Nghiên cứu tác dụng của tam thất hoang (panax stipuleanatus h t tsai et k m feng) trên sự biểu hiện COX 2, eNOS PHOSPHORYL hóa và một số cơ trơn cô lập

ĐẠI

HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC

HỒ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG
(Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) TRÊN SỰ
BIỂU HIỆN COX-2, eNOS PHOSPHORYL HÓA VÀ MỘT
SỐ CƠ TRƠN CÔ LẬP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

HÀ NỘI – 2018


ĐẠI

KHO

HỒ

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA TAM THẤT HOANG
(Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)
TRÊN SỰ BIỂU HIỆN COX -2, eNOS PHOSPHORYL

HÓ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Khóa
Ngƣờ i hƣớng dẫn : 1. TS. VŨ THỊ THƠM

Hà


LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn bộ Ban chủ nhiệm khoa Y - Dược,
Đại học Quốc Gia Hà Nội, Bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng, Bộ môn Y - Dược
học cơ sở đã tạo điều kiện cho em để hoàn thành khóa luận tốt nghi ệp này. Em xin
chân thành cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy, giúp đỡ em hoàn thành chương trình
học tập trong suốt 5 năm qua.
Em xin bày tỏ sự tri ân và lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Vũ Thị Thơm và
PGS. TS. Dƣơng Thị Ly Hƣơng, những người đã luôn tận tình hướng dẫn, tạo
điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Bộ
môn Dược lý – Dược lâm sàng, thầy cô Bộ môn Y – Dược học cơ sở đã giúp đỡ em
trong quá trình hoàn thành khóa luận.
Em xin cảm ơn chương trình thuộc đề tài Tây Bắc: “Ứng dụng các giải pháp
khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ 2 loài
cây thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax
stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/1318 đã tài trợ kinh phí để em thực hiện được nội dung nghiên cứu này. Em cũng xin
cảm ơn Bộ môn Sinh lý học, Học viên Quân Y đã giúp đỡ em thực hiện thí nghiệm.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân
đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu khó tránh khỏi thiếu sót,
em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô để khóa luận thêm hoàn thiện.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Hồ Thị Thu Hà

3

DANH


Ký hiệu

G

ACh

A

BH4

T

CaM

C

CD

C

cGMP

G

COX

C

COX-1

C

COX-2

C

eNOS

E

FAD

F

FMN

F

GTP

G

T

HUVEC

e

ICAM - 1

P

iNOS

I

LD50

L

LPS

L

NADPH

N

nNOS

N

NO

N

NOS

N
4

NSAIDs


NST
PDGF
PG
PGE2
PGI2
PS27
PSBt
PSnH
PST
RT-PCR
Ser
sGC
Thr
TTH
VCAM-1

5

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT
Hình 1.1 Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M.
Feng)
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học các chất 1–15 phân lập từ Panax
stipuleanatus
Hình 1.3 Cấu trúc thành động mạch
Hình 1.4 Cấu trúc của eNOS
Hình 1.5 Sự điều hòa các vị trí phosphoryl hóa eNOS
Hình 1.6 Sự tổng hợp NO bởi eNOS và chức năng sinh lý của NO nội
mạc
Hình 1.7 Sinh tổng hợp prostaglandin
Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn Tam thất hoang
Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao giàu saponin từ Tam thất hoang
Hình 2.3 Phương pháp gắn đoạn cơ trơn vào bình nuôi và hệ thống ghi
Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng tạo màu của thuốc thử Griess với NO2
Hình 3.1 Sự giãn cơ trơn khí quản của cao tổng Tam thất hoang
Hình 3.2 Sự giãn cơ trơn cổ bàng quang của cao tổng Tam thất hoang
Hình 3.3 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự tổng
hợp NO
Hình 3.4 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu
hiện protein eNOS phosphoryl hóa
Hình 3.5 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu
hiện mARN COX-2
Hình 3.6 Ảnh hưởng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu
hiện protein COX-2

6


DANH MỤC CÁC BẢNG

STT
Bảng 1.1

Các dạng của NO

Bảng 3.1

Tác dụng của các

7


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ..........................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................2
1.1. Tổng quan về Tam thất hoang............................................................................. 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật..................................................................................... 2
1.1.2. Sinh thái và phân bố.................................................................................. 2
1.1.3. Thành phần hóa học.................................................................................. 3
1.1.4. Tác dụng dược lý...................................................................................... 4
1.1.5. Công dụng................................................................................................ 4
1.2. Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS........................................................ 5
1.2.1. Nội mạc mạch máu................................................................................... 5

