Nghiên cứu định lượng atractylenolide III trong thân rễ bạch truật (atractylodes macrophala koidz) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao bắt cặp detector dad

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

TRẦN NGỌC TUÂN

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG
THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC
KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
Người thực hiện : TRẦN NGỌC TUÂN
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG
THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC
KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
Khóa: QH2014.Y
Người hướng dẫn:
TS. Hoàng Lê Sơn
PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải

HÀ NỘI – 2019


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Tiến sĩ Hoàng
Lê Sơn – Khoa Bào chế Chế biến và PGS.Tiến sĩ Nguyễn Thanh Hải – Chủ nhiệm

bộ môn Bào chế khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Dược Liệu là những
người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện
khóa luận này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Bào chế - khoa Y Dược, Đại học Quốc gia
Hà Nội và khoa Bào chế Chế biến – Viện Dược Liệu, đã tạo điều kiện để tôi có thể
thực hiện khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm, các Phòng ban khoa Y Dược, Đại học
Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa đã cho tôi những kiến
thức quý báu trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện tại khoa.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh,
động viên tôi trong lúc khó khắn cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận này.
Hà Nội, ngày

tháng

Trần Ngọc Tuân

năm 2019


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
LOD

Giới hạn phát hiện (Limit Of Detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu
Chromatography)

DAD

Máy đo quang (Diode Array Detector)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

ACN

Acetonitrile

USP

Dược điển Hoa Kì

ICH

Hội nghị quốc tế về hài hoà hoá các thủ tục đăng ký dược phẩ m sử
dụng cho con người

năng

cao

(High

Performance

Liquid


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng
1

Hóa chất thuốc thử

2

Trang thiết bị, máy

3

Kết quả sắc ký đồ
chương trình chạy
phát hiện là 220nm

4
5
6

7

8

9

10

Kết quả diện tích p

Ethanol 96% khi p

Các thông số đánh

Kết quả độ tuyến tí

Atractylenolide III

Kết quả đánh giá tí
định lượng Atract
26µg/ml.

Kết quả đánh giá đ

Atractylenolide III

Kết quả đánh giá đ

trong mẫu thử thêm

Kết quả xác định h

Bạch truật Việt Na

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình

Tên hình

1

Công thức cấ

2

Công thức cấ

3

4

5

6

7

8

Sắc ký đồ ph

sóng hấp thụ

Sắc ký đồ HP
định lượng A
thêm chuẩn v

Sắc ký đồ HP

lượt là 0,065

Đường chuẩn
diện tích pic
III.

Sắc ký đồ ph

truật bằng H
Phổ hấp thụ

truật Việt Na


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.............................................................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN....................................................................................................................... 2
1.1. Giới thiệu chung về cây bạch truật..................................................................................................... 2
1.1.1. Tên khoa học...................................................................................................................................... 2
1.1.2. Mô tả thực vật, bộ phận dùng...................................................................................................... 2
1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến......................................................................................................... 2
1.1.4. Thành phần hóa học......................................................................................................................... 3
1.1.5. Tác dụng dược lý.............................................................................................................................. 5
1.2. Tổng quan về vị thuốc Bạch thuật....................................................................................................... 7

1.3. Vài nét về hoạt chất Atractylenolide III............................................................................................ 8
1.4. Các nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong cây bạch truật..................................... 8
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................... 9
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................................................ 9
2.2. Trang thiết bị, dung môi, hóa chất.................................................................................................... 9
2.3. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................................................... 10
2.3.1. Khảo sát điều ki ệ n sắc ký......................................................................................................... 10
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu.............................................................................................................. 10
2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích.................................................................................................. 10
2.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả................................................................................ 13
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ............................................................................................................................ 15
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III........................................................... 15
3.1.1. Xác định bước sóng phát hiện của chất chuẩn Atractylenolide III............................. 15
3.1.2. Xây dựng điều kiện sắc ký trên mẫu Bạch truật bằng HPLC-DAD........................... 15
3.1.3. Xác định điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu.............................................................................. 17
3.1.4. Điều kiện chạy sắc ký HPLC.................................................................................................... 17
3.2. Thẩm định phương pháp phân tích................................................................................................... 18


