Nghiên cứu định lượng saponin triterpenoid trong cao rau má bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG
SAPONIN TRITERPENOID TRONG
CAO RAU MÁ BẰNG SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI – 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG
SAPONIN TRITERPENOID TRONG
CAO RAU MÁ BẰNG SẮC KÝ LỎNG
HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU-DƢỢC CỔ TRUYỀN
MÃ SỐ: 8720206

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Đỗ Quyên
TS. Hà Vân Oanh

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận đƣợc
rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các thầy cô giáo cùng đồng nghiệp, cơ quan, gia
đình và bạn bè.
Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS.
Đỗ Quyên, TS. Hà Vân Oanh, Ths. Phạm Tuấn Anh những ngƣời thầy đã trực
tiếp hƣớng dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình và động viên tôi trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, Phòng sau đại
học, các thầy cô giáo bộ môn Thực vật - Dƣợc liệu – Dƣợc cổ truyền – Đại học
Dƣợc Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp ý kiến cho tôi trong quá
trình thực hiện nghiên cứu.
Lời cuối cùng, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình và
bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và
đạt đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay.
Hà Nội, ngày 03 tháng 4 năm 2018
Học viên

Bùi Thị Thảo

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
DANH MỤC CÁC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chƣơng 1: TỔNG QUAN

2

1.1. Tổng quan về cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urb)

2

1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của cây Rau má

2

1.1.2. Thành phần hóa học

4

1.1.3. Tác dụng dược lý và công dụng của cây Rau má

6

1.2. Tổng quan về các phƣơng pháp định lƣợng saponin triterpenoid

10

trong cây Rau má
1.2.1. Chuyên luận Rau má và phương pháp định lượng saponin

10

triterpenoid trong một số chuyên luận Dược điển
1.2.2. Các nghiên cứu khác

12

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

17

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu

17

2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị

17

2.2.1. Chất chuẩn

17

2.2.2. Hóa chất

17

2.2.3. Thiết bị

17

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

18

2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong cao

18

Rau má bằng HPLC
2.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong

19

cao Rau má bằng HPLC
2.3.3. Định lượng saponin triterpen trong một số mẫu cao Rau má

21


2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu

22

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

23

3.1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng saponin

23

triterpenoid trong cao Rau má bằng HPLC
3.1.1. Kết quả điều chế cao khô Rau má

23

3.1.2. Triển khai các phương pháp định lượng saponin triterpenoid

24

trong cao Rau má bằng HPLC
3.1.3. Chương trình sắc ký định lượng saponin triterpenoid của cao Rau

33

má bằng HPLC
3.1.4. Thẩm định phương pháp định lượng saponin triterpenoid trong

34

cao Rau má bằng HPLC
3.2. Kết quả định lƣợng saponin triterpen trong một số mẫu cao Rau má

41

4. CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN

46

4.1. Về xây dựng chƣơng trình sắc ký

46

4.2. Về thẩm định phƣơng pháp

47

4.3. Về kết quả định lƣợng saponin triterpen trong một số mẫu cao Rau

48

má
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

49

A. KẾT LUẬN

49

B. ĐỀ XUẤT

50

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


STT

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu,
Tên đầy đủ
chữ viết tắt

1

ACN

2

As

3

AOAC

3

DAD

4

DĐVN

5

EP

6

EtOH

7

8

HPLC

HPTLC

Acetonitril
Asymmetry factor: Hệ số đối xứng pic
Association of Official Analytical Chemists: Hiệp hội các
nhà hóa phân tích chính thức
Diode array detector: Detector mảng diod
Dƣợc điển Việt Nam
European Pharmacopoeia: Dƣợc điển Châu Âu
Ethanol
High performance liquid chromatography: Sắc ký lỏng
hiệu năng cao
High performance thin layer chromatography: Sắc ký lớp
mỏng hiệu năng cao

9

MeOH

10

NXB

11

R

Correlation coefficient: Hệ số tƣơng quan

12

Rs

Resolution: Độ phân giải

13

RP-HPLC

14

% RSD

15

SD

16

SKĐ

17

tr

Retention time: Thời gian lƣu

18

x

Giá trị trung bình

19

USP

20

UV-VIS

Methanol
Nhà xuất bản

Reverse phase-HPLC: Sắc ký lỏng pha đảo
% Relative standard deviation: % Độ lệch chuẩn tƣơng đối
Standard deviation: Độ lệch chuẩn
Sắc ký đồ

United States Pharmacopoeia: Dƣợc điển Mỹ
Ultraviolet-Visible: Tử ngoại và khả kiến


DANH MỤC CÁC BẢNG

STT
Bảng 1.1

Tên bảng
Các điều kiện định lƣợng saponin triterpenoid trong Rau má
bằng HPLC

Bảng 3.1 Khối lƣợng cao Rau má
Bảng 3.2
Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5
Bảng 3.6

Trang
13, 14,
15
24

Thời gian lƣu và diên tích pic của mẫu chuẩn asiaticosid khi
tiêm 6 lần lặp lại ở nồng độ 300µg/ml

35

Thời gian lƣu 6 chất của mẫu cao Rau má chuẩn khi tiêm 6 lần
lặp lại ở nồng độ 5 mg/ml