1.2.2. eNOS........................................................................................................ 6
1.3. Tổng quan về viêm và COX-2.......................................................................... 14
1.3.1. Viêm và prostaglandin trong viêm.......................................................... 14
1.3.2 COX – 2................................................................................................. 15
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................18
2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu............................................................... 18
2.1.1. Nguyên liệu............................................................................................ 18
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu............................................................................. 19
2.2. Dung môi, hóa chất và thiết bị.......................................................................... 20
2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 21
2.3.1. Nghiên cứu tác dụng trên cơ trơn cô lập................................................. 21
2.3.2. Nghiên cứu sự biểu hiện của COX-2 và eNOS phosphoryl hóa.............22
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................... 24
3.1. Kết quả............................................................................................................. 24
8


3.1.1. Tác dụng trên cơ trơn cô lập................................................................... 24
3.1.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa.................................. 26
3.1.3. Tác dụng trên sự biểu hiện COX-2......................................................... 28
3.2. Thảo luận.......................................................................................................... 30
3.2.1 Tác dụng trên cơ trơn cô lập................................................................... 30
3.2.2. Tác dụng trên sự biểu hiện eNOS phosphoryl hóa.................................. 31
3.2.3. Tác dụng trên sự biểu hiện của COX-2................................................... 33
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO

9

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nội mạc mạch máu là một lớp tế bào nội mô mỏng nằm lót mặt trong của lòng
mạch [1]. Các tế bào này có khả năng sản xuất ra nitric oxid (NO), một chất giãn mạch
quan trọng và có nhiều vai trò trong điều hòa chức năng sinh lý của mạch máu như
trương lực mạch, sự kết tập tiểu cầu, sinh mạch, sự kết dính bạch cầu – nội mô… Tại
nội mạc mạch máu, NO được tổng hợp nhờ các enzym nitric oxide synthase ở nội mạc
(eNOS - Endothelial nitric oxide synthase). Hoạt động của enzym này được điều khiển
bởi nhiều cơ chế trong đó có quá trình phosphoryl hóa eNOS [41,69]. Viêm là một
trong những nguyên nhân gây rối loạn chức năng nội mạc [67]. Rối loạn chức năng nội
mạc có liên quan đến NO, phosphoryl hóa eNOS và quá trình viêm đã được báo cáo
trong nhiều bệnh lý tim mạch như xơ vữa động mạch, cao huyết áp…[24,37]. Trong
những năm gần đây, sự điều hòa eNOS thông qua quá trình phosphoryl hóa đang là một
mục tiêu y học triển vọng trong điều trị nhiều bệnh lý [41].

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng ) thuộc chi
Panax L., ở nước ta cây chỉ có ở vùng núi cao thuộc dãy Hoàng Liên Sơn [9].
Nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học cho thấy trong rễ và lá của Tam thất
hoang có chứa saponin với hàm lượng cao [6]. Đặc biệt, saponin trong các loài
thuộc chi Panax L. đã được chứng minh có tác dụng giãn cơ trơn, tăng tổng hợp
NO, tăng biểu hiện của eNOS phosphoryl hóa [39,73] và chống viêm [32,45,58].
Tuy nhiên, đến nay các nghiên cứu về loài này vẫn còn hạn chế. Điều này đặt ra câu
hỏi liệu với thành phần giàu saponin, Tam thất hoang có những tác dụng kể trên hay
không? Để làm sáng tỏ điều đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của
Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) trên sự biểu
hiện COX-2, eNOS phosphoryl hóa và một số cơ trơn cô lập” với ba mục tiêu:
1. Bước đầu đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên

cơ trơn cô lậ p của khí quản, bàng quang và thể hang.
2. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu

hiện của eNOS phosphoryl hóa và sự tổng hợp NO.
3. Đánh giá được tác dụng của các phân đoạn Tam thất hoang trên sự biểu

hiện của gen COX-2 và protein COX-2.

1


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Tam thất hoang
Tam thất hoang có tên khoa học là Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M.
Feng, thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae), chi Panax L.; hay còn được gọi với các tên
khác như Tam thất rừng, Bình biên tam thất, Thổ tam thất [2,8].
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây thân thảo cao 25 – 75 cm; thẫn rễ mập, nằm ngang, có nhiểu vết lõm do
vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm thường có 1 thân mang lá, ít khi 2 – 3 lá.
Lá kép chân vịt, gồm 1 – 3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống dài 5 – 10 cm. Lá chét 5,
có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5 – 13 cm, rộng 2 – 4 cm, nhọn hai
đầu, cuống hoa dài 1 – 1,5 cm. Hoa màu vàng xanh với 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5
nhị và bầu 2 ô. Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6 – 1,2 cm, khi chín màu
đỏ. Hạt gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng (Hình 1.1) [2].

Hình 1.1. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) [11]
1.1.2. Sinh thái và phân bố
Tam thất hoang (TTH) ưa ẩm và sáng. Cây mọc rải rác trên đất có nhiều
mùn, dưới tán rừng kín thường xanh, ở độ cao 1600 – 2300 m. Tái sinh bằng hạt. Ra
hoa tháng 4 – 5, có quả tháng 5 – 9. Cho đến nay, trên toàn thế giới, loài này mới chỉ
tìm thấy ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở Vườn Quốc gia Hoàng
Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [2,9].

