Ứng dụng phương pháp docking phân tử trong sàng lọc tìm kiếm hợp chất ức chế thụ thể interleukin 6 hướng điều trị viêm khớp dạng thấp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC

Người thực hiện: Đinh Gia Khánh

ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP
DOCKING PHÂN TỬ TRONG
SÀNG LỌC TÌM KIẾM HỢP CHẤT
ỨC CHẾ THỤ THỂ INTERLEUKIN
- 6 HƢỚNG ĐIỀU TRỊ VIÊM
KHỚP DẠNG THẤP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Khóa: QH.2013.Y
Người hướng dẫn: 1. TS. LÊ THỊ THU HƢỜNG
2.

TS. PHẠM THẾ HẢI


Hà Nội - 2018


LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành
tới TS. Lê Thị Thu Hƣờng, công tác tại bộ môn Dược liệu và Dượ c học cổ
truyền - khoa Y Dược Trường Đại học Quốc gia Hà Nội là người thầy tận tình
chỉ bảo, động viên, hướng dẫn để tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Phạm Thế Hải công tác tại Trường Đại

học Dược Hà Nội đã chỉ bảo tận tình cho tôi từ những bước đi ban đầu khi
nhận đề tài.
Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo, thầy cô Khoa Y
Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi được làm
khóa luận, được học tập, nghiên cứu, rèn luyện tại Khoa suốt 5 năm học qua.
Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em và
bạn bè luôn sát cánh, đồng hành, ủng hộ động viên tôi trong quá tình học tập,
nghiên cứu hoàn thành luận văn.
Dù đã rất cố gắng nhưng kiến thức, kỹ năng và thời gian thực hiện còn
hạn hẹp, tôi khó tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong nhận được những ý
kiến đóng góp của các thầy cô để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành c ảm ơn.
Hà Nội, Ngày 30 tháng 4 năm 2018
Sinh Viên

Đinh Gia Khánh


DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Tên viết tắt
CRP
CSDL
FDA

GA
HBA

HBD

HTS
IL-6

IL-6R
MIL-6R

MW

RA
SIL-6R

Rheumatoid Arthritis

Viêm khớp dạng thấp


SVBVS

VEGF

VNPD


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Cơ chế bệnh sinh viêm khớp dạng thấp.............................................4
Hình 1.2: Hai con đường kích hoạt phản ứng viêm của IL-6............................5
Hình 1.3: Cấu trúc 3 chiều (3D) của phức hợp IL-6 với thụ thể của nó. Hai IL6 (xanh tím đậm, hồng), hai IL-6R (xanh dương, xám) tạo phức hợp với vùng
màng ngoài của cấu trúc hai protein gp130 (xanh lá,vàng)
.......................................5

Hình 1.4: Các quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc....................................7
Hình 2.1: Phân tích protein 1 ALU về cấu trúc hình học so với IL-6 phản ánh
qua màu sắc trên Ngân hàng dữ liệu protein Châu Âu ( />Hình 2.2: Hình ảnh 3D của protein 1ALU.......................................................13
Hình 3.1: Minh họa kết quả sàng lọc............................................................... 16
....................................................................................................................17

Hình 3.2: Minh hoạ hai chiều tương tác củ a Madindoline A trong trung tâm hoạt động của
IL-6
....................................................................................................................24

Hình 3.3: Minh họa 2 chiều tương tác của (-)-Hydnocarpin trong trung tâm hoạt động của
IL-6
..........................................................................25

Hình 3.4: Minh họa 2 chiều tương tác của 24-methylene cycloartane-3β,21-diol trong trung
tâm hoạt động của IL-6
........................................26

Hình 3.5: Minh họa 2 chi ều tương tác của 20(R),24(E)-3-oxo-9β-lanosta- 7,24-dien-26oic acid trong trung tâm hoạt động của Il-6
.....................................................................................27

Hình 3.6: Minh họa 2 chi ều tương tác của 3,6,7-Tri-O-acetyl-α-mangostin trong trung tâm
hoạt động của Il-6

...........................................................................................................29

.........................................................................30

Hình 3.8: Minh họa 2 chiều tương tác của 3-epibartogenic acid trong trung tâm hoạt động
của IL-6

Hình 3.9: Minh họa 2 chiều tương tác của 3α-hydroxy-urs-12-ene-23,28-dioic acid trong
trung tâm hoạt động của IL-6
................................................32