35

Diện tích pic của cao Rau má chuẩn 6 chất của mẫu cao Rau má
chuẩn khi tiêm 6 lần lặp lại ở nồng độ 5 mg/ml

36

Tổng diện tích pic saponin triterpenoid và hàm lƣợng saponin
triterpenoid tính theo asiaticosid của 6 mẫu thử CRM-96

38

Tổng diện tích pic saponin triterpenoid và hàm lƣợng saponin
triterpenoid tính theo asiaticosid của 12 mẫu thử CRM-96

Bảng 3.7 Nồng độ của 6 mẫu thử thêm chuẩn

40
41

Hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phần, hàm lƣợng saponin
Bảng 3.8 glycosid và hàm lƣợng saponin aglycon trong các mẫu cao Rau

má

42, 43


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
STT

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Đặc điểm thực vật cây Rau má

3

Hình 1.2

Cấu trúc các saponin triterpenoid khung ursan trong Rau má

4

Hình 1.3

Cấu trúc saponin triterpenoid khung oleanan trong Rau má

5

Hình 3.1

Sắc ký đồ mẫu chuẩn asiaticosid theo chƣơng trình 1

25

Hình 3.2

Sắc ký đồ mẫu cao Rau má chuẩn theo chƣơng trình 1

25

Hình 3.3

Sắc ký đồ mẫu chuẩn asiaticosid theo chƣơng trình 2

27

Hình 3.4

Sắc ký đồ mẫu cao Rau má chuẩn theo chƣơng trình 2

27

Hình 3.5

Sắc ký đồ mẫu chuẩn asiaticosid theo chƣơng trình 3

29

Hình 3.6

Sắc ký đồ mẫu cao Rau má chuẩn theo chƣơng trình 3

29

Hình 3.7

Sắc ký đồ mẫu chuẩn asiaticosid theo chƣơng trình 4

30

Hình 3.8

Sắc ký đồ mẫu cao Rau má chuẩn theo chƣơng trình 4

30

Sắc ký đồ của các mẫu cao: CRM-30; CRM-70; cao Rau má
Hình 3.9

chuẩn; CRM-96 theo chƣơng trình 4

32

Sắc ký đồ các mẫu cao Rau má chuẩn; mẫu CRM-96; mẫu
Hình 3.10

chuẩn asiaticosid; mẫu trắng

37

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích pic

38

Hình 3.12 Sắc ký đồ của 6 mẫu thử CRM-96

38


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urban) là một loại cây mọc nhiều ở
nƣớc ta, đƣợc ngƣời dân sử dụng làm rau để ăn hoặc dùng tƣơi, xay lấy nƣớc
uống để giải nhiệt, giải độc [4] ngoài ra Rau má còn đƣợc giã nát, đắp ngoài làm
tan các vết bầm tím do ngã, làm tan ung nhọt [1]. Thành phần hóa học của cây
Rau má đã đƣợc nghiên cứu gồm các nhóm chất nhƣ: saponin, flavonoid, tinh
dầu …[29]. Trong đó, saponin triterpenoid là thành phần chính, và là nhóm chất
chính có hoạt tính sinh học của cây Rau má nhƣ làm lành vết thƣơng, vết bỏng
[13] ; chống oxi hóa [28], chống trầm cảm trên thực nghiệm [66], [67]…
Hiện nay, một số sản phẩm nhƣ kem bôi liền sẹo Madecassol®, Vicenla®,
hay viên nang Helaf® hỗ trợ điều trị trĩ, táo bón và kiết lỵ đang đƣợc lƣu hành
trên thị trƣờng có thành phần chính là cao Rau má. Tuy nhiên, Dƣợc điển Việt
Nam V [2] trong chuyên luận Rau má chƣa có chỉ tiêu định lƣợng nhóm chất
saponin triterpenoid. Để góp phần đảm bảo chất lƣợng các chế phẩm thuốc từ
dƣợc liệu nói chung và cao Rau má nói riêng, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài “Nghiên cứu định lƣợng saponin triterpenoid trong cao Rau má bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu chính:
- Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng saponin triterpenoid
trong cao Rau má bằng HPLC;

- Ứng dụng phƣơng pháp HPLC đã xây dựng để định lƣợng saponin
triterpenoid trong một số mẫu cao Rau má.

1


Chƣơng 1.TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urb)
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của cây Rau má
Vị trí cây Rau má trong hệ thống phân loại thực vật
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [58], cây Rau má thuộc chi
Centella (L.) Urban, một chi nằm trong họ Hoa tán (Apiaceae). Vị trí phân loại
của loài Centella asiatica (L.) Urb trong hệ thống phân loại thực vật có thể tóm
tắt nhƣ sau:
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Thù du (Cornidae)
Bộ Nhân sâm (Hoa tán) (Apiales)
Họ Hoa tán (Apiaceae)
Chi Centella (L.) Urban
Theo Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ [3], chi Centella (L.) Urban ở
Việt Nam chỉ có 1 loài, C. asiatica, trong khi đó chi Centella (L.) Urban trên thế
giới có hơn 50 loài theo The plant list đã đƣợc công nhận [60].
Đặc điểm thực vật
Cây thảo nhỏ, cao 7 – 10 cm. Thân mảnh, mọc bò, hơi có lông khi còn non,
bén rễ ở các mấu. Lá mọc so le, nhƣng thƣờng tụ họp 2 – 5 cái ở một mấu, phiến
lá nhẵn, hình thận hoặc gần tròn, mép khía tai bèo; cuống lá mảnh, dài 3 – 5 cm,
có khi đến 7 – 8 cm [1], [4].
Cụm hoa gồm những tán đơn mọc riêng lẻ hoặc 2 – 5 cái ở kẽ lá, mỗi tán
mang 1 – 5 hoa (thƣờng là 3) màu trắng hoặc phớt đỏ, hoa giữa không có cuống;

