Phân Lập Vi Khuẩn Khử Đạm Từ Nước Thải Nhà Máy Sữa Và Các Trại Chăn Nuôi Bò Sữa
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.33 MB, 48 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
PHÂN LẬP VI KHUẨN KHỬ ĐẠM TỪ NƯỚC THẢI
NHÀ MÁY SỮA VÀ CÁC TRẠI CHĂN NUÔI BÒ SỮA
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGs.Ts. CAO NGỌC ĐIỆP
SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGÔ MỸ NGÂN
MSSV:3064464
LỚP:CNSH K32
Cần Thơ, Tháng 5/2010
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên)
(ký tên)
PGs.Ts. Cao Ngọc Điệp
Ngô Mỹ Ngân
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………...
Cần Thơ, ngày tháng
năm 2010
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)
LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn:
PGs.Ts. Cao Ngọc Điệp đã tận tình hướng dẫn và cho những lời khuyên hết sức quý
báu, bổ ích trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.
Cô Trần Thị Xuân Mai, cố vấn học tập lớp Công nghệ sinh học khóa 32 đã luôn quan
tâm, động viên và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng
như trong thời gian thực hiện đề tài.
Quý Thầy, Cô giảng dạy chương trình đại học Công nghệ sinh học khóa 32, trường
Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cần thiết trong suốt
quá trình tôi theo học tại trường.
Anh Bùi Thế Vinh, nghiên cứu sinh tại Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh
học, trường Đại học Cần Thơ đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt
luận văn này.
Cán bộ phòng thí nghiệm vi sinh vật của Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ
sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực hiện thí nghiệm.
Xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến sự quan tâm và giúp đỡ quý báu này.
Sinh viên thực hiện
Ngô Mỹ Ngân
TÓM TẮT
Ô nhiễm đạm là vấn đề đang được quan tâm trong xử lý môi trường hiện nay.
Hàm lượng ammonia, nitrate trong nước thải cao ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ
thủy sinh động, thực vật và sức khỏe con người. Hiệu quả của quá trình loại bỏ
nitrogen bằng vi khuẩn khử đạm đã được chứng minh qua nhiều nghiên cứu trong và
ngoài nước. Vì vậy, đề tài “ Phân lập vi khuẩn khử đạm từ nước thải nhà máy sữa và
các trại chăn nuôi bò sữa” được thực hiện.
Bốn mươi bảy dòng vi khuẩn khử đạm được phân lập từ mẫu chất thải lỏng và
rắn của các nhà máy sữa, trại chăn nuôi bò sữa ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu
Long (ĐBSCL). Khảo sát trên môi trường tối thiểu có bổ sung NH4+, NO2-, NO3- với
nồng độ từ 100-700mM, kết quả nhận được cả 47 dòng vi khuẩn đều có khả năng oxy
hóa ammonium và khử nitrate. Ở nồng độ 100mM, 47/47 dòng phát triển được trên cả
hai môi trường bổ sung NH4+, NO3-, 11/47 dòng vi khuẩn phát triển trên môi trường
bổ sung NO2-. Ở nồng độ 700mM, có 5/47 dòng có khả năng oxy hóa ammonium và
15/47 dòng có có khả năng khử nitrate.
Từ khóa: ammonium, chu trình nitơ, nitrite, nitrate, nước thải nhà máy sữa, vi khuẩn
khử đạm.
i
MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT.............................................................................................
LỜI CẢM TẠ .....................................................................................................
TÓM TẮT.......................................................................................................... i
MỤC LỤC ........................................................................................................ ii
DANH SÁCH BẢNG....................................................................................... iv
DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................ v
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU ............................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................. 2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................... 3
2.1. Chu trình nitơ .................................................................................................. 3
2.2. Vi khuẩn khử đạm........................................................................................... 5
2.3. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn khử đạm trên thế giới và trong nước ......... 6
2.3.1. Những nghiên cứu vi khuẩn khử đạm trên thế giới ..................................... 6
2.3.2. Những nghiên cứu vi khuẩn khử đạm trong nước ........................................ 9
Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 11
3.1. Phương tiện nghiên cứu ................................................................................ 11
3.1.2. Nguyên vật liệu ......................................................................................... 11
3.1.1.. Dụng cụ, thiết bị ...................................................................................... 11
3.1.3. Hóa chất ................................................................................................... 12
3.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 13
3.2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ...................................................... 13
ii
3.2.2. Phương pháp phân lập .............................................................................. 13
3.2.3. Khảo sát khả năng oxy hóa ammonium và khử nitrite, nitirate .................. 15
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 17
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn từ chất thải trại chăn nuôi bò sữa tại các tỉnh,
thành ở ĐBSCL, trạm thu mua sữa TP.HCM và mẫu nước thải từ nhà máy sữa
Vinamilk ............................................................................................................... 17
4.1.1. Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn ......................................................... 17
4.1.2. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập .................................................... 18
4.1.3. Đặc điểm các dòng vi khuẩn đã phân lập .................................................. 20
4.2. Kết quả khảo sát khả năng oxy hóa ammonium, khử nitrite và nitrate của
các dòng vi khuẩn phân lập ................................................................................. 24
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..................................................... 36
5.1. Kết luận.......................................................................................................... 36
5.2. Đề nghị ........................................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 37
PHỤ LỤC............................................................................................................
