Nghiên cứu xác định một số chất cấm trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG THỊ KHÁNH HUYỀN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ
CHẤT CẤM TRONG MỸ PHẨM
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
KHỐI PHỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG THỊ KHÁNH HUYỀN
Mã sinh viên: 1501223

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ
CHẤT CẤM TRONG MỸ PHẨM
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
KHỔI PHỔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. HVCH Ngô Thị Duyên
2. PGS. TS. Lê Đình Chi
Nơi thực hiện:
Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương

HÀ NỘI - 2020


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương dưới
sự hướng dẫn của HVCH Ngô Thị Duyên và TS. Lê Đình Chi.
Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới HVCH Ngô Thị
Duyên và TS. Lê Đình Chi, hai người thầy đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và
góp ý giúp tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo công tác tại Bộ môn Hóa phân tích –
Độc chất, trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ dạy và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập
tại trường.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung
ương và các cán bộ khoa Mỹ phẩm của Viện đã tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, chăm sóc,
động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và gặt hái nhiều
thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 24 tháng 05 năm 2020
Sinh viên
Dương Thị Khánh Huyền


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN3
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT6
DANH MỤC CÁC BẢNG8
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ9

ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .........................................................................................3
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .....................................................................3
1.1.1. Đặc tính của các GLU nghiên cứu ...............................................................3
1.1.2. Vài nét về Glucocorticoid ..............................................................................5
1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ ...................................................................9
1.2.1. Hệ thống HPLC .............................................................................................9
1.2.2. Khối phổ ......................................................................................................10
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................15
2.1. Đối tượng, nguyên liệu và trang thiết bị nghiên cứu .....................................15
2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu ............................................................................15

2.1.2.

Chất chuẩn, dung môi, hóa chất.............................................................15

2.1.3.

Thiết bị, dụng cụ phân tích ....................................................................16

2.2. Nội dung nghiên cứu.........................................................................................16
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................16
2.3.1.

Quy trình xử lý mẫu ...............................................................................16

2.3.2.

Xây dựng phương pháp phân tích ..........................................................17

2.3.3.

Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng ...................................17

2.3.4.
trường

Ứng dụng xác định các GLU trong một số mẫu mỹ phẩm có mặt trên thị
………………………………………………………………………...21

2.3.5.

Phương pháp xử lý số liệu .....................................................................21

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..............................22
3.1. Quy trình chuẩn bị mẫu ...................................................................................22
3.1.1. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ......................................................................22
3.1.2. Chuẩn bị dung dịch nền mẫu .......................................................................23
3.1.3. Chuẩn bị chuẩn nội ......................................................................................23
3.1.4. Chuẩn bị mẫu chuẩn ....................................................................................23
3.1.5. Chuẩn bị mẫu thử ........................................................................................24
3.1.6. Chuẩn bị mẫu tự tạo ....................................................................................25


3.2. Xây dựng phương pháp phân tích ..................................................................25
3.2.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện khối phổ ....................................................25
3.2.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký ........................................................30
3.2.3. Khảo sát và lựa chọn chuẩn nội ...................................................................32

3.3. Thẩm định phương pháp phân tích ................................................................33
3.3.1. Sự phù hợp của hệ thống (system suitability) .............................................33
3.3.2. Độ đặc hiệu – chọn lọc (selectivity) ............................................................33
3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ..........................35
3.3.4. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn (linearity)............................................36
3.3.5. Độ chính xác của phương pháp (accuracy) .................................................37
3.4. Kết quả xác định GLU trong các mẫu mỹ phẩm dạng kem trên thị trường
...................................................................................................................................38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................41
KẾT LUẬN ..............................................................................................................41
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO1
PHỤ LỤC3
Phụ lục 1: Danh mục mỹ phẩm được kiểm tra3
Phụ lục 2: Kết quả thẩm định5
2.1. Kết quả thẩm định độ chụm trung gian của phương pháp5
2.2. Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại6
Phụ lục 3: Sắc ký đồ một số mẫu mỹ phẩm trên thị trường8


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
APCI

Giải thích
Atmospheric pressure chemical ionization
(Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển)

APPI

Atmospheric pressure photoionization
(Kỹ thuật ion hóa ánh sáng ở áp suất khí quyển)

ASEAN

Association of South East Asia’s Nations
(Liên hiệp các quốc gia Đông Nam Á)

ACN

Acetonitril

BMD

Betamethason dipropionat

CBP

Clobetasol propionate

CTPT

Công thức phân tử

DAD

Diod array detector (Detector mảng diod)

DXA

Dexamethason acetat

ESI

Electrospray ionization (Ion hóa kiểu phun sương điện)