tổng bao có 2 – 3 mảnh hình trái xoan, lõm, dạng màng; cánh hoa hình tam giác
hoặc trái xoan; nhị có chỉ nhị ngắn, bao phấn hình mắt chim; bầu hình cầu [1],
[4].

2


Quả màu nâu đen, đỉnh lõm, có 7- 9 cạnh lồi, nhẵn hoặc có lông nhỏ, có
vân mạng. Mùa hoa quả từ tháng 4 đến tháng 6 [1], [4].

Hình 1. Đặc điểm thực vật cây Rau má
Chú thích: 1. Toàn cây, 2. Hình thái lá, 3. Cách mọc của lá, 4. Hai mặt lá; 5. Cách
mọc của cụm hoa, 6. Cụm hoa, 7. Hoa nguyên vẹn, 8. Tràng hoa, 9. Bầu và bộ nhị, 10.
Bầu cắt dọc, 11. Bầu cắt ngang.

Phân bố
Chi Centella (L.) Urban phân bố tập trung ở vùng Bắc Phi, còn loài
Centella asiatica (L.) chỉ thấy ở vùng nhiệt đới Nam và Đông Nam Á, các tỉnh
Nam Trung Quốc bao gồm cả đảo Hải Nam [1], [4].
Ở Việt Nam, Rau má là loại cây rất quen thuộc. Cây mọc tự nhiên khắp
nơi, từ vùng hải đảo, ven biển đến vùng núi, độ cao dƣới 1800 m. Ở một số nơi

3


thuộc vùng Nam và Đông Nam Á, Rau má phân bố đến độ cao 2500 m. Cây ƣa
ẩm, hơi chịu bóng; thƣờng mọc thành đám ở vƣờn, bãi sông suối, nƣơng rẫy, bờ
ruộng cao và ven rừng [1], [4].
1.1.2. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học của cây Rau má gồm saponin triterpenoid, alcaloid,

flavonoid, tinh dầu, acid béo, các vitamin B, C và một số acid amin khác [1],
[20], [29].
- Saponin triterpenoid: là thành phần chính và quan trọng nhất của Rau má
gồm các triterpenoid nhƣ asiaticosid, madecassosid, centellosid và các acid
triterpenic là acid asiatic, acid madecassic, acid centellic, acid brahmic,
isobrahmic …[20]. Trong số các saponin triterpenoid nêu trên, 6 hợp chất
asiaticosid B - acid terminolic, madecassosid - acid madecassic, và asiaticosid acid asiatic là 3 cặp glycosid - aglycon tƣơng ứng là thành phần chính, chiếm đa
số [8], [64].
Về cấu trúc các saponin triterpenoid trong Rau má có thể đƣợc chia thành
2 nhóm chính: cấu trúc ursan và oleanan.
Nhóm ursan gồm 4 saponin chính là asiaticosid, madecassosid, acid
asiatic, và acid madecassic. Hai glycosid (asiaticosid, madecassosid) đều có 3
đơn vị đƣờng nối với phần aglycon bằng dây nối ester, không phải dây nối Oglycosid [20].
- Acid asiatic: R = H, R1 = OH
- Acid madecassic: R = OH, R1 = OH
- Asiaticosid: R = H, R1 = O – Glu
(6→1) – Glu (4→1) - Rham
- Madecassosid: R = OH, R1 = O –
Glu (6→1) – Glu ( 4→1) - Rham
Hình 1.1. Cấu trúc các saponin triterpenoid khung ursan trong Rau má

4


Nhóm oleanan gồm 2 saponin chính là asiaticosid B và acid terminolic.
Hai chất này cũng là 1 cặp glycosid - aglycon tƣơng ứng.

- Acid terminolic: R = OH, R1 = OH
- Asiaticosid B: R = OH, R1 = O - Glu
(6→1) – Glu (4→1) - Rham

Hình 1.2. Cấu trúc saponin triterpenoid khung oleanan trong Rau má
- Flavonoid: bên cạnh nhóm chất chính saponin triterpenoid thì flavonoid
cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong Rau má. Các flavonoid này đa số ở dạng
glycosid,

