Tổng hợp và thử tác dụng kháng ung thư của một số dẫn chất 1h indazol 6 amin

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  -----

NGUYỄN ĐÌNH TRUNG DŨNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
KHÁNG UNG THƯ
CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT
1H-INDAZOL-6-AMIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-----  ----NGUYỄN ĐÌNH TRUNG DŨNG
Mã sinh viên: 1501112

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
KHÁNG UNG THƯ
CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT
1H-INDAZOL-6-AMIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
TS. Trần Phương Thảo

ThS. Ngô Xuân Hoàng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI - 2020


LỜI CẢM ƠN
Trước khi trình bày những nội dung nghiên cứu trong đề tài của mình, tôi xin gửi
lời cảm ơn chân thành nhất đến với những người trong suốt thời gian qua đã luôn hỗ trợ
và động viên tôi hoàn thành khóa luận của mình một cách tốt nhất.
Trước hết, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến hai giảng viên đã hướng dẫn tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài đó là TS. Trần Phương Thảo – Bộ môn hóa dược
– Trường đại học Dược Hà Nội và ThS. Ngô Xuân Hoàng – Bộ môn hóa hữu cơ –
Trường Đại học Dược Hà Nội. Thày và cô không chỉ tạo những điều kiện thuận lợi nhất
cho tôi trong quá trình nghiên cứu mà còn đưa ra những chỉ dẫn chính xác, kịp thời và
động viên tôi những lúc khó khăn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các giảng viên, nghiên cứu viên và các anh chị kĩ
thuật viên đang công tác tại bộ môn Hóa dược - Trường đại học Dược Hà Nội, Khoa
Hóa – Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Khoa Dược – Đại học quốc gia Seoul đã luôn
giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận này.
Lời cuối, tôi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè cùng các thành viên khác cũng đang
tham gia nghiên cứu tại bộ môn hóa dược, đặc biệt là NCS. Dương Tiến Anh, em
Dương Văn Hiếu và em Nguyễn Hữu Long đã chia sẻ buồn vui, giúp đỡ, khích lệ tôi
trong suốt quá trình nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 1 tháng 4 năm 2020
Sinh viên

Nguyễn Đình Trung Dũng

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

2

1.1. Indoleamine 2,3-dioxygenase

2

1.1.1. Khái niệm chung

2

1.1.2. IDO và sự dung nạp miễn dịch của cơ thể

2

1.2. Mối liên quan giữa IDO và bệnh ung thư

3

1.3. Liên quan cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế IDO1

5

1.3.1. Cấu trúc của enzym

5

1.3.2. Môi trường nhân hem

6

1.3.3. Liên quan cấu trúc và tác dụng ức chế IDO1

8

1.3.4. Một số dẫn chất indazol có tiềm năng ức chế IDO1

9

1.4. Các phản ứng đã thực hiện

9

1.4.1. Phản ứng amin hóa khử

10

1.4.2. Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm

11

CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu

14
14

2.1.1. Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu

14

2.1.2. Thiết bị nghiên cứu

15

2.2. Nội dung nghiên cứu

16

2.2.1. Tổng hợp hóa học

16

2.2.2. Thử hoạt tính sinh học

16

2.3. Phương pháp nghiên cứu

16

2.3.1. Tổng hợp hóa học

16

2.3.2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

17

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Hóa học

19
19

3.1.1. Tổng hợp hóa học

19

3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết

24


3.1.3. Xác định cấu trúc
3.2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro
Chương 4: Bàn luận kết quả thực nghiệm

4.1. Phản ứng hóa học

25
28
30
30

4.1.1. Tổng hợp chất trung gian số II

30

4.1.2. Tổng hợp các chất mục tiêu IIIa-e

31

4.2. Khẳng định cấu trúc

31

4.2.1. Phổ khối lượng

31

4.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

32

4.3. Thử hoạt tính sinh học

34

TÀI LIỆU THAM KHẢO

39

PHỤ LỤC

42


DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
13

C-NMR

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
(Proton nuclear magnetic resonance)

1

H-NMR

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon
(Carbon-13 nuclear magnetic resonance)

A549

: Tế bào ung thư phổi

AcOH

: Axit acetic

AhR

: Aryl hydrocacbon receptor

ATCC

: Viện bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ
(American type culture collection)

d

: Vạch đôi trong phổ NMR (Doublet)

DCM

: Diclorometan

dd

: Vạch chẻ đôi hai lần trong phổ NMR (doublet of doublets)

DMEM

: Dulbecco’s modified eagle medium

DMSO

: Dimethyl sulfoxit

EA

: Ethyl acetat

eIF-2α

: Eukaryotic translation initiation factor 2

ELISA

: Enzym-linked immunosorbent assay

FBS

: Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)

GCN2

: General control depressible 2

GLK1

: Glucose kinase 1

HCT-116

: Tế bào ung thư đại trực tràng

IC50

: Nồng độ ức chế 50%
(The half maximal inhibitory concentration)

IDO

: Indoleamin-2,3-dioxygenase

IDO1

: Indoleamine-2,3-dioxygenase 1

J

: Hằng số ghép cặp trong phổ NMR

Kyn

: Kyrunenin

M

: Đa vạch trong phổ NMR (Multiplet)