3.2.1. Tính đặc hiệu của phương pháp............................................................................................... 18
3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng........................................................................... 19
3.2.3. Độ tuyến tính................................................................................................................................... 19
3.2.4. Độ thích hợp của hệ thống......................................................................................................... 21
3.2.5. Độ lặp lại.......................................................................................................................................... 21
3.2.6. Độ đúng............................................................................................................................................. 22
3.3. Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng dược chất trong củ Bạch truật..................23
CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN........................................................................................................................ 25
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT...................................................................................................................... 26
TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỞ ĐẦU
Bạch truật là vị thuốc từ loài Atractylodes macrocephala Koidz (Họ
Compossitae), có vị trí quan trọng trong các bài cổ phương hoặc đơn độc tại Đông
Á trong hơn một ngàn năm nay để điều trị một số chứng bệnh như đau dạ dày, bụng
trướng đầy, ung thư, chứng loãng xương và béo phì. Khoảng hơn bảy mươi hợp chất
được xác định cấu trúc hóa học trong đó đa phần thuộc về nhóm sesquiterpenoid,
phenolic acid và polyacetylene nhưng mối liên hệ với tác dụng trên lâm sàng là
chưa rõ ràng. Cả chất tinh khiết lẫn cao dịch chiết đều thể hiện tác dụng dược lý
mạnh như cải thiện hệ tiêu hóa thông qua thế bào IEC-6, kháng một số dòng tế bào
ung thư gồm HepG2, LOVO, CEM, và MKN-45, kích thích miễn dịch, kháng viêm,
chống oxy hóa, và cải thiện khả nhớ của chuột. Với những lợi ích trên lâm sàng và
hiệu quả điều trị đã được chứng minh, cây Bạch truật bắt đầu di thực về Việt Nam
từ những năm 1970 và giờ được tr ồng phổ biên tại Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Hà
Nội và Lâm Đồng. Hiện tại, các nghiên cứu công bố về hàm lượng dược chất có
trong Bạch truật di thực vẫn còn hạn chế. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên
cứu định lượng Atractylenolide III trong thân rễ bạch truật (Atractylodes
macrophala Koidz) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao bắt cặp detector DAD” với
hai mục tiêu dưới đây:
- Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III trong thân rễ cây
Bạch truật bằng phương pháp HPLC-DAD.
- Ứng dụng phương pháp để định lượng hàm lượng Atractylenolide III trong
mẫu Bạch truật Việt Nam và Trung Quốc.
Lựa chọn chấ t nghiên cứu là Atractylenolide III giữa các hoạt chất chính thể hiện
tác dụng b ảo v ệ đường tiêu hóa, chống loãng xương, cải thiện trí nhớ, và kháng
viêm trên các mô hình dược lý được giải thích như sau. Hàm lượng Atractylenolide
III thấp hơn so với atractylenolide I và II có thể gây khó khăn quá trình định
lượng
nhưng điều này phản ảnh một thực tế tác dụng của cao dịch chiết Bạch truật lại tốt
hơn đơn chất riêng biệt. Kiểm soát chất nhỏ hơn sẽ có lợi ích hơn trong trường hợp

này.