nhƣ

3-β

glucosylquercetin,

3-β

glucosylkaempferol,

7-

β-

glucosylkaempferol, có phần aglycon là các flavon [29].
- Tinh dầu: Theo Quin và cộng sự, thành phần tinh dầu của Rau má tƣơng
tự nhƣ những loài thuộc chi Hydrocotyle (họ Apiaceae), trong đó caryophyllen,
farnesol, và elemen là các cấu tử chính [49]
Năm 2002, nhóm nghiên cứu ngƣời Malaysia đã tiến hành cất kéo hơi
nƣớc riêng rẽ các bộ phận lá, thân bò và rễ Rau má và phân tích GC-MS cho
thấy cả ba mẫu thí nghiệm đều có tinh dầu với hàm lƣợng khác nhau. Tuy nhiên,
trong khi rễ và thân bò chỉ phát hiện có thành phần sesquiterpen thì lá chứa cả
monoterpen và diterpen. Các cấu tử chính trong cả ba mẫu nghiên cứu là βcaryophylen, α-humulen, (e)-b-farnesen, epi-bicyclosesquiphellandren, δcadinen, α-copaen và β-elemen [41].
Một nghiên cứu khác (2005) cho thấy mẫu Rau má mọc ở Nam Phi có hàm

lƣợng tinh dầu chỉ đạt 0,06% (tt/tt), trong đó có 11 hydrocarbon monoterpenoid,
9 dẫn chất monoterpenoid oxi hóa, 15 hydrocarbon sesquiterpenoid, 5 dẫn chất
sesquiterpenoid oxi hóa và 1 sesquiterpenoid sulfid. Các cấu tử chính trong tinh
dầu là α-humulen, β-caryophyllen và bicyclogermacren [42].

5


Nhƣ vậy, qua các nghiên cứu về tinh dầu đƣợc thực hiện bởi nhiều tác giả
khác nhau, mẫu thu hái ở các thời gian và địa điểm khác nhau thì kết quả đều
cho thấy β-caryophyllen là thành phần chính luôn có mặt trong các bộ phận Rau
má.
- Acid amin: trong Rau má có chứa một số acid amin nhƣ alanin, arginin,
acid aspartic, acid glutamic…[1], [20].
- Ngoài ra Rau má còn có một số thành phần khác nhƣ alcaloid, tannin,
sterol, phenolic, carbohydrat, vitamin, chất khoáng …[29], [64].
1.1.3. Tác dụng dƣợc lý và công dụng của cây Rau má
Tác dụng làm lành vết loét dạ dày
Dịch chiết rau má có tác dụng ngăn chặn ổ loét dạ dày ở chuột thí nghiệm
bị stress do gò bó và hạ nhiệt [16] hoặc gây loét bằng tác nhân acid acetic [18].
Ngoài ra, Rau má còn có tác dụng tốt trong việc ngăn chặn tác hại của ethanol
lên niêm mạc dạ dày thông qua tăng cƣờng hàng rào niêm mạc và giảm tác động
gây hại của gốc tự do [17].
Thử nghiệm lâm sàng trên ngƣời lớn cho thấy 93 % ca loét dạ dày tá tràng
đƣợc điều trị với chế phẩm từ rau má cho thấy hiệu quả rõ rệt. Thử nghiệm đƣợc
tiến hành trên ngƣời lớn bình thƣờng cho thấy làm tăng số lƣợng hồng cầu và
đƣờng máu, tăng nồng độ hemoglobin, cholesterol huyết tƣơng và protein toàn
phần; giảm nồng độ ure và phosphat máu [16].
Tác dụng lên da và quá trình làm lành vết thương
Dịch chiết toàn phần và phân đoạn triterpenoid từ Rau má tác động lên

nhiều giai đoạn khác nhau của quá trình khôi phục tổn thƣơng da. Nó có tác
dụng tăng sinh tế bào, tăng quá trình tổng hợp, trƣởng thành và liên kết chéo
của collagen và tăng biểu mô hóa tế bào và tạo mạch ở vị trí tổn thƣơng; qua đó
có tác dụng thúc đẩy nhanh quá trình làm lành vết thƣơng [57], [59].

6


Chế phẩm kem từ dịch chiết ethanol Rau má đƣợc chứng minh có tác dụng
cải thiện kết cấu da và tăng tái tạo da ở ngƣời cao tuổi. Thuốc cũng cải thiện
triệu chứng ngứa và các rối loạn khác về da [57].
Thử nghiệm lâm sàng với chế phẩm kem chứa cao Rau má, α-tocopherol
và collagen-elastin hydrolysat cho thấy chế phẩm giúp ngăn chặn sự phát triển
của các vết rạn trên da ở phụ nữ mang thai có tiền sử rạn da ở lần mang thai
trƣớc đó [59].
Tác dụng điều hòa miễn dịch, chống ung bướu và gây độc tế bào
Một số nghiên cứu thử nghiệm trên chuột cho thấy Rau má và các thành
phần hoạt tính của nó có tác dụng điều hòa miễn dịch rất tốt [46], [65].
Uống chế phẩm Brahma Rasayana có chứa Rau má làm tăng đáng kể số
lƣợng tế bào máu, tế bào tủy xƣơng, tế bào NK trên chuột bị tiếp xúc với bức xạ
gamma. Bên cạnh đó, thuốc còn làm giảm tác động của tia bức xạ gây ra sự
peroxid hóa ở gan, mà cơ chế có thể là giúp tăng sinh tế bào gốc và ngăn chặn
gốc tự do gây tổn thƣơng [32], [65].
Dịch chiết thô và các phân đoạn chiết từ Rau má có tác dụng làm chậm sự
phát triển của các khối u rắn và cổ trƣớng do tác động trực tiếp lên quá trình
tổng hợp DNA [10], điều hòa sản xuất yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) và nitric
oxid ở đại thực bào là yếu tố đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng viêm và
chống viêm [45]; giúp tăng thời gian sống của chuột có khối u đang phát triển.
Nghiên cứu cho thấy dịch chiết nƣớc Rau má có tác dụng ngăn chặn quá
trình sinh ung thƣ ruột kết [14]; hoạt chất acid asiatic có tác dụng chống ung thƣ

