Đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus)

Vietnam J. Agri. Sci. 2020, Vol. 18, No. 2: 94-104

Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2020, 18(2): 94-104
www.vnua.edu.vn

ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ VÀ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH GAN THẬN MỦ
TRÊN CÁ NHEO MỸ (Ictalurus punctatus)
Trương Đình Hoài1*, Kim Văn Vạn1, Đào Lê Anh2, Nguyễn Thị Huyên2, Nguyễn Văn Tuyến1,
Vũ Đức Mạnh1, Nguyễn Thị Hương Giang2, Trương Quang Lâm2, Nguyễn Thị Lan2
1

Khoa Thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
2
Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
*

Tác giả liên hệ:

Ngày nhận bài: 28.10.2019

Ngày chấp nhận đăng: 24.02.2020
TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện để xác định đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh
gan thận mủ do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) nuôi ở các tỉnh phía bắc Việt Nam.
Để thực hiện nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thu thập và phân tích mẫu cá nheo Mỹ bệnh, xác định các triệu
chứng, các đặc điểm bệnh lý đại thể và vi thể thông qua phương pháp quan sát lâm sàng và phương pháp mô bệnh
học và ứng dụng PCR trong chẩn đoán khẳng định mầm bệnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy cá bệnh có triệu chứng
bơi lờ đờ, mang nhiều nhớt, xuất huyết nắp mang, các gốc vây và hậu môn. Các đặc điểm bệnh lý đại thể của cá bị
bệnh gồm gan, thận có các đốm mủ màu trắng, thành ruột và biểu mô xuất huyết nặng. Kết quả giám định bằng PCR
cho thấy cá bị bệnh do nhiễm E. ictaruli. Kết quả nghiên cứu mô bệnh học chỉ ra rằng mô mang, gan, thận và ruột bị

tổn thương nghiêm trọng nhất. Mang cá tăng sinh và xuất huyết, trong khi gan và thận cá bị hoại tử, cấu trúc lỏng
lẻo, giảm số lượng tế bào và xuất huyết.
Từ khóa: Edwardsiella ictaluri, bệnh lý, PCR, cá nheo Mỹ.

Pathological characterization and PCR application
for diagnosis Edwardsiella ictaluri infecting Channel catfish (Ictalurus punctatus)
ABSTRACT
This study was conducted to determine the pathological characteristics and to apply PCR method to diagnose
the disease caused by Edwardsiella ictaluri for Channel catfish (Ictalurus punctatus) in Northern provinces of
Vietnam. The infected Channel catfish was collected and determined the clinical symptoms, gross features and
microscopic lesions using through clinical observation and histopathological methods. Subsequently, PCR method
was applied to confirmed the pathogen. The results revealed that the diseased fish exhibited the symptoms of
lethargy swimming, mucus in the gills, haemorrhage of gill operculum, fins, anus. The liver and kidneys contained
white spots, intestinal walls and epithelial cells were severe haemorrhage. The evaluation by PCR showed that all
affected fish was infected with E.ictaluri. Histopathological examination revealed that the gill tissue, liver, kidney, and
intestines were the most severely damaged organs. Gills exhibited the hyperplasia and hemorrhage, while liver and
kidneys are necrosis and loose structure, decreasing cells and severed haemorrhage.
Keywords: Ewardsiella ictaluri, pathoglogy, PCR, Channel catfish.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Cá
nheo
Mỹ
(Ictalurus
punctatus,
Rafinesque, 1818) có tên tiếng anh là Channel
catfish, đây là loài cá bản địa của Châu Mỹ, phân
bố ở phía nam Canada và phía đông bắc Mỹ cũng
như phía bắc của Mexico. Cá nheo Mỹ gồm 7 họ

94

và hơn 45 loài, chúng sống trong môi trường nước
ngọt ở sông, hồ và ao. Chúng chịu được ngưỡng
biến đổi môi trường khá rộng, nhiệt độ thích hợp
là 24-30C nhưng có thể chịu rét tốt (Gatlin &
Stickney, 1982). Ngày nay, cá nheo Mỹ đã có ở
trên 35 quốc gia trên thế giới di nhập và phát
triển. Loài cá này trở thành một đối tượng thủy


Trương Đình Hoài, Kim Văn Vạn, Đào Lê Anh, Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Văn Tuyến,
Vũ Đức Mạnh, Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn Thị Lan

sản quan trọng của thế giới. Cá nheo Mỹ được
nuôi nhiều nhất ở Trung Quốc với sản lượng
trung bình 255.000 tấn/năm (FAO, 2014).
Loài cá này được du nhập vào miền Bắc
Việt Nam từ năm 2010. Đây là loài cá có giá trị
dinh dưỡng cao, thịt cá thơm ngon, bổ dưỡng,
nhiều khoáng chất canxi, phốt pho, sắt, vitamin.
Từ năm 2013, loài cá này được nuôi thử nghiệm
ở nhiều tỉnh miền Bắc cho kết quả tốt, cá có thể
sinh trưởng và phát triển tốt ở điều kiện tự
nhiên ở Việt Nam (Kim Văn Vạn, 2017). Hiện
nay, nhiều cơ sở sản xuất giống cá nước ngọt đã
có thể chủ động sản xuất giống cá nheo Mỹ và
nuôi dưới nhiều hình thức như nuôi ghép, nuôi
thâm canh, nuôi lồng hay nuôi ở hệ thống nước
chảy. Do vậy, sản lượng loài cá này càng ngày