1


CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về cây bạch truật
1.1.1. Tên khoa học.
Bạch truật có tên khoa học là Atractylodes macrocephala Koidz thuộc họ Cúc
(Compossitae) [1].
1.1.2. Mô tả thực vật, bộ phận dùng
Đặc điểm: Cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ to, mọc dưới đất. Thân thẳng, cao 0.30.8m, đơn độc hoặc phân nhánh ở bộ phận trên, phần dưới thân hóa gỗ. Lá mọc
cách, dài. Lá ở phần dưới của thân có cuống dài, phần trên có cuống ngắn, gốc lá
rộng, bọc lấy thân. Phiến lá xẻ sâu thành 3 thùy, thùy giữa rất lớn, hình trứng tròn,
hai đầu nhọn, hai thùy bên nhỏ hơn, hình trứng mũi mác, phần gốc không đối xứng.
Các lá ở gần ngọn thân có phiến nguyên, hình thuôn hoặc hình trứng mũi mác, mép
có răng cưa. Đầu lớn, phần dưới có một lá bắc hình lá xẻ sâu, hình lông chim. Bao
hình chuông, có lá bắc mỏng xếp thành 7 hàng. Lá bắc dưới nhỏ hình trứng tam
giác, to dần ở phía trên. Hoa nhiều, tràng hình ống, phần dưới màu trắng, phần trên
màu đỏ tím, xẻ làm 5 thùy hình mũi mác, xoắn ra ngoài. Năm nhị hàn liền nhau (có
nhị bị thoái hóa), chỉ nhị hình sợi dẹp. Bầu thon mặt ngoài có lông nhung, màu nâu
nhạt, đoạn trên có lông hình lông chim. Vòi hình chỉ màu tím nhạt đầu nhị xẻ thành
2 thùy nông hình đầu, mặt ngoài có lông ngắn. Quả bế, thuôn, dẹp, màu xám [2].
Bộ phận dùng làm thuốc: Dùng thân rễ cứng chắc, có dầu thơm nhẹ, ruột màu trắng
ngà [2,10].
1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến
Phân bố: Bạch truật trồng chủ yếu ở Trung Quốc. Đến những năm 1970, Bạch truật
đã bắt đầ u di thực và hiện nay được trồng tại Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Hà Nội
và Lâm Đồng [2,10].
Thu hái và sơ chế: Cây trồng bạch truật thu hái từ cuối tháng 10 đến đầu tháng 11

(thường từ 8-22/11). Lúc thu hoạch, chọn ngày nắng ráo, đất khô, nhổ từng cây nhẹ
nhàng. Sau khi nhổ, lấy dao cất bỏ thân cây đem củ về chế biến [1,10].

2


Chế biến: Bạch truật đã loại bỏ tạp chất, rửa sạch, ủ mềm, thái lát dày, làm khô. Sau
khi sơ chế có thể tiến hành chế biến 2 loại Bạch truật sau:
- Thổ Bạch truật: Lấy bạch truật phiến, dùng bột mịn phục long cán sao đến
khi mặt ngoài có màu đất, rây bỏ đất, cứ 100 kg bạch truật phiến dùng 20 kg
bột mịn phục long cán [1].
- Bạch truật sao: Lấy cám mật chích, cho vào trong nồi nóng, khi khói bốc
lên thì cho bạch truật phiến vào sao cho đến khi có màu vàng sém, có mùi
thơm cháy, lấy ra rây bỏ cám mật chích, cứ 100 kg bạch truật phiến dùng 40
kg cám mật chích. Có thể sử dụng cám gạo thay cám mật chích [1].
1.1.4. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học trong cây bạch truật đã được xác định cấu trúc gồm 67 hoạt
chất chính thuộc chia vào các nhóm sau: Sesquiterpenoids, triterpenoids,
polyacetylenes, coumarins, phenylpropanoids, flavonoids, và flavonoid glycosides.
Ngoài ra, hai nhóm steroid và benzoquinones gồm có 4 hoạt chất chiếm tỉ lệ thấp
hơn trong cây bạch truật [7].

