PHÂN LẬP GENE TÁCH DÒNG PHÂN TỬ VÀ BIỂU HIỆN GENE

Chương 9
PHÂN LẬP GENE TÁCH DÒNG PHÂN TỬ
VÀ BIỂU HIỆN GENE

Tóm tắt: Công nghệ ADN tái tổ hợp bao gồm các kĩ thuật tách dòng gene và
biểu hiện gene. Bắt đầu từ sự phân lập gene và sau đó là tạo vector tái tổ hợp,
biến nạp vào tế bào chủ, tách dòng và xác định trình tự gene. Protein là sản
phẩm biểu hiện gene. Quá trình biểu hiện gene ngoại lai bắt đầu từ việc đưa
gene vào vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào chủ. Vector biểu hiện gene
được thiết kế bao gồm promotor mạnh và điều khiển được. E. coli là vi khuẩn
được sử dụng rộng rãi trong công nghệ ADN tái tổ hợp và sự biểu hiện gene
thành công nhất hiện nay vẫn là ở E. coli. Phân lập, tách dòng và biểu hiện
gene được minh hoạ bằng ví dụ về sự phân lập, xác định trình tự gene mã hoá
cho trichobakin-RIP và quá trình biểu hiện gene này.
Nội dung của chương gồm 3 vấn đề chính là: (1).Phân lập gene; (2). Tách
dòng gene; (3). Biểu hiện gene.


§1. PHÂN LẬP GENE
Phân lập gene hay phân lập đoạn ADN theo mục đích có thể được tiến
hành theo phương pháp sử dụng enzyme cắt hạn chế hoặc bằng phản ứng chuỗi
PCR. Phân lập gene mang ý nghĩa trong kĩ thuật giải trình tự ADN hay tạo dòng
ADN tái tổ hợp trong kĩ thuật chuyển gene.
1.1. Phân lập gene bằng kĩ thuật cắt hạn chế

Enzyme giới hạn (restrition enzyme) có khả năng cắt ADN ở những điểm
đặc hiệu. Với đặc tính đó người ta đã vận dụng để xác định những đoạn ADN
mã hoá cho các tính trạng của sinh vật và phân lập đoạn ADN đó. Kĩ thuật phân
lập gene nhờ enzyme giới hạn có thể gồm các bước sau:
(1). Tách chiết và tinh sạch ADN.
(2). Cắt ADN bởi enzyme giới hạn.

(3). Điện di trên gel agarose.
(4). Dựa vào ADN marker xác định được đoạn ADN cần phân lập.
(5). Biến tính ADN thành 2 mạch đơn ngay trên gel, rồi chuyển lên màng

126
lai phân tử. Vị trí các đoạn ADN được giữ nguyên.
(6). ADN cố định trên màng được lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ
Rửa để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp.
(7). Dùng kĩ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các phân tử lai ADN- mẫu
dò.
1.2. Phân lập gene bằng kĩ thuật PCR
Phản ứng chuỗi polimerase được tiến hành với các primers có trình tự biết
trước. Cặp primer gồm primer xuôi (sens primer) và ngược (antisens primer)
được thiết kế theo trình tự gene từ ngân hàng gene. Cặp mồi chuyên biệt này
được bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN. Sử dụng cặp mồi
chuyên biệt cùng với ADN mẫu, enzyme, dNTP, Mg
++
, bufpher... trong thiết bị
nhân ADN (máy PCR) thì đoạn gene từ phân tử ADN mẫu sẽ được khuếch đại.
Phân lập gene bằng PCR có thể được tiến hành theo các bước sau:
(1) Tách chiết và tinh sạch ADN.
(2). Thiết kế primers.
(3). Chọn điều kiện phản ứng PCR.
(4). Nhân đoạn ADN trong máy PCR để phân lập đoạn gene theo mục
đích.


§2. TÁCH DÒNG GENE
2.1. Mục đích
- Tạo ra một lượng lớn bản sao một trình tự ADN xác định.

- Chọn lọc một thư viện gene.
2.2. Các bước của kĩ thuật tách dòng
- Chọn và xử lí vector.
- Xử lí ADN cần tạo dòng.
- Tạo vector tái tổ hợp.
- Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.
- Phát hiện dòng cần tìm trong thư viện gene.

