân lập có duy nhất một sản phẩm PCR đặc
hiệu vào khoảng 285bp theo lý thuyết giống với sản phẩm
PCR của chủng chuẩn B. thuringiensis var. aizawai M1
(kênh 1,3). Như vậy cả hai chủng B. thuringiensis var.

aizawai H1phân lập và chủng chuẩn B. thuringiensis var.
aizawai M1 đã mang gen cry1C.

Tương tự chúng tôi tiến hành sử dụng cặp mồi: TY6 và
TY14 để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab
của chủng B. thuringiensis var. aizawai phân lập và chủng
chuẩn B. thuringiensis var. aizawai M1. Kết quả cho thấy
cả hai chủng này đều không có sản phẩm PCR đặc hiệu.
Như vậy cả hai chủng B. thuringiensis var. aizawai H1
phân lập và chủng chuẩn B. thuringiensis var. aizawai M1
đều không chứa gen cry1Ab.

Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy chủng B.
thuringiensis var. aizawai H1phân lập ở Việt Nam đã mang
gen cry1C nhưng không mang gen cry1Ab.

II.4. Tạo dòng đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1C từ
chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập.

Tiến hành gắn sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1C từ
chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập vào vectơ
PCRTM2.1 để tạo vectơ tái tổ hợp. Sau đó biến nạp vectơ
tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5. Nhờ quá trình nhân
lên của vi khuẩn mà vectơ tái tổ hợp cũng được nhân theo.
Sau đó tiến hành tách chiết và tinh sạch plasmit tái tổ hợp
từ vi khuẩn E. coli đã biến nạp. Kiểm tra plasmit tái tổ hợp
bằng cách cắt với enzim giới hạn E. coR I, sản phẩm cắt
được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza 1%. Kết quả
được thể hiện ở hình 3.

Kết quả ở hình 3 cho thấy: khi plasmit tái tổ hợp được cắt
bởi enzim EcoR I đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C được
tách ra khỏi plasmit có kích thước đúng bằng với sản phẩm
PCR của đoạn ADN này ( Kênh 1 và 3, 4, 5, 6). Kênh 2 cho
thấy plasmit của khuẩn lạc xanh không mang đoạn ADN
ngoại lai, và chỉ có một băng duy nhất có kích thước vào
khoảng 3,9kb là trọng lượng phân tử của plasmit. Như vậy
chúng tôi đã chọn được 4 dòng có đính sản phẩm PCR là
đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C và được vi khuẩn E.
coli nhân lên theo mong muốn. Tuy nhiên để khẳng định
một cách chắc chắn điều này, cần xác định trình tự đoạn
ADN đã được gắn vào vectơ.

Hình 3: Điện di trên gel agaroza 1% để kiểm tra các plasmit
tái tổ hợp
mang sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1C cắt bằng
EcoR I.

Chú thích: Kênh 1: Sản phẩm PCR của đoạn ADN đặc hiệu
gen cry1C; Kênh 2: plasmit của khuẩn lạc xanh; Kênh
3,4,5,6: Plasmit cắt bằng EcoR I ; Kênh 7: Chỉ thị phân tử
ADN 1kb leader (12216, 11198, 10180, 9162, 8144, 7126,
6108, 5090, 4072, 3054, 2036, 1636, 1018, 517, 506, 396,
344, 298, 220, 201, 154, 134, 75).


II.5. Xác định trình tự nucleotit đoạn ADN đặc hiệu của
gen cry1C.

Kết quả ở hình 4 cho thấy: trình tự đoạn ADN đặc hiệu của

gen cry1C tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var. aizawai
H1 phân lập được xác định có chiều dài 285 cặp bazơ bao
gồm số lượng các nucleotit như sau: 96A, 44C, 61G, 84T.

Hình 4: Trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry 1C tạo
dòng từ chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập,
đoạn ADN này dài 285 cặp bazơ.


II.6. So sánh trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C.

Chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự đoạn ADN đặc hiệu
của gen cry1C tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var.
aizawai H1 phân lập với trình tự cùng đoạn gen này đã
được công bố năm 1989 trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc
tế, kết quả được thể hiện ở hình 5.

