Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích paraquat trong huyết tương và ứng dụng phục vụ chẩn đoán, điều trị bệnh nhân ngộ độc cấp paraquat
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (6.36 MB, 237 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------------
Vũ Anh Phƣơng
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN
TÍCH PARAQUAT TRONG HUYẾT TƢƠNG VÀ ỨNG
DỤNG PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN ĐIỀU TRỊ BỆNH NHÂN
NGỘ ĐỘC CẤP PARAQUAT
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 62440118
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
HÀ NỘI - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------------
Vũ Anh Phƣơng
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN
TÍCH PARAQUAT TRONG HUYẾT TƢƠNG VÀ ỨNG
DỤNG PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN ĐIỀU TRỊ BỆNH NHÂN
NGỘ ĐỘC CẤP PARAQUAT
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 62440118
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. TẠ THỊ THẢO
2. PGS.TS. HÀ TRẦN HƢNG
HÀ NỘI - 2019
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất
kỳ công trình nào khác.
Tác giả
Vũ Anh Phƣơng
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Tạ Thị Thảo và
PGS.TS. Hà Trần Hưng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc
biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá
trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhân
viên Trung tâm Chống Độc - Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
được học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Ánh Hường, PGS.TS. Mai
Thanh Đức, ThS. Đỗ Thị Trang, ThS. BSNT Đoàn Thu Hà đã nhiệt tình giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn công ty 3Sanalysis ( đã cung cấp
4
thiết bị CE-C D để thực hiện nghiên cứu này, cảm ơn các bạn trong nhóm nghiên
4
cứu sử dụng phương pháp điện di mao quản CE-C D của Bộ môn Hóa Phân tích,
Khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội đã phối hợp và hỗ trợ tôi
hoàn thành nghiên cứu này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên,
chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi.
Hà Nội, ngày 08 tháng 01 năm 2019
Học viên
Vũ Anh Phƣơng
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU................................................................................................................................................. 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN.............................................................................................................. 5
1.1. T ng quan về paraquat................................................................................................................ 5
1.1.1. Công thức hóa học, tính chất lý hóa học của paraquat......................................... 5
1.1.2. Thực trạng sử dụng paraquat hiện nay........................................................................ 6
1.1.3. Độc tính của paraquat....................................................................................................... 7
1.1.4. Dược động học paraquat.................................................................................................. 9
1.2. Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương....................10
1.3. Các phương pháp xác định paraquat trong huyết tương............................................. 16
1.3.1. Phương pháp quang ph hấp thụ phân tử (UV - Vis).......................................... 16
1.3.2. Các phương pháp sắc ký................................................................................................ 17
1.3.2.1. Phương pháp sắc ký khí
........................................................................................................................................................
17
1.3.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng
........................................................................................................................................................
20
1.3.3. Phương pháp điện di mao quản (CE)........................................................................ 23
1.3.3.1. Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector UV (CE - UV)
........................................................................................................................................................
25
1.3.3.2. Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn
4
không tiếp xúc (CE - C D)
...................................................................................................................................................................
25
1.3.3.3. Ứng dụng của phương pháp điện di mao quản trong phân tích
paraquat
...................................................................................................................................................................
27
1.4. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích paraquat.................................. 29
1.4.1. Phương pháp kết tủa protein........................................................................................ 30
1.4.2. Phương pháp chiết lỏng - lỏng.................................................................................... 31
1.4.3. Phương pháp chiết pha rắn........................................................................................... 33
1.5. Kết luận chung phần t ng quan............................................................................................. 38
Chƣơng 2: THỰC NGHIỆM..................................................................................................... 40
2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất................................................................................................ 40
2.1.1. Thiết bị, dụng cụ............................................................................................................... 40
2.1.2. Chất chuẩn.......................................................................................................................... 41
2.1.3. Hóa chất, dung môi.......................................................................................................... 42
2.1.4. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất................................................................................ 43
2.2. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................................. 44
2.2.1. Bệnh nhân............................................................................................................................ 44
2.2.2. Mẫu nghiên cứu................................................................................................................ 44
2.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................................ 46
2.3.1. Phương pháp định tính PQ trong nước tiểu............................................................ 46
2.3.2. Phương pháp lấy mẫu và tiền xử lý mẫu huyết tương........................................ 46
2.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector DAD
(HPLC/ DAD)..................................................................................................................................... 47
2.3.3.1. Phương pháp khảo sát điều kiện tối ưu quá trình phân tích PQ
trên nền mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn
...................................................................................................................................................................