127


Hình 9.1. Quy trinh chung của kĩ thuật tách dòng gene
2.3. Thư viện bộ gene

Thư viện bộ gene là tập hợp tất cả các trình tự ADN cấu thành bộ gene đã
được gắn vào vector. Về nguyên tắc, thư viện bộ gene được thiết lập từ bất cứ tế
bào nào của sinh vật nghiên cứu.
Các bước thiết lập thư viện bộ gene:
(1) Tách chiết ADN.
(2). Cắt ADN thành những đoạn có kích thước xác định bằng RF.
(3). Gắn đoạn các ADN vào vector để tạo vector tái tổ hợp.
(4). Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.
(5). Tế bào chủ nuôi cấy trên môi trường đặc và hình thành nên các dòng.


128

Hình 9.2. Tách dòng ADN tái tổ hợp
Ứng dụng:
- Giải mã thông tin di truyền chứa trong bộ gene, đặc biệt cấu trúc itron,

exon của một gene xác định.
- Tạo dòng các trình tự không mã hoá nằm cạnh các gene và đóng vai trò
quyết định trong sự điều hoà biểu hiện gene.
2.4. Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gene chaperonin ở đậu tương
Một ví dụ về xác định trình tự gene chaperonin liên quan đến tính chịu
nóng hạn ở cây đậu tương Glicine max (L.) Merrill trên thiết bị tự động theo

129
nguyên tắc của phương pháp Sanger. Glicine max (L.) Merrill là loại cây trồng
có vị trí quan trọng hàng đầu trong các loại cây họ đậu. Hạt đậu tương có hàm
lượng protein cao từ 28% - 45%, dễ tan và chứa hầu hết các loại axit amin, đặc
biệt là các loại axit amin không thay thế. Ngoài protein, hạt đậu tương còn có
lipit và nhiều chất hữu cơ khác. Rễ đậu tương có nốt sần chứa vi khuẩn cố định
đạm Rhizobium.
Các dòng đậu tương M48, M10 và M61 được tạo ra bằng phương pháp
đột biến thực nghiệm (Chu Hoàng Mậu, 2001) đã được đánh giá và chọn lọc qua
nhiều thế hệ. Ngoài các đặc điểm về năng suất và chất lượng, tác giả còn quan
tâm nghiên cứu mối liên quan giữa khả năng chịu hạn với đặc điểm hoá sinh và
sinh học phân tử của các dòng đậu tương đột biến này. Dòng đậu tương đột biến
chịu hạn ML61 có nguồn gốc từ giống đậu tương Lạng Sơn và được tạo ra bằng
đột biến thực nghiệm với công thức xử lí phối hợp (16 kr
γ
+ 0,01%EI). Trần
Thị Phương Liên (1999) đã nghiên cứu, phân lập và xác định trình tự gene
chaperonin từ giông đậu tương chịu nóng M103, genome của các dòng đậu
tương đột biến ML10, ML48 và ML61 có tồn tại gene chaperonin và cấu trúc
của nó có điểm gì khác với gene chaperonin đã được nghiên cứu. Kết quả nhân
và tách dòng gene chaperonin của các dòng đậu tương đột biến M48, M10 và
M61 và xác định trình tự gene chaperonin của dòng đậu tương chịu hạn M61
được thực hiện nhằm mục đích trên. Phát hiện gene chaperonin theo phương

pháp của Kary Mullis và cộng sự (1985) với việc sử dụng cặp mồi
Chap_N/chap_C thiết kế dựa trên trình tự ADN bổ sung (cDNA) của giống đậu
tương Nhật Bản.
Chap_N:
5_GCC ATA TGT CGG CAA TCG CGG CCC C
Chap_C:
5_CGG GAT CCC TAC CTC ACA GTT ACA GTT ACA ATA TCA TC
Chu trình nhiệt phản ứng: 95
0
C : 1 phút; 55
0
C : 1 phút; 72
0
C : 1 phút 20
giây: 32 chu kì; 72
0
C : 8 phút; Kết thúc ở 4
0
C.
Để tiến hành tách dòng gene chaperonin sản phẩm PCR được cắt thành
các đoạn nhỏ hơn bằng SacI. Sau đó đem sản phẩm cắt gắn vào vector
pBluescript KS (-) đã được mở vòng. ADN tái tổ hợp được biến nạp vào chủng
E. coIi-DH5
α
. Môi trường nuôi cấy, các phương pháp gắn, tạo tế bào khả biến,
biến nạp, tách ADN plasmid, kiểm tra đoạn gene bằng cách xử lí với enzyme
giới hạn dược tiến hành theo sách cẩm nang chọn dòng phân tử của Sambrook
và cộng sự 1989.