2


1.1.3. Thành phần hóa học
Trong thân rễ của TTH chứa các saponin khung oleanan (hầu hết đều là
saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin
khung dammaran với hàm lượng thấp [19].
Năm 1985, từ dịch chiết methanol của thân rễ TTH đã phân lập được 2
saponin dẫn chất của acid oleanolic là stipuleanosid R1và stipuleanosid R2 [19].
Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Đại học Toyama, Nhật Bản phân tích thành
phần dịch chiết ethanol của TTH thu hái ở Trung Quốc đã xác định được một hàm
lượng nhỏ các saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd [43].

Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun Liang và cộng sự đã phân lập được
11 hợp chất saponin là dẫn chất của acid oleanolic, trong đó có một chất mới là

spinasaponin A methyl ester từ rễ TTH thu hái ở Việt Nam [15]. Năm 2013, nhóm
tiếp tục xác định được thêm 4 hợp chất saponin khung oleanan khác [45]. Ngoài ra
3 polyacetylen, 1 sesquiterpen và 1 acid béo cũng được phân lập [15] (Hình 1.2).

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của 15 chất phân lập từ P. stipuleanatus [45]
Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự chỉ ra trong
TTH ngoài saponin còn có thành phần khác như: polyacetylen, triterpenoid, tinh
dầu, đường khử, acid hữu cơ, acid polyuronic, acid béo, acid amin và các nguyên tố
vi lượng [5,6].

3


1.1.4. Tác dụng dƣợc lý

Trên thế giới, năm 2010, từ 11 hợp chất saponin phân lập được từ TTH (1 –
11, hình 1.2) nhóm nghiên cứu của Chun Liang đã tiến hành thử tác dụng gây độc
trên các tế bào ung thư bạch cầu cấp tiền tủy bào (HL-60) và ung thư ruột kết người
(HCT-116) thu được kết quả: Chất 1 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với
giá trị IC50 lần lượt là 4,44 và 0,63 µM trên 2 dòng tế bào HL-60 và HCT-116 [15].
Năm 2013, Chun Liang và cộng sự tiếp tục đánh giá hoạt tính của 15 chất (1 – 15,
hình 1.2) lên yếu tố nhân kappa B (NF-κB) trên tế bào HepG2 cho kết quả: Các chất
từ 6 – 11 ức chế NF-κB với IC50 từ 3,1 – 18,9 µM. Các chất 8, 10 và 11 ức chế sự
biểu hiện của mARN iNOS (inducible nitric oxide synthase) và COX-2
(cyclooxygenase-2) phụ thuộc nồng độ. Điều này đem lại tiềm năng trong điều trị
như là chất chống viêm, chống xơ vữa động mạch và chống loạn thần [45].
Năm 2011, 2 polyacetylen mới được phân l ậ p từ TTH là stipudiol và stipuol
ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư HL-60 và HCT-116 thông qua kích
hoạt quá trình apotosis của tế bào [46].
Tại Việt Nam, nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 cho thấy: Cao TTH
có tác dụng phục hồi thời gian ngủ do stress, đưa về trạng thái bình thường ở các
mức liều thử 44; 88 và 176 mg/kg. Ở các nồng độ 25; 50 và 100 μg/ml cao saponin
toàn phần của TTH có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl
dialdehyd. Cao thân r ễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đường uống với liều
LD50 = 8,8 g/kg [5].
Nghiên cứu của Lê Thị Tâm và Nguyễn Thị Tuyết Trinh (2016) cho kết quả
TTH có tác dụng chống đông và ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro [7,11].
1.1.5. Công dụ ng
Sách đỏ Việt Nam (2007) có ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều có công
dụng làm thu ốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường
sinh dục, chống stress. Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu
hóa, an thần”. TTH có tác dụng tán ứ, định thống. Bộ phận dùng là thân rễ Rhizoma
Panacis Stipuleanati [2].

4

1.2. Tổng quan về nội mạc mạch máu và eNOS
1.2.1. Nội mạc mạch máu
1.2.1.1 Đặc điểm cấu trúc
Về giải phẫu học từ trong ra ngoài, thành động mạch có cấu tạo gồm 3 lớp áo
đồng tâm: Lớp áo ngoài là lớp vỏ xơ, có các sợi thần kinh chi phối; l ớp áo giữa gồm
những sợi cơ trơn và sợi đàn hồi; lớp áo trong là lớp tế bào nội mô (Hình 1.3) [3].