47
2.3.3.2. Phương pháp tối ưu quy trình xử lý mẫu huyết tương huyết tương
phân tích bằng phương pháp HPLC/DAD
...................................................................................................................................................................
48
4
2.3.4. Phương pháp điện di mao quản (CE - C D)........................................................... 49
2.3.4.1. Phương pháp khảo sát điều kiện tối ưu phân tích dung dịch
PQ chuẩn
...................................................................................................................................................................
49
2.3.4.2. Phương pháp tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu huyết tương phân tích
4
bằng phương pháp CE - C D
...................................................................................................................................................................
50
2.3.5. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích........................................ 53
2.3.5.1. Tính chọn lọc
........................................................................................................................................................
53
2.3.5.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
........................................................................................................................................................
54
2.3.5.3. Độ chụm của phương pháp
........................................................................................................................................................
54
2.3.5.4. Độ đúng của phương pháp phân tích
........................................................................................................................................................
54
2.3.5.5. Độ ổn định của phương pháp
........................................................................................................................................................
55
2.3.6. Ước lượng độ không đảm bảo đo............................................................................... 55
2.4. Áp dụng trong chẩn đoán, tiên lượng và điều trị ngộ độc cấp PQ..........................56
2.5. Vấn đề đạo đức nghiên cứu................................................................................................... 58
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................... 59
3.1. Phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC/DAD) định lượng
paraquat trong huyết tương............................................................................................................. 59
3.1.1. Lựa chọn các điều kiện phù hợp của hệ thống phân tích HPLC/DAD........59
3.1.1.1. Xác định bước sóng phát hiện chất phân tích với detector DAD
........................................................................................................................................................
59
3.1.1.2. Ảnh hưởng của thể tích vòng mẫu
........................................................................................................................................................
59
3.1.1.3. Lựa chọn loại pha động
........................................................................................................................................................
61
3.1.1.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ thành phần pha động
........................................................................................................................................................
62
3.1.1.5. hảo sát ảnh hưởng của pH pha động
64
3.1.1.6. hảo sát nồng độ các cấu tử trong pha động
65
3.1.1.7. hảo sát ảnh hưởng của tốc độ d ng
70
3.1.2. hảo sát phương pháp xử l mẫu huyết tương phân tích PQ..........................71
3.1.2.1. hảo sát nồng độ dung dịch CA
72
3.1.2.2. hảo sát th i gian lắc xoáy
73
3.1.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp HPLC.............................................. 75
3.1.3.1. ính đặc hiệu
75
3.1.3.2. Đư ng chuẩn giới hạn phát hiện v giới hạn định lượng
76
3.1.3.3. Đánh giá độ chính xác của phương pháp phân tích
........................................................................................................................................................
78
3.1.3.4. Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại của phương pháp phân tích
........................................................................................................................................................
81
3.2. Nghiên cứu định lượng paraquat trong huyết tương người bằng phương pháp
4
điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE - C D)........................ 88
4
3.2.1. Tìm điều kiện tối ưu phân tích paraquat bằng phương pháp CE - C D.......88
3.2.1.1. Ảnh hưởng của loại đệm
........................................................................................................................................................
89
3.2.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của th i gian bơm mẫu
........................................................................................................................................................
95
3.2.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thế tách
........................................................................................................................................................
96
3.2.1.4. Ảnh hưởng của các cation đến quá trình phân tách PQ
........................................................................................................................................................