GLU

Glucocorticoid

GLP

Good laboratory practice (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm)

HPLC

High performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HQC
IS
KLPT
LC – MS

Internal standard (Chuẩn nội)
Khối lượng phân tử
Liquid chromatography – mass spectrophometry
(Sắc ký lỏng khối phổ)

LC – MS/MS Liquid chromatography – Tandem mass spectrophometry

(Sắc ký lỏng khối phổ hai lần)
LOD

Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ

Limit of quantitation (Giới hạn định lượng)

MeOH

Methanol

MQC
MRM

Multiple Reaction Monitoring


PRS

Prednison

RSD

Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

S/N

Signal/ noise

SD

Standard deviation (Độ lệch chuẩn)

SKĐ

Sắc ký đồ

TAA

Triamcinolon acetonid

TB
TLC

Trung bình
Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng )

TLTK

Tài liệu tham khảo

USFDA

United states – Food and Drug administration
(Cục quản lý thực phẩm, dược phẩm Mỹ)

v/v
VKNTTW

Volume/Volume (thể tích/thể tích)
Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1: Một số phương pháp phân tích Glucocorticoid trong mỹ phẩm ....................7
Bảng 2. 1: Thông tin chất chuẩn sử dụng ......................................................................15
Bảng 3. 1: Nồng độ đường chuẩn của các GLC ............................................................23
Bảng 3. 2: Điều kiện khối phổ của các chất phân tích ..................................................29
Bảng 3. 3: Các thông số tối ưu của MS .........................................................................29
Bảng 3. 4: Chương trình gradient dung môi ..................................................................31
Bảng 3. 5: Kết quả đánh giá sự phù hợp của hệ thống LC-MS/MS (n=6) ....................33
Bảng 3. 6: Kết quả so sánh thời gian lưu của các pic ở mẫu tự tạo và mẫu chuẩn .......34
Bảng 3. 7: Kết quả so sánh tỷ lệ cường độ ion ở mẫu tự tạo và mẫu chuẩn .................35
Bảng 3. 8: Giá trị LOD và LOQ của 5 glucocorticoid ..................................................35
Bảng 3. 9: Kết quả khảo sát đường chuẩn của prednison, dexamethason acetat,
clobetason propionat ......................................................................................................36
Bảng 3. 10: Kết quả khảo sát đường chuẩn của betamethason dipropionate,
triamcinolon acetonid. ...................................................................................................36
Bảng 3. 11: Kết quả độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp (n=6) ..........................37
Bảng 3. 12: Kết quả độ chụm trung gian của phương pháp (n=12) ..............................38
Bảng 3. 13: Thông tin sử dụng để định tính các GLU ..................................................39
Bảng 3. 14: Kết quả xác định GLU trong mẫu mỹ phẩm thực tế ..................................39


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1. 1: Công thức cấu tạo của betamethason dipropionat ..........................................3
Hình 1. 2: Công thức cấu tạo của clobetasol propionat ...................................................3
Hình 1. 3: Công thức cấu tạo của dexamethason acetat ..................................................4

Hình 1. 4: Công thức cấu tạo của triamcinolon acetonid ................................................4
Hình 1. 5: Công thức cấu tạo của prednison ...................................................................5
Hình 1. 6: Sơ đồ hệ thống HPLC.....................................................................................9
Hình 1. 7: Sơ đồ khối cấu tạo các bộ phận của một khối phổ kế ..................................11
Hình 1. 8: Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI...........................................................12
Hình 1. 9: Sơ đồ bộ phân tích tứ cực. ............................................................................13
Hình 1. 10: Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba. .....................................14
Hình 3. 1: Quy trình chuẩn bị mẫu thử ..........................................................................24
Hình 3. 2: Phổ khối MS của dung dịch chuẩn Betamethason dipropionat với chế độ
ESI (+) ...........................................................................................................................26
Hình 3. 3: Giản đồ mối quan hệ giữa cone voltage và số lượng ion có số khôi 505,25
Da đi vào bộ phân phân tích khối. .................................................................................26
Hình 3. 4: Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [BMD-H]+ ...............................................27
Hình 3. 5: Giản đồ năng lượng phân mảnh (m/z 505,25 -> 337,13) .............................28
Hình 3. 6: Giản đồ năng lượng phân mảnh (m/z 505,25 -> 411,22) .............................28
Hình 3. 7: SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 50 mm, 1,7
µm), pha động MeOH : Acid formic 0,1% (70:30, v/v) ................................................30
Hình 3. 8: Sắc ký đồ mẫu chuẩn khi sử dụng chương trình gradient ............................31
Hình 3. 9: Sắc ký đồ của chuẩn glibenclamid ...............................................................32
Hình 3. 10: Sắc ký đồ của các mẫu ...............................................................................34
Hình 3. 11: Sắc ký đồ và S/N tại LOD của một số chất đại diện ..................................35
Hình 3. 12: Sắc ký đồ và S/N tại LOQ của một số chất đại diện ..................................36