càng tăng nhanh và cung cấp một lượng lớn
thực phẩm cho người tiêu dùng, mang lại thu
nhập cao cho người nuôi.
Tuy nhiên, dịch bệnh trên cá nheo Mỹ diễn
biến khá phức tạp, gây khó khăn và thiệt hại
lớn cho người nuôi, các bệnh thường gặp gồm
xuất huyết, lỡ loét, bệnh nội và ngoại ký sinh
(De la Cruz & cs., 2017; Hoai & cs., 2019;
Wagner & cs., 2002). Những năm gần đây bệnh
gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
gây ra trên cá nheo Mỹ nuôi ở Việt Nam đã được
ghi nhận và bệnh gây thiệt hại rất lớn cho người
nuôi. Tuy nhiên đặc điểm về bệnh gan thận mủ
trên cá nheo Mỹ đặc biệt là các đặc điểm lâm
sàng, đặc điểm mô bệnh học, phương pháp chẩn
đoán bệnh gan thận mủ cho đối tượng nuôi này
vẫn chưa được nghiên cứu sâu. Các nghiên cứu
trước đây về bệnh mủ gan tập trung trên cá tra
và basa ở miền Nam, bệnh do vi khuẩn
E. ictaluri gây ra hao hụt có thể lên đến 90%
(Crumlish & cs., 2002; Dung & cs., 2008). Với sự
phát triển ngày càng mạnh mẽ của cá nheo Mỹ
ở các tỉnh Miền Bắc và Bắc Trung bộ, cùng với
tình trạng ô nhiễm môi trường nước, bệnh gan
thận mủ có thể diễn biến phức tạp trong thời
gian tới và có thể gây thiệt hại cho người nuôi.
Do vậy, cần có các nghiên cứu liên quan đến tác
nhân, đặc điểm bệnh lý và phương pháp chẩn
đoán bệnh để góp phần giúp người nuôi sớm
nhận dạng, đề ra các biện pháp phòng trị bệnh

hiệu quả và giảm thiểu thiệt hại trong tương lai.

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu cá nheo Mỹ thương phẩm bị bệnh (kích
cỡ 0,5-1,7kg) được thu từ các hộ nuôi cá ao, cá
lồng khu vực phía bắc Việt Nam. Môi trường
Tryptic soya broth và Tryptic soya Agar- (TSB
và TSA; Merck). Bộ thuốc nhuộm vi khuẩn
Gram (Merck); Kit chiết tách DNA thương mại
QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN), GoTaq PCR
green (Promega) và các hóa chất, máy móc, thiết
bị trong phòng thí nghiệm phục vụ chạy PCR,
làm tiêu bản mô học, phân tích kết quả và một
số trang thiết bị dụng cụ cần thiết khác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Địa điểm và phương pháp thu mẫu
Để thực hiện nghiên cứu này, chúng tôi đã
tiến hành thu thập 70 mẫu cá bị bệnh từ các hộ
nuôi cá nheo Mỹ ở Lý Nhân - Hà Nam (32 mẫu),
Lương Tài - Bắc Ninh (22 mẫu), Ân Thi - Hưng
Yên (16 mẫu). Thời gian thu thập từ tháng 3 tháng 11 năm 2019. Mẫu được vận chuyển về và
phân tích tại phòng thí nghiệm Bệnh thủy sản,
Khoa Thủy sản - Học viện Nông nghiệp Việt
Nam bằng phương pháp vận chuyển kín.
2.2.2. Quan sát lâm sàng
Cá được phân tích ngay sau khi chuyển tới
phòng thí nghiệm. Các triệu chứng lâm sàng
được quan sát và ghi chép cẩn thận. Sau đó, tiến
hành giải phẫu cá bằng dao kéo tiệt trùng để

thu thập bệnh tích đại thể, nuôi cấy và phân lập
vi khuẩn theo mô tả của Hoai & cs. (2019), thu
mẫu mô để làm tiêu bản mô bệnh học theo mô
tả của Hoai & cs. (2014).
2.2.3. Phân lập vi khuẩn gây bệnh
Dùng que cấy vô trùng thu mẫu vi khuẩn từ
tiền thận cá bị bệnh, nuôi cấy vi khuẩn trên môi
trường TSA và TSA bổ sung 5% máu cừu. Vi
khuẩn được nuôi cấy ở nhiệt độ 28C. Các mẫu
bệnh có nhiễm khuẩn được quan sát hình dạng,
màu sắc, kích thước khuẩn lạc. Trong trường
hợp có sự hiện diện của nhiều hơn 1 loại khuẩn
lạc, xác định loại khuẩn lạc chiếm ưu thế và loại
thiểu số để sơ bộ xác định loại khuẩn lạc nào là

95


Đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus)

tác nhân chính, nhuộm Gram theo hướng dẫn
của nhà sản xuất kit nhuộm Gram (Merck) để
xác định đặc tính. Các chủng vi khuẩn phân lập
được sử dụng để thử đặc tính sinh hóa bằng kit
API 20E theo hướng dẫn của nhà sản xuất
(BioMerieux, Pháp) và bảo quản trong môi
trường TSB bổ sung 20% glycerol (v/v) và giữ ở
tủ âm sâu (-80C).
2.2.4. Giám định vi khuẩn gây bệnh bằng
phương pháp PCR

DNA từ vi khuẩn (n = 70) được tách chiết
theo phương pháp sử dụng kit chiết tách DNA
thương mại QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN).
Quy trình chiết tách DNA được thực hiện theo
hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng PCR
dùng để giám định các chủng phân lập sử dụng
cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gene 16S
rRNA của vi khuẩn Edwardsiella ictaluries
EiFd-1 (Forward) 5’- GTAGCAGGGAGAAAGCT
TGC - 3’ và EiRs-1 (Reverse) 5’- GAACGCTATT
AACGCTCACACC - 3’ (Panangala & cs., 2007).
Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 5,5
nuclease-free water; 12,5µL 2X Go Taq green
master mix (Promega); 1µL Mồi ngược (10
pmole EiFd-1-F); 1µL mồi xuôi (10 pmole EiFd1-R) và 5µL khuôn mẫu DNA. Đối chứng dương
sử dụng trong phản ứng PCR là chủng
Edwardsiella ictaluri LMG 7860, đây là chủng
đối chứng dương chuẩn quốc tế phân lập từ cá
nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) được cung cấp từ
Viện Nuôi trồng thủy sản II.