da [43].
Tác dụng lên thần kinh trung ương
Dịch chiết nƣớc từ Rau má có tác động tốt lên khả năng học tập, giúp tăng
cƣờng trí nhớ và khả năng nhận thức trên chuột và trẻ em [40].
Rau má có tác dụng bảo vệ và phục hồi tế bào thần kinh thông qua thúc đẩy
tái tạo dây thần kinh, làm dài sợi trục trên in vitro. Hoạt chất acid asiatic cũng

7


đƣợc chứng minh hiệu quả trong điều trị tổn thƣơng neuron do ngăn chặn sự oxi
hóa tế bào thần kinh [33], [56].
Triterpenoid từ Rau má có tác dụng chống trầm cảm ở chuột bị ép bơi
thông qua làm giảm nồng độ corticosteron huyết tƣơng, cải thiện sự mất thăng
bằng acid amin và tăng hàm lƣợng chất dẫn truyền thần kinh monoamin trong
não chuột [66], [67].
Một số nghiên cứu cho thấy Rau má, đặc biệt là phân đoạn saponin có tác
dụng an thần và giảm đau trên chuột thí nghiệm; giảm hoạt động của dây thần
kinh vận động và tăng tác dụng của thuốc an thần gây ngủ barbiturat. Tác dụng
của các hoạt chất trong rau má lên hệ thần kinh trung ƣơng giống với
chlorpromazin và reserpin [37].
Cao khô dịch chiết methanol và ethyl acetat từ Rau má có tác dụng giải lo
âu trên mô hình chữ thập nâng cao [33].
Tác dụng lên tim mạch
Rau má có tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim khỏi tác động của chất gây tổn
thƣơng cơ tim (Adriamycin) [25] và cải thiện tình trạng tổn thƣơng tái tƣới máu
và thiếu máu cục bộ cơ tim (nguyên nhân gây nhồi máu cơ tim) ở chuột thí
nghiệm [44].
Thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng và mù đôi trên các bệnh
nhân mắc chứng tăng huyết áp tĩnh mạch cho thấy rau má và các saponin từ Rau

má giúp cải thiện tình trạng phù mắt cá chân, cải thiện vi tuần hoàn, tăng hiệu
quả lọc ở mao mạch và tác dụng này phụ thuộc vào liều sử dụng [11], [15], [26].
Tác dụng bảo vệ gan
Nghiên cứu in vitro cho thấy Rau má có tác dụng chống ung thƣ gan [34].
Phân đoạn glycosid từ rau má hiệu quả trong việc ngăn chặn tác nhân
dimethylnitrosamin gây xơ gan ở chuột [38].
Thực tế trên lâm sàng đã sử dụng cao Rau má chuẩn hóa giúp cải thiện rối
loạn chức năng gan mạn tính ở ngƣời [21].

8


Tác dụng chống viêm và chống oxi hóa
Rau má và các hoạt chất saponin của nó thể hiện hoạt tính kháng viêm tốt
trên thực nghiệm. Cơ chế kháng viêm đƣợc cho là do giảm sự sản sinh NO và
ngăn chặn tác động của tia xạ có hại lên cơ thể, nhờ đó cũng giúp tổn thƣơng dễ
dàng hồi phục [35].
Tác dụng chống oxi hóa của Rau má đƣợc nghiên cứu trên các mô hình
khác nhau. Dịch chiết methanol Rau má thể hiện tác dụng chống oxi hóa trên
chuột có khối u lympho [28]. Dịch chiết còn cho thấy hoạt tính bảo vệ tế bào
thần kinh chuột khỏi các tổn thƣơng oxy hóa gây nên, giúp chống lão hóa hiệu
quả.
Ngoài ra, Rau má còn sở hữu rất nhiều tác dụng dƣợc lý khác đã đƣợc
chứng minh thông qua các thử nghiệm in vitro và in vivo nhƣ tác dụng tăng đồng
hóa, chống lao và phong, chống vảy nến, chống giun sán và đơn bào, chống
virus, chống co thắt, chống sinh sản quá nhanh ở chuột [7], [52], [53], [69].
Công dụng
Hầu hết các tác dụng của Rau má đều đƣợc ứng dụng để chữa bệnh. Hiện
nay loại cây thảo quý này đƣợc dùng cả theo phƣơng pháp Y học dân gian và Y
học hiện đại.