ĐẶT VẤN ĐỀ
Glucocorticoid (GLU) là một nhóm thuốc được chỉ định rộng rãi trong rất nhiều
bệnh với hiệu quả điều trị đáng kể và đôi khi là thuốc không thể thay thế. Trong da liễu,
chúng được sử dụng để điều trị các bệnh như vẩy nến, viêm da, eczema… Chúng làm
giảm viêm và có thể tạm dừng các triệu chứng viêm da do vẩy nến thể mảng nghiêm
trọng. Để sử dụng tại chỗ, chúng có sẵn ở dạng kem, gel và thuốc mỡ với hiệu lực và

tác dụng khác nhau. Tuy nhiên, khi điều trị kéo dài với các chế phẩm chứa GLU có thể
dẫn đến một số tác dụng phụ toàn thân như tăng huyết áp, đái tháo đường, loãng xương,
hội chứng Cushing…và khi dùng tại chỗ có thể dẫn đến viên da, rạn da, teo da vĩnh
viễn… [3], [8].
Từ xa xưa con người đã có nhu cầu làm đẹp và đã biết làm đẹp. Ngày nay, khi xã
hội phát triển, kinh tế phát triển thì nhu cầu làm đẹp ngày càng tăng cao; Trên thị trường
có vô số loại mỹ phẩm với mức giá và chất lượng đa dạng để thỏa mãn nhu cầu mọi
người. Với khả năng kháng viêm và ức chế miễn dịch, GLU dễ bị lợi dụng trộn trái phép
vào các mỹ phẩm bôi da (12-15% mỹ phẩm được kiểm tra có chứa GLU trái phép [18],
[19]) nhằm đem đến làn da hết mụn, láng mịn và trắng sáng không tỳ vết trong thời gian
ngắn cho người dùng. Tuy nhiên đó chỉ là hiệu quá tức thời và bề nổi, nếu sử dụng trong
thời gian dài điều này vô cùng nguy hiểm, có thể dẫn đến một số biến chứng như da bị
bào mòn đến rất mỏng, nám kháng trị, vi khuẩn và nấm tăng sinh… gây ảnh hưởng đến
thẩm mỹ và sức khỏe người sử dụng.
Mỹ phẩm được sử dụng tiếp xúc trực tiếp với những bộ phận bên ngoài cơ thể,
không có quy định về thời gian và liều lượng sử dụng, không có sự giám sát y tế; nên
chỉ với lượng rất nhỏ GLU được đưa vào mỹ phẩm cũng có thể đem đến những tác dụng
không mong muốn như trên. Chính vì vậy, theo hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN
trong mỹ phẩm, GLU là một trong những nhóm chất được đưa vào danh mục chất không
được phép dùng trong mỹ phẩm [13].
Như vậy, đòi hỏi cần có một phương pháp phân tích để sàng lọc các sản phẩm
mỹ phẩm như kem, gel, thuốc mỡ có chứa GLU. Các nghiên cứu trước đó đã đưa ra một
số phương pháp LC (TLC và HPLC với detector DAD) để phân tích các steroid này
trong mỹ phẩm [5], [9]. Tuy nhiên, những phương pháp này còn một số nhược điểm như
giới hạn phát hiện còn cao, độ đặc hiệu còn hạn chế [9]. Những tồn tại này cho thấy sự
cần thiết phải nghiên cứu xây dựng một phương pháp có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn,
1


đảm bảo kết quả tin cậy hơn để kiểm tra các chất cấm nhóm GLU trong mỹ phẩm. Để

góp phần giải quyết những tồn tại trên, nhóm nghiên cứu tiến hành thực nghiệm đề tài:
“Nghiên cứu xác định môt số chất cấm trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký
lỏng khối phổ” với mục tiêu cụ thể như sau:
1. Xây dựng được phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC – MS/MS) xác định một số
chất cấm nhóm glucocorticoid trong mỹ phẩm dạng kem.
2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định có hay không có các chất cấm nhóm
glucocorticoid trong các mẫu mỹ phẩm trên thị trường nhằm đánh giá việc tuân thủ các
quy định của cơ quan quản lý đối với mỹ phẩm của các đơn vị.