Hình 1.3. Cấu trúc thành động mạch [1]
Tương tự như thành động mạch, thành tĩnh mạch, mao mạch và mạch bạch
huyết cũng có một lớp tế bào nội mô lợp mặt trong lòng mạch. Lớp nội mô thuộc biểu
mô lát đơn, gồm một hàng tế bào nội mô hình đa giác dẹt, có phần bào tương chứa
nhân lồi vào trong lòng mạch, phần bào tương ở ngoại vi tỏa thành lá mỏng. Các tế bào
nội mô liên kết với nhau bằng những dải bịt hoặc liên kết khe [1]. Ở người trưởng
13

thành, nội mạc mạch máu gồm khoảng mười ngàn tỷ (10 ) tế bào, bao phủ một diện
2

tích khoảng 1 - 7 m hình thành nên một tổ chức nặng khoảng 1 kg [27,52].

1.2.1.2. Chức năng của nội mạc mạch máu
Nội mạc mạch máu có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự lưu thông
dòng máu, trương lực mạch máu, sự kết tập tiểu cầu cũng như tham gia điều hòa các
quá trình viêm, miễn dịch, sinh mạch, chuyển hóa và duy trì sự hằng định nội môi
[30]. Các tế bào nội mô thực hiện cả hai chức năng trao đổi chất và tổng hợp [52].
Nội mạc mạch máu hình thành nên một hàng rào bán thấm kiểm soát sự di
chuyển của các chất hòa tan, các đại phân tử và cả các tế bào giữa dòng máu với các
mô xung quanh [27,30]. Irie và Tavassoli gọi đó là hàng rào máu – mô [65]. Rối

loạn tính thấm nội mạc có thể gây ra nhiều bệnh lý như phù, sốc, xung huyết.

5


Các tế bào nội mô có khả năng sản xuất ra nhiều phân tử khác nhau như các
chất giãn mạch: nitric oxide (NO), prostacyclin (PGI 2), EDHF (yếu tố cường phân
cực có nguồn gốc nội mô/ endothelium-derived hyperpolarizing factor); các chất co
mạch: Endothelin, thromboxan A2, angiotensin II; các phần tử kết dính: E-selectin,
P-selectin, ICAM -1 (phân tử kết dính liên bào/ intercellular adhesion molecule) và
VCAM-1 (phân tử kết dính tế bào mạch/ vascular cell adhesion molecule); cytokin
và yếu tố tăng trưởng: GM-CSF (Yếu tố kích thích quần thể bạch c ầ u hạt – đại
thực bào/ Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), interleukin (IL-1, IL6) và SCF (Yếu tố tế bào gốc/ Stem cell factor); các chemokin: α và β chemokin,
fractalkin; các yếu tố liên quan đến quá trình cầm máu: t-PA (yếu tố hoạt hóa
plasminogen mô), PAI-1 (chất ức chế yếu tố hoạt hóa plasminogen), yếu tố
Willebrand, thromboxan A2, NO, PGI2, TF (yếu t ố mô), TFPI (chất ức chế con
đường yếu tố mô); hay các yếu tố liên quan đến sự tăng sinh cơ trơn và sinh mạch:
VEGF (yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch/ vascular endothelial growth factor),
PDGF (yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc ti ể u cầu/ platelet derived growth factor)
[17,26,27,38].
Rối loạn về cấu trúc cũng như chức năng nội mạc mạch máu liên quan đến
nhiều quá trình bệnh lý như xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, bệnh động mạch
vành, suy tim mạn, bệnh mạch ngoại vi, tiểu đường, tăng áp lực phổi, nhiễm khuẩn
và các hội chứng viêm [26,27].
1.2.2. eNOS
1.2.2.1. Nitric oxide
Năm 1980, Furchgott và Zawadzki đã chứng minh được rằng sự giãn của
động mạch thỏ khi kích thích bằng acetylcholin (ACh) cần sự có mặt của nội mô
nguyên vẹn và ACh đã kích thích sự giải phóng của một chất được gọi là yếu tố giãn
mạch nguồn gốc nội mạc (Endothelium derived relaxing factor – EDGR). Năm

1987, Palmer và cộng sự đã xác định được yếu tố đó là nitric oxide (NO) [25]. Ngày
nay, NO được biết đến là một trong những gốc khí tự do đơn giản nhất và đóng vai
trò tín hiệu trung gian quan trọng trong cơ thể [41]. NO tham gia điều hòa nhiều quá
trình sinh lý như sự dẫn truyền thần kinh, trương lực mạch máu, sự co cơ, kết tập
tiểu cầu, chuyển hóa, đáp ứng miễn dịch, phiên mã gen và dịch mã mARN, quá
trình biến đổi sau dịch mã của protein [25,69].