3


Hình 1: Công thức hóa học một số chất chính trong cây Bạch truật.
4


1.1.5. Tác dụng dược lý

Cải thiện chức đường tiêu hóa: Trong thử nghiệm lâm sàng trên chuột sử dụng cao
bạch truật với hàm lượng 0,035 g/kg và 0,105 g/kg cho kết quả cải thiện trọng lượng
của chuột, và thúc đẩy khả năng tiêu hóa của vi khuẩn đường ru ột [2,7].
Hoạt động chống khối u: Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên người mắc ung thư,
những người sử dụng cao ethanol bạch truật (1 – 4 mg/ml) trong 24 giờ cho thấy
giảm đáng kể các tế bào ưng thư [2,7].
Tác dụng điều hòa miễn dịch: Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện ra rằng khi sử
dụng bạch truật cho tác dụng điều hòa miễn dịch. Bột bạch truật dùng đường uống
với liều rất cao (1g/kg) sử dụng cho heo con trong 30 ngày cho kết quả tăng sinh tế
bào lympho ngoại biên, chỉ số tăng trọng, nồng độ immunoglobulin G (IgG) trong
huyết thanh, nồng độ IL-1 và IL-2, và biểu hi ệ n mRNA PR-39. Những chỉ số này
cho thấy rằng bạch truật có thể cải thiện sự trao đổi chất và chức năng miễn dịch
của heo con [2,7].
Tác dụng chống viêm: Thử nghiệm trên những con chuột bị viêm đại tràng cấp tính
do dextran sulfate gây ra, nghiên cứu sử dụng cao chiết bạch truật (100mg/kg) đã
làm giảm biểu hiện của những yếu tố viêm như COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α, NFB. Ngoài ra, những nghiên cứ u sử dụng polyacetylenes (25 – 300 mg/kg) trên chuột
có hiện tượng viêm gây ra bởi acetic acid hoặc dimethyl benzene thì trong 3 − 5
ngày đã được tìm thấy để ức chế đáng kể phản ứng viêm [26,7].
Điều trị bệnh Alzheimer và bảo vệ hệ thần kinh: Trong một mô hình thử nghiệm có
sử dụng cao chiết xuất bạch truật với ethanol (0,5 – 2 mg/kg) được xây dựng để tăng
cường trí nhớ, giảm tần suất sai lệch và giảm cholinesterase (AChE). Tác dụng của
cao chiết bạch truật với ethanol có thể cải thiện tình trạng suy giảm trên chuột già.
Ngoài ra, phương pháp điều trị 3 ngày với atractylenolide III (30 µg/ml) được xây
dựng để cải thiện hoạt động của tế bào và ức chế apoptosis. Những tác dụng này cho
thấy rằng atractylenolide III có hoạt tính bảo vệ thần kinh quan trọng [4,7].
Tác dụng chống lão hóa và chống oxy hóa: Cao bạch truật được chứng minh là có
hoạt động chống lão hóa và chống oxy hóa trên mô hình chuột. Trên những con
5