Chu trình nhiệt được thực hiện gồm 3 bước
bao gồm: Tiền biến tính ở nhiệt độ 94°C trong 2
phút; Chu kỳ lặp lại 30 lần: Biến tính ở nhiệt độ
95°C trong 30 giây, gắn mồi ở 53°C trong 45 giây,
tổng hợp kéo dài ở 72°C trong 30 giây; Hoàn
thành ở 72°C trong 7 phút. Sản phẩm PCR được
điện di trên gel 1,2% (TBE 1X) với thang DNA
chuẩn 100bp (marker). Sử dụng nguồn điện di ở
hiệu điện thế 100V, cường độ 100mA, thời gian

chạy điện di trong 30 phút. Sản phẩm PCR nếu
dương tính sẽ cho vạch sáng 407bp.
2.2.5. Thu mẫu mô, làm tiêu bản và phân
tích biến đổi mô bệnh học
Các cơ quan và bộ phận của 14 cá bị bệnh
gan thận mủ được chọn ngẫu nhiên từ số bị
bệnh gan thận mủ (đã được khẳng định bằng
PCR) và 1 cá khỏe mạnh (mẫu đối chứng) được
tiến hành làm tiêu bản mô học. Mang, gan,
thận, ruột của cá bị bệnh được thu và cố định
trong dung dịch buffer formalin 10%, sau đó
được đúc parafin, cắt mô và nhuộm
Hematoxyline và Eosin (HE) theo quy trình và
phương pháp của Mumford & cs. (2007). Các
mẫu mô được phân tích đặc điểm bệnh lý vi thể
ở độ phóng đại 40, 100 và 400 lần để phát hiện
và so sánh các biến đổi mô học.
2.3.6. Xử lý số liệu
Tỷ lệ xuất hiện các triệu chứng, bệnh tích
của cá bệnh được thu thập và tính toán bằng
phần mềm Microsoft Excel 2010.

Bảng 1. Triệu chứng và bệnh tích của cá nheo Mỹ bị bệnh gan thận mủ (n = 70)
Triệu chứng và bệnh tích cá bị bệnh

Số cá có triệu chứng/bệnh tích

Tỷ lệ (%)

Triệu chứng

Cá bỏ ăn, bơi lờ đờ

70

100

Mang có nhiều nhớt

60

85,7

Nắp mang xuyết huyết

48

68,5

Sưng và xuất huyết lỗ hậu môn

44

62,8

Gốc vây ngực xuất huyết

40

57,1

Thân bị lở loét

12

17,1

Gan, thận có các đốm mủ trắng

70

100

Xuất huyết ruột

58

82,8

Bụng chứa nhiều dịch vàng

44

62,8

Thận sưng

36

51,4

Bệnh tích

96


Trương Đình
Đình Hoài, Kim V
Văn Vạn,
n, Đào Lê Anh, Nguy
Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn
Nguy n Văn Tuyến,
Tuy
Vũ
V Đức Mạnh,
nh, Nguy
Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn
Nguy Thị Lan

3. KẾT
T QU
QUẢ VÀ TH
THẢO LUẬN
3.1. Đặc
c đi
điểm bệnh
nh lý c
của
a cá
c nheo Mỹ
ỹ bị

bệnh
nh gan th
thận mủ
Kiểm
m tra 70 mẫu
u cá thu từ
ừ các hộ nuôi có
dấu hiệu bị bệnh gan th
thận mủ cho thấy
th y cá nheo
Mỹ mắcc b
bệnh có biểu
u hi
hiện triệu
u chứng
ch ng như b
bỏ
ăn, bơi llờ đờ,, mang nhi
nhiều
u nhớt,
nh
xuấtt huy
huyết
xương nắ
ắp
p mang và các g
gốcc vây, ngoài ra hi
hiện
tượng xuấ
ất huyếtt và llở loét trên da cũng thư

thường
xuất hiện
n.. Trong đó, cá b
bỏ ăn, bơi lờ
l đờ,, ng
ngửa
bụng trướớc khi chết,
t, cá b
bị xuấtt huyết
huy gốcc vây,
sưng và xu
xuất huyếtt llỗ hậu
u môn, mang nhi
nhiều

nhớ
ớt và xuấtt huy
huyết nắp
p mang chiếm
chi
tỷ
ỷ lệ cao và
là các triệu
tri u ch
chứng thường
ng thấy
th
ở cá bị
b bệnh.
Giả

ải phẫu
u cá b
bị bệnh
nh cho thấy
th y gan thận
th
có các
đốm
m hoại
ho tử màu tr
trắng
ng có thể
th quan sát rõ trên
bề mặtt gan và th
thận. Các đốm
đ
mủ này mềm,
m
nhũn, một
m số đ
đốm mủ dễ vỡ ra nhiều
u dịch
d
khi
tác động
đ
nhẹ và đ
đồng
ng nhất
nh t khi quan sát trên

kính hiển
hi vi. Ru
Ruột xuất huyết
huy t và xoang bụng
b
có
nhiều
nhi dịch
ch vàng cũng chi
chiếm
m tỷ
t lệ khá cao (Bảng
(B
1). Các triệu
u ch
chứng, bệnh
nh tích đại
đ i thể
th của cá
nheo Mỹ
M bị bệnh
nh gan th
thận
n mủ
m và tỷ lệ % xuất
hiện
n từng
t
triệệu chứng, bệ
ệnh tích cụ

ụ thể được
trình ở bảng 1, hình 1 và hình 2.

