PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE(POLIMERASE CHAIN REACTION - PCR)

Chương 7
PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE(POLIMERASE CHAIN
REACTION - PCR)

Tóm tắt: Kĩ thuật phản ứng chuỗi dùng enzyme polimerase (Polimerase chain
reaction = PCR hay PCR Technology) lần đầu tiên được Mullis và cộng sự mô
tả năm 1986 và cũng chính do sự phát minh này mà Mullis đã xứng đáng nhận
giải thưởng Nobel về Y học và Sinh lí học năm 1993. Phản ứng chuỗi
polimerase (PCR) là kĩ thuật cơ bản và rất quan trọng trong Sinh học phân tử.
Phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn chính: (1). Biến tính ADN mẫu; (2). Tiếp hợp
mồi, (3). Tổng hợp đoạn ADN mới. PCR cũng như các kĩ thuật sinh học phân tử
khác cần phải có ADN tinh sạch và chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Hiện nay
đã có nhiều phiên bản của PCR như RT-PCR, RAPD, AFLP... PCR và các kĩ
thuật cải tiến từ PCR có nhiều ứng dụng trong thực tiễn, như: sản xuất mẫu dò,
khuếch đại số lượng các đoạn ADN và ARN, định lượng bằng PCR, phân tích
đột biến, phân tích ADN đa hình, phân lập gene và tách dòng gene, phân tích
sinh vật chuyển gene, xác định quan hệ di truyền...
Nội dung của chương gồm 3 vấn đề cơ bản: (1). Phản ứng chuỗi polimerase
(PCR); (2). Phân tích tính đa hình của ADN được nhân bản ngẫu nhiên
(Random Amplified Polimorphic DNA - RAPD); (3). Phân tích tính đa hình
chiều dài các phân đoạn ADN được nhân bản có chọn lọc (Amplifed Fragment
Length Potimorphism - AFLP).


§1. PHẢN ỨNG CHUỖI POLIMERASE (PCR)
1. Nguyên tắc
Phản ứng chuỗi polimerase là một kĩ thuật đơn giản, cho phép khuếch đại
invitro một trình tự ADN lên hàng triệu lần trong vài giờ. Điều này rất thuận lợi
cho việc phát hiện những trình tự hiếm trong các bộ gene (đột biến điểm, tái tổ
hợp, retrovirus) từ những đoạn ADN ngắn được phân lập hoặc từ một lượng rất
nhỏ lấy ra được khuếch đại cho các thử nghiệm sinh học, y học và nông nghiệp.

Đồng thời nó giúp cho các nhà sinh học phân tử nghiên cứu cấu trúc trình tự
ADN trong bộ gene của các cơ thểsinh vật khác nhau.
Phản ứng chuỗi PCR được thực hiện khi có ADN mẫu, 2 đoạn mồi (mỗi
đoạn mồi dài 18-30 bazơ), Taq polimerase (ensyme chịu nhiệt được tách từ vi

92
khuẩn Thermus aquaticus):,bốn loại deoxyronucleotit triphotphate ( dATP,
dTTP, dGTP, dCTP), dung dịch đệm và con Mg
2+
Phản ứng chuỗi PCR được
thực hiện trên thiết bị nhân ADN (máy PCR).


Hình 7.1. Thiết bị nhân ADN (Máy PCR)
Kĩ thuật PCR là một phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu
và phân tích hệ gen. Sử dụng kĩ thuật PCR có thể tạo ra một số lượng lớn các
bản sao của đoạn ADN cần tổng hợp mà không phải tách và nhân dòng. Thực
chất PCR là một phương pháp invitro cho phép nhân bản nhanh một đoạn ADN
nào đó mà chỉ cần một khối lượng mẫu ban dầu hạn chế. Các thành phần cơ bản
của một phản ứng PCR gồm: ADN khuôn, hai đoạn mồi để xác định các điểm
bắt đầu tổng hợp ADN, Taq polimerase, hỗn hợp bốn tiền chất deoxynucleotit,
dung dịch đệm chứa một số cation hoá trị 1, ion Mg
2+
và dung môi (nước khử
ion khử trùng).
Enzyme Taq polimerase là enzyme chịu nhiệt, được tách từ vi khuẩn
suối nước nóng Thermus aquaticus. Enzyme Taq có trọng lượng phân tử là 94
kDa và không mất hoạt tính ở nhiệt độ cao trong giai đoạn gây biến tính ADN.
Hoạt tính của enzyme Taq giảm 50% sau 150 phút ở nhiệt 92,5
0