MDA-MB-231 : Tế bào ung thư vú
MeOH

: Methanol

MS

: Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

mTOR

: Mammalian target of rapamycin

mTORC1

: Mammalian target of rapamycin complex 1

PI

: Phenyl imiadazol

Rf

: Hệ số lưu giữ

RPMI

: Roswell park memorial institute medium

S

: Vạch đơn trong phổ NMR (Singlet)

SK-HEP-1

: Tế bào ung thư biểu mô tế bào gan

SNU-638

: Tế bào ung thư dạ dày

SRB

: Phương pháp sulforhodamin B

T

: Vạch ba trong phổ NMR (Triplet)

TDO

: Tryptophan-2,3-dioxygenase

TLC

: Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

tºnc

: Nhiệt độ nóng chảy

WHO

: Tổ chức y tế thế giới (World health organization)

δ (ppm)

: Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) trong phổ NMR


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

14

Bảng 3.1. Chỉ số hóa lý và hiệu suất tổng hợp các dẫn chất 1H-indazol-6-

24

amin
Bảng 3.2. Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các dẫn chất IIIa-e

25

Bảng 3.3. Dữ liệu phổ khối lượng của các dẫn chất IIIa-e

26

Bảng 3.4. Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR của các

26

dẫn chất IIIa-e

Bảng 3.5. Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của các dẫn chất

27

IIIa-e
Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro của các dẫn
chất IIIa-e

28


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1. IDO và quá trình ức chế miễn dịch

3

Hình 1.2. Cấu trúc của enzym IDO

5

Hình 1.3. Cấu trúc của phức hợp IDO-phenyl imidazol (PI)

6

Hình 1.4. Tương tác giữa nhân hem và phenyl imiadazol (PI)

7

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của các chất từ 1 đến 4

9

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của các chất số 5 và 6

9

Hình 3.1. Phổ khối lượng của chất IIId

31

Hình 3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) của chất IIId

33

Hình 3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13Cacbon của chất IIIc

34

Hình 3.4. Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào của 2 dẫn chất IIId-e

35

trên ba dòng tế bào A549, SNU-638 và CHT116.


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 1.1. Phương trình phản ứng amin hóa khử

10

Sơ đồ 1.2. Cơ chế của phản ứng amin hóa khử

10

Sơ đồ 1.3. Khử hòa nhóm nitro thơm với tác nhân hydro phân tử

12

Sơ đồ 1.4. Phản ứng bechamp

13

Sơ đồ 1.5. Khử hóa p-nitro benzen bằng phương pháp điện hóa

13

Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng hợp chung

19

Sơ đồ 3.2. Quy trình tổng hợp chất số II

19

Sơ đồ 3.3. Quy trình tổng hợp chất IIIa

20

Sơ đồ 3.4. Quy trình tổng hợp chất IIIb

21

Sơ đồ 3.5. Quy trình tổng hợp chất IIIc

22

Sơ đồ 3.6. Quy trình tổng hợp chất IIId

23

Sơ đồ 3.7. Quy trình tổng hợp chất IIIe

23

Sơ đồ 3.8. Cơ chế phản ứng khử hóa tạo thành chất số II.

29

Sơ đồ 3.9. Cơ chế phản ứng amin hóa khử

30


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư là nhóm bệnh lý đặc trưng bởi sự phân chia không kiểm soát của các tế
bào, dẫn tới xâm lấn tổ chức xung quanh hay theo dòng máu đến di trú ở nhiều cơ quan
khác nhau [1]. Mặc cho những nỗ lực trong việc phát triển những phương pháp chẩn
đoán và điều trị, theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, ung thư là nguyên nhân gây

tử vong thứ 2 chỉ sau các bệnh lý tim mạch. Năm 2018 có tới 9,6 triệu người chết bởi
ung thư và tính trung bình trên toàn cầu cứ 10 ca tử vong thì có 1 ca liên quan đến căn
bệnh này [28].
Hiện nay dù có rất nhiều các phương pháp điều trị ung thư như phẫu thuật, xạ trị,
hóa trị, trị liệu miễn dịch hoặc chăm sóc giảm nhẹ nhưng không phương pháp nào được
coi là đặc hiệu với tế bào ung thư, việc tìm kiếm và tối ưu hóa các phương pháp điều trị
ung thư vẫn còn là thách thức không nhỏ đối với các nhà khoa học. Do đó, một trong
những hướng nghiên cứu được chú ý hàng đầu hiện nay đó là tìm kiếm và sàng lọc
những phân tử hóa học có hoạt tính mạnh mẽ nhằm nâng cao hiệu quả của phương pháp
hóa trị liệu.
Indazol là một nhóm các hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học phong phú như kháng
khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống trầm cảm, chống buồn nôn và nôn, kháng tế bào
ung thư [24], [27], [30]. Dẫn chất indazol có khả năng tương tác với nhiều phân tử đích
khác nhau liên quan tới sự phát sinh ung thư [26]. Đặc biệt, các dẫn chất ở vị trí số 6 của
indazol đã cho thấy hoạt tính chống ung thư rất tốt với các cơ chế đa dạng, tác động lên
nhiều đích phân tử của nhiều bệnh ung thư khác nhau [5], [25]. Điều này đã đưa các dẫn
chất này trở thành những chất dẫn đường đầy tiềm năng để tổng hợp các hợp chất mới
có hiệu quả trong điều trị ung thư.
Trên cơ sở đó, nhằm mục đích tìm kiếm và phát triển thêm các hợp chất có hoạt
tính kháng ung thư mạnh, đồng thời góp phần làm phong phú thêm thư viện hợp chất
indazol trên thế giới, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng kháng
tế bào ung thư của một số dẫn chất 1H-indazol-6-amin” với hai mục tiêu chính, đó là:
• Tổng hợp một số dẫn chất 1H-indazol-6-amin
• Thử độc tính của các chất vừa tổng hợp được trên các dòng tế bào ung thư