chuột sử dụng D-galactose, cao chiết bạch truật ngâm với nước được sử dụng làm
tăng hoạt động NO synthase (NOs), tăng sản xuất NO, và giảm hàm lượng lipid
peroxide (LPO) trong mô não. Các điều trị bằng polysacarides (100−200 mg/kg)
cho chuột đã sử dụng D-galactose trong 6 tuần thấy rằng nồng độ MDA và
lipofuscin (Lipo) cũng như hoạt động của monoamtin oxydase (MAO) giảm. Hơn
nữa, điều trị này làm tăng glutathione peroxidase (GSH-Px), CAT, SOD và toàn bộ
năng lượng hoạt động chống oxy hóa (T-AOC). Những tác dụng này cho thấy rằng
polysacarides làm tăng hoạt động chống oxy hóa ở chuột già bằng cách ức chế tạo
ra peroxit lipid và tăng hoạt tính enzyme chống oxy hóa [7].
Điều hòa nội tiết và tác dụng giảm co: Nghiên cứu s ử dụng cao methanol bạch
truật với liều rất cao 0,5−0,8 g/kg cho chuột gây rối loạn nội tiết bởi testosterone
propionate trong 8 tuần cho thấy cải thiện chu kỳ động dục, mức độ hormone kích
thích nang trứng (FSH) và giảm sự cân bằng c ủa toàn bộ testosterone (TT), chỉ số
androgen tự do (FAI), androstenedione phụ thuộc vào liều dùng. Cao chiết này cũng
tăng kiểm soát biểu hiện của aquaporin-9 (AQP-9) và giảm kiểm soát biểu hiện của
thụ thể FSH (FSHR), vì vậy, cao chiết xuất bạch truật với metanol có thể điều chỉnh
tuyến sinh dục sản xuất hoóc môn và làm giảm chứng tăng huyết áp [7].
Điều trị béo phì và tăng cường chuyển hóa năng lượng: Những nghiên cứu sử dụng
cao bạch truật (100-300 mg/kg) cho chuột béo phì do chế độ ăn nhiều chất béo trong
16 tuần dẫn đến giả m trọng lượng cơ thể, nồng độ lipid gan và nồng độ cholesterol
toàn phần trong huyết thanh. Phương pháp sử dụng cao chiết bạch truật này dẫn đến
s ự tăng nồng độ insulin, và không dung nạp glucose. Những hiệu ứng này cho thấy
r ằ ng bạch truật có thể ngăn ngừa béo phì. Hơn nữa, sử dụng cao bạch truật (0,2 −
1,0 mg/ml) đến các tế bào C2C12 trong 24h tăng đáng kể giải phóng glucose, s ự
biểu hiện của PGC1α và palmitoyltransferase 1b chuyển hóa khoáng chất (CPT).
Hơn nữa, cao bạch truật cũng làm giảm hàm lượng axit béo tự do (FFA). Khi kết
hợp với nhau, những tác động này cho thấy bạch truật có thể kích thích chức năng
ty thể và chuyển hóa năng lượng trong các mô cơ [2,7].
Tác dụng chống loãng xương: Nghiên cứu thử nghiệm trên các đại thực bào chuyển
hóa từ tủy xương và chuột bị tác động bởi thụ thể của phối tử NF-κB (RANKL; một

6


cytokine thiết yếu thúc đẩy biệt hóa tế bào tiền hủy xương thành tế bào hủy xương),
việc sử dụng cao chiết xuất bạch truật với ethanol cho thấy ức chế sự phân hóa tế
bào hủy xương [7].
Hoạt tính kháng khuẩn: Cao bạch truật cũng đã được chứng minh là có hoạt động
kháng khuẩn. Nghiên cứu sử cao chiết bạch truật (5-40 mg/ml) với t ụ cầu vàng,
E.Coli, và trực khuẩn mủ xanh trong 24 giờ cho thấy để ức chế đáng kể sự phát triển
của các vi khuẩn này [2,7].
Tác dụng lợi niệu: Trên chuột thử nghiệm với cao chiết nước của bạch truật (1 – 10
g/ml) trong 30 phút cho thấy cao chiết có tác dụng ức chế tiểu quản thận tái hấp thu
nước, tăng bài tiết Natri [4,7].
1.2. Tổng quan về vị thuốc Bạch thuật
Tính vị quy kinh: Khổ, cam, ôn. Vào kinh Tỳ và Vị [1].
Công năng chủ trị:
Kiện tỳ, ích khí, táo thấp, lợi thủy, cố biểu, liễm hãn, an thai.
Chủ trị: Tiêu hóa kém, bụng trướng, tiêu chảy, phù thũng, tự hãn, động thai.
Cách dùng: Ngày dùng từ 6–12g, dạng thuốc sắc hoặc bột. Bạch truật sao cám, tẩm
mật ong tăng tác dụng kiệ n tỳ, sao cháy có tác dụng chỉ huyết [1].
Kiêng kỵ: Đau bụng do âm hư nhiệt trướng, đại tiện táo, háo khát không dùng [1].
1.3. Vài nét về hoạt chất Atractylenolide III

Hình 2: Công thức cấu tạo của Atractylenolide III.
Atractylenolide III có công thức phân tử là C15H20O3.