130

2.4.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN tổng số
Mầm 2-3 ngày tuổi của các dòng dậu tương ML10, ML48 và ML61 được
chia nhỏ từ 0,5-1g và giữ ở -70
0
C. Khi tách chiết, mầm được nghiền trong nitơ
lỏng và ADN tổng số được chiết ra bằng dung dịch đệm có chứa 10 mM Tris-
HCl pH 8.0,1 mM EDTA, 100 mM NaCl, SDS 2,1%. Sử dụng enzyme
proteinaza, hỗn hợp phenol : chlorofoc : isoamylalcohol (25 : 24 : 1) để loại
protein và các hợp chất không mong muốn, EDTA có tácdụng cố định các ion
Mg
++
- là yếu tố cần thiết cho sự hoạt động của các nucleaza, do đó ADN trong
dung dịch không bị phân giải bởi các enzyme này. Thực hiện quy trình tách
chiết ADN như đã mô tả [1], thu được dung dịch có chứa ADN. Dung dịch
ADN thu được vẫn tồn tại cả ARN, loại bỏ ARN bằng cách xử lí với ARNaza, ủ
ở 37
0
C trong 2-3 giờ.
Sau đó tiến hành kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Bản gel sau khi điện di được nhuộm bằng EtBr (ethidium bromide) trong 10-15
phút. Do cấu trúc của ADN có các liên kết hydro giữa hai mạch đơn nên khi
nhuộm, các phân tử EtBr sẽ bám vào các liên kết này. Phân tử EtBr có khả năng
phát quang dưới ánh sáng của tia tử ngoại (UV) nên có thể phát hiện băng vạch
khi chiếu bản gaeldưới đèn UV.

Hình 9.3. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agaroza 0,8%
2.4.2. Nhân gene chaperonin từ 3 dòng đậu tương bằng kĩ thuật PCR

Chaperonin tế bào chất là một dạng protein tồn tại trong tất cả các tế bào đóng
vai trò quan trọng trong việc tạo cấu trúc không gian đúng cho protein tạo khung
tế bào là actin và tubulin. Chúng cùng đồng thời thực hiện nhiều chức năng khác
như tham gia tái tạo cấu trúc không gian đúng cho protein bị biến tính khi gặp
điều kiện bất lợi. Các tác giả đã sử dụng đoạn mồi được tổng hợp dựa vào trình
tự cDNA của chaperonin tế bào chất giống đậu tương chịu lạnh Nhật Bản để tiến
hành nhân gene chaperonin của các dòng đậu tương đột biến ML10, ML48 và
ML61 bằngkĩ thuật pPC.


131

Hình 9.4. Điện di đồ sản phẩm PCR gene chaperonin của 3 dòng đậu tương
Sau 32 chu kì phản ứng, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên
gel agarose 0,8% và kết quả cho thấy ở cả ba dòng đậu tương đều thu được sản
phẩm PCR đặc hiệu. Kích thước phân tử (KTPT) của sản phẩm PCR vào khoảng
1,6 kb. Đồng thời sản phẩm PCR nhận được có KTPT giống với đoạn tương ứng
ở đoạn cDNA của gene chaperonin trong giống đậu tương Nhật Bản. Điều đó
chứng tỏ rằng các dòng đậu tương nghiên cứu đều có gene chaperonin. Như vậy,
trong trình tự của nó chỉ có những vùng được dịch mã sang protein (exon), mà
không có những vùng không dịch mã (intron).
2.4.3. Phân tích gene chaperonin bằng enzim giới hạn
Theo các nghiên cứu đã công bố, trình tự gene chaperonin có điểm nhận
biết cho một số enzyme giới hạn như: SacI, AluI, SauI. Trong đó SacI cắt trình
tự cDNA thành 5 đoạn có kích thước phân tử tương ứng là 260, 189, 198, 630 và
325 bp. Như vậy, để so sánh gene chaperonin này với các trình tự công bố. Sản
phẩm cắt được điện di trên gel agaroza 1,2%.