Hình 3.10: Minh họa 2 chiều tương tác của 6-O-benzoyl-α-mangostin trong
trung tâm hoạt động của Il-6............................................................................31
...............................................................................................33

Hình 3.11: Minh họa 2 chiều tương tác của 9-hydroxycanthin-6-O- glucopyranoside
trong trung tâm hoạt động của IL-6


Hình 3.12: Minh họa 2 chiều tương tác của apigenin 7-O-β-D-glucosid trong trung tâm
hoạt động của IL-6


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Kết quả phân tích dữ liệu docking phân tử......................................18
Bảng 3.2 Tính toán các thông số hoá lý trong quy tắc 5 Lipinski c ủa 10 hợp chất được
chọn
...........................................................................................................................22


MỤC LỤC
DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH VẼ
DANH MỤC BẢNG
MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN..........................................................................3
1.1 Tổng quan về bệnh viêm khớp dạng thấp................................................... 3
1.2 Tổng quan về Interleukin-6......................................................................... 4
1.2.1 Sợ lược về IL-6.........................................................................................4
1.2.2 Vai trò của IL-6 đối với bệnh viêm khớp dạng thấp.................................5
1.2.3 Trung tâm hoạt động và cơ chế ức ch ế Interleukin-6..............................7
1.3 Quá trình nghiên cứu và phát triển thu ố c .................................................7
1.4 Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc...................................................................... 8
1.5 Phương pháp Docking.................................................................................9
1.5.1 Đại cương về phương pháp Protein docking............................................9
1.5.2 Quy trình Docking..................................................................................10
CHƢƠNG 2- NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU...............................................................................................12
2.1 Nguyên liệu và thi ết bị nghiên cứu.......................................................... 12
2.2 Nội dung nghiên c ứu:...............................................................................13
2.3 Phương pháp nghiên cứu...........................................................................14
2.3.1 Sàng lọc bằng quy tắc 5 của Lipinski.....................................................14
2.3.2 Sàng lọc bằng Docking.......................................................................... 14
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ..............................................................................16
3.1 Kết quả sàng lọc bằng quy tắc số 5 của Lipinski...................................... 16
3.2 Sàng lọc docking....................................................................................... 16
3.3 Chọn 10 hợp chất tốt nhất từ kết quả Docking..........................................18
3.4 . Đặc điểm hoá lý của các hợp chất được chọn.........................................22
3.5 Đặc điểm chi tiết từng chất theo tương tác với Interleukin-6 và thông
tin về cây dược liệu......................................................................................... 23


CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN............................................................................35
4.1. Về kết quả.................................................................................................35

4.2. Về phương pháp....................................................................................... 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................ 39


ĐẶT VẤN ĐỀ
Interleukin-6 (IL-6) là một cytokine đa chức năng điều chỉnh đáp ứng
miễn dịch và gây ra các phản ứng cấp tính. Mặc dù có vai trò quan trọng với các
hoạt động sinh lý nhưng việc sản sinh không kiểm soát IL-6 lại liên quan đến các
bệnh viêm miễn dịch IMID bao gồm cả bệnh viêm khớp dạng thấp (rheumatoid
arthritis, RA) [25], do đó ức chế IL-6 có thể được xem là một hướng đi đầy tiềm
năng trong điều trị bệnh RA. Madindoline A là hợp chất tự nhiên có tác dụng ức
chế chọn lọc IL-6, nhưng khó phát triển thành thuốc do sự khan hiếm nguồn
nguyên liệu cùng với quá trình sản xuất phức tạp, tốn kém [17]. Thuốc điều trị
RA hiện nay nhiều tác dụng phụ và đắt tiền, đó là lý do giới nghiên cứu hiện rất
quan tâm đến các thuốc có nguồn gốc tự nhiên cho điều trị RA.
Nguồn thực vật phong phú và cây thu ố c Việt Nam được xác định có chứa
các hoạt chất có tác dụng sinh học đáng chú ý và cũng là nguồn nguyên liệu quý
để sàng lọc và xác định các hoạt chất ức chế IL-6. Do số lượng các hợp chất tự
nhiên rất lớn, nhằm tiết kiệm và nâng cao hiệu quả tìm kiếm, các phương pháp
sàng lọc hiệu năng cao sử dụng máy tính đã trở thành một công cụ rất hữu ích hỗ
trợ quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới. Trong đó, docking là một trong
những phương pháp phổ bi ến nhất. Phương pháp này dựa trên cấu trúc đích
phân tử để dự đoán, với độ chính xác khá cao, sự hình thành liên kết của cấu tử
(các chất cần sàng lọc) với đích phân tử của nó (thường có bản chất là protein).
Nhờ đó, chúng ta tìm được vị trí và cấu hình phù hợp nhất để cơ chất gắn kết với
protein.
Từ các phân tích nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khóa luận “Ứng
dụng phương pháp docking phân từ trong sàng lọc tìm kiếm hợp chất ức chế thụ
thể Interleukin-6 hướng điều trị viêm khớp dạng thấp” với 2 mục tiêu chính:

Sàng lọc và tìm kiếm hợp chất tự nhiên có tác dụng ức chế IL-6 bằng
phương pháp docking.
1.

1


Nghiên cứu đặc điểm giống thuốc của các hợp chất tốt nhất, thu được
sau quá trình sàng lọc, thông qua chỉ số hóa lý của cấu trúc và đặc điểm của cây
dược liệu.
2.

2


CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về bệnh viêm khớp dạng thấp
Rheumatoid arthritis (RA) là bệnh viêm khớp mạn tính phổ biế n với đặc
trưng là viêm đa khớp, gây tê cứng khớp, đau và sưng và có thể tổn thương cơ
quan khác. Theo thống kê, hàng năm ở nước ta có khoảng 750 – 800 người mới
mắc bệnh viêm đa khớp dạng thấp trên một triệu dân từ 15 tuổi trở lên. Tỷ lệ
mắc bệnh là 0,5% dân số, trong đó 80% là nữ giới. Mặc dù ta không xác định
được nguyên nhân chính xác gây ra bệnh viêm khớp dạng thấp, bệnh được coi là
có tính chất di truyền [18].
Bệnh viêm khớp dạng thấp hiện nay được cho là bệnh tự miễn [23]. Khi
kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể sẽ được các tế bào trình diện kháng nguyên
(đại thực bào, các tế bào đuôi gai, tế bào diệt tự nhiên) nhận biết, sau đó được
trình diện cho các tế bào lympho T và B. Các tế bào lympho T CD4 (T help)
được kích hoạt và sản xuất ra các lymphokin (Inteleukin-4,10,13), các
lymphokin này sẽ kích thích các tế bào lympho B tăng sinh và biệt hoá thành các

tương bào và sản xuất ra các globulin miễn dịch là các thể tự kháng.
Tại màng hoạt dịch khớp có tình trạng lắng đọng phức hợp miễn dịch
kháng nguyên – kháng thể, do đó có thực bào xuất hiện với sự hiện diện của các
bạch cầu đa nhân trung tính, đại thực bào, tế bào mastocyt. Sau đó, chính các tế
bào này lại tiết ra các cytokin khác như TNF-α, IL-1,2,6, interferon, yếu tố phát
triển nội mạc mạch máu (VEGF) và các yếu tố hoá ứng động khác tạo vòng xoắn
bệnh lý thúc đẩy quá trình viêm. Sự tăng sinh mạch dưới tác dụng của VEGF
cùng sự xâm nhập một loạt các tế bào viêm khác hình thành nên màng mạch
(mảng pannus). Mảng pannus xâm lấn vào đầu xương, sụn khớp và các enzym
tiêu huỷ tổ chức do các tế bào viêm giải phóng như stromelysin, elastase,
collagenase... cùng sự xâm nhập các nguyên bào xơ gây phá huỷ khớp, dính
khớp và hậu quả là tàn tật [2]. Như vậy có sự tham gia của cả miễn dịch dịch thể
(tạo thành phức hợp miễn dịch) và miễn dịch tế bào (giải phóng ra các cytokin
thực hiện phản ứng viêm và phá hủy khớp), trong đó lympho T đóng vai trò

3


trung tâm. Dựa trên sự hiểu biết về cơ chế bệnh sinh này, các nhà khoa học đã
nghiên cứu ra các thuốc kích hoạt hoặc sửa chữa hệ miễn dịch thông qua ức chế
từng loại tế bào, từng loại cytokin để khống chế tình trạng viêm của bệnh.