Hình 5: So sánh trình tự nucleotit giữa đoạn ADN đặc hiệu
của gen cry1C tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var.
aizawai H1 phân lập ở Việt Nam (VNCRY1C) và đoạn
ADN đặc hiệu của gen cry1C do Sanchis V và cộng sự
công bố trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế
(QTCRY1C).


Từ kết quả ở hình 5 cho thấy đoạn ADN đặc hiệu của gen
cry1C tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var. aizawai H1
phân lập của Việt nam có độ tương đồng cao so với đoạn
ADN đặc hiệu của gen cry1C do Sanchis V và cộng sự
công bố năm 1989 trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế mã

số AC X13602. Độ tương đồng đạt 99,3%. Chúng chỉ khác
nhau bởi 2 nucleotit ở vị trí thứ 122 và 243.

II.7. Dịch mã đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C

Chúng tôi đã tiến hành dịch mã đoạn ADN đặc hiệu của
gen cry1C sang protein nhờ chương trình phần mềm
PC/Gene. Kết quả được thể hiện ở hình 6.

Hình 6: Trình tự các axit amin được dịch mã từ đoạn ADN
đặc hiệu của gen cry1C tạo dòng từ chủng B. thuringiensis
var. aizawai H1 phân lập ở Việt nam.



Kết quả ở hình 6 cho thấy: Đoạn ADN đặc hiệu của gen
cry1C có thể dịch thông sang một đoạn protein có chiều dài
95 axit amin.

III. KẾT LUẬN:

Chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập ở Việt
nam có hiệu lực diệt đặc hiệu cao là 100% đối với sâu ngài
gạo, sâu tơ và sâu keo. Hiệu quả diệt giảm hơn đối với sâu
khoang (90%) và giảm hơn nữa trên đối tượng sâu bông
(30%).

Kết quả điện di protein tinh thể của chủng Bt.aizawai H1
phân lập cho thấy: Khuôn mẫu protein của chủng B.
thuringiensis var. aizawai H1 phân lập giống với chủng

chuẩn B. thuringiensis var. aizawai M1.

Chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập mang gen
cry1C, không mang gen cry1Ab. Đã tạo dòng và đọc trình
tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C từ chủng B.
thuringiensis var. aizawai H1 phân lập, đoạn ADN này có
chiều dài 285bp, có thể mã hoá cho một đoạn protein có
chiều dài 95 axit amin. Trình tự đoạn ADN đặc hiệu của
gen cry1C tạo dòng từ chủng B. thuringiensis var. aizawai
H1 phân lập ở Việt nam có độ tương đồng cao đạt tới
99,3% so với đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C do
Sanchis V và cộng sự công bố năm 1989 trong Ngân hàng
dữ liệu gen Quốc tế mã số AC X13602.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bacillus thuringiensis an environment
biopesticides.(1986), Theory & Practice.
2. Kalman, S., K. L Kiehne, K. J. Libs, and T.
Yamatomo. (1993), “Cloning of a Novel cryIC-Type Gene
from a Strain of Bacillus thuringiensis subsp–galleriae”.
Applied and Environmental Microbiology, p.1131-1137.
3. Klier A. (1985), Biopestiside opportunities and
Challegene for management insect. Parteun International
Symposia.
4. Koo, B. T., S. H. Park, S. K. Choi, B. S. Shin, J. I.
Kim, J. H. Yu. (1995), “Cloning of a novel crystal protein
gen Cry 1 K from Bacillus thuringiensis subsp. Morrisoni”.
FEMS Microbiology Letter 134, p.159-164
5. Maniatis, T; E.F. Fritisch and Sambrook. (1989),

Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
6. 6. Proceeding of the Second Pacific Rim Conference
on Biotechnology of Bacillus thurinsgiensis and its impact
to the environment, Chiangmai, Thailand, Nov. 4-8, 1996.
7. Proceeding of the 2nd Canberra Bacillus thuringiensis
meeting September Lanberra, 1993.
8. Sanchis V; D. Lereclus, G. Menou, J. Chaufaux, S.
Guo, M.M. Lecadet, (1989). "Nucleotide sequence and
analysis of the amino-terminal coding region of the
spodoptera active delta endotoxin gene of Bacillus
thuringiensis aizawai”, Mol. Microbiol. 3, p. 229-238.
9. Schnepf H.E and H.R. Whiteley. (1981), “Cloning and
expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein in E.
Coli Proc Nat”. Acad. Sei. USA, 78: p. 2893-2897.
10. Manual of Technology in Insect Pathodology”. A
academic press, p. 55-57.
11. Wang Fei, Ren Gaixin and Chen Yuehua. (2001),
“Characterisation of Cry- type genes and their insecticidal
crystal protein of 23 specific Bacillus thuringiensis
isolates”. 4th Pacific Rim Conference on the Biotechnology
of Bacillus thuringiensis and its Environmental Impact,
p.26.


SUMMARY

Some biochemical and Biomolecular characteristics of
B. thuringiensis var. aizawai H1 strain isolated in Viet
Nam

Bui Thi Huong, Nguyen Thuy chau
Microbiology Department, Post Harvest Technology
Institute.
Đinh Duy Khang
Molecular Microbiology Department, Institue of
Biotechnology
National Centre for Natural Science and Technology.

We isolated B. thuringiensis var. aizawai H1 from the
habitat in Viet nam, the microscopic observation showed
that it have bipyramidal shape crystals. The insecticidal
activities of spore-crystal mixtures of B. thuringiensis var.
aizawai H1 isolate tested against some Lepidopteran
insects and Coleopteran insects. The results showed that it
gave 100% mortality to Corrcyra cephalonica, Plutella
xylostella and Spodoptera exiqua, 90% mortality to
Spodoptera litura and 30% mortality to Helicoverpa
armigera. It has no insecticidal activities to some
Coleopteran insects including Tribolium castaneum,
Sytophylus zeamays, Sytophylus oryzae. SDS-PAGE of
parasporal inclusions of the B. thuringiensis var. aizawai
H1 isolate were similar in comparison with B. thuringiensis
var. aizawai M1, they consisted four protein core fragments
of 130 kDa, 81kDa, 70 kDa and 55kDa . This isolate was
screened for cry1Ab and cry1C genes by PCR method.
Total DNA of this B. thuringiensis strain were isolated then
analysed by electrophoresis on 1% agaroza gel. The result
showed that total DNA isolated was not broken, it could be
used as DNA template for the PCR. Oligonucleotit primer

pairs of TY6 and TY14; TYIC and TYIUNI respectively
were used to amplified the specific DNA fragments of
cry1Ab gene as well as of cry1C gene by PCR. The PCR
components of 25l of total volum included: 13,6l of
H
2
O, 2,5l of dNTP, 2,5l of buffer, 2l of primer, 0,4l
of Tag-polymeraza enzim, 2l of DNA template (50ng/l).
The PCR conditions were: denaturation at 94
0
C for 3 min,
followed by 30 amplification cycles (94
0
C, 50 sec; 60
0
C, 50
sec; 72
0
C, 1min and 20sec) and extension at 72
0
C for 8
min. The content of 5l of PCR products were analyzed by
electrophoresis on 1% agaroza gel. The result showed that
B. thuringiensis var. aizawai isolate produced only one
PCR product of about 285bp, this result indicated that this
isolate harboured cry1C gene but no cry1Ab gene. The
amplified specific DNA fragment of cry1C gene from B.
thuringiensis var. aizawai H1 isolate was ligated in to
PCR
TM

2.1 vector and transformed in to E. coli DH5. E.
coli cell carrying recombinant plasmid were grown in LB
midium containing ampicillin, IPTG and followed by
incubation at 37
0
C or 30
0
C for 24 hours. The white colonies
were screened as transformants. This recombinant plasmid
was isolated and purified from transformed E. coli DH5,
then it was examined carefully by cutting of restrict enzim
EcoR I . Sequences of DNA fragment were determined by
the dideoxy chain termination method with 32P dATP on
Autosequencer ALF-Express. The sequence data were
compared with reference gene. The results showed that
specific DNA fragment of cry1C gene had 285bp in length
including 96A, 44C, 61G, 84T, this DNA fragment could
be translated into a protein fragment of 95 amino acids. The
mentioned DNA was homology 99,3% in comparison with
DNA fragment of the same gene published by Sanchis V et
al in International Gene Bank Database.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Lê Quang Huấn.