2


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
1.1.1. Đặc tính của các GLU nghiên cứu [4]
a. Betamethason dipropionat

Hình 1. 1: Công thức cấu tạo của betamethason dipropionat
- Công thức phân tử: C28H37FO7
- Phân tử lượng: 504,6
- Betamethason dipropionat là 9-fluoro-11β-hydroxy-16β-methyl-3,20dioxopregna-1,4-dien-17,21-diyl dipropionat
- Tính chất lý hóa: Bột kết tinh trắng hay gần như trắng. Không tan trong nước,
dễ tan trong aceton và methylen clorid, hơi tan trong ethanol 96%.
b. Clobetasol propionat

Hình 1. 2: Công thức cấu tạo của clobetasol propionat
- Công thức phân tử: C25H32ClFO5
- Phân tử lượng: 467,0
- Clobetasol propionat là 17-(2-chloroacetyl)-9-fluoro-11-hydroxy-10,13,16trimethyl-3-oxo-6,7,8,11,12,14,15,16-octahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl
propanoat

3


- Tính chất lý hóa: Bột kết tinh trắng hay gần như trắng. Không tan trong nước,
dễ tan trong aceton, hơi tan trong ethanol 96%.
c. Dexamethason acetat

Hình 1. 3: Công thức cấu tạo của dexamethason acetat
- Công thức phân tử: C24H31FO6
- Phân tử lượng: 434,5
- Dexamethason acetat là 9-fluoro-11β,17-dihydroxy-16α-methyl-3,20dioxopregna-1,4-dien-21-yl acetat
- Tính chất lý hóa: Bột kết tinh trắng hay gần như trắng, đa hình. Không tan trong
nước, dễ tan trong ethanol 96%, khó tan trong methylen clorid.
d. Triamcinolon acetonid

Hình 1. 4: Công thức cấu tạo của triamcinolon acetonid
- Công thức phân tử: C24H31FO6
- Phân tử lượng: 434,5
- Triamcinolon acetonid là 12-fluoro-11-hydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-6,6,9,13tetramethyl-5,7-dioxapentacyclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-16-on
- Tính chất lý hóa: Bột kết tinh trắng hay gần như trắng, đa hình. Không tan trong
nước, hơi tan trong ethanol 96%.

4


e. Prednison

Hình 1. 5: Công thức cấu tạo của prednison
- Công thức phân tử: C21H26O5

- Phân tử lượng: 358,4
- Prednison là 17,21-dihydroxypregna-1,4-dien-3,11,20-trien
- Tính chất lý hóa: Bột kết tinh trắng hay gần như trắng, đa hình. Không tan
trong nước, khó tan trong ethanol 96% và methylen clorid.
1.1.2. Vài nét về Glucocorticoid
a. Tác dụng của GLU [8]
- Ở nồng độ sinh lý, GLU cần cho cân bằng nội mô, tăng sức chống đỡ của cơ
thể với stress và duy trì các chức năng khác của cơ thể.
- GLU tác dụng trên chuyển hóa glucid (làm tăng tạo glucose), chuyển hóa protid
(tăng dị hóa protid), chuyển hóa lipid (thay đổi sự phân bố lipid trong cơ thể), chuyển
hóa muối nước (tăng tái hấp thu Na+ , tăng thải trừ H+ và K+ ).
- GLU còn tác dụng trên các cơ quan, tổ chức như thần kinh trung ương, máu,
tiêu hóa, tổ chức hạt và hệ tim mạch.
- GLU có tác dụng chống viêm, chống dị ứng, ức chế miễn dịch.
b. Tác dụng không mong muốn [8]
- Phù, tăng huyết áp do giữ nước và natri.
- Loét dạ dày, tá tràng.
- Vết thương chậm lên sẹo, dễ nhiễm trùng.
- Tăng đường huyết gây đái đáo đường hoặc làm nặng thêm bệnh đái tháo đường.
- Nhược cơ, teo cơ, mỏi cơ.
- Loãng xương, xốp xương.
- Rối loạn phân bố mỡ.
5


- Suy thượng thận cấp khi ngừng thuốc đột ngột.
- Khi dùng tại chỗ có thể gây mỏng da, viêm da, teo da vĩnh viễn, rạn da, bệnh
vảy nến thể mủ, trứng cá đỏ …
Chính vì những tác dụng không mong muốn tại chỗ như trên nên các chất thuộc
nhóm Glucocorticoid là những chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm do Hiệp định hệ

thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm quy định (Số thự tự 300 trong Annex 2)
c. Một số phương pháp phân tích:
- Định tính bằng các phản ứng hóa học chung đặc trưng cho GLU:
+ Bị oxy hóa với tác nhân H2SO4 đặc, có màu đỏ (thường kèm huỳnh quang).
Khi pha loãng với nước, màu biến mất [2], [11].
+ Cho phản ứng với phenylhydrazin trong môi trường acid cho dẫn chất
pheninhydrazon có màu vàng [2], [11].
- Định tính bằng phương pháp quang phổ:
+ Quang phổ hồng ngoại (IR): bằng cách so sánh phổ IR của chất phân tích với
phổ IR của chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích. Phương pháp này thường được
áp dụng để định tính nguyên liệu và một vài chế phẩm đơn chất.
+ Quang phổ UV-VIS: tạo dẫn chất với xanh tetrazolium cho sản phẩm có màu,
đo quang ở vùng khả kiến (400 – 760 nm).
- Các phương pháp sắc ký:
Sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao detector UV-VIS [2], [11] hay khối
phổ thường để dùng để xác định các GLU trong các chế phẩm.
- Phương pháp hòa hợp ASEAN ACM SIN 01, ASEAN ACM 007 đã đưa ra quy
trình định tính và định lượng GLU trong mỹ phẩm bằng TLC và HPLC [6], [12].
d. Các nghiên cứu xác định GLU trong mỹ phẩm:
Có nhiều nghiên cứu đã xây dựng phương pháp để phát hiện và xác định các
GLU trong mỹ phẩm bằng nhiều phương pháp khác nhau như TLC [9], HPLC với
detector UV – VIS [5], [12] hay LC – MS/MS [15], [17], [18], [19]. Tóm tắt một số
phương pháp định tính, định lượng GLU được trình bày trong bảng 1.1.

6


Bảng 1. 1: Một số phương pháp phân tích Glucocorticoid trong mỹ phẩm
STT

Đối tượng nghiên cứu

Phương

Kết quả phân tích

TLTK

pháp phân
tích
1

Xác định hydrocortison TLC và

- LOD: 20 – 50 µg/g

acetat, dexamethason,

- LOQ: 70 – 160 µg/g

HPLC

betamethason,

- Thời gian phân tích:

betamethason 17-

35 phút

[12]

valerat và triamcinolon
acetonid trong mỹ
phẩm
2

Xác định

TLC

- LOD: 200 µg/g

[9]

HPLC

- Khoảng tuyến tính:

[5]

dexamethason,
prednisolon acetat,
fluocinolon acetonid,
hydrocortison acetat,
cortison acetat trong
mỹ phẩm
3

Phân tích đồng thời 12

Glucocorticoid thông

0,2 – 1,2 µg/ml

thường trong mỹ phẩm

- LOD: 0,1 – 2,0 µg/g
- LOQ: 0,3 – 6,0 µg/g
- Thời gian phân tích:
60 phút

4

Xác định đồng thời 6

LC – MS

- Khoảng tuyến tính:

glucocorticoid

0,3 – 100,0 µg/ml

(betamethason 17-

- LOD: 12 - 35 ng/ml

valerat, betamethason,

- LOQ: 35 - 95 ng/ml

beclomethason

- Thời gian phân tích:

dipropionat,

30 phút

methylprednisolon,
budesonid, flunisolid)
7

[15]


trong dược phẩm vs
trong mỹ phẩm giả.
Định lượng

5

LC – MS/MS

- Khoảng tuyến tính:

prednisolon,

0,1 – 10 µg/ml

hydrocortison,

- LOD: 1,4 – 2,4 ng/ml

betamethason,

- LOQ: 4,7 – 8,0 ng/ml

dexamethason,

- Thời gian phân tích:

triamcinolon acetonid

25 phút

[19]

trong các mỹ phẩm
điều trị eczema, viêm
da tiết bã, vẩy nến
Xác định 10

6

LC – MS/MS

- Khoảng tuyến

glucocorticoid trong

tính:0,005 – 0,250

mỹ phẩm bất hợp pháp

µg/ml

[16]

- LOD: 0,085 – 0,109
µg/g
- LOQ: 0,102 – 0,212
µg/g
- Thời gian phân tích:
10 phút
Xác định 43

7

LC – MS/MS

- Khoảng tuyến tính:

glucocorticoid bị cấm

0,1 – 2,0 µg/ml

trong mỹ phẩm

- LOD: 0,8 – 30,0

[18]

ng/ml
- LOQ: 2,5 – 90,0
ng/ml
- Thời gian phân tích:
25 phút
Phương pháp TLC với ưu điểm tiến hành đơn giản, chi phí thấp, dễ dàng so sánh
kết quả trên cùng một bản mỏng. Tuy nhiên giới hạn phát hiện còn cao, độ đặc hiệu còn
hạn chế.
8


Phương pháp HPLC độ đặc hiệu đã cải thiện hơn so với phương pháp TLC, song
giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng còn cao, chưa phù hợp để phân tích các chất
cấm (thường được thêm vào với lượng nhỏ) trong mỹ phẩm.
Phương pháp LC – MS/MS có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp,
khoảng tuyến tính rộng. Tuy nhiên các nghiên cứu đã tiến hành có thời gian phân tích
còn dài.