Hình 1.1: Cơ chế bệnh sinh viêm khớp dạng thấp
1.2 Tổng quan về Interleukin-6
1.2.1 Sợ lƣợc về IL-6
IL-6 là một glycopeptide 26 kDa có gen mã hóa được tìm thấy trên nhiễm
sắc thể số 7, gồm có 212 axit amin được bố trí trong bốn chuỗi α. Nó được tạo ra
bởi nhiều loại tế bào khác nhau, như tế bào T, tế bào B, bạch cầu đơn nhân,
nguyên bào sợi, tế bào nộ i mô và một số tế bào khối u [27].
IL-6 được tìm thấy nhiều ở dịch ổ khớp của bệnh nhân RA và là nguyên

nhân chính cho nhiều tác dụng tại chỗ và toàn thân ở bệnh này. IL-6 kết hợp trưc
tiếp với ph ức hợp thụ thể màng IL-6 (membrane-bound Interleukin 6 receptor –
MIL-6R) và glycoprotein-130 dẫn tới hoạt hóa tế bào viêm như đại thực bào và
bạch c ầu trung tính từ đó kích hoạt các phản ứng viêm, gây hủy hoại sụn khớp,
xương . IL-6 cũng có khả năng hoạt hóa các tế bào không có thụ thể màng IL-6
miễn có chứa phổ biến thụ thể gp-130. Cơ chế này liên quan tới thụ thể dạng hòa
tan của IL-6 (soluble Interleukin-6 receptor – SIL-6R). Sự gia tăng nồng độ IL-6

4


cũng như nồng độ thụ thể IL-6 dạng hòa tan có liên quan đến mức độ trầm trọng
và sự tiến triển của bệnh [2, 11].

Hình 1.2: Hai con đƣờng kích hoạt phản ứng viêm của IL-6
Hai con đường truyền tín hiệu kích hoạt phả n ứng viêm của IL-6: Truyền tín
hiệu cổ điển (classical signalling) qua màng tế bào với vai trò của MIL-6R.
Truyền tín hiệu chuyển tiếp (trans-signalling) thông qua SIL-6R [27]

Hình 1.3: Cấu trúc 3 chiều (3D) của phức hợp IL-6 với thụ thể của nó.
Hai IL -6 (xanh tím đậm, hồng), hai IL-6R (xanh dƣơng, xám) tạo phức hợp

với vùng màng ngoài của cấu trúc hai protein gp130 (xanh lá,vàng)
1.2.2 Vai trò của IL-6 đối với bệnh viêm khớp dạng thấp.
RA được đặc trưng bởi sự gia tăng yếu tố dạng thấp (kháng thể IgM và
IgG RF) trong cả huyết thanh và khớp. Tế bào B có vai trò trong việc tạo ra các
5


kháng thể này chứng tỏ ức chế tế bào B là một phương hướng điều trị bệnh RA.

IL-6 cũng được xác định là một yếu tố biệt hóa của tế bào B, ảnh hưởng đến quá
trình phát triển của nó [2].
Trong pha viêm cấp tính trong của bệnh RA, bạch cầu đơn nhân, đại thực
bào và các tế bào nội mô giải phóng IL-6, kèm theo tăng bạch cầu trung tính tại
dịch khớp. Bạch cầu trung tính có khả năng giải phóng các enzym phân giải
protein và chất trung gian nên có vai trò quan trọng trong hiện tượng viêm và phá
hủy khớp ở bệnh RA. IL-6 tác động trực tiếp trên bạch cầu trung tính qua thụ thể
của IL-6 tại màng tế bào. Đã có bằng chứng ghi nhận, việc ức chế IL-6 sẽ ngăn
chặn sự bám dính của bạch cầu trung tính. Khi b ệnh tiến triển, sự chuyển từ
viêm cấp tính sang viêm mạn tính có ảnh hưởng do IL-6 tác động lên bạch cầu
trung tính [2].
Nồng độ IL-6 tăng cao trong màng ho ạt dịch của bệnh nhân RA có liên
quan đến mức độ tăng lên của phản ứng viêm và tình trạng phá hủy khớp.Tổn
thương khớp trong RA được đặc trưng bởi tổn thương bào mòn xương tại vị trí
bám của màng hoạt dịch và hẹp khe khớp. Trong nghiên cứu trên người và động
vật, tổn thương này được xác định là do hủy cốt bào gây ra. IL-6 gây tăng số
lượng hủy cốt bào bằng cách tác động vào các tế bào gốc tạo máu từ các bạch
cầu hạt, đại thực bào dòng h ạt [2].
Các phản ứng ở giai đoạn cấp tính, bao gồm sự phóng thích các cytokine
tiền viêm và tăng protein pha viêm cấp tính. Protein pha viêm cấp tính được sản
xuất trong gan (ví dụ như CRP) và IL-6 là một yếu tố chính kích thích gan thực
hiện quá trình này. Ở bệnh nhân RA, nồng độ IL-6 huyết thanh tương quan với
nồng độ CRP và hiện nay IL-6 dễ dàng định lượng được nhờ đánh giá nồng độ
CRP trong d ịch sinh học. Nồng độ CRP được sử dụng như một dấu hiệu sinh
học của tình trạng viêm và đánh giá mức độ bệnh [2].
Từ những dẫn chứng trên, có thể thấy ở bệnh nhân viêm khớp dạng thấp,
các triệu chứng toàn thân hay tại chỗ trên các khớp xương có thể được giải thích
bởi tác động của IL-6. Do đó ức chế IL-6 là một mục tiêu hợp lý để điều trị RA
[2, 11].
6