Ghi chú: A - Cá bơi lờ đ
đờ, ngửa bụng
ng trong lồng
l ng nuôi; B - Mang nhiều
nhi nhớớt, xuất huyết
ết trên gốc
g c vây; C - Mang
nhiều nhớt,
t, xương n
nắp
p mang xu
xuấtt huyết;
huy D - Xuất
ất huy
huyết lỗ hậu
u môn.

Hình 1.. Triệu
Tri
chứng
ng cá nheo M
Mỹ
ỹ bị bệnh
nh gan th
thận mủ
ủ

Ghi chú: A - Bụng
ng tích nư
nướcc vàng, gan có nhiều đốm
ốm m
mủ trắng;
ng; B, C - Gan xu
xuất hiện nhiềm
m đốm
đ
mủ, xuất huyết, tụ
huyết; D- Th
Thận
n sưng, nhi
nhiều đốm mủ trắng,
tr
xuấtt huy
huyết và tụ huyết;
huy E, G - Ru
Ruột xuất huyết,
ết, niêm mạc
m c xuất
xu huyết.

Hình 2. Bệ
ệnh
nh tích cá nheo Mỹ bị
b bệnh
nh gan th
thận mủ

97


Đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus)

Theo người nuôi cá nheo Mỹ, cá bị bệnh gan
thận mủ rất khó phát hiện sớm, vì các triệu
chứng bệnh bên ngoài không đặc trưng, người
dân chỉ phát hiện được bệnh khi cá bắt đầu có
hiện tượng chết rải rác, mổ khám mới nhận diện
được bệnh. Trong quá trình thu mẫu ở 3 tỉnh
cho thấy bệnh gan thận mủ ở cá nheo Mỹ
thường xuất hiện rải rác quanh năm, bệnh xuất
hiện từ tháng 3 đến tháng 11 hàng năm, tập
trung nhiều ở các tháng mùa hè nắng nóng từ
tháng 6-9. Theo Francis-Floyd & cs. (1987), vi
khuẩn phát triển và gây bệnh ở nhiệt độ từ 17
đến 32C, nhưng cá có triệu chứng bệnh rõ khi
nhiệt độ nước >22C và có thể gây bùng phát
dịch bệnh khi nhiệt độ nước nuôi dao động xung
quanh 28C. Điều nay cũng hoàn toàn phù hợp
với đặc điểm phát triển của bệnh gan thận mủ ở
cá nheo Mỹ ở miền Bắc Việt Nam, từ tháng 11
năm trước đến tháng 3 năm sau, nhiệt độ nước
thấp, do vậy bệnh ít xuất hiện. Trong khi tháng
6-9 là thời điểm nắng, nhiệt độ cao và là điều
kiện cho vi khuẩn phát triển và gây bùng phát
dịch bệnh.
Hiện nay, một số tác nhân gây bệnh có thể
gây ra hiện tượng đốm mủ trắng trên nội tạng

cá da trơn, do vậy cần phân biệt để chẩn đoán
đúng tác nhân gây bệnh. Bệnh gan thận mủ
trên cá tra chủ yếu do E. ictaluri (Crumlish &
cs., 2002; Dung & cs., 2008), trong khi đó theo
Đặng Thị Hoàng Oanh & Nguyễn Trọng nghĩa
(2016) tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá
lóc (Channa striata) nuôi ở đồng bằng sông cửu
long là Aeromonas schubertii. Ngoài ra một số
đốm trắng trên gan, thận cá da trơn có thể do
bào tử sợi Myxobolus sp. gây ra (Đồng Thanh
Hà, 2009). Theo Đồng Thanh Hà (2009) bệnh
gan thận mủ trên cá tra do E. ictaluri thường
gây ra các đốm mủ nhỏ, kích thước 1-2mm,
trong khi cá bị bệnh, các đốm trắng lớn thường
do bào nang bào tử sợi gây ra. Tuy nhiên, theo
quan sát của chúng tôi, cá nheo Mỹ bị bệnh gan
thận mủ, các đốm mủ này có kích thước dao
động lớn, từ 1-8mm và hoàn toàn không có sự
xuất hiện của bào tử sợi. Đặc điểm khác biệt về
kích thước đốm mủ này có thể do sự khác biệt về
loài cá nheo Mỹ và cá tra, ngoài ra có thể có sự
khác biệt về chủng vi khuẩn gây bệnh và giữa
điều kiện môi trường giữa 2 miền Nam và Bắc
mà biểu hiện bệnh ở 2 loài cá là khác nhau.