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Indoleamin 2,3-dioxygenase

1.1.1. Khái niệm chung
Indoleamin 2,3-dioxygenase hay còn gọi là IDO là một enzym nội bào bao gồm
một chuỗi polypeptid và có chứa nhân hem, nó được mã hóa vởi gen IDO1 nằm ở trên
nhiễm sắc thể. Vai trò chính của nó là điều khiển quá trình dị hóa tryptophan trong cơ
thể theo con đường kynurenin (Kynurenine pathway-KP) [3].
Qúa trình mở vòng indol xúc tác bởi enzym IDO là bước đầu tiên và quyết định
tới tốc đô dị hóa của tryptophan theo con đường kynurenin, theo con đường này
tryptophan iến đổi thành các chất chuyển hóa khác như kynurenin (Kyn), kynurenic axit,
3-hydroxykynurenin, axit 3-hydroxyanthranilic, axit picolinic và axit quinolinic. Sự tiêu
thụ tryptophan thông qua con đường kynurenin (KP) có liên quan tới tự tăng trưởng và
phát triển của tế bào. Các nghiên cứu gần đây còn chỉ ra rằng, KP còn có mối liên quan
đến sự kháng khuẩn và ức chế miễn dịch trong cơ thể.
IDO được chia thành hai loại với kí hiệu là IDO1 và IDO2, cả hai đều tham gia
vào con đường kynurenin, tuy nhiên tốc độ xúc tác cho quá trình dị hóa tryptophan bởi
hai enzym này là khác nhau do hoạt lực enzym của IDO2 chỉ bằng từ 3-5% so với enzym
IDO1 [16]. Ngoài ra, người ta cũng biết đến một loại enzym chuyển hóa tryptophan
khác có cơ chế giống như IDO đó là tryptophan 2,3-dioxxygenase (TDO), tuy nhiên sự
phân bố của enzym này trong cơ thể là khác so với IDO và chúng cũng xuất hiện ở cả
các vi khuẩn.
1.1.2. IDO và sự dung nạp miễn dịch của cơ thể
Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, IDO giữ một vai trò quan trọng trong sự phát
triển của tế bào ung thư. Cụ thể, nó hoạt hóa quá trình viêm xung quanh tế bào khối u,
ức chế miễn dịch thông qua sự điều hòa tế bào NK, tế bào T và tế bào T điều hòa [17].
Mặc dù chức năng điều hòa miễn dịch của các IDO chưa được nghiên cứu một
cách thực sự đầy đủ nhưng nó có mối quan hệ mật thiết đối với sự suy giảm nồng độ
của tryptophan và sự gia tăng chất chuyển hóa kyrunenin tại vị trí xung quanh môi
trường tế bào ung thư. Đặc biệt hơn nữa, sự suy giảm tryptophan gây ra sự đình trệ chu
trình tế bào của tế bào T và khích hoạt quá trình chết tế bào theo chương trình apotosis.Ở
nồng độ tryptophan dưới ngưỡng 0,5 µM, quá trình biệt hóa của tế bào T bị ức chế [14],
dẫn đến gia tăng sự biệt hóa các tế bào CD4+ thành các tế bào T điều hòa.

2


1.2. Mối liên quan giữa IDO và bệnh ung thư
Nhìn chung, khi nghiên cứu mối liên quan giữa sự phát triển của tế bào ung thư và
đáp ứng miễn dịch của cơ thể, người ra cho rằng Indoleamine 2,3-dioxygenase tác động
đến sự biệt hóa và phân chia của các tế bào T, gây ra những tín hiệu điều hòa xuôi thông
qua các GCN2, mTOR và AhR.