1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ
Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các
chất trong hỗn hợp của bộ phân sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khả năng phân
tích khối phổ (m/z) của bộ phân khối phổ (MS).
LC – MS là một kỹ thuật đầy tiềm năng được ứng dụng ngày càng rộng rãi vì có
tính chọn lọc và độ nhạy cao, giới hạn phát hiện có thể đến 10-14gam, thời gian phân tích
nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu gần giống nhau mà các
phương pháp sắc ký lỏng thông thường không làm được [7].
1.2.1. Hệ thống HPLC

HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa
các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng
giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha
động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành
phần pha động đưa chất phân tích qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân
tích với thời gian hợp lý [1].
Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao:

Hình 1. 6: Sơ đồ hệ thống HPLC

9


Hệ thống gồm có:
- Hệ thống cấp pha động
- Bơm cao áp
- Bộ phận tiêm mẫu
- Cột sắc ký
- Detector
- Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển
hệ thống.
1.2.2. Khối phổ
a. Cơ sở lý thuyết của phương pháp khối phổ [1], [7]
Phương pháp phổ khối lượng là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện
tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ
số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (Atomic mass unit) hoặc bằng
Dalton. 1 amu bằng 1 Da và bằng khối lượng của nguyên tử hydro.
Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ
phận phân tích khối trước khi đến bộ phận phát hiện (detector). Quá trình phân tích khối
và phát hiện được thực hiện trong môi trường chân không (áp suất khoảng 10-5 đến 10-8

Torr).
Đối với các hợp chất hữu cơ: Cơ sở của phương pháp MS là sự ion hóa phân tử
trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phá vỡ cấu trúc phân
mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích (có khối lượng nhỏ
hơn) bằng các phần tử mang năng lượng cao theo sơ đồ sau:
+ Ion hóa phân tử trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích:
M + e → M+ + 2e (>95%)
→ M2+ + 3e
→ M+ Phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích:
ABCD + e* → ABn+ + C + DmSự phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích
tuân theo định luật bảo toàn khối lượng. Năng lượng bắn phá (năng lượng ion hóa) là
một yếu tố quyết định sự phân mảnh của các hợp chất. Khi năng lượng bắn phá mẫu
(khoảng 10 eV) bằng với năng lượng ion hóa phân tử sẽ gây nên sự ion hóa phân tử.
10


Nếu năng lượng ion hóa tăng lên (30-50 eV) sẽ bẻ gãy một số liên kết trong phân tử, tạo
ra nhiều mảnh. Đó là các ion hoặc phân tử trung hòa có khối lượng bé hơn.
Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của phân tử và chỉ ra sự có mặt của
những nhóm chức đặc thù, cung cấp nhưng thông tin hữu ích về cấu tạo hoặc nhận dạng
của chất phân tích.
b. Cấu tạo và nguyên lý vận hành của một khối phổ kế [1], [7]

Hình 1. 7: Sơ đồ khối cấu tạo các bộ phận của một khối phổ kế
Một khối phổ kế bao gồm các bộ phận chính: Bộ phận nạp mẫu – đưa mẫu vào
(inlet), bộ phân ion hóa (ion source), bộ phân tích khối (mass analyzer), bộ phát hiện ion
(detector) và ghi/ xử lý số liệu (data system).
❖ Bộ phận nạp mẫu:
Bộ phận nạp mẫu sẽ chuyển mẫu phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị khối
phổ. Với LC – MS mẫu phân tích được nạp vào MS gián tiếp thông qua hệ thống HPLC.

❖ Nguồn ion hóa:
Ion hóa phân tử trung hòa thành các ion mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân
mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phân tử
mang năng lượng cao. Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion
qua bơm chân không của thiết bị MS. Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc độ và
thu gọn (hội tụ).
Việc tăng tốc được thự hiện bởi một điện thế (2-10 kV), khi ra khỏi buồng ion
hóa các ion phân tử có tốc độ đạt cao nhất. Việc thu gọn thành chùm ion được thực hiện
bởi một điện trường phụ để khi vào phần phân tích khối là một dòng ion tập trung, đồng
nhất.
Có nhiều loại nguồn ion hóa sử dụng các kỹ thuật ion hóa khác nhau:
- Kỹ thuật ion hóa va chạm điện tử (Electron Impact ionization)
- Kỹ thuật ion hóa hóa học (Chemica ionization)
11