7


Danh pháp IUPAC: (4 S,8 R,9 S)-9 -hydroxy-3,8 -dimethyl-5-methylidene 4,4 ,

6,7,8,9-hexahydrobenzo(1)benzofuran-2-one.
Tính chất:
- Atractylenolide III là dạng bột màu trắng hoặc tinh thể màu trắng.
- Atractylenolide III tan tốt trong nước, methanol, ethanol, và một s ố dung
môi hữu cơ khác.
- Atractylenolide III cho phổ hấp thụ cực đại ở 220nm [27].
Tác dụng dược lý: Atractylenolide III có tác dụng bảo vệ thần kinh, dạ dày, chống
ung thư và chống viêm. Hoạt chất Atractylenolide III cũng có tác dụng kiểm soát
miễn dịch bằng cách điều chỉnh chức năng của tế bào IL-6 trong tế bào mast.
1.4. Các nghiên cứu định lượng Atractylenolide III trong cây bạch truật
Trong một nghiên cứu của nhóm tác giả Hao Cai và các đồng nghiệp vào năm 2012
đã định lượng hai hoạt chất trong Bạch truật là Atractynolid I và Atractynolid III với
bước sóng cực đại 220nm. Máy Agilent Zorbax Eclipse XDB Cột C-18 (250
0

mm × 4.6 mm, 5 μm). Tốc độ dòng 1 ml/phút , tiêm 10µl và nhiệt độ cột là 25 C.
Hệ được sử dụng trong nghiên cứu này là ACN (A) và nước (B) với tỉ lệ 0-10 phút
30-60% A; 10-20 phút 60-65% A; 20-25 phút 65-100% A; 25-37 phút 100% A.
Nghiên cứu lựa chọn phương pháp xử lý mẫu với Ethanol 80%, chiết siêu âm trong
30 phút , sau đó lọc để thu được dịch chiết [7,13].
Theo dược điển Hong Kong định lượng được hoạt chất Atractylenolide III trong
mẫu Bạch tru ậ t bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng với điều kiện bước sóng hấp
thụ cực đại 220nm, cột silicagen liên kết ODS (5µm, 250 x 4,6mm), tốc độ dòng
1ml/phút và với hệ dung môi Methanol :Nước = 70 :30 trong 25 phút. Mẫu được xử
lý bằng phương pháp siêu âm với 2g bột dược liệu trong 50 ml dung môi Ethanol
70%, siêu âm, có thể tiến hành chiết nhiều lần với thời gian kéo dài phù hợp với
mục đích nghiên cứu mẫu [23].

8

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu: thân rễ khô của Bạch truật với tên khoa học Atractylodes
macrophala Koidz (họ Compossitae). Mẫu có nguồn gốc từ Hà Nội, Việt Nam và
Liêu Ninh, Trung Quốc do Viện Dược Liệu cung cấp.
2.2. Trang thiết bị, dung môi, hóa chất
Hóa chất – thuốc thử
Hóa chất thuốc thử được cung cấp bởi nhà sản xuất có uy tín với độ tinh khiết phù
hợp với mục đích sử dụng.
Bảng 1: Hóa chất, thuốc thử dùng trong nghiên cứu.

Thiết bị, dụng cụ
Thiết bị máy móc được sử dụng đảm bảo chính xác và độ tin cậy theo thông tin như
nhà sản xuất.
Bảng 2: Trang thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu.
STT

Tên thiết

1.

Shimadzu LC – 20AD

2.

Shimadzu SPD – M20A

3.

Shimadzu SIL – 20A

9


4.

Shimadzu CTO – 10AS

5.