C; sau 40 phút ở
nhiệt độ 95
0
C và sau 5-6 phút ở nhiệt độ 97
0
C. Nếu nhiệt độ tăng lên tới 95
0
C
trong 20 giây để biến tính ADN kép thành sợi đơn thì hoạt tính enzyme Taq còn
lại 65% sau 50 chu kì phản ứng.
Nồng độ enzyme Taq tối ưu cho phản ứng PCR là 0,5-2,5 đơn vị, nhưng
nếu nồng độ enzyme quá cao sẽ làm giảm hiệu suất xúc tác của phản ứng. Ngoài
ra, nồng độ Mg
2+
và dNTP cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Hiện nay,
có nhiều loại polimerase chịu nhiệt khác có chức năng riêng biệt và hoàn thiện
hơn như Tth polimerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt
động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt của ARN khuôn và ion Mg
2+
.
ADN khuôn (template)
ADN khuôn là vật liệu khởi đầu cho phản ứng PCR nên đòi hỏi có độ tinh

93
sạch cao. ADN khuôn có thể là sợi đơn hoặc sợi đôi của chuỗi ADN được biết
trước trình tự ở hai đầu để thiết kế mồi. Thông thường, nồng độ của ADN khuôn
được đưa vào phản ứng PCR khoảng 10-500ng.
Đoạn mồi (primer)
Các đoạn mồi thực chất là các oligonucleotit dài khoảng 4-10 bazơ (đối
với mồi ngẫu nhiên) hoặc khoảng 12-24 bazơ (đối với mồi đặc trưng). Nồng độ

mồi thích hợp để tiến hành phản ứng PCR là từ 0,1-0,5
μ
M. Lượng mồi đưa vào
phản ứng PCR phải phù hợp với lượng ADN cần tổng hợp (thường 106 phân tử
ADN cần 108 phân tử mồi). Nếu nồng độ mồi quá thấp thì mồi sẽ hết trước khi
số chu kì kết thúc, còn nồng độ mồi quá cao thì sẽ dễ làm tăng sản phẩm không
đặc hiệu.
Các đoạn mồi cần có tính đặc thù để làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng.
Mồi phải được thiết kế sao cho không được bổ trợ lẫn nhau, số lượng 4 loại bazơ
nitơ trong mồi nên xấp xỉ nhau, lượng G-C giữa hai mồi phải bằng nhau, tránh
những vùng trình tự không bình thường như polipurine hoặc poliprimidine hay
các trình tự lặp.
Các nucleotit (dNTPs)
dNTPs là hỗn hợp của bốn loại deoxyribonucleotit (dATP, dTTP, dGTP,
dCTP) làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp ADN. Tuỳ thuộc vào mục đích
nghiên cứu, các nhà khoa học còn có thể sử dụng một số nucleotit đã được thay
đổi như gắn thêm biotin hoặc digoxygenin... Nồng độ phản ứng của các dNTP
thường dùng vào khoảng 200mM mỗi loại, tuy nhiên ở nồng độ dNTP thấp (10-
100mM) Taq ADN polimerase hoạt động chính xác hơn. Hơn nữa, nồng độ tối
ưu của chúng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: Nồng độ Mg
2+
nồng độ chất
mồi, độ dài của sản phẩm được khuếch đại số chu kì của phản ứng.
Thành phần của dung dịch đệm phụ thuộc vào loại enzyme polimerase
được sử dụng. Trong dung dịch đệm quan trọng nhất là ion Mg
2+
làm tăng nhiệt
độ nóng chảy (Tm) của ADN mạch đôi, tạo ra phức chất tan với dNTPs để hình
thành cơ chất mà enzyme polimerase có thể nhận ra, điều này rất cần thiết cho
quá trình liên kết của các dNTP. Nồng độ Mg

2+
trong hỗn hợp phản ứng cuối
cùng biến đổi từ 0,5-5,5mM (nồng độ này có thể thay đổi khi cần thiết). Nồng
độ lớn Mg
2+
quá thấp sẽ làm giảm khả năng tổng hợp của enzyme polimerase,
còn nếu nồng độ quá cao sẽ tạo ra những phân đoạn không đặc hiệu.
Nhìn chung, nồng độ MgCl
2
có ảnh hưởng nhiều tới hiệu quả và tính đặc
thù của phản ứng. Ngoài Mg
2+
còn một số chất khác trong dung dịch đệm như
AMSO, DMSO, formamide được thêm vào như các chất phụ gia nhằm tạo ra
các sản phẩm PCR có kích thước lớn.

94
Mỗi một chu kì PCR gồm 3 giai đoạn cơ bản có nhiệt độ khác nhau:
(1) Giai đoạn tách chuỗi ADN: ADN bị biến tính từ dạng sợi kép thành
dạng sợi đơn ờ nhiệt độ 94-95
0
C trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 1-1,5
phút).

(2). Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng được hạ thấp xuống 40
0
- 65
0
C
cho phép hai đoạn mồi gắn vào ADN mẫu ở vị trí tương đồng theo nguyên tắc

bổ sung (A - T, G - C) ở hai đầu ADN cần nhân.