1.2.3 Trung tâm hoạt động và cơ chế ức chế Interleukin-6
Khi xuất hiện đột biến mất đoạn với những protein IL-6 thử nghiệm, tất cả
các protein không có hoạt động về mặt sinh học. Sau đó tiến hành phản ứng miễn
dịch với một bộ kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng IL-6, cho thấy ch ỉ có đột
biến mất đoạn ở các trình tự 177, 178 và 179 là không gây ra sự thay đổi đáng kể
trong cấu trúc nếp gấp. Tức là các đột biến mất đoạn này không làm mất đi cấu
trúc không gian 3 chiều của protein IL-6. Khi IL-6 có đột biến mất đoạn tại trình
tự 177, 178, 179 thì nó vẫn giữ được hoạt tính sinh học liên quan đến cấu trúc 3
chiều của protein. Cùng với đó, quan sát thấy rằng protein IL-6 có đột biến mất
đoạn ở bộ 3 trình tự acid amin 177-179 không th ể cạnh tranh với protein IL-6
(còn đủ trình tự polypeptide) để liên kết với thụ thể hòa tan SIL-6R, điều này gợi
ý rằng có 1,2 hoặc cả 3 acid amin trên có th ể tham gia vào vị trí liên kết giữa IL6 với thụ thể hòa tan SIL-6R. Bằng cách tạo ra nhiều đột biến thay thế acid amin
ở từng vị trí 177, 178 và 179 kết quả cho thấy Arg179 đóng vai trò quan trọng
đối với hoạt động ở tế bào chuột. Sự thay thế duy nhất mà giữ nguyên hoạt tính ở
vị trí 179 là từ Arg thành Lys chứng tỏ vai trò quan trọng của điện tích dương ở
vị trí 179 cho sự liên kết của IL-6 với thụ thể của nó [12]. Từ đây có thể kết luận,
Arginine ở vị trí 179 đóng vai trò quan trọng, nhắm vào vị trí đặc biệt này trong
cấu trúc chuỗi polypeptide IL-6 sẽ làm suy giảm hoạt động bình thường của IL-6
[32].
1.3 Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc.
Quá trình nghiên cứu và phát triển thường được sử dụng trong công
nghiệp dược phẩm hiện nay được minh họa như hình dưới đây:

Lựa chọn mục
tiêu

Hình 1.4: Các quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc

7


Lựa chọn mục tiêu là chọn một mục tiêu cụ thể, được giả thuyết là có vai
trò quan trọng với mục đích điều trị bệnh đã được nhắm đến cho chương trình
phát triển thuốc. Các mục tiêu phân tử thường là một thụ thể, một enzyme hoặc
một phân tử tương tự như vậy [14].
Xác định hợp chất Hit là việc tìm ra các phân tử có tác dụng mong muốn
trong một hoặc nhiều thử nghiệm ban đầu. Những thử nghiệm này sẽ giúp dự
đoán được các tác dụng dược lý đang mong đợi. Xác định hợp chất Hit thường
được tiến hành bằng sàng lọc thông lượng cao (High Throughput Screening HTS), với các thư viện hợp chất lớn, 105-106 phân t ử, được kiểm tra bằng thực
nghiệm. Các hợp chất Hit có tác dụng ở bước này tiếp tục trở thành hợp chất
khởi đầu cho các khám phá mở rộng hơn về hóa dượ c ở giai đoạn xác định và tối
ưu hóa hợp chất dẫn đường (Lead). Khi quá trình này diễn ra, càng có nhiều
thông tin về tính chất dược lực học và dược độ ng học của các hợp chất được
phát hiện. Việc xác thực giả thuyết dược lý ban đầu, cùng với đặt ra nghi vấn
trong giai đoạn lựa chọn mục tiêu, là hai quá trình tiến hành song song. Cuối
cùng, ứng cử viên làm thuốc là hợp chất duy nhất còn lại hội đủ các yêu cầu và
được đưa đi tiến hành các thử nghiệm lâm sàng [14].
Việc sử dụng mô hình phân tử trong xác định hợp chất Hit được gọi là
sàng lọc ảo. Điều này được s ử dụng cả cho thiết kế bộ hợp chất để sàng lọc
trong HTS và dự đoán các bộ hợp chất nhỏ hơn để kiểm tra với các thử nghiệm
với thông lượng thấp hơn [10].
1.4 Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc
Sàng lọc ảo dựa trên cấu trúc (Structure-Based Virtual Screening - SVBS)
là dự đoán các hợp chất liên kết với protein đích thông qua các phương pháp tính
toán, s ử d ụng các hiểu biết về cấu trúc 3D của đích phân tử.
Cách tiếp cận cơ bản của SVBS là dự đoán cấu dạng liên kết của từng
phân t ử nhỏ trong thư viện dữ liệu (docking), và từ đó dự đoán năng lượng tự do

của phân tử đó khi liên kết (scoring). Các hợp chất Hit sau đó được dự đoán
bằng cách sắp xếp tất cả các hợp chất trong thư viện bằng cách tính điểm (score),

8


và quyết định một điểm ngưỡng. Hợp chất có điểm tốt hơn điểm ngưỡng được
coi là hợp chất Hit, sau đó sẽ đánh giá thêm [14].
1.5 Phƣơng pháp Docking
1.5.1 Đại cƣơng về phƣơng pháp Protein docking
Docking là một trong những phương pháp phổ biến nhất dùng trong quá
trình thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc vì có khả năng dự đoán với độ chính xác
khá cao sự hình thành liên kết của cấu tử với thụ thể trong túi liên kết. Ra đời từ
những năm 1980 [22], docking phân tử đã trở thành một công cụ thiết yếu trong
nghiên cứu và phát triển thuốc. Không những ch ỉ ra các liên kết có ý nghĩa,
docking còn có thể định lượng khả năng liên kết b ởi các hàm tính điểm, qua đó
phân hạng khả năng liên kết mạnh yếu của các cấu t ử [22].
Docking trở thành một bài toán tối ưu, tìm vị trí và cấu hình phù hợp nhất
của một cơ chất gắn kết lên protein. Về mặ t nhiệt động lực học, mục tiêu chính
của docking là tìm ra cấu hình mà năng lượng tự do của toàn hệ là thấp nhất. Để
tìm cấu hình phù hợp nhất, cần liên hệ cấu hình không gian với các trị số đánh
giá được khả năng gắn kết của cơ chất lên protein và sau đó áp dụng thuật toán
tìm kiếm [20].
Thuật giải di truyền (Genetic Algorithm - GA) là thuật toán tìm kiếm được
ứng dụng nhiều trong các chương trình docking như Autodock, Autodock Vina,
GOLD [24, 30]. GA áp dụng các lí thuyết liên quan đến học thuyết tiến hoá và
chọn lọc tự nhiên. Đầu tiên, thuật toán sẽ mã hoá tất cả các tham số của cấu trúc
ban đầu trong “một nhiễm sắc thế” - biểu diễn bằng một véc tơ. Từ “nhiễm sắc
thể” ban đầu này, tạo ngẫu nhiên một quần thể bao phủ một miền năng lượng.
Quần thể này được đánh giá và từ đó các “nhiễm sắc thể” thích nghi nhất (tức là

có giá trị năng lượng thấp nhất) được chọn làm khung để tạo ra quần thể tiếp
theo. Quy trình này làm giảm năng lượng trung bình của toàn bộ “nhiễm sắc thể”
bằng cách truyền các đặc tính cấu trúc thuận lợi từ một quần thể này sang một
quần thể khác. Sau một số chu kỳ tìm kiếm và đánh giá, cuối cùng ta sẽ tìm được
một “nhiễm sắc thể” (cấu dạng) phù hợp với mức năng lượng tối thiểu [21].