98

3.3. Kết quả phân lập, kiểm tra đặc điểm
sinh hóa và giám định vi khuẩn bằng
phương pháp PCR

Vi khuẩn nuôi cấy từ cá bị bệnh trên môi
trường nuôi cấy phần lớn đều có hình dạng là
các khuẩn lạc nhỏ, không nhân, phát triển sau
48h ở môi trường TSA và phát triển nhanh hơn
(24h) ở môi trường TSA có bổ sung 5% máu cừu.
Các khuẩn lạc có màu trắng hơi đục, rìa bằng,
hơi lồi (Hình 3A). Kết quả nhuộm Gram cho
thấy vi khuẩn hình que, thon mảnh, tròn hai
đầu và bắt màu Gram âm (Hình 3B). Khoảng
3% khuẩn lạc còn lại có kích thước khá lớn, khi
nhuộm gram bắt màu Gram âm, dạng trực
khuẩn. Các vi khuẩn này có thể là Aeromonas
spp. và đây là vi khuẩn cơ hội trong môi trường
nước và thường có trong cơ thể cá nên rất dễ bắt
gặp khi phân lập vi khuẩn từ cơ thể cá (Wang &
Silva, 1999). Với tỷ lệ phần trăm khuẩn lạc xuất
hiện trên đĩa thạch cho thấy vi khuẩn có khuẩn
lạc nhỏ là tác nhân chính gây bệnh. Các chủng
vi khuẩn này đã được nuôi cấy thuần, thử đặc
tính sinh hóa và tăng sinh để phục vụ giám
định bằng PCR.
Các chủng vi khuẩn (n = 70) được đánh giá
là tác nhân gây bệnh gan thận mủ cho cá nheo
Mỹ đã được nuôi cấy thuần để xác định sử dụng
cho các thử nghiệm tiếp theo. Kết quả phản ứng
sinh hóa sử dụng API 20E cho thấy các chủng vi
khuẩn phân lập có khả năng thủy phân lysine
(dương tính LDC) và ornithine (dương tính
ODC), có khả năng lên men và oxy hóa đường
(dương tính D-glucose), 17/20 phản ứng còn lại

cho kết quả âm tính. Kết quả này hoàn toàn
phù hợp với đặc tính sinh hóa của E. ictaluri
theo mô tả của Hawke (1979) ở cá nheo mỹ và
của Đặng Thị Hoàng Oanh & Nguyễn Trúc
Phương (2010) (Bảng 2).
Kết quả giám định các chủng vi khuẩn bằng
phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu EiFd1F/EiFd-1R để phát hiện DNA của vi khuẩn
E. ictaluri cho thấy 100% chủng đều cho kết quả
PCR dương tính với DNA của vi khuẩn
E. ictaluri và cho sản phẩm PCR có độ dài
407bp (Hình 4).


Trương Đình
Đình Hoài, Kim V
Văn Vạn,
n, Đào Lê Anh, Nguy
Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn
Nguy n Văn Tuyến,
Tuy
Vũ
V Đức Mạnh,
nh, Nguy
Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn
Nguy Thị Lan

Bảng
ng 2. Kếtt qu
quả thử sinh hóa các ch
chủng Edwardsiella ictaluri phân lập

l
từ cá bệnh
b
Các ch
chỉ tiêu sinh hóa

Các chủng
ch ng vi khu
khuẩn phân lập
p cá bệnh
b
(n = 70))

Edwardsiella ictaluri CAF255*

-

-

Trực khuẩn

Trực khuẩn
n

Tính di động
ng

+

+

ONPG

-

-

ADH

-

-

LDC

+

+

ODC

+

+

Citrate utilization

-

-

H2S Production

-

-

Urease

-

-

TDA

-

ND

Indole production

-

-

Voges-Proskauer
Proskauer

-

-

Gelatin

-

-

D-glucose
glucose

+

+

D-mannitol
mannitol

-

-

Inositol

-

-

D-sorbitol
sorbitol

-

-

L-rhamnose
rhamnose

-

-

D-sucrose
sucrose

-

-

D-melibiose
melibiose

-

-

Amygdalin

-

-

L-arabinose
arabinose

-

-

Nhuộm
m gram
Hình dạng
ng

Tạo axit từ
ừ

Ghi chú: * - Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn
Nguy n Trúc Phương (2010); ND - Không xác đ
định
nh.

Hình 3. Hình d
dạ
ạng khuẩn
n lạc
l c và nhu
nhuộm
m gram chủng
ch ng vi khu

khuẩn E. ictaluri Ei-VN19
VN19-6
thu từ
t cá nheo M
Mỹ bị bệnh
nh gan thận
th n m
mủ

99


Đặc điểm
mb
bệnh lý và ứng
ng d
dụng phương
ng pháp PCR ch
chẩn đoán bệnh
nh gan thận
th mủ
ủ trên cá nheo Mỹ
M (Ictalurus
Ictalurus punctatus)
punctatus

Ghi chú: M: Marker; Gi
Giếng 1-7: 7 chủ
ủng vi khuẩn
nđ

đại diện
n thu từ
t cá nheo bịị bệnh; Giếng
ng 8: Đối chứng
ng âm;
Giếng
ng 9: Đ
Đối chứng
ng dương ch
chủng
ng vi khuẩn
khu n E. ictaluri LMG 7860.