Cột supelco

6.

Máy siêu âm MRC

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký
Chúng tôi tiến hành sắc ký với cột Supleco C18(5µm, 250 x 4,6mm), tốc độ dòng
1ml/phút và thể tích tiêm mẫu 20µl để khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại và hệ
dung môi pha động.
- Khảo sát bước sóng: Tiến hành sắc ký với chất chuẩn Atractylenolide III
bằng phương HPLC-DAD để tìm ra bước sóng hấp thụ cực đại của chất.
- Khảo sát hệ dung môi pha động: Phương pháp khảo sát với các hệ dung
môi ACN:Nước và Methanol:Nước.
2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu
Chuẩn bị mẫu chuẩn:
- Dung dịch gốc: Cân chính xác khoảng 1mg chất chuẩn Atractylennolide III
trong 1ml Methanol trong bình định mức 1ml.

- Tiến hành pha dãy chuẩn trong bình định mức 1ml với các nồng độ 104;
52; 32,5; 26; 19,5; 13; 6,5; 3,25; 1,675; 0,65 và 0,065µg/ml từ dung dịch mẹ.
Xử lý mẫu: Cân khoảng 0.2g bột dược liệu chiết với 5ml dung môi Nước, Methanol,
và Ethanol 30; 50; 70; 90; 96% bằng phương pháp siêu âm. Sau đó định mức với
bình định mức 5ml bằng dung môi. Lọc dung dịch qua màng 0,45µl trước khi tiến
hành phân tích định lượng.
2.3.3. Thẩm định quy trình phân tích
Theo tài liệu “Thẩm định quy trình phân tích: nội dung và phương pháp”
(Validation of analytical procedures: text and methodology) của ICH (International
Conference on Harmonization) ban hành vào tháng 11 năm 2005, các yếu tố của

10


một quy trình phân tích định lượng cần thẩm định gồm: độ đúng, độ chính xác, tính
đặc hiệu, tính tuyến tính giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng [5,6,22,25].
Tính đặc hiệu
Khái niệm: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạ p chất khác
như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất.... Trong phép
phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi
bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác .
Phương pháp xác định: Sử dụng phương pháp thêm chuẩn sau chuẩn bị mẫu, cách
này thường áp dụng đối với các phương pháp sắc ký. Sau khi chuẩn bị mẫu thử và
phân tích mẫu thử trên thiết bị sắc ký thu được các pic sắc ký, ta thêm chuẩn vào
mẫu đã chiết xuất và phân tích mẫu này. So sánh sắc ký đồ của hai mẫu để đánh giá
tính đặc hiệu.
Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, pic mẫu thử phải trùng với vị trí của pic chất chuẩn và sắc
ký đồ của chất nền không có pic nào.
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Khái niệm: Giới hạn phát hiệ n (LOD) của một quy trình phân tích là lượng thấp

nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải
xác định chính xác hàm lượ ng.
Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất
phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp.
Phương pháp xác định: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu S/N. LOD là nồng độ mà
tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 – 3 và LOQ lại nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị
gần bằng 10.
Độ tuyến tính
Khái niệm: Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả
của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại
lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x).

11


Tính tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+b với hệ số tương
2

quan tuyến tính R .
Phương pháp xác định:
- Khảo sát ở ít nhất 5 hoặc 6 mức nồng độ khác nhau.
- Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của phương
pháp.
- Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu.
2