iii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1: Thành phần hoá chất pha chế môi trường Minimal phân lập vi khuẩn ........ 12
Bảng 3.2: Thành phần môi trường Minimal bổ sung Nitrate, Nitrite và Ammonium
100mM ...................................................................................................................... 16
Bảng 4.1: Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn từ chất thải trại chăn nuôi bò sữa, trạm
thu mua sữa và nhà máy sữa Vinamilk ....................................................................... 17
Bảng 4.2: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập ...................................................... 18
Bảng 4.3: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn phân lập ................................... 20
Bảng 4.4: Tỷ lệ phần trăm về hình dạng và khả năng chuyển động của 47 dòng vi
khuẩn phân lập........................................................................................................... 23
Bảng 4.5: Tỷ lệ phần trăm về các đặc điểm khuẩn lạc của 47 dòng vi khuẩn phân lập 24
Bảng 4.6: Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung
NH4+, NO2-, NO3- ở 100mM ...................................................................................... 25
Bảng 4.7: Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung
NH4+, NO3- ở 200mM ................................................................................................ 27
Bảng 4.8: Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung
NH4+, NO3- ở 300mM ................................................................................................ 29
Bảng 4.9: Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung
NH4+, NO3- ở 400mM, 500mM và 600mM ................................................................ 31
Bảng 4.10: Khả năng phát triển của các dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ
sung NH4+, NO3- ở 700mM…………………………………………………………...35
iv
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Chu trình nitơ ............................................................................................... 3
Hình 3.1: Một số dụng cụ, thiết bị thí nghiệm ............................................................ 12
Hình 3.2: Mẫu chất thải lỏng và mẫu chất thải rắn ..................................................... 13
Hình 3.3: Mẫu trải phát triển trên môi trường Minimal .............................................. 14
Hình 3.4: Khuẩn lạc sau khi cấy chuyển .................................................................... 14
Hình 3.5: Khuẩn lạc ròng được trữ trong môi trường Minimal ................................... 15
Hình 4.1: Khuẩn lạc một số dòng vi khuẩn phát triển trên môi trường Minimal ......... 22
Hình 4.2a: Sự phát triển của một số dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung
500mM NH4+ ............................................................................................................. 33
Hình 4.2b: Sự phát triển của một số dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung
500mM NO3- ............................................................................................................. 34
Hình 4.3a: Sự phát triển của một số dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung
600mM NH4+ ............................................................................................................. 34
Hình 4.3b: Sự phát triển của một số dòng vi khuẩn trên môi trường tối thiểu bổ sung
600mM NO3- ............................................................................................................. 34
v
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Từ lâu, sữa là thực phẩm thiết yếu hàng ngày của người tiêu dùng ở nhiều nước
trên thế giới. Tại Việt Nam, những năm gần đây do điều kiện kinh tế phát triển, thu
nhập người dân tăng lên nên nhu cầu tiêu dùng cũng tăng theo, trong đó có nhu cầu
tiêu dùng sữa. Tuy nhiên, sản lượng sữa hiện nay không đáp ứng đủ nhu cầu tiêu dùng
trong nước. Vì vậy, ngành chăn nuôi bò sữa hiện đang được khuyến khích phát triển
nhằm đáp ứng nhu cầu này. Theo số liệu thống kê của Tổng cục Thống kê về số lượng
bò sữa và sản lượng sữa năm 2008, tổng số đàn bò sữa Việt Nam hiện đã lên đến
107.983 con, sản lượng sữa đạt 262.160 tấn nhưng chỉ mới đáp ứng khoảng 25% nhu
cầu sữa trong nước ( />5&dmtk=9).
Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng có truyền thống và có điều kiện
chăn nuôi bò nhưng lại chậm phát triển. Từ năm 2000 tới nay, nhờ chương trình phát
triển bò sữa quốc gia (theo quyết định 167/QĐT.Tg của Thủ tướng ngày 26/10/2001),
đã tạo ra sự chuyển biến mạnh mẽ về vị trí con bò nói chung, bò sữa nói riêng trong
sản xuất nông nghiệp. Một số tỉnh đang dẫn đầu về đàn bò sữa tại ĐBSCL như Long
An, Tiền Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp,... đã và đang có nhiều dự án khuyến khích phát
triển đàn bò sữa trong nông dân giúp họ làm giàu, cải thiện đời sống
( />Song song với hiệu quả kinh tế mà các dự án này mang lại có một vấn đề rất
đáng được quan tâm là tình hình ô nhiễm môi trường do các trại chăn nuôi bò sữa gây
ra. Những trại chăn nuôi bò quy mô lớn cũng như các hộ chăn nuôi gia đình mỗi ngày
đang thải vào môi trường một lượng lớn chất thải dạng rắn, lỏng và khí không thân
thiện với môi trường sống. Quản lý những chất thải này không tốt sẽ ảnh hưởng trực
tiếp đến sự trong sạch của không khí, nguồn nước và lan truyền dịch bệnh cho chính
những người chăn nuôi và những người sống lân cận. Đáng chú ý nhất là ô nhiễm
nguồn nước vì các ô nhiễm từ đất, không khí đều có thể làm ô nhiễm nước. Một báo
cáo toàn cầu được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công bố cho thấy, mỗi năm Việt Nam
có hơn 20.000 người tử vong do điều kiện nước sạch và vệ sinh thấp kém.). Còn theo
thống kê của Bộ Y tế, hơn 80% các bệnh truyền nhiễm ở nước ta liên quan đến nguồn
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
1
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
nước. Người dân ở cả nông thôn và thành thị đang phải đối mặt với nguy cơ mắc bệnh
do môi trường nước đang ngày một ô nhiễm trầm trọng ( />?option=com_content&view=section&layout=blog&id=9&Itemid=187&lang=vi&limitstart=
42).