Hình 9.5. Phổ điện di ADN plasmid
Kết quả trên diện di đồ cho thấy không có sự khác biệt về vị trí điểm cắt

SacI ở các dòng đậu tương đột biến so với các gene chaperonin đã được công bố
trước đây. Điều này chứng tỏ sản phẩm PCR nhận được có thể chính là đoạn
gene chaperonin. Đây là một trong những bằng chứng khẳng định sản phẩm

132
PCR thu được chính là gene chaperonin đã được công bố. Tuy nhiên để có thể
khẳng định chắc chắn về gene này cần tiếp tục nghiên cứu tách dòng sản phẩm
PCR của một đại diện là dòng đột biến ML61 - dòng được đánh giá là có năng
suất cao, chín sớm và khả năng chống chịu hạn tốt để tiến hành đọc trình tự
ADN của đoạn gene này làm cơ sở cho việc so sánh với trình tự của gene
chaperonin đã được công bố trên ngân hàng gene thế giới.
2.4.4. Tách dòng một số đoạn ADN của gene chaperonin ở dòng ML61
Nhằm mục đích nghiên cứu đọc trình tự gene, cần phải gắn một số đoạn
ADN của gene chaperonin ở dòng ML61 đã được cắt bằng enzyme SacI vào
vector pBluescript KS (-). Dựa vào các đặc điểm của vector pBluescript KS (-)
có chứa gene lacZ và vị trí cắt của SacI... Đồng thời trên gene chaperonin cũng
chứa vị trí các điểm cắt đặc hiệu của SacI. Vì vậy, sử dụng SacI để xử lí sản
phẩm PCR của dòng đậu tương ML61 và mở vòng vector pBluescirpt KS (-).
Phản ứng gắn của vector với các đoạn cắt của sản phẩm PCR được tiến hành ở
16
0
C trong vòng 24 giờ, sử dụng enzyme T
4
ligaza. Sau đó, dịch phản ứng được
biến nạp vào chủng E. coli - DH5
α
và cấy trải trên môi trường chọn lọc có
ampixillin, X-gal và IPTG. Kết quả đã nhận được một số khuẩn lạc trắng và
khuẩn lạc xanh trên môi trường chọn lọc. Những khuẩn lạc trắng có thể đã mang
đoạn ADN ngoại lai, còn khuẩn lạc xanh mang plasmid không chứa đoạn gắn

vào. Để kiểm tra kết quả của quá trình chọn dòng 9 khuẩn lạc màu trắng (kí hiệu
các khuẩn lạc từ 1 đến 9) và một khuẩn lạc màu xanh (làm đối chứng) được sử
dụng để tách chiết ADN plasmid. Sau khi tách chiết và làm sạch, sản phẩm
ADN plasmit được kiểm tra trên gel agaroza 0,8%. Trên ảnh điện di đồ cho thấy
cả 9 khuẩn lạc đều có ADN plasmid với độ di động điện di cao hơn đối chứng.
Để xác định được những khuẩn lạc cần tìm có gắn đoạn sản phẩm PCR cắt bằng
SacI, chọn ADN plasmid từ bơn khuẩn lạc 1, 4, 7 và 8 để tiến hành phản ứng cắt
kiểm tra bằng enzyme SacI. Sản phẩm sau khi cắt được kiểm tra bằng điện di
trên gel agaroza 0,8 %.
Kết quả trên ảnh điện di dòng số 8 đã gắn được một đoạn ADN khoảng
0,6 kb; dòng số 7 đã gắn được đoạn ADN khoảng 0,4 kb; dòng số 4 đã gắn dược
đoạn ADN khoảng 0,2 kb. Riêng sản phẩm cắt của dòng số 1 cho thấy có cả 2
đoạn ADN khoảng 0,6 kb và 0,2 kb được gắn vào vector. Trong quá trình tách
dòng, sử dụng enzyme SacI cắt gene chaperonin thành 5 đoạn. Vì SacI là
enzyme cắt tạo đầu dính nên sản phẩm cắt chỉ cho được 3 đoạn có đầu dính
tương ứng với kích thước là 189, 198 và 630 bp.
Như vậy, rõ ràng là dòng số 8 đã gắn được đoạn tương ứng có kích thước
là 630 bp. Dòng số 4 thì gắn dược hoặc là đoạn 189 bp hoặc 198 bp (vì hai đoạn