6


Về đặc điểm cấu trúc và tính chất, NO là một gốc khí tự do nhỏ nặng 30
Dalton, không màu và nhiệt độ nóng chảy khoảng 163,6 °C, trong cấu trúc của NO
có một electron chưa ghép cặp [25,60]. NO có khả năng phản ứng với các nguyên tố
kim loại chuyển tiếp để hình thành nên nitrosyl kim loại, đây là đặc tính quan trọng
trong con đường tín hiệu của nó. Mặt khác, NO tan kém trong nước, có thể dễ vượt
qua được màng tế bào để tham gia điều hòa các quá trình sinh lý. Tuy nhiên, chất
này không bền có thời gian bán thải (T
thể [25].

1/2)

ngắn và bị chuyển hóa nhanh trong cơ

Trong cơ thể NO được tổng hợp qua hai con đường: thông qua các enzym
-

NOS (Nitric oxide synthase) hoặc từ quá trình khử của NO 2 . NOS là enzym xúc tác
cho phản ứng hình thành NO và L-citrullin từ L-arginin và O 2 [69]. Ở động vật có
vú, NOS có ba dạng chính, mã hóa bởi các gen riêng biệt trên nhiễm sắc thể (NST)
khác nhau: NOS thần kinh (nNOS) hay NOS loại 1; NOS do cảm ứng (iNOS) hay

NOS loại 2 và NOS nội mạc (eNOS) hay NOS loại 3 (Bảng 1.1). Con đường thứ hai
-

để hình thành NO là từ phản ứng khử NO2 , phản ứng này được tạo điều kiện bởi
-

enzym NO2 reductase như các enzym chứ a molypden (xanthin oxidase), NOS và
-

nhiều thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử ti thể. Phản ứng khử NO 2 đóng vai
trò quan trọng trong trường hợp thiếu oxy khi đó hoạt động của NOS bị giới hạn.
Trong cơ thể NO được chuyển hóa bằng quá trình oxy hóa để hình thành nên NO 2

-

-

và NO3 . Quá trình này có th ể tự xảy ra (autooxidation) hoặc được xúc tác. Một
-

phần NO bị bất hoạt trong stress oxy hóa, NO kết hợp với superoxid (O 2 ) để hình
-

thành nên peroxynitrit (ONOO ) [25,69].

7


Bảng 1.1. Các dạng của NOS [13,69]

Tên phổ
biến

Tế bào
biểu hiện

Gen
Đặc điểm

Chức năng
và các quá
trình sinh
học

1.2.2.2. eNOS
eNOS (Endothelial nitric oxide synthase) là một trong 3 dạng của NOS. NO
sản xuất tại nội mô bởi eNOS là một hợp chất vận mạch quan trọng, tham gia điều
hòa nhiều quá trình sinh lý đặc biệt liên quan đến chức năng tim mạch. eNOS biểu
hiện chủ yếu trong tế bào nội mô, ngoài ra enzym này cũng được phát hiện trong tế
bào cơ tim, tiểu cầu, neuron ở não, hợp bào lá nuôi của nhau thai người và trong tế
bào biểu mô ống thận LLC-PK1 [69,70].


8


Cấu trúc gen và protein
eNOS được mã hóa bởi một gen nằm trên nhiễm sắc thể số 7 (7q35–7q36);
có cấu trúc gồm 26 exon, gen này chiếm một đoạn khoảng 21 – 22 kb [13,66,70].
Về cấu trúc, eNOS là một protein chứa 1203 acid amin, nặng 133 kDa, có dạng

homodimer gồm 2 domain (Hình 1.4) [13,70]:
-

Domain reductase nằm ở đầu –COOH, chứa vị trí gắ n của NADPH
(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), FAD (Flavin adenine
dinucleotide) và FMN (Flavin mononucleotide).

-

Domain oxygenase nằm ở đầu –NH2 chứa vị trí gắn của BH4

-

(Tetrahydrobiopterin), hem và L-arginin.
Hai domain này được gắn kết với nhau bởi một trình tự dài khoảng 30 acid
amin chứa vị trí gắn của Camodulin (CaM).

Hình 1.3. Cấu trúc c ủ a eNOS (Ser: Serine; Thr: Threonin)
[29] Phosphoryl hóa eNOS
Hoạt động của eNOS được điều khiển bởi 2 cơ chế đó là cơ chế phụ thuộc
Ca

2+

2+

và không phụ thuộc Ca :
2+

2+

Cơ chế phụ thuộc Ca : eNOS là một enzym phụ thuộc Ca /CaM. Khi nồng
2+

độ Ca nội bào tăng, tạo điều kiện cho CaM gắn được vào vị trí của nó trên eNOS.
CaM là protein đầu tiên tương tác với eNOS, sự gắn của CaM làm dịch chuyển điện
tử từ NADPH ở domain reductase đến hem ở domain oxygenase thông qua FAD và
FMN. Tại vị trí hem các điện tử được dùng để khử và hoạt hóa O 2 từ đó oxi hóa Larginin thành L-citrullin và NO. Các yếu tố thiết yếu cần cho eNOS chức năng bao
gồm L-arginin, Fe, BH4, NADPH, FAD và FMN [69].
Phosphoryl hóa eNOS: Phosphoryl hóa eNOS là một biến đổi sau dịch mã,
được điều khiển bởi hệ thống các kinase, phosphatase và tương tác protein – protein
và đây là một trong những cơ chế tham gia điều khiển eNOS. Mặc dù hoạt động của
eNOS phụ thuộc vào nồng độ Ca