Hình 1.1. IDO và quá trình ức chế miễn dịch
Đầu tiên, sự suy giảm của tryptophan bởi IDO dẫn đến sự suy giảm nồng độ axit
amin này trong môi trường nội mô và kết quả là sự tích lũy của t RNA vận chuyển ở
trạng thái không liên kết với amino axit. GCN2 là một kinase đáp ứng với các “stress”
bao gồm một vị trí điều hòa có vai trò điều tiết với các t RNA ở trạng thái không vận
chuyển. Sự hoạt hóa của GCN2 dẫn đến sự phosphoryl hóa và giảm hoạt động của yếu
tố khởi đầu dịch mã ở tế bào nhân eukaryote factor 2α. eIF-2α bị phosphory hóa sẽ ngăn
chặn quá trình phiên mã và giới hạn sự dịch mã protein trong điều kiện đó [13].
Bên cạnh đó, một phân tử nữa bị ức chế bởi sự thiếu hụt tryptophan đó là yếu tố
điều khiển chuyển hóa mTOR, đây là phân tử đích của sự điều hòa bởi enzym kinase 1
phụ trách điều khiển sự nhận biết amino axit (GLK1). Sự thiếu hụt tryptophan cục bộ
có thể khóa GLK1, dẫn đến sự ức chế mTORC1, một phức hợp protein có nhiệm vụ
kiểm soát quá trình tổng hợp protein trong tế bào và cũng đủ để gây ra sự chết tế bào.
IDO ức chế mTORC1 như các rapamycin kích hoạt quá trình autophagy và làm mất khả
năng gây độc tế bào của các tế bào T. Thông thường autophagy được định nghĩa là quá
3


trình tái cấu trúc lại tế bào, loại bỏ những phần không cần thiết hoặc những phần bị mất
chức năng của tế bào, dẫn đến sự chết của các tế bào già và phục hồi các tế bào còn
sống, tuy nhiên trong một số bệnh, autophagy có vẻ như kích thích sự chết của các tế

bào hoặc trong một số trương hợp nó giúp tế bào sinh tồn và đáp ứng lại các bất lợi của
môi trường [10].
Thứ ba, sản phẩm trung gian chuyển hóa của tryptophan bởi enzym IDO là
kynurenin, là một phối tử nội sinh của thụ thể aryl hydrocacbon (AhR). AhR là yếu tố
tham gia vào quá trình dịch mã được hoạt hóa bới phối tử, nó đáp ứng với các chất độc
ngoại sinh như dioxin và liên quan tới quá trình phát triển phôi, đột biến và sự hình thành
khối u. Kynurenin (KYN) liên kết với AhR là điều kiện cần thiết để kích hoạt sự biệt
hóa các tế bào Tregs (tế bào T điều hòa) những tế bào có trách nhiệm trong việc ức chế
miến dịch chống lại các khối u Sự hoạt hóa của các thụ thể AhR giúp các tế bào ung
thư tạo ra một “chương trình” viêm đáp ứng với mầm bệnh tại môi trường xung quanh
đó giúp nó có thể thoát khỏi sự giám sát của hệ thống miễn dịch. Tín hiệu từ AhR được
giải thích cho sự tương tác giữa hệ miễn dịch, độc tố và sự phát triển của tế bào ung thư.
Cũng có thể giải thích cho việc tại sao sự tiêu thụ tryptophan giúp hình thành chương
trình gây viêm đáp ứng với yếu tố bệnh sinh nhằm che mắt sự giám sát miễn dịch của
cơ thể đối với sự tồn tại của tế bào ung thư và sự phát triền thành các tế bào ác tính [15].
Muller và các cộng sự [11] đã chỉ ra rằng vai trò của IDO trong nhiều cơ chế
bệnh sinh là phức tạp hơn so với giả thiết IDO hoạt động như một tác nhân điều biến hệ
miễn dịch, họ cho rằng IDO đã tạo ra môi trường viêm thuận lợi cho sự phát triển và di
căn của tế bào ung thư.
Trước đó vào năm 1996, Sakamuro cũng nhóm nghiên cứu đã phát hiện ra sự mất
kiểm soát trong hoạt động của IDO tại các khối u do gen Bin1 (Bridging integrator 1)
[20]. Bin 1 là một protein tương tác với c-myc, ức chế tế bào ung thư thông qua tương
tác với nguyên tử N cuối trong cấu trúc của c-Myc protein nhằm ngăn chặn các tác động
gây đột biến hoặc sự biểu hiện gen do protein này gây ra. Dữ liệu thu nhập được từ các
quan sát trên lâm sàng chỉ ra rằng sự thiếu hụt của Bin 1 và sự biển hiện quá mức của
IDO xuất hiện trong rất nhiều loại ung thư như ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung
thư da, ung thư nguyên bào thần kinh và có liên quan tới những tiên lượng xấu trong
lâm sàng ở các bệnh nhên có sự di căn trên diện rộng [6]. Bin1 có thể ngăn chặn sự phát

4

triển không kiểm soát và giảm thiểu sự trốn tránh với hệ thống miễn dịch của các tế bào
khối u thông qua tác dụng điều hòa ức chế hoạt động của enzym IDO.
1.3. Liên quan cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế IDO1
1.3.1. Cấu trúc của enzym
Cấu trúc tổng thể của IDO (hình 1.2) bao gồm hai chuỗi có cấu trúc khác biệt nhau
(chuỗi lớn và chuỗi bé). Chuỗi lớn có cấu trúc xoắn toàn bộ bao gồm 13 cấu trúc xoắn
alpha và 2 cấu trúc xoắn bậc 3. Bốn đoạn xoắn polypeptid của chuỗi lớn (C, I, Q và S)
chạy song song với mặt phẳng nhân hem và tương tác với các cấu trúc xoắn xung quanh
bằng tương tác kị nước.