- Kỹ thuật ion hóa điện trường (Field ionization)
- Kỹ thuật bắn phá nhanh nguyên tử (Fast Atom Bombardment)
- Kỹ thuật phản hấp thụ và ion hóa bằng tia laser
- Kỹ thuật ion hóa phun sương điện (ESI - Electron Spray Ionization)
- Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI - Atmospheric pressure
chemical ionization)
- Kỹ thuật ion hóa ánh sáng ở áp suất khí quyển (APPI – Atmospheric pressure
photoionization)
Trong số các kỹ thuật trên thì kỹ thuật ion hóa phun sương điện ESI được dùng
phổ biến nhất trong các máy LC – MS. Trong ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh
hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt
sương nhỏ mang điện tích ở bề mặt. Khí và nhiệt ở xung quanh cung cấp nhiệt năng làm
bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương. Dung môi bay hơi làm gia tăng mật độ điện tích
tại bề mặt hạt sương. Khi mật độ điện tích này tăng đến điểm giới hạn (giới hạn ổn định

Rayleigh), lực đẩy lớn hơn sức căng bề mặt sẽ chia hạt sương thành những hạt nhỏ hơn.
Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ chứa các tiểu phân
mang điện. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích này, các ion phân tích được chuyển
thành thể khí rồi đi vào bộ phận phân tích khối.

Hình 1. 8: Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI
❖ Bộ phận phân tích khối:
Các ion hình thành ở nguồn ion hóa có khối lượng m và điện tích z (tỷ số m/z
được gọi là số khối) sẽ đi vào bộ phận phân tích khối. Bộ phận phân tích khối có nhiệm

12


vụ tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt nhờ tác dụng của
từ trường, điện trường trước khi đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu.
Có thể phân bộ phận phân tích khối thành 4 loại: Bộ phân tích từ, bộ phân tích tứ
cực, bộ phân tích thời gian bay và bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron.
Trong đó, bộ phân tích tứ cực bao gồm bộ phân tích tứ cực đơn, bộ phân tích tứ
cực chập ba và bẫy ion kiểu tứ cực.
Bộ tứ cực (quadrupole) gồm 4 cực bằng kim loại đặt song song và sát nhau, hai
thanh đối nhau có điện tích bằng nhau. Có một khoảng không giữa 4 cực để các ion bay
qua. Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào từng cặp đối diện
của tứ cực. Cả hai trường đều không làm tăng tốc dòng ion từ nguồn đi ra nhưng làm
chúng dao động quanh trục trung tâm khi chuyển động và chỉ các ion có số khối nhất
định mới đến bộ phận phát hiện. Chỉ các dao động của các ion có m/z đặc biệt không
tăng lên theo biên độ dao động và có thể đi qua tâm tứ cực dọc theo trục. Các ion khác
có biên độ dao động tăng sẽ va đập vào thành các điện cực trước khi có thể vượt qua các
điện cực đi vào detector.
Phương trình tổng quát của tứ cực như sau:
𝑚

𝑉
=𝐾 2 2
𝑧
𝑟 𝑓
Trong đó: K: hằng số, V: điện áp tần số cao, r: khoảng cách 2 điện cực đối nhau,
f: tần số dao động ion.
Bằng cách thay đổi tần số và thế của các cực, các ion có tỷ số m/z khác nhau có
thể vượt qua khoảng không để đến detector với khoảng thời gian khác nhau (các ion
được tách theo số khối của chúng).

Hình 1. 9: Sơ đồ bộ phân tích tứ cực.

13


Độ phân giải phổ kế tứ cực thông thường đạt từ 500-1000, muốn nâng cao độ
phân giải, thường phải nối 2-3 bộ tứ cực với nhau (độ phân giải có thể đạt tới 20000).
Phổ khối tứ cực chập ba, gồm 3 bộ tứ cực nối tiếp nhau Q1, Q2 và Q3.

Hình 1. 10: Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba.
Trong đó:
Q1: Bộ tứ cực thứ nhất, có nhiệm vụ tách các ion. Lựa chọn ion mẹ với m/z nhất
định từ nguồn ion chuyển đến để đưa vào tứ cực Q2.
Q2: Bộ tứ cực thứ hai, ở điều kiện áp suất cao, các ion mẹ bị phân mảnh do va
chạm với các khí trơ có mặt như khí N2, Ar, He. Bộ Q2 tạo ra phân ly do các ion mẹ bị
phân mảnh tiếp theo tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions). Q2 không đóng vai
trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả ion do Q1 chuyển đến. Sau đó tất cả các ion con
được chuyển qua bộ tách Q3.
Q3: Bộ tứ cực thứ ba, làm nhiệm vụ tách các ion con được chuyển từ Q2 đến để
đi tới bộ phận phát hiện.