2+

nhưng đây không phải là yếu tố duy nhất cần

9


cho sự điều hòa hoạt động của enzym này. Sự gắn của CaM và sự dịch chuyển của
dòng các điện tử từ domain reductase đến domain oxygenase của enzyme cũng phụ
thuộc vào sự phosphoryl hóa và khử phosphoryl hóa eNOS [41]. Các nghiên cứu chỉ
ra rằng, sự phosphoryl hóa eNOS xảy ra tại Serin (Ser) và ở một mức độ thấp hơn
trên Tyrosin (Tyr) và Threonin (Thr). Ở người, phosphoryl hóa Ser
633

495

1177

, Ser

617

và

114

Ser làm kích hoạt eNOS trong khi phosphoryl hóa tại Thr và Ser làm giảm
chức năng eNOS. Sự phosphoryl hóa eNOS có thể được điề u hòa bởi nhiều yếu tố
như “shear stress”, yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô mạch máu (VEGF),
bradykinin, insulin, estrogen… làm hoạt hóa các enzym khác nhau như serin/
2+

threonin kinase Akt, CaMKII (Ca / calmodulin dependent protein kinase II),
AMPK (AMP-activated protein kinase), PKA (protein kinase A) và gây phosphoryl
hóa eNOS tại các vị trí khác nhau (Hình 1.5) [29,34,41].
Ngoài ra, hoạt động của eNOS còn được điề u khiển bởi sự tương tác với các
protein như Hsp90 hay Caveolin-1. Cav-1 (Caveolin-1) là protein vỏ chính của
caveolae tại tế bào nội mô, cav-1 gắn với eNOS và kết quả là làm bất hoạt eNOS
[59]. Hsp90 (Protein shock nhiệt 90) làm tăng hoạt động của eNOS theo cơ chế điều

hòa dị lập thể, nghiên cứu cho thấy sự hình thành phức hợp eNOS – Hsp90 ở tế bào
nội mô khi bị kích thích bởi histamin, bradykinin, yếu tố tăng trưởng nội mạc và
“shear stress” làm tăng hoạt tính của eNOS lên 3 lần [31]. Sự tương tác của eNOS với 2
2+

protein này đều là những cơ chế điều hòa hoạt tính của eNOS độc lập với Ca .

10


Hình 1.5. Sự điều hòa các vị trí phosphoryl hóa eNOS. Các vị trí eNOS
phosphoryl hóa được đánh số theo thứ tự eNOS người/ bò [41] (VEGF: Vascular
endothelial cell growth factor/ Yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô mạch máu; 8-BrcAMP: 8-bromoadenosine -3’,5’- monophosphate vòng; S-1-P: sphingosine 1phosphate; PMA: phorbol 12-myristate 13-acetate; HDL: highdensity lipoprotein/ lipoprotein trọng lượng phân tử cao; S: Serin; T: Threonin; )
1.2.2.3. Chức năng sinh lý của eNOS và NO nội mạc
a. Điều hòa trương lực mạch máu
Tại nội mạc NO được t ạ o ra bởi eNOS làm hoạt hóa guanylyl cyclase hòa
tan (sGC/ soluble guanylyl cyclase) kích hoạt con đường truyền tin cGMP (GMP
vòng). sGC xúc tác cho phản ứng chuyển GTP (Guanosine-5'-triphosphate) thành
cGMP là một chất truyền tin thứ hai, cGMP hoạt hóa các protein kinase G (PKG),
2+

thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa các protein kết quả là làm giảm nồng độ Ca nội
bào và giãn mạ ch (Hình 1.6) [25]. Nghiên cứu cho thấy huyết áp tăng ở nhóm
chuột bị xóa bỏ gen eNOS [47].
b. Ức chế sự kết dính bạch cầu và viêm mạch máu
NO kiểm soát sự biểu hiện của các gen liên quan đến xơ vữa động mạch. NO
làm giảm sự biểu hiện của protein hóa hướng động bạch cầu mono MCP-1
(Monocyte chemoattractant protein-1) [56], ức chế sự kết dính của bạch cầu với
thành mạch bằng cách can thiệp vào khả năng gắn của các phân tử kết dính bạch cầu
CD11/ CD18 (Cụm biệt hóa/ Cluster of differentiation) với bề mặt tế bào nội mô
hoặc ức chế sự biểu hiện của CD11/ CD18 ở bạch cầu. Sự kết dính bạch cầu là