Hình 1.2. Cấu trúc của enzym IDO
Chuỗi Q cung cấp một phối tử nội sinh cho nguyên tử sắt của nhân hem tại vị trí
histamin 346 (hình 1.3). Pocket xung quanh phân tử hem được tạo bởi 4 chuỗi này và 2
chuỗi xoắn khác (K-L và N). Các chuỗi bên K-L và N cũng đóng góp một phần vào
tương tác với nhân hem cũng như tạo thành cầu nối liên kết hai chuỗi bên. Một vòng dài
giúp liên kết hai chuỗi và chuỗi bé bao phủ đỉnh của của pocket chứa hem. Chuỗi bé có
chứa sáu cấu trúc xoắn alpha, hai cấu trúc gấp nếp beta và ba cấu trúc xoắn 310. Liên kết
giữa hai chuỗi tạo thành bởi các tương tác kị nước, cầu muối, liên kết hydro bởi các
nhóm chức trên các phân tử amino axit của các chuỗi.

5


Hình 1.3. Cấu trúc của phức hợp IDO-phenyl imidazol (PI)
1.3.2. Môi trường nhân hem
Hình 1.4 minh họa tương tác giữa phenyl imidazol (1 chất có khả năng ức chế
enzym IDO) với trung tâm hoạt động của enzym này.
Nhóm 6-propionat của nhân hem tương tác với nhóm guanidin của phân tử arginin

343 và phân tử nước số (hình 1.4). Ngoài ra phân tử nước 2 cũng hình thành liên kết
hydro với phân tử nước số 1 và nhóm carbony của phân tử amino axit leucin 388. Một
nghiên cứu đột biến chuỗi bên [22] đã chỉ ra rằng phân tử axit amin aspartic 274 đóng
vai trò quan trọng trong quá trình xúc tác cho phản ứng oxy hóa của nhân hem. Tuy
nhiên, phân tử này lại nằm tại chuỗi gần đó, tạo một cầu liên kết giữa nhóm carbonyl và
nhóm guanidine của phân tử arginin 343, đồng thời phần nào đó cũng ảnh hưởng tới
nhóm 6 propionat của nhân hem. Vì thế, sự giảm khả năng hoạt động của enzym xuất
phát từ sự đột biến của phân tử aspartic 274 này dẫn đến sự không ổn định của vị trí
định vị của nhân hem tại vị trí hoạt động của enzym

6


Hình 1.4. Tương tác giữa nhân hem và phenyl imiadazol (PI)
Quan sát các chuỗi polypeptit xung quanh môi trường nhân hem, người ta chỉ ra
rằng nguyên tử N của phân tử imidazol thuộc phân tử histidine số 346 mang một phần
bản chất là anion. Nó cũng phù hợp với dữ liệu phổ Rahman đưa ra là tần số của liên kết
giữa sắt và phổi tử imidazol là 231 cm-1 [23]. Trong khi đó, đối với phối tử imidazol
trung hòa trong phân tử myoglobin trị số này là 220 cm-1 và với phổi tử imidazol mang
điện tích âm trong enzym peroxidase là 248 cm-1. Nhóm 7-propionat của phân tử hem
hướng lên phía trên từ mặt phẳng hem để tương tác với nhóm chức hydroxyl của phân
tử serin 263.
Để đánh giá sự liên quan của các nhóm chức không tham gia liên kết peptit của
các phân tử amino axit trên chuỗi polypeptit đối với sự xúc tác cho phản ứng oxy hóa
của enzym này, Hiroshi sugimoto và các cộng sự đã tiến hành đột biến để thay thế các
amino axit tồn tại xung quanh túi chứa nhân hem [22]. Kết quả đột biến các axit amin
phân cực (Serin 167A, Cystein 129A và Serin 263A) chỉ ra rằng hoạt tính dioxygenase
của enzym vẫn được bảo toàn. Khi tiến hành đột biến với axit amin S263A, hoạt tính
của enzym giảm nhẹ khoảng 15%, lí do được đưa ra là chuối bên chứa axit amin serin
263 có vẻ tương tác với nhóm 7-propionat của nhân hem giúp duy trì độ ổn định về vị

trí của nhân hem.

Ngược lại, sự đột biến trong cấu trúc đối với 3 axit amin là

phenylalanin 226, 227 và phân tử arginin 231 đã làm giảm mạnh hoạt tính dioxygenase
của enzym này. Giả thiết được đưa ra là các axit amin phenylalanin 226 và arginin 231
7


trực tiếp liên quan tới sự nhân diện cơ chất của enzym thông qua tương tác kị nước. Hơn
nữa nhóm phenyl của axit amin phenylalanin 227 cũng hình thành tương tác cation-π
với nhóm guanidin của axit amin arginin 231, từ đó nó cũng phần nào ảnh hưởng tới sự
nhận diện cơ chất đối với enzym này thông qua sự ổn định về vị trí và hình dạng đối với
phân tử amino axit arginin 231. Một điều đáng chú ý nữa là sự đột biến của phenylalanin
163A không ảnh hưởng tới hoạt động cũng như vị trí xung quanh khác, mặc dù có sự
tồn tại tương tác π-π với phân tử phenyl imidazol trong cấu trúc phức hợp của PI-IDO.
1.3.3. Liên quan cấu trúc và tác dụng ức chế IDO1
Roehrig và các cộng sự đã mô phỏng liên kết của các chất ức chế IDO với enzym
IDO1 đã biết dựa trên thuật toán EA Dock và đưa ra mô hình dược lý để kiểm tra khả
năng ức chế IDO của các phân tử mới [19]. Dựa trên các kết quả thu nhập được từ mô
hình liên kết giữa IDO1 và các phối tử của nó, họ đưa ra kết luận là một phân tử lí tưởng
có khả năng ức chế hoạt động của enzym này cần phải có những đặc tính sau:
-