Hình 4. Kếtt qu
quả chạy
y PCR 7 chủng
ng vi khu
khuẩn
n đại
đ diện
n phân llập từ
ừ cá nheo Mỹ
M
bị bệ
ệnh gan thậ
ận mủ
Từ các đ
đặcc tính hình thái khuẩn
khu lạc, kếtt qu
quả

nhuộm
m Gram và k
kếtt qu
quả giám định
nh bằng
b ng PCR, có
thể nói rằ
ằng
ng cá nheo M
Mỹ bị bệnh
nh gan thận
th mủ
ủ do
E. ictaluri gây ra. Theo Waltman & cs.. (1986)
(1986),
các chủng
ng E. ictaluri phân lập từ
ừ một số loài cá
khác nhau nhưng có đ
độ tương đồng
ng cao trong ccấu
trúc gen. C
Cặp mồi đặ
ặc hiệu
u EiFd-1F/EiFd-1R
EiFd
1R đ
để
phát hiện
n DNA ccủa

a vi khu
khuẩn E. ictaluri đã đư
được
sử dụng
ng đ
để chẩn
n đoán b
bệnh
nh gan thận
th mủ trên cá
tra, cá rô phi và cá nheo M
Mỹ trong nghiên ccứu
này. Mặcc dù v
vậy,
y, gi
giữa
a các chủng
ch ng vi khu
khuẩn
E. ictaluri gây bệnh
nh cho các loài cá khác nhau có
thể có sự khác nhau v
về đặcc tính di truyền
truy n và ccần
có các nghiên ccứu tiếp
p theo, đ
đặcc biệt
bi là giảii trình
tự bộ gen ccủa
a các ch

chủng gây bệnh
nh ở các loài cá
khác nhau đ
để làm rõ v
vấn đề này.
3.4. Mộtt ssố đặc điể
ểm mô bệnh
nh học
h
của
a cá
nheo Mỹ
ỹ mắc bệnh
nh gan th
thận
n mủ
m
Để nghiên ccứu
uđ
đặc điểm bệnh
nh lý vi thể
th của
cá bị bệnh,
nh, 14 m
mẫu
u mô đư
đượcc thu từ
t cá nheo M
Mỹ
bị bệnh

nh gan th
thận mủ đã giám định
nh bằng
b ng PCR và
01 cá khỏỏe mạnh đượợc sử dụng
ng để
đ làm tiêu b
bản
mô học.
c. Nh
Những biến
n đ
đổi mô họ
ọc ở mang, gan,
thận, ruộột của
a cá nheo M
Mỹ mắcc bệnh
b nh gan th
thận
mủ đượcc so sán
sánh vớới cá khỏe
e mạnh
m nh và đư
được
trình bày ở các hình 5 đ
đến
n hình 20.
Kếtt qu
quả kiểm
m tra bi

biến đổii mô bệnh
b
họọc cá
mắc bệnh
nh gan th
thận
n m
mủ cho thấy
y mang cá tăng
sinh, mô mang xu
xuấtt huy
huyếtt và phù nề
n trong khi

100

mang cá khỏe
kh e các tơ mang sơ cấp,
c
thứ
ứ cấp và số
lượng
ng các tế
t bào mang phân bố
b đều,
u, không gian
giữa
a các tơ mang th
thứ cấp
p rõ và nhiề

nhiều khoảng
trống
ng giúp cho quá trình hô hấp
h thuận
n lợi
l (Hình
5, 6 7 và 8). Mang tăng sinh, phù nề
nề và nhiều
nhớ
ớtt làm cho cá thi
thiếu
u oxy, sức
s khỏee kém cũng là
nguyên nhân làm cho cá chết
ch nhiều.
u. Gan cá bệnh
xuấ
ất hiện nhiều
u ttế bào đạii thực
th c bào, nhiều
nhi vùng
xuấ
ất huyết, tụ máu, giảm
m số
s lượng tếế bào gan,
thoái hóa kèm theo ho
hoại tử
ử nghiêm trọng
tr
(Hình

10 và 12). Thận
Th n cá cũng xuất
xu hiện nhiềều vùng bị
thoái hóa, xuất
xu t huy
huyếtt và tụ
t huyết,
t, các vùng bị
b
hoạ
ại tử ống thậ
ận bị tổn
n thương nặng
n
nềề (Hình 14
và 16). Thành ru
ruột xuấtt huyết,
huy t, cơ trơn của
c
ruột
cấu
u trúc lỏng
l
lẻẻo, biểu
u mô lông nhung của
c ruột bị
đứtt nát, thoái hóa, lan tràn vi khuẩn
khu n gây bệnh
b
và

hồng
ng cầu
c u đã ph
phản ảnh
nh đúng đặc
đ điểm
m bệnh
b
tích
đạii thể
th ở ruộtt cá b
bị bệnh
nh (Hình
(Hình 19 và 20). Cho
đến
n nay, chỉ
ch có m
mộtt nghiên cứu
c
về mô bệnh
b
học
của
a cá nheo Mỹ
Mỹ nhiễm E. ictaluri do Miyazaki &
Plumb (1985) thực hiện,
n, tuy nhiên kết
k
quả
nghiên cứu

c chỉ nêu được đặ
ặc điểm
m mô bệnh
b
học ở
cơ, thận
th n và mô máu cá. Hi
Hiệ
ện tượng
ng cơ cá bị
b lở loét
và hoại
ho tử da đã đư
được Miyazaki & Plumb (1985)
mô tả
t kỹ,, tuy nhiên trong nghiên cứu
c u này, tỷ
t lệ
cá có hiện
hi tượng
ng llở loét và hoại
ho tử cơ chiếm
chi
tỷ lệ
khá thấp
th p (17,1%). Các đ
đặcc điểm
đi
về biến
bi đổi mô

bệnh
nh học
h ở thậ
ận cá bệnh
nh trong nghiên cứu
c
của
Miyazaki & Plumb (1985) là khá tương đồng
đ
so
vớii kết
k quả nghiên ccứu
u này.