Yêu cầu: Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,995 ≤ R ≤ 1.
Độ thích hợp hệ thống
Khái niệm: Đánh giá độ thích hợp của hệ thống để đảm bảo hệ thống phù hợp để
phân tích. Đánh giá sự phù hợp của hệ thống là các phép thử để chứng minh rằng hệ

thống hoạt động đúng theo mục đích sử dụng.
Phương pháp xác định: Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn nhiều lần lặp lại vào hệ
thống sắc ký và xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Số lần bơm tối thiểu 5 lần
phải cho RSD nhỏ hơn 2% Nếu RSD lớn hơn 2% cần sử dụng 6 điểm.
Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu ≤ 2%.
Độ lặp lại
Khái niệm: Độ lặp lại là sự ổn định trong phương pháp phân tích định lượng mẫu
trong quá trình thực hiện.
Phương pháp xác định: Trong phân tích hàng ngày, cần thực hiện song song tối
thiểu 2 lần nh ằm tránh được các sai số ngẫu nhiên gặp phải. Đánh giá mức độ
chênh lệch giữa hai lần làm với giá trị trung bình, sự chênh lệch này phải thỏa mãn
theo yêu cầu c ủa từng phương pháp.
Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 2%.
Độ đúng

12


Khái niệm: Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị
trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là
đúng.
Phương pháp xác định: Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc
mẫu trắng, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu b ốn lần bằng
phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo công thức sau đây:
- Đối với mẫu thử:

- Đối với mẫu trắng:

Trong đó:
R%: Độ thu hồi %

: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn
:
:

Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
Nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn

:

Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại.

Yêu cầu: Độ thu hồi đạt 98 - 102% và RSD ≤ 2%.
2.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả
Các số liệ u thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê với chương trình
Excel thông qua diện tích và thời gian lưu trên peak để xác định giá trị trung bình và
độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Công thức áp dụng xử lý kết quả:

13


Trong đó:
-

là giá trị trung bình của các phép thử, được tính bằng công thức:

- SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. Trong đó SD được tính theo công thức:

Công thức sử dụng trên Excel: Sử dụng hàm =stdev/average.

Đánh giá kết quả thông qua các thông số: Hệ số kéo đuôi F, hệ số phân giải R, giá
trị trung bình và độ lệch chuẩn tương đối RSD.

14


CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III
3.1.1. Xác định bước sóng phát hiện của chất chuẩn Atractylenolide III
Tiến hành khảo sát với mẫu chuẩn Atractylenolide III với nồng độ 6.5µg/ml điều
kiênh cột Supleco C18, tốc độ dòng 1ml/phút, chế độ chạy sắc ký gradient dung môi
ACN từ 20 đến 80% trong 60 phút. Kết quả thu được như hình 3.

A

B

Hình 3: Sắc ký đồ HPLC và bước sóng hấp thụ cực đại của Atractylenolide III
trong đó: A – sắc ký đồ chất chuẩn ở bước sóng 1- 254nm và 2- bước sóng 220nm;
B

– Bước sóng hấp thụ cực đại.

Kết quả và nhận xét: Chúng ta thấy mẫu hấp thụ cực đại ở bước sóng 220nm. Dựa
vào sắc ký đò, chúng tôi thấy rằng chất chuẩn Atractylenolide III mà chúng tôi sử
dụng hoàn toàn đúng theo tiêu chuẩn nhà sản xuất với độ tinh khiết 98%.
3.1.2. Xây dựng điều kiện sắc ký trên mẫu Bạch truật bằng HPLC-DAD
Chuẩn bị 1 mẫ u thử với phương pháp xử lý mẫu nêu ở trên bằng dung môi Ethanol
96%. Tiến hành sắc ký kháo sát pha động với điều kiện sắc ký khảo sát pha động
với cột pha đảo Supleco C18, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu là 20µl,

0

nhiệt độ phòng 25 C và chế độ chạy đẳng dòng. Kết quả thu được như bảng 3:

15


Bảng 3: Kết quả sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động với các chương trình
chạy đẳng dòng bằng HPLC-DAD, bước sóng phát hiện là 220nm.
Hệ dung môi
Hệ 1:

Thời gian

0-15

Hệ 2:
Thời gian
0-30

Hệ 3:
Thời gian

0-30

Hệ 4:
Thời gian
0-30

tR (phút): Thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích Atractylenolide III