Phải có một hệ vòng thơm với ít nhất hai vòng để khớp vừa với cấu trúc của
pocket A, hầu hết các chất ức chế IDO1 đều tuân theo quy tắc này.

-

Phải có một nguyên tử với cặp electron tự do (O, S hoặc N) tạo liên kết phối trí

với nguyên tử Fe trong nhân hem.

-

Phải tồn tại hợp phần có thể tạo được tương tác van der waals với vị trí liên kết
của pocket B

-

Phải có nhóm chức để tạo được liên kết hydro phân tử axit amin serin167, arginin
231 hoặc nhóm 7-propionat của nhân hem.
Vào năm 2012, Smith cùng cộng sự [21] đã tổng hợp được 18 dẫn chất và thử hoạt

tính in vitro. Kết quả cho thấy phân tử số 1 (IC50: 20µM) có nhóm ester và imidamid
liên kết hai hệ vòng thơm với nhau có tương tác rất mạnh với các axit amin trong trung
tâm hoạt động của enzym IDO1 so với nhiều chất ức chế IDO1 có cấu trúc đơn giản đã
được phát hiện ra tính đến thời điểm đó.
Khi phân tích các mảnh có tiềm năng ức chế enzym IDO1, bao gồm cả những phân
tử không xác định dựa trên cấu trúc enzym, nhận thấy 2-hydrazin benzothiazol (2) và
phenyl hydrazin (3) có khả năng ức chế IDO1 mạnh. Cả hai phân tử này đều tạo liên kết
phối trí với nguyên tủ sắt của nhân hem thông qua nhóm chức hydrazin. Việc định lượng
enzym chỉ ra rằng liên kêt phối trí này là đủ cho sự ức chế IDO1 và nhóm benzothiazol

8


ít thích hợp cho khả năng ức chế IDO, có lẽ do nó cạnh tranh với hydrazin khi tương tác
với nhân hem.
Căn cứ trên sự đồng kết tinh của IDO với PI (Phenyl imidazol), nhóm nghiên cứu
của Huang [4] đã khám phá ra vòng 1H-1,2,3-triazol có thể là những tác nhân ức chế

IDO tiềm năng. Khung triazol có cấu trúc gần như tương tự với khung imidazol, một
dãy các chất có cấu trúc 1,2,3-triazol đã được tổng hợp cho hiệu quả cao trong việc ức
chế enzym IDO1, chất (4) cho hiệu quả ức chế IDO1 với giá trị IC50 là 86 µM. Nghiên
cứu docking chỉ ra rằng nhóm thế aryl ở vị trí số 4 không nên quá cồng kềnh và sự có
mặt của nhóm hút điện tử gần vị trí nhóm NH là điều kiện tiên quyết cho hoạt tính ức
chế IDO1.

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của các chất từ 1 đến 4
1.3.4. Một số dẫn chất indazol có tiềm năng ức chế IDO1
Hai chất mang nhóm thế bromo ở vị trí số 6 của indazol do 2 nhóm nghiên cứu độc
lập của Qian và Yang tổng hợp có khả năng ức chế IDO1 ở ngưỡng μM (5, IC50 = 5,3
μM; 6, IC50 = 0,74 μM, hình 1.6) [18], [29].Nhóm nghiên cứu của Qian cho rằng việc
hình thành liên kết kỵ nước giữa nhóm thế halogen ở vị trí số 6 với các axit amin thân
dầu của IDO1 làm tăng khả năng liên kết và ức chế enzym của các dẫn chất này. Dựa
vào phân tích cấu trúc-tác dụng của phức hợp chất ức chế IDO1, nhóm tác giả kết luận
nhóm thế halogen ở vị trí số 6 trên khung indazol đóng vai trò quan trọng đối với hoạt
tính ức chế IDO1 [18].

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của các chất số 5 và 6
1.4. Các phản ứng đã thực hiện
9


1.4.1. Phản ứng amin hóa khử
1.4.1.1. Phương trình và cơ chế phản ứng

Sơ đồ 1.1. Phương trình phản ứng amin hóa khử
Alkyl hóa các amine theo con đường amin hóa khử là một phương pháp tiện lợi để
hình thành liên kết N-C, quá trình này liên quan đến sự chuyển hóa của amin thành imin
và khử hóa imin.