9


Chương trình docking sử dụng các hàm tính điểm (scoring function) để
ước lượng các năng lượng liên kết của phức hợp cấu tử - receptor. Năng lượng
này được cho bởi hằng số liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔGL), đơn vị
là kCal/mol. Dự đoán về năng lượng liên kết được thực hiện bằng cách đánh giá
những tương tác hóa lý quan trọng bao gồm: các tương tác liên phân tử, các ảnh
hưởng solvat và entropy [15]. Do đó, số lượng các tham số hoá lý được đánh giá
càng lớn thì độ chính xác càng cao. Tuy nhiên, nếu số lượng biến càng lớn thì
thời gian tính toán sẽ lâu. Các hàm tính điểm hiệu quả nên đưa ra sự cân bằng
giữa độ chính xác và tốc độ, đây là một điểm quan tr ọng khi làm việc với cơ sỡ
dữ liệu lớn.
1.5.2 Quy trình Docking
Quá trình docking được thực hiện thông qua ba bước: chuẩn bị cấu tử,
chuẩn bị protein, mô phỏng docking.
Chuẩn bị cấu tử: cấu trúc các cấu tử có thể được lấy từ hệ thống dữ liệu
có sẵn như Pubchem, Zinc [13, 19] Trong trường hợp không có sẵn, chúng ta có
thể xây dựng cấu trúc cấu tử bởi các phần mềm như ChemDraw, Chemsketch…
Sau khi xây dựng được cấu trúc 3D, sử dụng các phần mềm để chuẩn bị cấu tử
cho chương trình mô phỏng docking, các bước chuẩn bị thường được tiến hành
gồm: gắn hydro, gắn trườ ng l ực, xây dựng file pdbqt.
Chuẩn bị protein : Cấu trúc 3D của protein thường có sẵn trên ngân hàng
dữ liệu protein (protein data bank). Trong trường hợp chưa có sẵn, chúng ta có

thể xây dựng cấu trúc 3D theo phương pháp mô phỏng tính tương đồng
(homology modeling) [31]. Sau khi có cấu trúc 3D, sử dùng các phần mềm để
chuẩn bị protein cho chương trình mô phỏng docking. Các bước chuẩn bị thường
gồm: lo ại nước và các cấu tử (nếu có), thêm hydro, gắn trường lực và xây dựng
file pdbqt.
Mô phỏng docking: Trước khi phần mềm tiến hành tìm kiếm vị trí và cấu
dạng phù hợp của cấu tử, cần khoanh vùng tìm kiếm (grid box) cho thuật toán.
Kích thước của vùng tìm kiếm không nên quá lớn vì như thế sẽ tốn kém thời
gian và độ lặp lại không cao, cũng không nên quá nhỏ vì như vậy phần mềm chỉ
10


tìm kiếm được một vùng rất nhỏ, không có ý nghĩa. Vị trí của vùng tìm kiếm
thông thường sẽ được đặt ở trung tâm hoạt động của protein. Sau khi xác định vị
trí và kích thước của vùng tìm kiếm, phần mềm sẽ tự động tìm kiếm và đưa ra
cấu dạng phù hợp với năng lượng thấp nhất. Cấu dạng này cùng với các tương
tác của nó với protein sẽ được phân tích bởi các phần mềm chuyên dụng như:
MOE, Pymol, Discovery studio…

11


CHƢƠNG 2- NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu
Cấu trúc protein: Cấu trúc tinh thể tia X của protein IL-6 được lấy từ
ngân hàng dữ liệu Protein châu Âu, có mã là 1ALU (Độ phân giải 1.9Å), lần đầu
tiên được công bố bởi Somers và cộng sự (https:/www.rcsb.org/structure/1ALU).