Vì vậy, việc xử lý chất thải góp phần giảm thiểu tác hại của ô nhiễm nước đang
là mối quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu môi trường. Nguyên tắc cơ bản của
xử lý môi trường là loại bỏ các chất độc hại và nguồn chất hữu cơ có trong chất thải.
Tầm quan trọng của việc loại bỏ các vật chất hữu cơ trong chất thải, đặc biệt là nước
thải, liên tục được nhấn mạnh qua nhiều nghiên cứu và điều luật môi trường. Một
trong hai chỉ tiêu chính trong nước thải được quy định là nitơ tổng số (Toet et al.,
2005; Joeng et al., 2006; Zhang et al., 2008). Nitrate (NO3-) hòa tan dễ dàng trong
nước. Nước có nồng độ nitrate cao sẽ gây nên hiện tượng phú dưỡng làm một số loài
tảo, rong rêu phát triển quá mức. Các loài rong rêu sẽ chiếm lấy và làm giảm oxy trong
nước, phá hủy hệ thủy sinh động vật. Hơn nữa khi vào cơ thể con người nitrate có thể
biến đổi thành nitrit (NO2-), một hợp chất gây ung thư. Trong tự nhiên, quá trình khử
đạm được xem là then chốt của chu trình nitơ. Quá trình này được ứng dụng trong xử
lý nước thải và được xem là một cách loại trừ ammonium, nitrate hiệu quả nhờ vào
hoạt động của một số dòng vi khuẩn khử đạm (denitrifying bacteria). Biện pháp xử lý
bằng vi sinh vật này được chú ý đặc biệt do hiệu quả xử lý cao và ít tốn chi phí. Để xử
lý triệt để cần phải có sự phối hợp hoặc hoạt động nối tiếp của nhóm vi khuẩn nitrate
hóa (oxy hóa ammonium thành nitrate) và vi khuẩn khử nitrate (khử nitrate thành NO,
NO2 và N2) (Lee et al., 2002).
Với mục tiêu tìm kiếm các dòng vi khuẩn có khả năng khử đạm cao có thể ứng
dụng trong xử lý nước thải từ trại chăn nuôi bò sữa và nhà máy sữa, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài “Phân lập vi khuẩn khử đạm từ nước thải nhà máy sữa và các
trại chăn nuôi bò sữa”.
1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập được một số dòng vi khuẩn khử đạm từ nước thải trại chăn nuôi bò sữa
và nhà máy sữa. Khảo sát khả năng oxy hóa ammonium, khử nitrite và khử nitrate của
những dòng vi khuẩn phân lập trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
2
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Chu trình nitơ
Nitơ giữ một vai trò quan trọng trong đời sống của các sinh vật. Nitơ là thành
phần thiết yếu của protein; axit nucleic DNA và RNA; trong các enzyme; tham gia cấu
tạo các hợp chất dự trữ năng lượng ADP và ATP… Trong tự nhiên nitơ tồn tại ở 2
dạng:
- Dạng tự do: nitơ trong không khí.
- Dạng hợp chất: dạng vô cơ (NH4+, NO3-,…), dạng hữu cơ (acid amin, protein,…).
Hình 2.1: Chu trình nitơ
(Nguồn: />
Các dạng nitơ trên chuyển hóa nhờ vào hoạt động của sinh vật tạo nên chu trình
nitơ trong tự nhiên bao gồm các quá trình cơ bản sau:
- Quá trình cố định nitơ ( Nitrogen fixation):
Khí nitrogen là khí chiếm lượng nhiều nhất trong không khí (79%). Tuy nhiên,
hầu hết các sinh vật không có khả năng sử dụng dạng nitơ này vì cầu nối ba hóa trị
giữa hai nguyên tử nitơ làm cho phân tử N2 gần như là một khí trơ. Để sử dụng được,
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
3
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
nitơ phải được "cố định" (kết hợp) dưới hình thức ion ammonium (NH4+) hoặc nitrate
(NO3-). Các vi khuẩn cố định đạm có khả năng tổng hợp các enzyme cắt đứt liên kết ba
giữa hai nguyên tử nitơ của phân tử nitơ trong không khí, chuyển về dạng ammonia
cây trồng hấp thu được.
- Quá trình nitrate hóa (Nitrification):
Sự nitrate hóa là sự chuyển đổi ammonium (NH4+) thành nitrate (NO3-) bằng
hoạt động của các vi sinh vật. Quá trình này được thực hiện bằng hai loại vi sinh vật,
trong hai giai đoạn: chuyển ammonium thành nitrite và chuyển nitrite thành nitrate.
Chuyển ammonium thành nitrite: Việc chuyển ammonium thành nitrite được
thực hiện bởi các vi khuẩn oxi hóa ammonium, các vi khuẩn này được xếp vào nhóm
phụ beta (Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosolobus, và Nitrosovibrio) và gamma
proteobacteria (Nitrosococcus). Nitrosomonas (như loài N. europaea) là loài vi khuẩn
tự dưỡng oxi hóa ammonium thành nitrite thông qua hydroxylamine (NH2OH)
(Purkhold et al., 2003).