11


sự kiện sớm của xơ vữa động mạch do vậy NO có thể bảo vệ chống sự hình thành

xơ vữa động mạch [69]. Rối loạn tính toàn vẹn của hàng rào nội mô có thể khởi phát
các sự kiện của tiền viêm. NO ngăn chặn quá trình apotosis của tế bào nội mô gây ra
bởi các cytokin và các yếu tố tiền xơ vữa như oxygen hoạt tính (ROS - reactive
oxygen species) và angiotensin II. Điều này có thể góp phần vào tác dụng chống
viêm và chống xơ vữa của NO được sản xuất tại nội mạc [64].
c. Ức chế sự kết tập tiểu cầu
NO sản xuất trong mạch là một chất ức chế sự kết tập và kết dính tiểu cầu
vào thành mạch [68,72].
d. Kiểm soát sự tăng sinh của cơ trơn mạch

NO thể hiện hoạt tính ức chế tổng hợp ADN, ức chế sự sinh sản và tăng sinh
của tế bào cơ trơn thành mạch. Tác dụng này có thể thông qua trung gian cGMP
[14,51]. Bên cạnh đó NO còn ngăn chặn sự giải phóng của yếu tố tăng trưởng có
nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), là chất kích thích sự tăng sinh của cơ trơn. NOS cũng
quan trọng đối với sự tái tạo lại mạch máu để thích ứng với sự thay đổi dòng chảy
trong bệnh mạn tính [22].

Hình 1.6. Sự tổng hợp NO bởi eNOS và chức năng sinh lý của NO nội mạc [52]

12


1.2.2.4. Vai trò của eNOS phosphorayl hóa và NO trong một số bệnh lý
a. Xơ vữa động mạch
Xơ vữa động mạch là nguyên nhân chính gây ra nhiều bệnh tim mạch mãn
tính như bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não và tắc động mạch ngoại vi [16]. Quá
trình này được đặc trưng bởi giảm hoạt động của eNOS và sinh khả dụng của NO
kèm theo đó là tăng sự biểu hiện của các phần tử kết kính như VCAM-1, ICAM-1.
Ức chế eNOS đã thể hiện làm tăng tốc độ xơ vữa động mạch cho th ấ y NO có thể
ức chế một số bước quan trọng trong quá trình xơ vữa động mạch. Do vậy, eNOS có

thể là một gen ứng cử viên liên quan đến xơ vữa động mạch và sự điều chỉnh hoạt
tính của eNOS thông qua thay đổi sự phosphoryl hóa eNOS đang được quan tâm
đáng kể vì những vai trò sinh lý bệnh của nó [41].
b. Nhồi máu cơ tim

Nghiên cứu cho thấy, trong nhồi máu cơ tim mãn tính kích thước vùng nhồi
máu ở chuột bị loại bỏ eNOS không thay đổi nhưng mật độ mao mạch ít hơn, phì
đại tăng lên đi kèm với huyết áp tâm thu tăng, rối loạn chức năng tâm trương và
tăng tỷ lệ tử vong ở chuột sau 28 ngày, điều này cho thấy vai trò có lợi của NO và
eNOS trên tâm thất sau nhồi máu cơ tim [55].
c. Tăng huyết áp

Tăng huyết áp là một yếu tố nguy cơ của nhiều bệnh lý như xơ vữa động
mạch, suy tim, bệnh động mạ ch vành, đột quỵ. NO và eNOS có vai trò quan trọng
giãn mạch gây hạ áp. Sự tăng huyết áp đã được quan sát thấy ở nhóm chuột bị xóa
bỏ gen eNOS [47].
d. Stress oxy hóa
Stress oxy hóa là bệnh lý xảy ra do sự mất cân bằng trong sự hình thành và
phá hủy các ROS. Stress oxy hóa tham gia vào bệnh sinh của nhiều tình trạng bệnh
lý như dị tậ t tim mạch, tăng huyết áp, tiểu đường, xơ vữa động mạch, ung thư, dẫn
đến rối loạn chức năng nội mô. Sự sản xuất ROS liên quan đến sự bất hoạt của phân
tử tín hiệu NO dẫn đến rối loạn chức năng nội mô [41].
Bên cạnh đó, sự rối loạn trong tổng hợp NO và phosphoryl hóa eNOS còn
liên quan trong nhiều bệnh lý khác như thiếu máu cục bộ, tiểu đường, rối loạn
cương dương, Alzheimer... Chính vì vậy, trong những năm gần đây eNOS
phosphoryl hóa trở thành một mục tiêu tiềm năng trong điều trị nhiều bệnh lý [41].