98
3.2.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương................................. 100
4
3.2.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp CE - C D..................................... 119
3.2.3.1. ính đặc hiệu của phương pháp...................................................................... 119
3.2.3.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng................................................ 119
3.2.3.3. Xây dựng đư ng chuẩn PQ............................................................................... 121
3.2.3.4. Đánh giá độ đúng của phương pháp............................................................. 123
3.2.3.5. Đánh giá độ chụm (độ chụm lặp lại v độ chụm tái lặp)......................124
3.2.3.6. Ước lượng độ không đảm bảo đo................................................................... 126
3.3. So sánh kết quả phân tích nồng độ paraquat trong huyết tương của các
4
bệnh nhân ngộ độc paraquat bằng phương pháp CE - C D và phương pháp
HPLC/DAD....................................................................................................................................... 128
3.4. Nghiên cứu áp dụng kết quả định lượng nồng độ paraquat huyết tương
phục vụ chẩn đoán, tiên lượng và điều trị bệnh nhân ngộ độc cấp PQ.......................132
3.4.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân nghiên cứu........................................... 133
3.4.1.1. Đặc điểm về tuổi................................................................................................... 133
3.4.1.2. Đặc điểm về giới................................................................................................... 133
3.4.1.3. Nguyên nhân ngộ độc.......................................................................................... 134
3.4.1.4. Th i gian vào viện................................................................................................ 134
3.4.2.
ngh a định lượng paraquat huyết tương trong chẩn đoán mức độ nặng
và tiên lượng bệnh nhân................................................................................................................ 135
3.4.2.1. Tỷ lệ tử vong của các bệnh nhân ngộ độc cấp PQ................................... 135
3.4.2.2. Nồng độ paraquat huyết tương ở hai nhóm sống và tử vong...............136
3.4.2.3. Giá trị tiên lượng tử vong của nồng độ PQ huyết tương và
điểm SIPP........................................................................................................................................... 137
3.4.3.
ngh a định lượng PQ huyết tương trong điều trị ngộ độc PQ
(đánh giá hiệu quả và hướng dẫn lọc máu hấp phụ)........................................................... 138
3.4.3.1. Các biện pháp điều trị được áp dụng........................................................... 138
3.4.3.2. Điều trị lọc máu hấp phụ................................................................................... 139
3.4.3.3. Khảo sát giá trị nồng độ PQ sau mỗi lần lọc............................................ 140
3.4.3.4. Xác định số cuộc lọc cần thiết dựa vào nồng độ PQ.............................. 141
ẾT LUẬN...................................................................................................................................... 144
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN.............................................................................................................................. 146
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................................... 147
PHỤ LỤC.......................................................................................................................................... 160
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức hóa học của paraquat...............................................................5
Hình 1.2. Cơ chế gây độc của paraquat....................................................................7
Hình 1.3. Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết tương (µg/ml),
thời gian sau uống, và khả năng sống...................................................................... 12
Hình 1.4. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo hệ điện di mao quản....................................... 24
Hình 1.5. Sơ đồ thiết kế của C4D........................................................................... 26
Hình 1.6. Quy trình chung xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn.................34
Hình 2.1. Quy trình định tính PQ trong nước tiểu người........................................ 46
Hình 3.1. Ph hấp thụ UV của PQ........................................................................ 59
Hình 3.2. Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫu........................................................... 60
Hình 3.3. Sắc đồ phân tích PQ trong huyết tương với các hệ dung môi khác nhau 61
Hình 3.4. Sắc đồ khảo sát t lệ pha động ACN: dung dịch đệm (pH = 2,5) v/v.......63