133
này rất khó phân biệt trên diện di đồ). Còn dòng số 1 gắn được cả hai đoạn 630
bp và một trong hai đoạn ngắn nói trên. Đối với dòng số 7 đoạn gắn có kích
thước khoảng 400 bp có thể là tổng của hai đoạn ngắn 189 và 198 bp và cũng có
thể là đoạn lẫn tạp trong sản phẩm cắt ngẫu nhiên. Để có những kết luận chính
xác về các dòng thu được, cần tiến hành đọc trình tự ADN.
2.4.5. Xác định trình tự gene Chaperonin ở cây đậu tương
Vector tách dòng TA cloning và các hoá chất cần thiết của hãng
Invitrogen, vi khuẩn E. coli chủng DH5
α
. Tạo dòng phân tử được tiến hành

theo phương pháp của Sambrook và Russell. Xác định trình tự gene chaporonin
được thực hiện trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic
Analizer. Nhân đoạn gene chaperonin từ ADN tổng số, tiểu phần CTT
δ
của
dòng đậu tương đột biến ML61. Sau đó, sản phẩm PCR được đưa vào vector TA
cloning, được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5
α
. Kiểm tra vector tái tổ hợp
bằng xử lí với enzyme EcoRI đã thu được dòng mang đoạn gene mong muốn để
tiến hành đọc trình tự. Để kiểm tra kết quả đọc trình tự gene chaperonin, sử dụng
phần mềm Sinh học Clustalx để so sánh trình tự gene này với các gene
chaperonin của giống Cúc Vàng (còn gọi là Cúc Lục Ngạn), một giống địa
phương có khả năng chịu hạn, giống M103 đột biến có khả năng chịu nóng và
giống đậu tương chịu rét Nhật Bản - Bonminori.


134


135

Trình tự gene chaperonin của dòng đậu tương đột biến ML61 có sự sai
khác 41 vị trí nucleotit so với giống M103, 57 vị trí nucleotit so với giống Cúc
Vàng và 25 nucleotit so với giống đậu tương Bonminori. Sự sai khác này tạo
nên sự thay đổi trình tự 9, 10 và 11 axit amin sai khác của ML61 tương ứng so
với Bominori, M103 và Cúc Vàng.
Bảng 9.1: Trình tự axit amin của gene chaperonin ML61 sai khác so với
Bonminori, Cúc Vàng và M103
STT Vị trí Bonminori Cúc Vàng M103 MI61

1 8 Gln (Q) Gln (Q) Gln (Q)
His (H)

2 24 Glu (E) Asp (D) Asp (D) Glu (E)
3 29 Gli (G) Ala (A) Ala (A) Ala (A)
4 43 Thr(T) Thr(T) Thr(T)
Ala (A)

5 54 Ile (1) Thr(T) Thr (I) Ile (I)
6 76 Val (V) Gli (G) Val (V) Val (V)
7 99 Ser (S) Thr(T) Thr (T) Thr (T)
8
110
His(H) Leu (L)
His(H)
Leu (L)
9
128
Glu Asp (D)
Asp
Asp
10 129 Pro (P) Ala (A) Pro (P) Ala (A)
11 191 Pro (P) Pro (P) Pro (P)
Ala (A)

12 204 Val (V) Ile(I) Val (V) Val (V)
13 220 Leu (L) Pro (P) Leu (L) Leu (L)
14 280 Ser (S) Gli (G) Gli (G) Ser (S)
15 308 Ser (S) Ser (S) Ala (A) Ser (S)
16 360 Phe (F) Val (V Phe (F) Phe (F)

17 447 Asp (D) Ala (A) Ala (A) Ala (A)
18 506 Leu (L) Leu (L) Pro (P) Leu (L)
19 514 Thr(T) Met (M) Thr (T) Thr (T)

Các trình tự nucleotit sai khác còn lại đều do sự dột biến điểm có tính chất
đồng chuyển (hoán vị của các nucleotit trong nhóm với nhau) mà không làm
thay đổi trình tự axit amin. Mặt khác ở dòng đậu tương MI61 còn có sự sai khác
ở 3 vị trí axit amin 8Gln-His, 29Thr-Ala và 191Pro-Ala so với cả 3 giống so
sánh trên. ML61 là một dòng đậu tương đã được xử lí đột biến phối hợp với 16
kr
γ
+ 0,01%EI, có thể chính việc xử lí phối hợp tia
γ
và EI đã gây nên sự đột
biến trình tự nucleotit của dòng đậu tương này.

136