13

1.3. Tổng quan về viêm và COX-2
1.3.1. Viêm và prostaglandin trong viêm
Viêm vừa là phản ứng mang tính chất bảo vệ của cơ thể chống lại các yếu tố
gây bệnh vừa là phản ứng bệnh lý vì quá trình viêm có thể gây ra các tổn thương,
hoại tử hay rối loạn chức năng cơ quan [4]. Phản ứng viêm được đặc trưng bởi sự
tăng tính thấm của thành mạch, giãn mạch và kèm theo sự xuyên mạch của bạch
cầu, dẫn đến những dấu hiệu kinh điển là sưng, nóng, đỏ, đau. Quá trình này có sự
tham gia của nhiều chất trung gian có hoạt tính như histamin, bradykinin,
prostaglandin, leucotrien. Trong đó, prostaglandin (PG) là một trong những yếu tố
đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của hội chứng viêm [3].
PG và thromboxan A2 (TXA2) được gọi chung là prostanoid, là các chất
được hình thành từ acid arachidonic (AA), một acid béo không bão hòa được giải
phóng từ phospholipid màng tế bào nhờ enzym phospholipase A 2. Acid arachidonic
được oxi hóa bởi cyclooxygenase (COX) hay còn được gọi là prostaglandin G/H
synthase để hình thành nên PGG 2 và sau đó là PGH2. PGH2 không bền bị chuyển
hóa bởi các enzym prostaglandin synthase để tạo nên các PG khác nhau (Hình 1.7).
Có 4 PG hoạt tính sinh học chủ yếu được tạo ra trong in vivo đó là: prostaglandin E2
(PGE2), prostacyclin (PGI2), prostaglandin D2 (PGD2) và prostaglandin F2α (PGF2α)
[33,61]. Trong đó, PGE2 đóng vai trò quan trọng trong viêm vì nó tham gia vào tất
cả các quá trình dẫn đến các dấu hiệu kinh điển của viêm. Cụ thể, PGE 2 gây giãn
mạch, làm tăng dòng máu đến mô viêm, đồng thời cùng với các chất trung gian của
quá trình viêm như histadin, bradykinin, leucotrien, PGE 2 làm tăng tính thấm của
thành mạch gây thoát dịch và kết quả đỏ và sưng xuất hiện. Đau là kết quả PGE 2
làm tăng nhạy cảm của các sợi thần kinh cảm giác ngoại vị và trung ương ở não và
tủy sống dẫn đến tăng cảm giác đau. Cuối cùng, PGE 2 được xem như một chất trung
gian gây sốt. Trong viêm, các PG còn làm khuếch đại các phản ứng viêm bằng cách
tăng cường và kéo dài các tín hiệu gây ra bởi các chất tiền viêm [21,36].
Sự sản xuất của PG phụ thuộc nhiều vào hoạt tính của enzym COX. Enzym
này có 2 dạng chính là COX-1 (cyclooxygenase - 1) và COX-2 (cyclooxygenase –
2). COX-1 được biểu hiện cơ định trong nhiều loại tế bào lành của cơ thể, tham gia

sản xuất các PG cần cho tác dụng sinh lý bình thường của một số cơ quan như tăng
tiết chất nhầy ở dạ dày, kết tập tiểu cầu, tăng sức lọc cầu thận thận. Ngược lại,
COX-2 là một enzym cảm ứng, nó không biểu hiện hoặc chỉ biểu hiện ở mức độ rất
thấp trong các mô bình thường; dưới kích thích của các yếu tố tiền viêm, hormon và

14


yếu tố tăng trưởng sự biểu hiện của COX-2 tăng lên đáp ứng để tạo ra các PG gây
viêm và tham gia vào bệnh lý viêm. Chính vì vậy, COX trở thành đích phân tử của
các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs - Non-steroidal anti-inflammatory
drugs) và các NSAIDs tác dụng chọn lọc trên COX-2 đang là xu hướng nghiên cứu
hiện nay [44].

Hình 1.7. Sinh tổng hợp prostaglandin [33]
(Thromboxan A2, PGD2, PGE2, PGI2, và PGF2α được tạo ra bởi các enzym
prostaglandin synthase khác nhau gồm TxAS, PGDS, PGES, PGIS và PGFS)
1.3.2. COX – 2
COX -2 là một trong 2 dạng chính của COX. Enzym này xúc tác cho hai
bước đầu tiên trong con đường tổng hợp PG [36]. Ở người, gen mã hóa cho COX-2
nằm trên NST số 1, kích thước nhỏ khoảng 8 Kb với 10 exon [35,63]. COX-2 là
enzym cảm ứng, đáp ứng chủ yếu để sản xuất các PG trong viêm. Sự tăng biểu hiện
của COX-2 đã được quan sát thấy trên các mô hình viêm khớp ở động vật cũng như
trong hoạt dịch của bệnh nhân viêm khớp dạng thấp [36,75].

15