Các phản ứng chuyển hóa ammonium thành nitrite:
NH3 + O2 + 2H+
Ammonia monooxygenase
NH2OH + H2O
NH2OH + H2O → NO2 + 5 H+
Phản ứng tổng quát là:
NH3 + 3/2 O2
Hydroxylamine
oxidoreductase
NO2− + H + H2O
+
Việc chuyển nitrite thành nitrate: Việc chuyển nitrite thành nitrate được thực hiện
bởi các vi khuẩn oxi hóa nitrite. Các loài được xếp vào nhóm phụ alpha của
proteobacteria và các loài tự dưỡng bắt buộc ngoại trừ Nitrobacter, loài có thể sinh
trưởng dị dưỡng với sự hiện diện của acetate, formate, hoặc pyruvate (Bitton, 2005).
- Quá trình phản nitrate hóa (Denitrification):
Đây là sự hô hấp hiếm khí trong đó NO3- hay NO2 - là chất nhận điện tử cuối
cùng. NO3- hay NO2- được biến đổi thành nitrite oxide (NO), nitrous oxide (N2O) và
cuối cùng thành khí nitrogen (N2). Quá trình phản nitrate hóa (hay còn gọi là quá trình
khử đạm) làm giảm lượng nitrate, khép kín và hoàn thiện vòng tuần hoàn nitơ.
Quá trình khử đạm được coi như là một tiến trình then chốt trong chu trình nitơ
(Lee et al., 2002). Theo Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thùy Dương (2003),
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
4
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
Schloesing là người đầu tiên phát hiện ra hiện tượng khử nitrate và nitrite thành nitơ
phân tử vào năm 1868.
Quá trình này được xem như là sự tập hợp của sự hô hấp nitrate, nitrite kết hợp
với sự khử nitric oxide và sự hô hấp nitrous oxide (Zumft, 1997):
Nitrate
Nitrite
Nitric oxide
Nitrous oxide
Dinitrogen gas
(NO3- )
(NO2- )
(NO)
( N2O)
(N2)
Dạng phản ứng oxy hóa- khử:
2NO3- + 10e- + 12H+
N2 + 6H2O
Quá trình này được thực hiện bởi các vi khuẩn dị dưỡng như Paracoccus
denitrificans, Thiobacillus denitrificans và những loài Pseudomonas, Clostridium.
Đặc biệt là quá trình ANAMMOX (Anaerobic Ammonium Oxidation-Oxy hóa
ammnium trong điều kiện kỵ khí), ammonium và nitrite sẽ được chuyển đổi trực tiếp
thành nitơ phân tử dưới điều kiện thiếu oxy (Mulder, 1989). Có thể ứng dụng tiến trình
này vào trong xử lý nguồn nước thải giàu nitơ. Toàn bộ phản ứng này là:
NH4+ + NO23NH4+ + 2NO3-
N2 + 2H2O
5
N2 + 6H2O
2
2.2. Vi khuẩn khử đạm
Các vi sinh vật có khả năng khử nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc tác sự
khử nitrate thành nitrite và nitơ phân tử. Đây là cách biến dưỡng năng lượng theo
phương thức hô hấp kỵ khí. Hầu hết các vi sinh vật khử nitrate là những vi sinh vật
hiếu khí tùy ý, chỉ thực hiện quá trình khử nitrate khi môi trường không có sự hiện
diện của oxy phân tử. Sản phẩm cuối cùng của sự khử này có thể là nitrite (NO2-),
ammonia (NH3-), nitơ phân tử (N2), một hydroxylamine (NH2OH) hay nitric oxide
(NO) tùy thuộc vào từng loài vi sinh vật và điều kiện môi trường (Trần Linh Thước,
2003).
Sơ lược về một số vi khuẩn khử đạm:
Pseudomonas aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí gram âm, tồn tại ở dạng đơn, bắt
cặp hoặc tạo chuỗi ngắn, có khả năng di động với một tiêm mao đơn cực. Là vi khuẩn
hiếu khí bắt buộc, nhưng P. aeruginosa có thể phát triển trong môi trường kỵ khí nếu
có NO3- làm chất nhận điện tử, nhiệt độ phát triển tối ưu ở 37oC. Loài này tăng trưởng
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
5
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
được trên môi trường nghèo dinh dưỡng chỉ gồm khoáng và một nguồn carbon thích
hợp duy nhất như acetate, pyruvate, succinate, glucose,… P. aeruginosa có khả năng
thủy giải gelatin, tinh bột, khử nitrate, oxidase…Khuẩn lạc của P. aeruginosa có ba
dạng: (1) khuẩn lạc nhỏ, thô ở những chủng hoang dại phân lập từ đất, nước; (2) khuẩn
lạc to, trơn, rìa phẳng, nhô cao và (3) khuẩn lạc có dạng nhầy (được phân lập từ bệnh
phẩm) (Trần Linh Thước, 2003). Nhóm vi khuẩn này phân bố rộng rãi và được tìm
thấy chủ yếu trong đất, nước.