Nhân dân ta dùng Rau má làm rau sống để ăn. Nƣớc rau má là loại nƣớc
giải khát phổ biến ở các tỉnh phía Nam. Hay dùng tƣơi, xay với nƣớc, lọc lấy
dịch ép thêm đƣờng để uống, ngày dùng 30-40g [1], [4].
Trong Y học dân gian ở các nƣớc trên thế giới, Rau má đƣợc dùng rộng
rãi làm thuốc chữa các bệnh ngoài da nhƣ rôm sảy, mẩn ngứa, làm thuốc liền
sẹo; đắp ngoài chữa các vết thƣơng do ngã, gãy xƣơng, bong gân và làm tan ung
nhọt. Rau má còn đƣợc sử dụng đơn lẻ hay phối hợp với các vị thuốc khác theo
đƣờng toàn thân, chữa các bệnh về gan, chữa loét dạ dày, sốt, cảm mạo, đau đầu,
thổ huyết, kiết lỵ, viêm amidan, viêm phế quản và viêm đƣờng tiết niệu [1], [4].
Một số nƣớc nhƣ Trung Quốc, Ấn Độ dùng Rau má làm thuốc bổ thần kinh.

9


Trong công nghệ dƣợc phẩm, Rau má đƣợc chiết xuất bào chế thành cao
định chuẩn, có hàm lƣợng hoạt chất xác định (saponin triterpenoid tính theo
asiaticosid) làm nguyên liệu bán thành phẩm.
Một số dạng chế phẩm chứa cao Rau má đang lƣu hành hiện nay
- Kem chống lão hóa
- Kem dƣỡng da làm lành vết sẹo
- Dầu gội để điều trị tóc hƣ
- Nƣớc uống rau má và chè thanh nhiệt
- Gotu kola herb 435 mg: Tăng cƣờng hệ miễn dịch góp vai trò chuyển hóa
tốt cho cơ thể giúp giảm acid uric, rối loạn lipid máu. Tăng cƣờng dƣỡng chất
cho não, trung hòa các gốc tự do, bảo vệ và chống lão hóa cho tế bào thần kinh
não. Giúp thanh nhiệt giải độc, giải độc gan, giúp dƣỡng âm.
1.2. Tổng quan về các phương pháp định lượng saponin triterpenoid
trong cây Rau má
Các phƣơng pháp đã đƣợc triển khai để định lƣợng saponin triterpenoid,
thành phần hoạt chất chính của cây Rau má, bao gồm các phƣơng pháp so màu,

quang phổ, sắc ký lỏng. Trong đó sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phƣơng
pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất để định lƣợng saponin triterpenoid trong cây
Rau má, có thể xác định hàm lƣợng đơn thành phần là asiaticosid hay acid
asiatic, hoặc định lƣợng đồng thời đa thành phần 2, 3 hoặc 4 chất asiaticosid,
madecassosid, acid asiatic, acid madecasic trong cùng một phép thử.
1.2.1. Chuyên luận Rau má và phương pháp định lượng saponin
triterpenoid trong một số chuyên luận Dược điển
Chuyên luận Rau má trong Dƣợc điển Việt Nam V [2] quy định dƣợc liệu
là toàn cây tƣơi hoặc phơi khô của cây rau má (Centella asiatica (L.) Urban).
Về chỉ tiêu định lƣợng, Dƣợc điển Việt Nam V mới chỉ xác định chất chiết
đƣợc trong dƣợc liệu bằng phƣơng pháp cân, chƣa xác định đƣợc hàm lƣợng
saponin triterpenoid toàn phần trong Rau má.

10


Dƣợc điển Trung Quốc [19] có chuyên luận về dƣợc liệu Rau má, quy
định dƣợc liệu là toàn bộ cây phơi khô của cây Rau má (Centella asiatica (L.)
Urban). Hàm lƣợng saponin triterpenoid của Rau má đƣợc tính theo hàm lƣợng
của madecassosid và asiaticosid, yêu cầu ≥ 0,8 % (tính theo dƣợc liệu khô tuyệt
đối), xác định hàm lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC với pha động là ACN : H2O
(chứa 2 µmol/l β-cyclodextrin), chƣơng trình đẳng dòng theo tỉ lệ [24 : 76],
detector UV, bƣớc sóng 205 nm.
Chuyên luận Rau má của Dƣợc điển Châu Âu (EP 8.0) [22], quy định
dƣợc liệu Rau má là phần trên mặt đất, phơi khô của cây Rau má (Centella
asiatica (L.) Urban). Yêu cầu về hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phần
đƣợc tính theo asiaticosid, gồm 4 chất: madecassosid, asiaticosid, acid
madecassic, acid asiatic, với hàm lƣợng saponin triterpenoid toàn phần ≥ 6 %.
Sử dụng HPLC với pha tĩnh là cột sắc ký ODS, thành phần pha động gồm có
kênh A (ACN) và kênh B (H3PO4 0,3 %), gradient nồng độ. Tốc độ dòng 1

ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, detector UV, λ = 200 nm.
Thời gian (phút)

0 – 65

65 – 66

66 – 76

76 – 85

22

55

95

22

Kênh A (%)

Năm 2017, chuyên luận Rau má của Dƣợc điển Châu Âu (EP 9.0) [ 23]
đã thay đổi so với EP 8.0, vẫn quy định hàm lƣợng saponin triterpenoid của cây
Rau má ≥ 6 % tuy nhiên, bên cạnh 4 chất đã nêu trong chuyên luận EP 8.0, thì
có thêm 2 chất là 1 cặp glycosid và aglycon tƣơng ứng asiaticosid B – acid
terminolic đƣợc tính thêm vào hàm lƣợng saponin triterpenoid. Về cơ bản điều
kiện sắc ký HPLC giống với chuyên luận của EP 8.0, chỉ khác về chƣơng trình
pha động, cụ thể nhƣ sau:
Thời gian (phút)

0 – 65

65 – 66

66 – 75

Kênh A (%)

22 – 55

55 – 95

95

Dƣợc điển Mỹ (USP 38) [62] có chuyên luận dƣợc liệu Rau má, bên cạnh
đó cũng có chuyên luận về cao Rau má (Powdered Centella asitica L. Extract).