Thiết bị khối phổ ba tứ cực gọi là máy khối phổ hai lần (LC – MS/MS).
❖ Bộ phận phát hiện:
Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của
thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận này cho phép phát hiện và khuếch
đại tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng. Tín hiệu tạo ra sẽ được chuyển đến máy
tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ.
Sắc ký lỏng khối phổ LC – MS là kỹ thuật phân tích tập hợp khả năng phân tách
cao của LC và khả phát hiện, định lượng chính xác của MS. Do đó được ứng dụng rộng
rãi trong phân tích.

14


CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. Đối tượng, nguyên liệu và trang thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu trắng: Nền mẫu dùng để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích là
các mẫu kem dưỡng da không chứa các GLU cần nghiên cứu được chuẩn bị bởi khoa
Nghiên cứu phát triển, viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương. Công thức bào chế các
mẫu nền dựa trên công thức của 3 mẫu kem:
+ Kem dưỡng ẩm Cetaphil moisturizing cream.
+ Kem dưỡng trắng và giảm nếp nhăn Rebirth.
+ Kem dưỡng trắng và giảm thâm nám ban đêm Za true white ex night cream
- Mẫu thử: Các sản phẩm mỹ phẩm dạng kem, dung dịch được sử dụng với mục
đích dưỡng trắng da, giảm thâm nám, trị mụn… đang lưu hành tại thị trường Việt Nam.
(Thông tin chi tiết được thể hiện ở phụ lục 1)
- Mẫu chuẩn tự tạo: là nền mẫu có chứa chuẩn GLU bằng cách thêm các chuẩn
này vào mẫu nền với các nồng độ nhất định.
2.1.2. Chất chuẩn, dung môi, hóa chất

- Chất chuẩn:
Thông tin các chất chuẩn sử dụng trong quá trình nghiên cứu được thể hiện ở
bảng 2.1.
Bảng 2. 1: Thông tin chất chuẩn sử dụng
Tên chất chuẩn

Nguồn
gốc
VKNTTW

Số lô

Hàm lượng

WS.0217235.02

Dexamethason acetat
(DXA)

VKNTTW

200014

Triamcinolon acetonid
(TAA)

VKNTTW

WS.0116086.01

Betamethason
dipropionat (BMD)
Clobetason propionat
(CBP)

VKNTTW

107216

99,19%
(nguyên
trạng)
99,6%
(nguyên
trạng)
98,35%
(nguyên
trạng)
99,44%

VKNTTW

WS.0212170.02
(07.12)

Prednison (PRS)

15

99,60%

(nguyên
trạng)

Độ
ẩm

0,21%


- Dung môi, hóa chất:
Dung môi tinh khiết sắc ký: methanol (MeOH) (Merck, Đức), acetonitril (ACN)
(Merck, Đức); hóa chất loại tinh khiết sắc ký: acid formic (Fisher, Mỹ), amoniacetat
(Fisher, Mỹ); nước cất hai lần được lọc qua hệ thống loại ion.
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ phân tích
- Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối thiết bị khối phổ có bộ phận phân tích
khối kiểu ghép nối ba tứ cực Xevo TQD với nguồn ion hóa kiểu phun sương điện (ESI)
(Water, Mỹ)
- Cân phân tích Mettler Toledo MS 105 – Thụy Sỹ (d = 0,01 mg).
- Máy li tâm Sigma 4 – 16 KS – Mỹ
- Máy lắc xoáy IKA MS3 basic – Đức
- Micropipet Eppendorf – Đức: 10 – 100 µl, 100 – 1000 µl.
- Bình định mức, pipet thủy tinh class A…
Tất cả các thiết bị phân tích tại khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm (Viện Kiểm nghiệm
thuốc Trung ương) đều được kiểm tra, hiệu chuẩn định kỳ đáp ứng tiêu chuẩn GLP và
ISO/IEC 17025.

2.2. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát, xây dựng phương pháp phân tích xác định 5 GLU trong mỹ phẩm
dạng kem sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ.
- Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí: Sự phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu –

chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính và đường chuẩn,
độ đúng, độ lặp lại và độ chụm trung gian theo hướng dẫn của FDA.
- Ứng dụng phương pháp trên xác định các GLU trong các mẫu mỹ phẩm dạng
kem trên thị trường.

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Quy trình xử lý mẫu
Dựa vào tính chất hóa lý của các GLU phân tích và tham khảo các nghiên cứu đã
công bố, tiến hành khảo sát chiết các GLU từ nền mẫu như sau:
- Khảo sát dung môi chiết mẫu: sử dụng các dung môi chiết: MeOH, hỗn hợp
MeOH – H2O (90:10), hỗn hợp MeOH – H2O (50:50), ACN.

16