Pseudomonas stutzeri là vi khuẩn khử đạm không có sắc tố huỳnh quang của
giống Pseudomonas. Tế bào vi khuẩn hình que, gam âm, di chuyển bằng chiên mao
đỉnh, có khả năng khử nitrate thành nitơ phân tử, có thể tăng trưởng trong maltose và
tinh bột (Bennasar et al., 1998; Sikorski et al., 1999). Cho phản ứng dương tính với
kiểm tra catalase và oxidase. Nó được phân lập lần đầu tiên bởi Burri và Stutzer (Burri
và Stutzer, 1895), có tên gọi là Bacillus denitrificans II, sau đó được đổi tên thành
Pseudomonas stutzeri bởi Niel và Allen (Van Niel và Allen, 1952). Khuẩn lạc của
Pseudomonas stutzeri có dạng không bình thường và độ sệt thay đổi theo thời gian, có
khuẩn lạc thì khô cứng và gắn kết chặt, có nếp gấp, có khuẩn lạc có màu trắng đục hay
màu vàng nhạt (Van Neil và Allen, 1952; Lalucat et al., 2006).
2.3. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn khử đạm trên thế giới và trong nước
2.3.1. Những nghiên cứu vi khuẩn khử đạm trên thế giới
Năm 1983, Curtis đã tiến hành nghiên cứu so sánh khả năng khử nitrate của ba
loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas
paracoccus, mặc dù 3 loài vi khuẩn này đều làm giảm nitrate tạo ra nitơ, nhưng tốc độ
tích lũy số lượng các chất trung gian của chúng khác nhau. Sản phẩm sinh ra của quá
trình khử nitrate của 3 loài vi khuẩn có sự khác biệt rõ ràng: Vi khuẩn Pseudomonas
stutzeri khử nitrate sản phẩm khí sinh ra duy nhất là N2, Pseudomonas aeruginosa và
Pseudomonas paracoccus khử nitrate sản phẩm sinh ra là khí NO2. Vi khuẩn P.stutzeri
và P. Paracoccus khử nitrate làm giảm nhanh nồng độ NO-3, NO2-, NO2 và vi khuẩn
này có thể tăng trưởng trong môi trường kỵ khí khi có sự hiện diện NO2 trong môi
trường.
Những nghiên cứu tiếp theo của Holmes (1986) và Rosello et al. (1991) đã phân
lập được tổng cộng 49 dòng Pseudomonas stutzeri. Chúng được phân lập từ các mẫu
bệnh lý, bùn biển và trong hệ thống nước thải.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
6
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
Những nghiên cứu đầu tiên về cơ sở phân tử và sinh học tế bào của sự khử đạm
được biết đến là mô tả kích thước gen và bản đồ gen của vi khuẩn khử đạm; những đặc
tính và cấu trúc enzyme khử nitrite, nitric oxide, nitrous oxide; các dòng Pseudomonas
khử đạm; độ đa dạng của vi khuẩn khử đạm. Nghiên cứu này do Zumft thực hiện năm
1997.
Sự xuất hiện của kỹ thuật PCR (1985) đã hỗ trợ rất nhiều trong việc nhận diện
các dòng vi khuẩn một cách nhanh chóng và chính xác. Vì thế những nghiên cứu sau
này tập trung vào các đoạn gen mã hóa cho tính khử đạm. Điển hình có Braker et al.
(1998) đã nghiên cứu phát triển hệ thống các cặp mồi chạy PCR khuếch đại đoạn gen
khử nitrite (nirK và nirS) để phát hiện vi khuẩn khử đạm trong mẫu môi trường thu
được (bùn hoạt động của hệ thống xử lý nước thải ở Đức). Gen nirK đã được khuếch
đại từ Blastobacter denitrificans, Alcaligenes xylosoxidans và Alcaligenes sp.(DM
30128); gen nirS được khuếch đại từ Alcaligenes eutrophus DSM 530 và từ chủng khử
đạm IFAM 3698. Với mỗi gen, ít nhất một mồi phối hợp đã khuếch đại thành công đối
với tất cả các chủng trong thí nghiệm. Cặp mồi nirK1F-nirK5R và nirS1F-nirS6R
được dùng trong PCR cho kết quả như mong đợi với các chủng vi khuẩn khử đạm có
mang gen tương ứng nirK và nirS. Sản phẩm khuếch đại không chuyên biệt đã không
thu được ở những vi khuẩn không khử đạm hoặc với các chủng có kiểu gen nir khác.
Năm 1999, Hallin và Lindgren đã tìm ra gen mã hóa cho sự khử nitrite (2 dạng
của gen nir: nirK và nirS) trong vi khuẩn khử đạm (Pseudomonas stutzeri ATCC
14405, P. fluorescens ATCC 33512, P. putida CCUG 2479, P. aureofaciens ATCC
13985, P. denitrificans ATCC 13867, Paracoccus denitrificans ATCC 19367,
Alcaligenes eutrophus ATCC 17699,…) bằng kỹ thuật PCR. Bước chính của con
đường khử đạm là sự khử nitrite bằng enzyme nitrite reductase (nir). Được biết có 2
loại enzyme nir đó là: một enzyme với heme c và heme d1 (cd1-nir) và một có chứa
đồng (Cu-nir). Cả hai loại enzyme này đều tương tự nhau về chức năng và đặc điểm
sinh lý học.