(3) Giai đoạn kéo dài: ở nhiệt độ 72
0
C ADN Taq polimerase hoạt động
kéo dài đoạn ADN từ đoạn mồi và hai đoạn ADN mới được tổng hợp theo
nguyên tắc bổ sung từ hai đầu đoạn ADN khuôn ban đầu.

Sau một chu kì gồm ba giai đoạn như trên, một đoạn ADN khuôn được
nhân lên thành hai, các đoạn ADN được nhân bản trong mỗi chu kì lại được coi
là ADN khuôn cho chu kì nhân bản tiếp theo. Chính vì vậy sau k chu kì nhân
bản sẽ tạo ra 2K đoạn ADN giống đoạn ADN khuôn ban đầu.

95

Kĩ thuật phản ứng di truyền dùng polimerase là kĩ thuật tương đối đơn
giản và phân tích một cách nhanh chóng sự biến dị di truyền ở mức độ phân tử
ADN trong phạm vi quần thể và giữa các cá thể (Innis và cộng sự, 1990). PCR
là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích genome của sinh vật, vì nó có khả
năng tạo ra một lượng lớn các trình tự ADN đặc hiệu từ bất kì cơ thể nào. PCR
được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau như xác định trình tự trực tiếp của
ADN được nhân bản, thiết kế các trình tự ADN mới, nhân bản quần thể ADN để
làm mẫu lai, xác định các trình tự đặc hiệu từ cADN hay thư viện gene, phân
tích tiến hoá và sự đa dạng ADN của quần thể sinh vật hay giữa các cá thể. Hiện
nay PCR được xem là phương pháp nhanh, chính xác và tương đối đơn giản để
đánh giá cây chuyển gene, phân tích một cách nhanh chóng sự biến dị di truyền
ở cấp độ phân tử ADN trong phạm vi quần thể và giữa các cá thể.

Hình 7.2. Sơ đồ phản ứng chuỗi polimerase (PCR)
Sự hạn chế lớn nhất của kĩ thuật này là phải có một trình tự ADN nhất

96
định mà từ đó người ta thiết kế và tổng hợp các đoạn mồi (đoạn khởi đầu cho
tổng hợp ADN). Tuy vậy sau này các nhà sinh học phân tử đã cải tiến kĩ thuật
này mà không cần thiết phải biết trước trình tự chuỗi ADN. John Welsh và
Michael Mc Clelland đã sử dụng kĩ thuật PCR với các đoạn mồi ngẫu nhiên
trong việc xác định in dấu genome. Kĩ thuật PCR được ứng dụng để phát hiện
nhanh các đột biến điểm và phân tích ADN đa hình. PCR còn được ứng dụng
phân lập gene, phân tích sinh vật chuyển gene. Ở Việt Nam các nhà khoa học đã
thành công trong việc phân lập các gene liên quan đến khả năng chống chịu ở
cây trồng, như gene chịu hạn ở cây lúa (Lê Trần Bình và cộng sự, 1998), gene
chịu nóng ở đậu tương (Trần Phương Liên và cộng sự, 1999),... và hàng loạt các
gene đã được tách và giải trình tự nucleotit.


Hình 7.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR (Đinh Duy Kháng, 2002)
1.2. Phản ứng RT-PCR (PCR ngược)
1.2.1. Nguyên lí
Thực chất của RT-PCR là phản ứng nhân một trình tự từ khuôn ARN,
gồm 2 giai đoạn: (1) Tổng hợp trình tự ADN 2 sợi từ sợi ARN làm khuôn; (2)
Trình tự ADN 2 sợi lại làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR.
Phản ứng biến đổi ARN thành ADN phải nhờ enzyme phiên mã ngược
(Reverse-trancriptase) được gọi là giai đoạn chuyển ngược (RT) thực hiện ở
nhiệt độ 50
0
C - 55
0
C trong 30 phút. Sau khi có sản phẩm ADN 2 sợi thì phản
ứng tiếp theo là PCR thông thường gồm 3 giai đoạn. RT-PCR được sử dụng để
nhân ARN của retrovirut hoặc mARN tách từ tế bào chất.

1.2.2. Tiến hành phản ứng RT- PCR
- Giai đoạn 1 (RT): 1 chu kì, thực hiện sao chép ngược từ ARN sợi đơn
sang ADN sợi kép ở nhiệt độ 50
0
C- 55
0
C, trong 30 phút.
- Giai đoạn 2 (PCR): (1). Biến tính ở nhiệt độ 94
0
-95
0
C /1phút; (2).Tiếp
hợp mồi ở 40-65
0
C; (3). Tổng hợp ADN ở 72
0
C/1 phút.
1.3. Kiểm tra sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR cùng với ADN marker được kiểm tra bằng phương pháp
điện ới trên gel agarose 0,8-2%. Tiến hành chụp ảnh trên ánh sáng đèn UV để
xác định sự có mặt của đoạn ADN được nhân bởi PCR.

97