Hình 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH....................................................... 64
Hình 3.6. Sắc đồ khảo sát nồng độ của natriheptanesulfonate trong đệm pH 2,5. . .66
Hình 3.7. Sắc đồ của PQ khi thay đ i nồng độ của Cl trong pha động...............68
Hình 3.8. Sắc đồ của PQ khi thay đ i nồng độ của PEG trong pha động...............69
Hình 3.9. Sắc đồ khảo sát tốc độ d ng.................................................................... 70
Hình 3.10. Hiệu quả loại bỏ protein trong huyết tương khi sử dụng TCA..............72
Hình 3.11. Sơ đồ quy trình xử lý PQ trong mẫu huyết tương.................................74
Hình 3.12. Sắc đồ PQ trong huyết tương chuẩn áp dụng quy trình xử l
mẫu hình 3.11.......................................................................................................... 75
Hình 3.13. Độ đặc hiệu của phương pháp HPLC phân tích PQ.............................. 75
Hình 3.14. Sắc đồ PQ trong huyết tương ở các nồng độ khác nhau
từ 0,02 - 10,00 µg/ml............................................................................................... 76
Hình 3.15. Đường chuẩn PQ huyết tương dựa trên phương pháp HPLC................77
Hình 3.16. Điện di đồ sự ảnh hưởng của pH đến sự phân tách PQ.........................90
Hình 3.17. Điện di đồ sự ảnh hưởng của thành phần dung dịch điện di
đến khả năng phân tách PQ..................................................................................... 92
Hình 3.18. Điện di đồ sự ảnh hưởng của nồng độ đệm điện di đến khả năng
phân tách PQ........................................................................................................... 94
Hình 3.19. Điện di đồ về sự ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu.............................96
Hình 3.20. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của điện thế tách đến thời gian
di chuyển và sự phân tách pic.................................................................................. 97
Hình 3.21. Điện di đồ sự ảnh hưởng của các cation đến tín hiệu PQ......................99
Hình 3.22. Điện di đồ chiết tách PQ bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng sử dụng
chất tạo cặp ion BTB ở pH = 6,5........................................................................... 101
Hình 3.23. Điện di đồ chiết tách PQ bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng sử dụng
chất tạo cặp ion sodium 1-heptane sulfonate ở pH = 3,0....................................... 101
Hình 3.24. Điện di đồ phân tích mẫu huyết tương thêm chuẩn PQ 5 µg/ml
sử dụng cột WCX và cột C18................................................................................ 102
+
Hình 3.25. Điện di đồ minh chứng sự loại bỏ cation Na 140 mM của cột C18...103
Hình 3.26. Điện di đồ minh chứng sự loại bỏ cation Ca
2+
5 mM của cột C18.....104
Hình 3.27. Điện di đồ minh chứng hiệu quả sử dụng của EDTA đến sự
phân tách PQ......................................................................................................... 105
Hình 3.28. Điện di đồ ảnh hưởng của nồng độ EDTA đến sự phân tách PQ.........107
Hình 3.29. Điện di đồ phân tích mẫu chiết pha rắn ở các điều kiện pH
khác nhau.............................................................................................................. 108
Hình 3.30. Điện di đồ về sự ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt (HĐBM)
trong quá trình SPE đến khả năng tách PQ........................................................... 109
Hình 3.31. Kết quả phân tích điện di sau khi chiết pha rắn sử dụng các loại
dung dịch rửa tạp khác nhau................................................................................. 111
Hình 3.32. Điện di đồ sự ảnh hưởng của t lệ dung dịch rửa tạp đến khả năng
phân tách PQ......................................................................................................... 112
Hình 3.33. Điện di đồ về ảnh hưởng của thành phần dung dịch rửa tạp
đến khả năng tách PQ trên cột C18....................................................................... 114
Hình 3.34. Ảnh hưởng của HCl trong dung dịch rửa giải đến tín hiệu PQ...........115
Hình 3.35. Sự phụ thuộc diện tích pic PQ vào thể tích HCl thêm vào trong
dung dịch rửa giải................................................................................................. 115
Hình 3.36. Điện di đồ thể hiện sự ảnh hưởng của t lệ acetic acid trong dung dịch
rửa giải đến PQ..................................................................................................... 116
Hình 3.37. Quy trình chiết dung dịch mẫu huyết tương trên cột C18 sử dụng chất
tạo cặp ion............................................................................................................. 117
Hình 3.38. Quy trình chiết cột C18 không sử dụng chất tạo cặp ion (QT2)..........118
4
Hình 3.39. Độ chọn lọc của phương pháp CE - C D............................................ 119
Hình 3.40. Đường chuẩn của dung dịch PQ chuẩn và mẫu huyết tương