Chèneby et al. (2000) tiến hành phân tích 16S rDNA về đặc tính của vi khuẩn
khử đạm phân lập từ 3 vị trí đất nông nghiệp ở Đông bắc nước Pháp, đất được lấy từ
tầng mặt (0-20 cm). Tổng cộng đã phân lập được 138 chủng từ 1445 chủng vi khuẩn
kỵ khí là có khả năng khử đạm. Phân tích hệ thống phát sinh loài của 16S rDNA của
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
7
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
những dòng khử đạm đã phân lập được từ 3 loại đất trên đã phát hiện sự đa dạng ở một
mức độ cao.
Su et al. (2001) tiến hành so sánh sự khử nitrite ở điều kiện hiếu khí, dưới bầu khí
quyển có mức oxy cao của Thiosphaera pantotropha ATCC 35512 và Pseudomonas
stutzeri SU2. Chúng đã được phân lập từ bùn hoạt tính trong hệ thống xử lý nước thải
từ trại chăn nuôi heo theo quy trình của Thái Lan.
Năm 2002, Sikorski et al. sử dụng môi trường SW-LB để phân lập P. stutzeri từ
mẫu môi trường (đất). SW-LB gồm có 10 g/l Bacto Trypton; 5 g/l yeast extract và 15
g/l agar cùng với nước biển nhân tạo (SW) chứa 24 g/l NaCl; 10,5 g/l MgSO4.7H2O và
0,11 g/l NaHCO3, có bổ sung 50mg cycloheximide để ngăn chặn sự phát triển của
nấm. Cặp mồi chuyên biệt và rất nhạy dựa trên vùng gen 16S rDNA được sử dụng
trong bài là fps158 và rps743 đã được mô tả bởi Bennasar et al. (1998) để phân tích sự
hiện diện của DNA P. stutzeri trong mẫu môi trường. Phương pháp này đã cải tiến một
cách chuyên biệt những qui trình phân lập, nhận diện P. stutzeri được Baggi et al. mô
tả năm 1987 bằng đoạn mồi thích hợp và đặc biệt hơn nữa là có độ nhạy tối đa để
khuếch đại mẫu DNA vi khuẩn đã phân lập từ môi trường. Gia tăng tính chuyên biệt
của qui trình phân lập, nhận diện đối với P. stutzeri có quan hệ với những vi khuẩn
khác bằng việc rút ngắn 4 nucleotide ở đầu 5’ của mồi ngược rps743, đổi tên thành
rps743minus4; mà các nucleotide đó được cho là đã làm tăng hiệu quả mất ổn định của
những lỗi sao chép ở đầu 3’ trong lúc mồi gắn với các gen của vùng 16S rDNA của
những vi khuẩn khác hơn là của P. stutzeri.
Cùng lúc đó Lee et al. (2002) nghiên cứu về đặc điểm phân tử của quần xã vi
khuẩn trong mẫu bùn hoạt tính loại thải nitrate với việc sử dụng phương pháp dựa trên
16S rDNA. Bài báo cáo cũng đã mô tả một vài đặc tính của một số chủng từ CR-I
(high-nitrate-removing activated sludge) và CR-II (low-nitrate-removing activated
sludge). Đa số thuộc lớp Gammaproteobacteria và là vi khuẩn gram (-), có hình que
như Pseudomonas putida, P. stutzeri, P. azotoformans.
Nghiên cứu về định lượng gen khử đạm của Henry et al. (2006) đã ứng dụng kỹ
thuật PCR để phát hiện, định lượng gen nosZ (mã hóa cho enzyme nitrous oxide
reductase khử nitrous oxide [N2O] thành nitơ phân tử [N2]) trong vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens từ mẫu môi trường đất và đối chiếu với sự phong phú của
các gen 16S rRNA, narG (mã hóa cho enzyme khử nitrate ở màng), và nirK (mã hóa
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
8
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
cho enzyme khử nitrite với nhân đồng). Hiện nay, nồng độ nitrous oxide (N2O) (một
khí nhà kính quan trọng) trong khí quyển đang gia tăng với một tỉ lệ khoảng 0,3 % mỗi
năm. N2O là một sản phẩm trung gian của con đường khử đạm, bao gồm sự khử nối
tiếp NO3- thành N2 với sự tham gia của các metalloenzyme như nitrate reductase,
nitrite reductase, nitric oxide reductase và nitrous oxide reductase.
Một nghiên cứu khác nhằm tối ưu hóa điều kiện phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
khử đạm cũng đã được tiến hành bởi Heylen (2006). Theo đó, môi trường sinh trưởng
tối ưu với giá trị pH= 7; hàm lượng đạm là 3 mM; có bổ sung 1ml dung dịch vitamin;
nguồn carbon từ ethanol hoặc succinate và tỉ lệ phân tử gam C/N là 2,5 : 20 hoặc 25 là
những điều kiện nuôi cấy thành công nhất. Nghiên cứu cũng đồng thời quan sát sự đa
dạng của vi khuẩn khử đạm từ bùn hoạt động của hệ thống xử lý nước thải đô thị. Có
199 vi khuẩn khử đạm đã được phân lập, trong đó, đa số thuộc về lớp
Betaproteobacteria (50,4 %) và Alphaproteobacteria (36,8 %), còn tìm thấy một số
lớp khác như Gammaproteobacteria (5,6 %), Epsilonproteobacteria (2 %), Firmicutes
(4 %) và Bacteroidetes.