Trong khi các phương pháp alkyl hóa khác như sử dụng các alkyl halogenid thiếu
đi tính chọn lọc vì sự alkyl hóa nhiều lần amin có thể xảy ra trong hỗn hợp phản ứng thì
trung gian imin được tạo ra theo con đường amin hóa khử giúp cho quá trình alkyl hóa
amin bậc 1 chọn lọc thành amin bậc 2 tương ứng.
Tác nhân alkyl hóa sử dụng có thể là aldehyd hoặc ceton, imin được tạo thành được
khử bởi natri cyanoborohydrid hoặc natri triacetoxyborohydrid. Trong thực tế,
NaBH3CN được đánh giá tốt hơn chút ít so NaBH4.

Sơ đồ 1.2. Cơ chế của phản ứng amin hóa khử

10


Cơ chế của phản ứng amin hóa khử bao gồm ba giai đoạn chính như sau:
- Giai đoạn 1: Trong môi trường axit yếu, imin được tạo thành thông qua phản ứng của
một amin no với nhóm carbonyl, đây là phản ứng cộng hợp ái nhân vào nhóm amin. Sự
có mặt của axit proton như là một xúc tác, proton hóa nguyên tử oxy giúp tác nhân
proton tấn công dễ dàng hơn
- Giai đoạn 2: Imin được tạo thành trao đổi proton với môi trường tạo thành dạng axit
liên hợp của nó, đây là một cân bằng hóa học.
- Giai đoạn 3: Hợp chất imin rất kém bền, đặc biệt là các imin mạch hở. Chúng dễ dàng
bị khử hóa trong môi trường có mặt natri bocyanohydrid để tạo thành amin tương ứng.
1.4.1.2. Các lưu ý
Trong phương pháp trên, ta không nên sử dụng NaBH4 vì lí do chúng có thể phản
ứng với các aldehyd và ceton là các tác nhân alkyl hóa sử dụng trong phản ứng, nhìn
chung hiệu suất phản ứng sẽ kém và ít chọn lọc hơn nếu sử dụng NaBH4. Đó là lí do tại
sao NaBH3CN, một tác nhân khử yếu hơn nếu so với NaBH4 lại được sử dụng.
Một lưu ý nữa là môi trường phản ứng nên có tính axit yếu, vì khi đó nhóm
carbonyl được proton hóa giúp gia tăng tốc độ của phản ứng, tuy nhiên nếu độ axit của
môi trường quá cao, các amin có thể bị proton hóa làm mất đi tính nucleophin của chúng.

1.4.2. Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm
Khử hóa là quá trình làm giảm số oxy hóa của chất đem khử thông qua quá trình
cho nhận điện tử giữa chất oxy hóa và chất khử. Thông thường, các phản ứng khử hóa
là các phản ứng làm đưa thêm nguyên tử hydro vào chất đem khử và ngược lại, phản
ứng oxy hóa là các phản ứng đưa thêm nguyên tử oxy vào chất đem khử.Trong hóa học
hữu cơ, các phản ứng khử hóa được sử dụng rất phổ biến với các tác nhân, điều kiện
phản ứng, dung môi, xúc tác rất đa dạng. Dựa vào bản chất các tác nhân khử hóa, người
ta có thể chia phản ứng khử thành ba loại:
-

Hydro phân tử. Ví dụ: tác nhân H2, xúc tác paladi/cacbon.

-

Kim loại hoặc muối của chúng trong môi trường axit. Ví dụ: Zn/HCl hoặc
AcOH.

-

Khử hóa bằng phương pháp điện hóa.

1.4.2.1. Khử hóa nhóm amin thơm với tác nhân hydro phân tử
11


Sơ đồ 1.3. Khử hóa nhóm nitro thơm với tác nhân hydro phân tử
Ở điều kiện thường, hydro phân tử ít có khả năng phản ứng. Khi tiếp xúc với xúc
tác, hydro được hoạt hóa và có khả năng tham gia phản ứng. Do đó, phản ứng hydro
hóa bao giờ cũng cần xúc tác. Độ hoạt hóa của các chất xúc tác được thể hiện bằng
lượng hydro hấp phụ trên một đơn vị khối lượng. Xúc tác có thể sử dụng riêng hoặc

được đưa lên một chất mang để giảm giá thành với các xúc tác là kim loại quý.
Niken là xúc tác sử dụng phổ biến nhất, có thể sử dụng một mình hoặc đưa lên
chất mang. Ni-Raney thường được sử dụng do độ hoạt hóa tốt. Một gam xúc tác NiRaney có thể hấp phụ 25-150 cm3 khí H2. Ni-Raney có thể dùng để hydro hóa các alken,
ceton, nitril và các hợp chất thơm.
Bột đồng có thể sử dụng để khử các hợp chất nitro thơm do không làm ảnh hưởng
tới nhân thơm. Có thể sử dụng một mình hoặc cùng chất mang. Hỗn hợp Cu-cromit là
xúc tác có giá trị thực tế lớn, có thể hydro hóa các ester và amid. Phản ứng khử với
xúc tác này được tiến hành ở điều kiện áp suất, nhiệt độ trên 100oC.
Các kim loại quý như palladi, platin cũng có thể sử dụng để khử hóa nhiều nhóm
chức. Các tác nhân này có giá thành cao nên thường được trộn với chất mang như than
hoạt tính, trong đó hàm lượng kim loại thường từ 3-10%. Platin và Palladi có thể khử
hóa hầu hết nhóm chức trừ axit carboxylic, amid và ester. Hoạt tính của palladi yếu hơn
platin khi dùng để khử ceton mạch thẳng và nhân thơm. Ưu điểm của các kim loại quý
là có thể tiến hành phản ứng ở nhiệt độ thấp hơn nhiều so với Ni và Cu, do đó hạn chế
được phản ứng dehydro hóa không mong muốn
1.4.2.2. Khử hóa nhóm nitro thơm với tác nhân kim loại trong axit
Có rất nhiều tác nhân khử hóa nhóm nitro thơm thuộc nhóm này, có thể kể đến như
Fe/HCl, Sn/HCl, Zn/AcOH…Trong đó tác nhân sắt trong axit hydrochloric và muối
thiếc (II) chlorid trong axit hydrochloric được sử dụng phổ biến hơn cả. Trong công
nghiệp, tác nhân được sử dụng nhiều nhất đó là sắt trong môi trường axit được và biết
đến với tên gọi phản ứng bechamp.