Trương Đình
Đình Hoài, Kim V
Văn Vạn,
n, Đào Lê Anh, Nguy
Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn
Nguy n Văn Tuyến,
Tuy
Vũ
V Đức Mạnh,
nh, Nguy
Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn
Nguy Thị Lan

Hình 5. Mang cá nheo M
Mỹ khỏ

ỏe,
e, các tơ mang
sơ cấp
p và th
thứ cấp
pr
rộng
ng và thoáng (HE × 40)

Hình 6. Mang cá nheo Mỹ
M khỏe, các tế
t bào
mang có cấu
c u trúc, ssố lượng
lư ng và kích thước
thư
bình thường
thư ng và phân bố
ố đều
u trên tơ mang
th
thứ cấp (HE ×100)

Hình 7. Mang cá nheo M
Mỹ bị bệnh,
b nh, tơ mang
tăng sinh, mang xu
xuất huyếtt nặng
n
(HE × 100)

Hình 8. Mang cá bệnh,, tơ mang tăng sinh và
xuấtt huy
huyếtt lan tràn (HE × 400)

Hình 9. Gan cá bình thư
thường,
ng, cấu
c u trúc, m
mật
độ và phân b
bố tế bào gan đ
đều
u trên nhu mô
gan (HE × 100)

Hình 10. Gan cá b
bệnh,
nh, nhu mô gan hoại
ho tử,
xuất
xu huyết,
t, ttế bào gan thưa thớt,
th t, cấu
c trúc
lỏng
l
lẻo
o (mũi tên đen), sự
s hiện diệ

ện của
E. ictaluri trong mô (mũi tên vàng) (HE × 100)

101


Đặc điểm
mb
bệnh lý và ứng
ng d
dụng phương
ng pháp PCR ch
chẩn đoán bệnh
nh gan thận
th mủ
ủ trên cá nheo Mỹ
M (Ictalurus
Ictalurus punctatus)
punctatus

Hình 11. Gan cá bình thư
thường,
ng, tế
t bào
o hình đa
giác, nhân rõ và phân b
bố đều
u trong nhu mô
gan (HE × 400)

Hình 12. Gan cá b
bệnh, số lượng tế bào gan
giảm,
m, cấu
c u trúc llỏng lẻo,
o, hoại
ho tử và xuất
xu huyết
lan tràn (mũi tên đen), sự
s hiện diệ
ện của
E. ictaluri trong mô (mũi tên vàng) (HE
(
× 400)

Hình 13.
3. Thận
n cá bình thư
thường,
ng, số
s lượng
ng và
cấ
ấu trúc ống
ng th
thận rõ (HE
HE × 40 )

Hình 14. Thận
n cá b

bệnh,
nh, thận
th
bị hoại
ho tử, số
lượ
ợng ống thậ
ận giảm, cấ
ấu trúc ống
ng thận
th
bị
biến
bi
dạng,
ng, xu
xuất huyếtt lan tràn (mũi tên
đen), sự
s hiện
n di
diện của E. ictaluri trong mô
(mũi tên vàng) (HE × 40)

5. KẾT
T LU
LUẬN
Cá nheo M
Mỹ bị b
bệnh
nh gan thận

th
mủ thư
thường
bơi lờ đờờ,, mang nhi
nhiều nhớt,
t, xuất
xu
huyếtt n
nắp
mang, gốc
ốc vây và h
hậ
ậu
u môn. Các nội
n i quan như
gan, thận
n có nhi
nhiều
u đ
đốm mủ trắ
ắng do hoạii ttử,
ruột xuấtt huy
huyết. Về mô b
bệnh học,
c, mang cá b
bệnh
có biểu
u hi
hiện
n tăng sinh mạnh

nh và xuất
xu huyếtt lan
tràn. Ruộột bị xuấtt huy
huyếtt và thành ruột
ru bị đứt
nát. Gan, th
thận bị hoạ
ại tử, cấu
u trúc nhu mô llỏng
lẻoo kèm theo hi
hiện tượợng xuấtt huyết
huy và tụ huy
huyết.

102

Các chủng
ng vi khu
khuẩn từ
ừ cá bệnh
nh có khuẩn
khu lạc
nhỏ
ỏ,, không nhân, tr
trắng
ng hơi đục,
đ
rìa bằng, hơi lồi,
vi khuẩn
khu

dạng
ng tr
trực khuẩn
n bắt
b t màu Gram âm.
Các chủng
ch ng vi khu
khuẩn
n này đã được
đư thử
ử đặc tính
sinh hóa và giám đ
định bằng
ng PCR với
v i 100% mẫu
m
dương tính với
v i E. ictaluri.. Những
ng thông tin từ
t
kếtt quả
qu nghiên ccứu
u này là cơ sở
s để người
ngư nuôi
phát hiện
hi
sớm
m b
bệnh, đề ra phương

phương pháp chẩn
ch
đoán và phòng và tr
trị bệnh
nh phù hợp,
h p, giảm
gi
thiểu
thiệ
ệt hại do dịch
ch b
bệnh
nh này gây ra trong tương lai.


Trương Đình
Đình Hoài, Kim V
Văn Vạn,
n, Đào Lê Anh, Nguy
Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn
Nguy n Văn Tuyến,
Tuy
Vũ
V Đức Mạnh,
nh, Nguy
Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang Lâm, Nguyễn
Nguy Thị Lan

Hình 15. Th
Thận

n cá bình thư
thường,
ng, cấu
c u trúc ống
thận
n rõ, các ttế bào ống thận
n phân bố
b đ
đều
(HE
HE × 100)

Hình 16. Thận
Th n cá b
bệnh,
nh, nhu mô bị
b hoại
ho tử, các
ống
ng thận
th bị m
mất cấu
u trúc, nhân thoái hóa,
nhu mô thận
th n xu
xuất huyếtt lan tràn (HE
HE × 100)