2.3.2. Những nghiên cứu vi khuẩn khử đạm trong nước
Hiện nay ở Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn khử đạm P. stutzeri:
Phan Trường Khanh (2007), thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn Pseudomonas
stutzeri trong đất đồng bằng sông Cửu Long và ứng dụng xử lý ammonia trong nước ở
điều kiện phòng thí nghiệm”. Tác giả đã phân lập được 20 dòng vi khuẩn
Pseudomonas từ các mẫu đất phù sa, phèn, mặn ở ĐBSCL và nhận diện được một
dòng P. stutzeri bằng cặp mồi đặc trưng 16S rDNA. Bước đầu khảo sát khả năng khử
đạm trong nước ao nuôi tôm bị nhiễm ammonia.
Nguyễn Trần Hải Bằng (2008), dùng cặp mồi đặc hiệu nosZ2F-nosZ2R và cd1nirF-cd1-nirR đã nhận diện được 6 dòng Pseudomonas stutzeri có chứa gen nosZ, và 8
dòng có chứa gen cd1-nir.
Tô Thị Lài (2008), ở qui mô phòng thí nghiệm cho thấy các dòng vi khuẩn
Pseudomonas stutzeri phân lập từ môi trường nuôi cá tra đều có khả năng xử lý
ammonia hiệu quả.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
9
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học - Trường ĐHCT cũng đang
thực hiện phân lập và nhận diện một số dòng vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri
từ ao nuôi tôm, ao nuôi cá tra...
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
10
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Nguyên vật liệu
Mẫu chất thải rắn và chất thải lỏng từ trại chăn nuôi bò sữa tại các tỉnh, thành ở
ĐBSCL, trạm thu mua sữa tại Tp.HCM và mẫu nước thải từ nhà máy sữa Vinamilk.
3.1.2. Dụng cụ, thiết bị
- Máy ảnh, kính hiển vi Olympus CH-2 (Nhật Bản)
- Cân điện tử Sartorius (Đức)
- pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ)
- Tủ cấy vi sinh vật (Pháp)
- Tủ ủ vi sinh vật (Đức)
- Tủ lạnh giữ mẫu
- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)
- Bộ micropipet Gibson P10, P20, P50, P200, P1000 (Đức)
-Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbinternational (Đức)
- Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan)
- Đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que gạt thủy tinh, bình tam giác, lam, lamen, bọc
nylon và chai đựng mẫu rắn và mẫu nước...
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
11
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
Tủ ủ
Máy vortex
Cân
Micropipet
Hình 3.1: Một số dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
3.1.3. Hóa chất
Các hóa chất dùng để pha môi trường phân lập vi khuẩn được liệt kê trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Thành phần hoá chất pha chế môi trường Minimal phân lập vi
khuẩn
Môi trường Minimal (Sikorski et al., 2002)
- Sodium succinate hoặc acid succinic
8,1 g/l
- NaNO3
11 g/l
- NH4Cl
0,54 g/l
- KH2PO4
3,3 mg/l
- K2HPO4
4,35 mg/l
- Vi lượng
1ml/l
- Nước muối nhân tạo (SW)*
100 ml/l
- Agar
2 g/100ml
- pH 6,8
- KOH 0.1M dùng để chỉnh pH
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
12
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
(*): sea water
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
- Thời gian: bắt đầu từ tháng 1/2010 đến tháng 05/2010.
- Địa điểm thí nghiệm: tiến hành thí nghiệm tại phòng thí nghiệm vi sinh vật của Viện
NC & PT CNSH - Trường Đại học Cần Thơ.
3.2.2. Phương pháp phân lập
a. Chuẩn bị mẫu
- Dạng mẫu: mẫu chất thải rắn và chất thải lỏng từ trại chăn nuôi bò sữa, trạm thu mua
sữa và mẫu nước thải từ nhà máy sữa Vinamilk.
- Số lượng mẫu: 11 mẫu lỏng và 2 mẫu rắn
- Bảo quản mẫu: mẫu chất thải lỏng và chất thải rắn được cho vào các chai nhựa, ghi
nhãn đem về phòng thí nghiệm bảo quản trong tủ lạnh (Hình 3.2).
Hình 3.2: Mẫu chất thải lỏng và mẫu chất thải rắn
b. Phân lập – làm ròng
- Đối với mẫu rắn: Cân 1g mẫu bùn đáy cho vào 99ml nước cất vô trùng trong bình
erlen 250ml, đậy bình bằng nút gòn và giấy dầu. Đem các bình erlen đã pha loãng lắc
trong 30 phút. Sau đó rút 1ml cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng vortex,
pha loãng tiếp đến tỉ lệ 10-4 hoặc 10-5 (thực hiện trong tủ cấy).
- Đối với mẫu nước: pha loãng đến tỉ lệ 10-2 hoặc 10-3.
- Dùng micropipet hút lần lượt 30-40μl mẫu nước và mẫu rắn đã pha loãng rồi nhỏ lên
đĩa petri có môi trường Minimal.
- Dùng que trải mẫu phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch, mở nắp đĩa để khô
trong khoảng 5-10 phút với ngọn lửa đèn cồn trong tủ cấy.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
13
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
- Đĩa môi trường đã trải mẫu được ủ ở 300C trong tủ ủ vi sinh vật từ 24-48 giờ để vi
khuẩn phát triển thành khuẩn lạc (Hình 3.3).