11


Điều kiện sắc ký để xác định hàm lƣợng saponin triterpenoid quy định trong
Dƣợc điển Mỹ và Châu Âu tƣơng đối giống nhau, chỉ khác một chút chƣơng
trình gradient nồng độ. Tuy nhiên, Dƣợc điển Mỹ chỉ yêu cầu hàm lƣợng
saponin triterpenoid trong cao Rau má ≥ 2 %.
Thời gian (phút)

0 – 65

65 – 66

66 – 76

76 – 85

Kênh A (%)

22 – 55

55 – 95

95

22

Nhận xét:
Quy định về hàm lƣợng saponin triterpenoid của cây Rau má có sự khác
biệt giữa các Dƣợc điển Trung Quốc, Châu Âu và Mỹ. Trong đó, Dƣợc điển
Châu Âu (EP 9.0) quy định hàm lƣợng saponin triterpenoid cao nhất ≥ 6 %.
Trong khi đó, Dƣợc điển Trung Quốc yêu cầu hàm lƣợng saponin triterpenoid ≥
0,8 % và hàm lƣợng đƣợc tính theo 2 saponin glycosid là asiaticosid và
madecassosid.
1.2.2. Các nghiên cứu khác
Hiện trên thế giới có nhiều nghiên cứu định lƣợng saponin triterpenoid
trong cây Rau má bằng HPLC. Phần lớn các nghiên cứu thực hiện phân tích trên
cột C18, một số ít nghiên cứu trên cột C8, không có nghiên cứu nào sử dụng cột
phenylsilyl silica gel. Hệ dung môi pha động thay đổi từ acetonitril và nƣớc/
dung dịch acid hoặc methanol và nƣớc với các tỷ lệ khác nhau. Bƣớc sóng phát
hiện đa số là khoảng từ 200 nm – 210 nm.
Các nghiên cứu xác định hàm lƣợng saponin triterpenoid trong cây Rau má
bằng HPLC, đơn thành phần hoặc đồng thời đa thành phần đƣợc tóm tắt ở bảng

1.1

12


Bảng 1.1. Các điều kiện định lƣợng saponin triterpenoid trong Rau má bằng HPLC
STT

Loại mẫu

Pha tĩnh

1.

Dƣợc liệu
Rau má

HiQ siL KYA -C18

2.

Dƣợc liệu
Rau má

3.

Dƣợc liệu
Rau má

4.

Dƣợc liệu
Rau má

5.

6.

Dƣợc liệu
Rau má

(250  4,6mm, 5µm)

Tốc độ
dòng
(ml/phút)

ACN : H2O với % ACN
ở 0 - 30 - 35 - 50 phút
là 20 - 55 - 55 – 20 %

LiChrospher 18e
(150 x 4mm, 5µm)

EtOH:H2O [6 : 4]

CLC-ODS (M)
(250 x 4,6mm, 5µm)

MeOH : H2O (1% TFA)

[75 : 25] và [70 : 30]
và [65 : 35]

X-Terra® RP-18
(150  4,6mm, 5µm)

Phenomenex RPC18(250  4,6mm, 5µm)

Dƣợc liệu
Rau má

Pha động

Zorbax Eclipse XDB
(150 x 4,6mm, 5µm)

MeOH : ACN : H2O
[5 : 57 : 38]
MeOH : H2O với % MeOH
ở 0 - 8 - 12 - 18 - 20 - 25
phút là 85 - 85 - 100 - 100 85 – 85 %
MeOH : ACN với % MeOH
ở 0 - 30 phút là 80 – 45 %

13

Detector,
bƣớc sóng
phát hiện

Hoạt chất định
lƣợng

TLTK

[70]
1

ELSD

1

UV
254 nm

1

UV
220 nm

1

UV
217 nm

asiaticosid
[36]
asiaticosid
[63]
asiaticosid

acid asiatic

[61]

[54]
1

PDA
205 nm

acid asiatic

1

DAD
206 nm

asiaticosid;
acid asiatic

[12]


STT

Loại mẫu

Pha tĩnh

Pha động

Tốc độ
dòng
(ml/phút)

Detector,
bƣớc sóng
phát hiện

7.

Dƣợc liệu
Rau má

Optimapak C18
(250 x 4,6mm, 5µm)

8.

Dƣợc liệu
Rau má

9.

Dƣợc liệu
Rau má

Hoạt chất định
lƣợng

ACN : H2O với % ACN ở 030-35-40 phút là 20-55-5520 %

1,4

UV

asiaticosid;
acid asiatic

C18
(200 x 50mm, 5 µm)

MeOH : H2O [60 : 40]

100

UV
220 nm

asiaticosid;
madecassosid

Agilent Zorbax SB-C18
(150 x 4mm, 5µm)

MeOH : H2O [50 : 50],
(4 mmmol/L β-cyclodextrin)

0,4

UV
204 nm

asiaticosid B;
madecassosid

TLTK

[31]
[24]

[30]
10.