Hình 2.1: Phân tích protein 1 ALU về cấu trúc hình học so với IL-6

phản ánh qua màu sắc trên Ngân hàng dữ liệu protein Châu Âu
( />Mật độ electron ảnh hưởng đến dạng hình học của cấu trúc tinh thể tia X
vì từ mật độ electron có thể xác định tọa độ các nguyên tử. Từ đó có thể dựng
cấu trúc của protein. Theo như hình trên thì màu sắc phản ánh mối quan hệ giữa
mật độ electron và dạng hình học. Màu sắc thể hiện chỉ số tiêu chuẩn chất lượng
hình học bao gồm tối thiểu 1 acid amin ngoại lai hay sai lệch về cấu hình: vùng
xanh (s ố acid amin ngoại lai = 0), Vàng (số acid amin ngoại lai = 1), Cam (số
acid amin ngoại lai = 2), Đỏ (số acid amin ngoại lai = 3). Như vậy có thể thấy,
theo trình tự chuỗi acid amin, vị trí 177-179 (vùng hoạt động) có chất lượng tốt
(màu xanh) và được chọn để nghiên cứu khả năng gắn kết giữa cấu tử và protein.

12


Hình 2.2: Hình ảnh 3D của protein 1ALU
Cơ sở dữ liệu để sàng lọc: Cơ sở d ữ liệu các hợp chất thiên nhiên Việt
Nam (Vietnamese natural product Database – VNPD) gồm cấu trúc topo (2
chiều) của 1602 hợp chất có nguồn gốc dược liệu Việt Nam và các thông tin như
nguồn dược liệu, tác dụng dược lý đã nghiên cứu… Do giới hạn về tài nguyên
tính toán), trong nghiên cứu này sử dụng nguồn dữ liệu là 500 chất đầu tiên của
VNPD.
Thiết bị sử dụng: Máy tình ACER Aspire V3 – Hệ điều hành Windows 8
Phần mềm: Danh sách các phần mềm sử dụng được tải hoặc mua từ các
nhà phát triển (trang web) bao gồm:
MarvinSketch ( />MGLtools ( />AutodockVina ( />Discovery Studio ( />PyMol ( />-

2.2 Nội dung nghiên cứu:
Bước 1. Sàng lọc ra các hợp chất tự nhiên trong cơ sở dữ liệu VNPD có
tác dụng ức chế IL-6 bằng phương pháp docking phân tử.

13


Bước 2. Nghiên cứu đặc điểm giống thuốc của các hợp chất tốt nhất, thu
được sau khi đã thông qua sang lọc, bằng cách phân tích các thông số hóa lý của
cấu trúc và đặc điểm của cây dược liệu có chứa chất đó.
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Sàng lọc bằng quy tắc 5 của Lipinski
Quy tắc số 5 của Lipinski chỉ ra rằng dược chất đường uống không vi
phạm quá một trong 4 tiêu chí dưới đây:
Trọng lượng phân tử MW < 500 daltons.
Không nhiều hơn 5 hydro có thể tham gia liên kết hydro (Số lượng các
nhóm –NH và –OH), HBD ≤ 5
-

Không nhiều hơn 10 nguyên tử có độ âm điện lớn có thể tham gia liên
kết hydro (bao gồm nguyên tử Oxy và Nitơ) , HBA ≤ 10
Hệ số phân bố octanol/nước MlogP ≤ 4,15
-

Sàng lọc bằng công cụ tính toán phát triển bởi Daina và cộng sự, hiện có
thể tiến hành trực tuyến bằng trang web Tập hợp 500
hợp chất tự nhiên đầu tiên trong CSDL VNPD được sàng lọc bằng cách đưa công
thức SMILEs vào web để có các cấu trúc và thông số, sau đó tiến hành phân tích
theo quy tắc 5. M ụ c tiêu nhằm tăng tỷ lệ thành công ở các giai đoạn phát triển
tiếp theo cho các h ợp chất vượt qua yêu cầu ở quy trình này.
2.3.2 Sàng lọc bằng Docking
Chuẩn bị protein: Cấu trúc tinh thể tia X của IL-6 (1ALU) được tải từ
ngân hàng dữ liệu protein ( sau đó tiến
hành loại bỏ các nước, ligand SO4 và TLA (tartaric acid). Thêm Hydro, gắn

trường lực Kollman và xây dựng file pdbqt. Tất cả các bước này được tiến hành
trên ph ần mềm MGLtools.
Chuẩn bị hợp chất: Đưa công thức SMILES các hợp chất tự nhiên vào để
vẽ công thức 2D sau đó xây dựng công thức 3D nhờ phần mềm MarvinSketch.
Sau cùng, sử dùng phần mềm MGLtools thêm hydrogen, gắn trường lực
Gasteiger và xây dựng file pdbqt.

14