Hình 17. Ruộtt cá bình thư
thường,

ng, thành ru
ruột
cấu
u trung r
rắn chắc,
c, bi
biểu
u mô và lông nhung
rõ cấu
u trúc (HE × 40)

Hình 18. Ruộ
ộtt cá bình thường,
thư ng, thành ruột
ru
cấu
u trung rắn
r n ch
chắc, biểu
u mô và lông nhung
rõ c
cấu trúc (HE
HE × 100)

Hình 19. Ruộtt cá b
bị bệnh,
nh, thành ruột
ru lỏ
ỏng
lẻo lông nhung rách nát, xu

xuấtt huyết
huy t trên c
cả
thành ru
ruộtt và bi
biểu mô ruộ
ột (HE × 40))

Hình 20. Ruộ
ột cá bị bệnh,
nh, thành ruột
ru giãn
ra,
ra cấu
u trúc cơ vòng llỏng
ng lẻo,
l o, lông nhung
rách nát, xuấ
xuất huyếtt trên cả
c thành ruột
ru và
biểu
u mô ru
ruột (HE
(
× 100)

103

Đặc điểm bệnh lý và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh gan thận mủ trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus)

LỜI CẢM ƠN
Để thực hiện nghiên cứu này, các tác giả
nhận được kính phí từ đề tài trọng điểm
(T2018-03-12TĐ) do Học viện Nông nghiệp Việt
Nam tài trợ. Nhóm tác giả xin chân thành cảm
ơn sự hỗ trợ của các em sinh viên Khoa Thủy
sản, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt
Nam và các chủ trang trại nuôi cá nheo Mỹ ở
Hưng Yên, Bắc Ninh và Hà Nam đã giúp đỡ và
tạo điều kiện trong quá trình điều tra, thu mẫu
để hoàn thành nghiên cứu này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Crumlish, Dung M., Turnbull T., Ngoc J., N. &
Ferguson H. (2002). Identification of Edwardsiella
ictaluri from diseased freshwater catfish,
Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in
the Mekong Delta, Vietnam. Journal of fish
diseases. 25: 733-736.
Đặng Thị Hoàng Oanh & Nguyễn Trọng Nghĩa (2016).
Xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá
lóc (Channa striata) nuôi ở đồng bằng sông cửu
long. Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn.
9: 82-89.
De la Cruz N.I., Rabago J.L., Monreal A.E., Colín
V.H., Aguirre G., Merino J.O., Carmona S.D.,
Rangel J.A., Horta J.V. & Venegas C.S. (2017).
Diagnosis and frequency of parasites in channel

catfish (Ictalurus punctatus) on northeastern and
gulf coast farms Mexico. 5(3): 98-103.
Dung T.T., Haesebrouck F., Tuan N.A., Sorgeloos P.,
Baele M. & Decostere A. (2008). Antimicrobial
susceptibility pattern of Edwardsiella ictaluri
isolates from natural outbreaks of bacillary
necrosis of Pangasianodon hypophthalmus in
Vietnam. Microbial drug resistance. 14: 311-316.
Đồng Thanh Hà (2009). Nghiên cứu xác định tác nhân
gây bệnh “mủ ở gan thận” trên cá tra (Pangasius
hypophthalmus) nuôi tại bến tre. Kỷ yếu hội nghị
sinh viên NCKH 2008-2009. Trường Đại học Thủy
sản Nha Trang.

104

FAO (2014). The State of Food and Agriculture Innovation in family farming.
Francis-Floyd R., Beleau M., Waterstrat P. & Bowser
P. (1987). Effect of water temperature on the
clinical outcome of infection with Edwardsiella
ictaluri in channel catfish. Journal of the American
Veterinary Medical Association. 191: 1413-1416.
Gatlin D.M. & Stickney R.R. (1982). Fall‐winter
growth of young channel catfish in response to
quantity and source of dietary lipid. Transactions
of the American Fisheries Society. 111: 90-93.
Hoai T.D., Trang T.T., Van Tuyen N., Giang N.T.H. &
Van Van K. (2019). Aeromonas veronii caused
disease and mortality in channel catfish in
Vietnam. Aquaculture. 513: 734425.

Hoai T.D., Hoai N.T, Phuong N.T.M & Hau N.T.
(2014). Histopathological features of tilapias
cultured in Nothern Vietnamese provinces
naturally infected with Streptococcus sp. J. Sci. &
Devel. 12: 360-371.
Miyazaki T. & Plumb J. (1985). Histopathology of
Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus
punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases.
8: 389-392.
Panangala V.S., Shoemaker C.A., Van Santen V.L.,
Dybvig K. & Klesius P.H. (2007). Multiplex-PCR
for simultaneous detection of 3 bacterial fish
pathogens,
Flavobacterium
columnare,
Edwardsiella ictaluri, and Aeromonas hydrophila.
Diseases of Aquatic Organisms. 74: 199-208.
Kim Văn Vạn (2017). Xây dựng mô hình nuôi cá nheo
mỹ (Ictalurus punctatus) trong ao tại Hưng Yên.
Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
15(6): 738-745.
Wagner B.A., Wise D.J., Khoo L.H. & Terhune J.S.
(2002). The epidemiology of bacterial diseases in
food‐size channel catfish. Journal of Aquatic
Animal Health. 14: 263-272.
Waltman W., Shotts E. & Hsu T. (1986). Biochemical
characteristics of Edwardsiella ictaluri. Appl.
Environ. Microbiol. 51: 101-104.
Wang C. & Silva J.L. (1999). Prevalence and
characteristics of Aeromonas species isolated from

processed channel catfish. Journal of Food
Protection. 62: 30-34.