Hình 3.3: Mẫu trải phát triển trên môi trường Minimal
- Tiếp tục chọn các dạng khuẩn lạc khác nhau cấy chuyển sang các đĩa môi trường cho
đến khi các khuẩn lạc được kéo rời rạc qua các đường cấy (Hình 3.4).
Khuẩn lạc rời
Hình 3.4: Khuẩn lạc sau khi cấy chuyển
- Tiến hành kiểm tra độ ròng của các dòng vi khuẩn phân lập dưới kính hiển vi quang
học. Cách chuẩn bị tiêu bản:
+ Khử trùng lam kính và lamen bằng cồn, để khô cồn.
+ Nhỏ 30-40μl nước cất vô trùng lên lam kính.
+ Dùng que cấy để nguội sau khi đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn lấy một ít
khuẩn lạc rời rồi trải đều lên giọt nước trên lam kính.
+ Lấy lamen đậy lên giọt nước bằng cách để lamen tiếp xúc với lam kính và
giọt nước một góc 45 0, hạ lamen xuống nhẹ nhàng để tránh bị bọt khí.
+ Quan sát và kiểm tra độ ròng của mẫu; mô tả hình dạng và khả năng chuyển
động của vi khuẩn trên kính hiển vi.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
14
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
- Cuối cùng chuyển một khuẩn lạc rời (xem như một chủng-isolate) vào ống nghiệm
chứa môi trường trên để trữ mẫu ròng.
6b
VC21
PL3a
Hình 3.5: Khuẩn lạc ròng được trữ trong môi trường Minimal
- Đồng thời các dòng vi khuẩn này được cấy ria trên môi trường Minimal đặc, ủ ở
nhiệt độ 30oC sau 24-48 giờ đem đo kích thước và quan sát hình dạng của khuẩn lạc.
3.2.3. Khảo sát khả năng oxy hóa ammonium, khử nitrite và nitrate
Từ các dòng vi khuẩn đã ròng, tiến hành nuôi cấy trên môi trường Minimal (môi
trường tối thiểu) có bổ sung ammonium, nitrite và nitrate ở dạng hợp chất (NH4Cl,
NaNO2, NaNO3) qua các nồng độ tăng dần nhằm kiểm tra khả năng oxy hóa
ammonium và khử đạm của các dòng vi khuẩn trên. Nồng độ của các chất bổ sung
được tính dựa theo nồng độ hợp chất chứa chúng.
Sau 24 – 48 giờ nuôi cấy chủng vi khuẩn nào không phát triển (-), được coi là
không có khả năng oxy hóa (hoặc khử) môi trường đó; chủng nào phát triển yếu (+),
được coi là có khả năng oxy hóa (hoặc khử) thấp; chủng nào phát triển trung bình
(++), được coi là có khả năng oxy hóa (hoặc khử) trung bình; chủng nào phát triển khá
(+++), được coi là có khả năng oxy hóa (hoặc khử) khá; chủng phát triển rất tốt
(++++) được xem có khả năng oxy hóa (hoặc khử) tốt.
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
15
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
Bảng 3.2: Thành phần môi trường Minimal bổ sung Nitrate, Nitrite và
Ammonium 100mM
Hoá chất
- NaNO3
MT nitrate
MT nitrite
MT amonium
8,5 g/l
- KNO2
8,5 g/l
- NH4Cl
8,5 g/l
- Sodium succinate (acid succinic) 8,1 g/l
8,1 g/l
8,1 g/l
- KH2PO4
4,35 g/l
4,35 g/l
4,35 g/l
- K2HPO4
4,35 g/l
4,35 g/l
4,35 g/l
- Vi lượng
1 ml/l
1 ml/l
1 ml/l
- Môi trường SW*
100 ml/l
100 ml/l
100 ml/l
(*): sea water
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
16
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn từ chất thải trại chăn nuôi bò sữa tại các tỉnh,
thành ở ĐBSCL, trạm thu mua sữa TP.HCM và mẫu nước thải từ nhà máy sữa
Vinamilk
4.1.1. Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn
Từ 13 mẫu chất thải rắn và nước thải (11 mẫu nước, 2 mẫu rắn) của 6 chuồng bò
ở một số tỉnh, thành ĐBSCL, trạm thu mua sữa tại TP.HCM và nhà máy sữa Vinamilk
đã phân lập được 47 dòng vi khuẩn trên môi trường Minimal (Bảng 4.1).
Bảng 4.1: Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn từ chất thải trại chăn nuôi bò
sữa, trạm thu mua sữa và nhà máy sữa Vinamilk
STT
Nơi thu mẫu
Dạng mẫu
Số mẫu
Số dòng đã
phân lập
1
Nhà máy sữa Vinamilk tại Cần Thơ
Nước
3
11
2
Huyện Phong Điền, TP. Cần Thơ
Nước
1
6
Rắn
1
5
3
Huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp
Nước
2
7
4
Huyện Bình Tân, Tỉnh Vĩnh Long
Nước
1
5
5
Viện lúa ĐBSCL, Ô Môn, TP. Cần Thơ
Nước
1
6
6
Huyện Mỹ Tú, tỉnh Sóc Trăng
Rắn
1
3
7
Tỉnh Tiền Giang
Nước
1
2
8
Trạm thu mua sữa tại TP. Hồ Chí Minh
Nước
2
2
13
47
Tổng
Chuyên ngành Công nghệ sinh học
17
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học