12


Sơ đồ 1.4. Phản ứng bechamp
Phản ứng cho hiệu quả cao khi sử dụng bột gang xám, do hình thành cặp pin điện
hóa giúp thúc đẩy quá trình trao đổi điện tử trong phản ứng.
Thiếc trong HCl có tính chọn lọc cao, khả năng khử tốt nên được ưa chuộng sử
dụng trong các phòng thí nghiệm, tuy nhiên, thiếc có giá thành tương đối cao nên ít được

sử dụng trong công nghiệp.
1.4.2.3. Khử hóa nhóm nitro thơm bằng phương pháp điện hóa

Sơ đồ 1.5. Khử hóa p-nitro benzen bằng phương pháp điện hóa
Trong môi trường axit yếu, nitro benzen bị khử hóa thành anilin, ngược lại sự có
mặt của các axit mạnh như H2SO4 đặc khiến phản ứng chuyển dịch theo chiều tạo ra 4amino phenol.

13


CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu
Các dung môi, hóa chất dùng trong tổng hợp hóa học chủ yếu có nguồn gốc xuất
xứ từ hãng Merck (Đức), AKSci (Mỹ) và Trung Quốc. Các hóa chất này được sử dụng
trực tiếp không qua tinh chế và được trình bày trong Bảng 2.1 dưới đây:
Bảng 2.1. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu
TT

Tên nguyên liệu

Nguồn gốc – Xuất xứ

1

6-Nitro-1H-indazol

Trung Quốc

2

Aceton

AKSci - Mỹ

3

Cyclohexanon

AKSci - Mỹ

6

Benzaldehyd

AKSci - Mỹ

7

4-flourobenzaldehyd

AKSci - Mỹ

8

3-flourobenzaldehyd

AKSci - Mỹ

9

Celite

AKSci - Mỹ

10

Ethyl acetat (EA)

Trung Quốc

11

n-hexan

Trung Quốc

12

Methanol (MeOH)

Trung Quốc

14

Axit acetic (AcOH)

Trung Quốc

15

Dicloromethan (DCM)

Trung Quốc

16

NaBH3CN

Trung Quốc

17

NaCl

Trung Quốc

18

NaHCO3

Trung Quốc

19

MgSO4

Trung Quốc
14

20

Nước cất

Việt Nam

21

10% Pd/C

Merck - Đức

22

Bản mỏng Silicagel 60 F254

Merck - Đức

2.1.2. Thiết bị nghiên cứu
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn (1 cổ dung tích 25 mL, 1 cổ dung tích 50
mL, 2 cổ dung tích 100 mL), bình chịu áp Sigma-Aldrich, sinh hàn, pipet chia vạch,
bình định mức, cốc thủy tinh, phễu lọc, phễu Buchner, bình nón, bình chiết, ống đong…
- Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật Bản).
- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC (Đức).
- Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ).
- Máy cất quay Buchi R-210 (Thụy Sĩ).
- Tủ sấy Memmer (Đức).
- Máy sinh khí Hydro PH200 (Mỹ) tại Bộ môn Hóa Dược- Trường Đại học Dược

Hà Nội.
- Thiết bị Hydrogen hóa 3911-PAR (Mỹ) tại Bộ môn Hóa Dược- Trường Đại học
Dược Hà Nội.
- Sắc kí lớp mỏng (TLC): được tiến hành trên bản mỏng silicagel Kieselgel 60
F254 (Merck).
- Đèn tử ngoại với hai bước sóng 254 nm và 365 nm.
- Bình sắc kí.
- Cột chạy sắc kí.
-Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện MPA 120 (Mỹ) tại Bộ môn Hóa hữu cơTrường Đại học Dược Hà Nội.
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 MHz với
Tetramethylsilan (TMS) làm chất chuẩn nội hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Khoa
Hóa học- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội. Máy đo phổ
cộng hưởng từ hạt nhân tần số 300 MHz tại Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc.
- Máy đo phổ khối lượng LTQ- Orbitrap hãng Thermo- Scientific (Mỹ) tại Khoa
Hóa học- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội.

15