11.

12.

Dƣợc liệu
Rau má

Dƣợc liệu
Rau má

Dƣợc liệu
Rau má

Agilent Zorbax SB-C18
(150 x 4mm, 5µm)

MeOH : H2O [65 : 35],
(4 mmmol/L β-cyclodextrin)

COSMOSIL 5C18-MS-II

H2O (0,01 % acid
trifluoroacetic) và
acetonitril (1,0 % methyl
tert-butyl ether, 0,01 % acid
trifluoroacetic) [78 : 22]

ZORBAX Eclipse XDB
(150  4,6mm, 5µm)

ACN : H2O (1mmol/L
KH2PO4) (gradient)

14

0,4

1

1

UV
204 nm

acid madecassic;

acid terminolic

ELSD

asiaticosid,
madecassosid,
asiaticosid B

[71]

205 nm

asiaticosid,
madecassosid,
acid asiatic,
acid madecassosic

[55]


STT

Loại mẫu

Pha tĩnh

Pha động

Tốc độ
dòng

(ml/phút)

Detector,
bƣớc sóng
phát hiện

ACN : H2O với % ACN
ở 0-5-10-20-30 phút là
20-30-65-70 %

1

UV
210 nm

13.

Dƣợc liệu
Rau má

TSK-gel ODS-80Tm

14.

Dƣợc liệu
Rau má

LiChroCART®
(250 x 4mm, 5µm)

ACN : H2O với % ACN ở
0-15-30-35-40-45-55 phút
là 20-35-65-80-80-20-20 %

1

UV
206 nm

15.

Dƣợc liệu
Rau má

Fused-Core® C18
(100 x 3mm, 2,7 µm)

ACN : acid formic 0,1 %
với % ACN ở 0-8-17-23
phút là 18-22-45-80 %

0,64

DAD

(150  4,6mm, 5µm)

15

Hoạt chất định

lƣợng
asiaticosid,
madecassosid,
acid asiatic
acid madecassosic
asiaticosid,
madecassosid,
acid asiatic,
acid madecassosic
asiaticosid,
madecassosid,
acid asiatic,
acid madecassosic

TLTK

[47]

[50]

[51]


Nhận xét: từ Bảng 1.1 và tham khảo chuyên luận về Rau má trong Dƣợc điển
của một số nƣớc, chúng tôi nhận thấy để định lƣợng saponin triterpenoid trong
cây Rau má bằng phƣơng pháp HPLC, điều kiện sắc ký đƣợc sử dụng nhƣ sau:
- Pha tĩnh: cột sắc ký C18. Kích thƣớc cột chủ yếu là 4,6 × 250 mm, với
hạt nhồi có kích thƣớc 5 µm.
- Pha động: hệ dung môi thƣờng là ACN – H2O hoặc ACN – H3PO4 0,3
%, gradient nồng độ.

- Tốc độ dòng: tốc độ thƣờng sử dụng là 1ml/phút.
- Detector: rất đa dạng có thể là detetor UV ở bƣớc sóng thấp (200 – 206
nm); detector DAD, phát hiện ở bƣớc sóng 200 nm.
Do vậy, chúng tôi cũng tiến hành khảo sát phƣơng pháp định lƣợng
saponin triterpenoid trong cao Rau má với các điều kiện sắc ký tƣơng tự đã đƣợc
áp dụng cho dƣợc liệu Rau má.

16


Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nguyên liệu nghiên cứu: gồm có
+ Mẫu cao khô tự điều chế: từ phần trên mặt đất (lá và thân bò) cây Rau má
(Centella asiatica (L.) Urban), đƣợc thu hái ở Thái Bình vào tháng 9/2017.
+ Mẫu cao khô đang lƣu hành trên thị trƣờng: công ty A (mã số CRM-A)
và công ty B (CRM-B).
2.2. Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị
2.2.1. Chất chuẩn
- Chất chuẩn asiaticosid, độ tinh khiết đạt 88,1 % (ID: Y0001206, giấy
chứng nhận chất chuẩn của Hội đồng Dƣợc điển Châu Âu).
- Cao Rau má chuẩn (Centella extract dry HRS), (ID: Y0001764, giấy
chứng nhận chất chuẩn của Hội đồng Dƣợc điển Châu Âu).
2.2.2. Hóa chất
- Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (MeOH, ACN) của
Merck.
- Dung dịch acid phosphoric (H3PO4) đặc (d=1,685 g/cm3) của Merck.
- Các dung môi, hóa chất dùng để xử lý mẫu (EtOH, MeOH) của Trung
Quốc và đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA)
- Nƣớc cất hai lần.

2.2.3. Thiết bị
- Hệ thống HPLC (Shimadzu, Nhật Bản): Gồm hệ 2 bơm LC-30AD, bộ
tiêm mẫu tự động SIL-30AHT, detector DAD, phần mềm Labsolution để truy
xuất hình ảnh và số liệu trên máy HPLC.
- Cột Shim-pack GIST C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm); tiền cột Shim-pack
GIST(G)
- Cân phân tích Precisa XT 220A, độ chính xác 0,0001 g.
- Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng Wisd (Hàn Quốc).

17