thêm chuẩn PQ...................................................................................................... 122
4
Hình 3.41. Tương quan nồng độ PQ huyết tương khi định lượng bằng CE - C D
và HPLC (n=118).................................................................................................. 131
Hình 3.42. Phân bố tu i của nhóm bệnh nhân nghiên cứu.................................... 133
Hình 3.43. Tỷ lệ tử vong do ngộ độc PQ.............................................................. 135
Hình 3.44. Nồng độ Paraquat huyết tương ở hai nhóm sống và tử vong..............136
Hình 3.45. Giá trị tiên lượng tử vong của nồng độ PQ huyết tương và
điểm SIPP............................................................................................................. 137
Hình 3.46. Nồng độ PQ huyết tương khi vào viện và sau mỗi cuộc lọc
4
bằng phương pháp HPLC và CE - C D................................................................. 140
Hình 3.47. Ước lượng số cuộc lọc theo nồng độ PQ huyết tương lúc vào viện....141
Hình 3.48. Tỷ lệ tử vong ở nhóm lọc máu và nhóm không lọc máu.....................142
Hình 3.49. Điện di đồ đường chuẩn PQ trong huyết tương..................................171
Hình 3.50. Điện di đồ kết quả phân tích nồng độ PQ vào viện của một số
bệnh nhân điển hình.............................................................................................. 171
Hình 3.51. Điện di đồ kết quả phân tích mẫu huyết tương lúc vào viện đến sau lọc
âm tính của một bệnh nhân điển hình.................................................................... 172
Hình 3.52. Sơ đồ nghiên cứu................................................................................ 174
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định PQ bằng phương pháp sắc ký khí. 19
Bảng 1.2. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định paraquat trong dịch sinh học
bằng phương pháp HPLC........................................................................................ 21
Bảng 1.3. Tóm tắt một số nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối ph
để định lượng PQ.................................................................................................... 23
Bảng 1.4. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định paraquat bằng phương pháp điện di
mao quản................................................................................................................. 28
Bảng 1.5. Tóm tắt một số nghiên cứu sử dụng quy trình chiết pha rắn nhằm
chiết tách paraquat................................................................................................... 36
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của t lệ pha động tới độ phân cực, thời gian lưu,
hệ số đối xứng pic................................................................................................... 63
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH tới thời gian lưu, hệ số đối xứng pic........................65
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ PEG đến thời gian lưu và hệ số đối xứng pic...69
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ TCA đến hiệu quả chiết PQ ra khỏi
huyết tương............................................................................................................. 73
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của thời gian lắc xoay đến quá trình chiết............................ 74
Bảng 3.6. Nồng độ và diện tích pic trung bình của PQ........................................... 76
Bảng 3.7. Kết quả phân tích lặp lại các mẫu huyết tương thêm chuẩn....................79
Bảng 3.8. Các đại lượng thống kê........................................................................... 79
Bảng 3.9. Kết quả đánh giá độ thu hồi đối với phương pháp phân tích PQ............80
Bảng 3.10. Độ lặp lại về thời gian lưu và diện tích pic của các chất.......................81
Bảng 3.11. Kết quả hàm lượng PQ tìm lại được bằng phương pháp thêm chuẩn
của 3 kỹ thuật viên khác nhau................................................................................. 82
Bảng 3.12. Các dữ kiện thống kê đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích
tiến hành bởi ba KTV khác nhau............................................................................. 83
Bảng 3.13. Các dữ kiện đánh giá độ tái lặp của phương pháp phân tích.................84
Bảng 3.14. ết quả xác định độ n định trong ngày.............................................. 84
Bảng 3.15. ết quả xác định độ n định khác ngày............................................... 85
Bảng 3.16. Cách dựng đường chuẩn trên nền mẫu huyết tương và
độ không đảm bảo đo.............................................................................................. 87
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến điện tích pic (Spic)
và thời gian di chuyển (tdc) của PQ chuẩn............................................................... 90
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm điện di
đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của PQ chuẩn..........................92
Bảng 3.19. Sự phụ thuộc của diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc )
của PQ vào nồng độ dung dịch đệm điện di............................................................ 94
Bảng 3.20. Sự phụ thuộc của diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc)
của PQ vào thời gian bơm mẫu............................................................................... 95
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của điện thế tách (E) đến thời gian di chuyển (tdc)
và diện tích pic (Spic ) của chất phân tích................................................................ 97
4
Bảng 3.22. Điều kiện tối ưu cho phân tích PQ bằng phương pháp CE - C D.......100
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của nồng độ EDTA đến hiệu suất thu hồi PQ
trong huyết tương.................................................................................................. 106
Bảng 3.24. Kết quả hiệu suất thu hồi PQ ở các pH khác nhau..............................108
Bảng 3.25. Hiệu suất thu hồi PQ khi sử dụng chất hoạt động bề mặt khác nhau
trong SPE.............................................................................................................. 110
Bảng 3.26. Kết quả hiệu suất thu hồi PQ khi sử dụng các loại dung dịch rửa tạp
khác nhau.............................................................................................................. 111
Bảng 3.27. Kết quả hiệu suất thu hồi PQ ở các t lệ dung dịch rửa tạp khác nhau. 113
Bảng 3.28. Kết quả hiệu suất thu hồi PQ khi sử dụng các dung dịch rửa giải
khác nhau.............................................................................................................. 114
4
Bảng 3.29. Giới hạn phát hiện PQ trên thiết bị CE - C D..................................... 120
Bảng 3.30. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) PQ trên
4
thiết bị điện di mao quản CE - C D....................................................................... 120
4
Bảng 3.31. Giới hạn phát hiện PQ của phương pháp (MDL) CE - C D...............121
Bảng 3.32. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ dung dịch PQ.................122
Bảng 3.33. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp bằng thêm chuẩn PQ.....124
Bảng 3.34. Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp chiết pha rắn
trong định lượng PQ trong huyết tương trên nền mẫu thực................................... 125
Bảng 3.35. Kết quả xác định độ tái lặp của phương pháp..................................... 126
Bảng 3.36. Cách dựng đường chuẩn và độ không đảm bảo đo của điểm chuẩn
trong dung dịch chuẩn trên nền mẫu huyết tương................................................. 127
Bảng 3.37. So sánh nồng độ PQ lúc vào viện của 30 bệnh nhân điển hình
4
bằng phương pháp CE - C D và phương pháp HPLC........................................... 129
Bảng 3.38. Thời gian xuất hiện triệu chứng, vào viện tuyến cơ sở
và Trung tâm Chống độc....................................................................................... 134
Bảng 3.39. Các yếu tố tiên lượng tử vong............................................................. 138
Bảng 3.40. Các biện pháp điều trị được áp dụng.................................................. 139
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt
% RSD
% RSDR
ACN
AS
Asc
ATP
Arg
BN
4
CE - C D
CZE
CTAB
DAD
DDAB
DQ
EPQ
EDTA
EV
GC-MS
His
HP
HPLC
KTV
LC-MS
LOD
LOQ
MCX
MeOH
Mes
ppm
ppb
PQ
R
ROC
RP-HPLC
SD
SIPP
TCA
tR
TTCĐ
UV-VIS
WCX
*Ghi chú: Tên hóa chất viết theo nguyên gốc tiếng Anh
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết, mục tiêu và nội dung của luận án
Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) thuộc nhóm hợp chất amin
bậc 4, được t ng hợp đầu tiên vào năm 1882. Paraquat (PQ) ứng dụng trong nông
nghiệp làm hóa chất trừ cỏ từ những năm 1950 [109] với giá thành rẻ, hiệu quả diệt
cỏ dại nhanh chóng, ít ảnh hưởng tới môi trường. Do đó, PQ hiện đang được sử
dụng rộng rãi ở Việt Nam với nhiều tên thương mại khác nhau. Tuy nhiên, PQ lại là
một chất hóa học vô cùng độc với người. Liều tử vong của PQ ước tính là khoảng
10 ml dung dịch 20%. Trên thế giới, nhiều ca tử vong do ngộ độc PQ đã được báo
cáo [22], [69], [107]. Tại Trung tâm Chống độc - Bệnh viện Bạch Mai, trong những
năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng và trở thành
một vấn nạn vô cùng nghiêm trọng. T lệ tử vong do ngộ độc PQ rất cao, thường
khoảng 70-80 % [82],[ 96]. Trước thực tế đó, rất nhiều quốc gia (32 quốc gia) cấm
lưu hành và sử dụng PQ. Tại Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã
ban hành thông tư về việc loại bỏ PQ ra khỏi danh mục các hóa chất bảo vệ thực vật
(HCBVTV) được phép sử dụng ngày 08/02/2017 [1]. Mặc dù vậy, số lượng bệnh
nhân ngộ độc PQ và đến cấp cứu tại TTCĐ có suy giảm nhưng không đáng kể do
lượng hóa chất diệt cỏ chứa thành phần PQ vẫn còn tồn dư rất nhiều trên thị trường.
Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQ
trong huyết tương đóng vai tr đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của
ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều
trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ [83], [99]. Tuy nhiên, cho đến nay, tại Việt Nam
việc xét nghiệm PQ tại các cơ sở y tế mới ch dừng ở mức độ định tính trong nước
tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc PQ mà chưa có cơ
sở xét nghiệm nào có thể thực hiện việc định lượng nồng độ PQ máu với kết quả
đáng tin cậy. Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩn đoán, tiên lượng
cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp lọc máu, làm cho việc điều trị ngộ
độc PQ tại Trung tâm Chống độc và các Khoa Hồi sức Cấp cứu trên cả nước gặp rất
nhiều khó khăn.
1
Để định lượng PQ trong huyết tương trên thế giới từ lâu đã áp dụng phương
pháp quang ph hấp thụ phân tử [62], [66], [89], phương pháp sắc ký khí khối ph (GCMS) [13], [33], [76], [79], điện di mao quản (CE) [73], [80], [86], [88], sắc ký lỏng với
các detector khác nhau [39], [59], [81], [118]... Mặc dù việc định lượng sớm nồng độ
PQ trong huyết tương để xác định mức độ nặng và tiên lượng khả năng sống cũng như
tiến hành lọc máu hấp phụ từ tuyến trung ương đến địa phương là rất quan trọng nhưng
ngay cả tại Trung tâm Chống độc - Bệnh viện Bạch Mai dù có thiết bị HPLC nhưng
mới ch áp dụng để định lượng một số loại thuốc tân dược (gardenal, paracetamol, …)
trong huyết tương mà chưa đưa vào áp dụng thường qui quy trình định lượng PQ.
Trong khi đó hầu hết bệnh viện tuyến địa phương chưa được trang bị thiết bị HPLC (do
giá thành trang thiết bị cao) nên việc định lượng độc chất còn hoàn toàn bỏ ngỏ. Do
vậy, với mong muốn có thể tiến hành định lượng sớm nồng độ PQ huyết tương bệnh
nhân tại các bệnh viện tuyến trung ương và ngay tại tuyến cơ sở, hỗ trợ hiệu quả chẩn
đoán và điều trị, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng
phƣơng pháp phân tích paraquat trong huyết tƣơng và áp dụng phục vụ chẩn
đoán, điều trị bệnh nhân ngộ độc cấp paraquat” với ba mục tiêu:
1.Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích paraquat trong huyết tương
ngư i bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector DAD
(HPLC/DAD) nhằm xây dựng phương pháp tiêu chuẩn cho phòng xét
nghiệm tuyến trung ương v l m phương pháp tham chiếu xây dựng phương
pháp phân tích mới.
2.Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích mới điện di mao quản sử
4
dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE - C D) hướng đến phân tích
paraquat trong huyết tương bệnh nhân ngay tại các phòng xét nghiệm tuyến
địa phương.
3.Áp dụng định lượng paraquat trong mẫu huyết tương bệnh nhân ngộ độc
paraquat tại bệnh viện tuyến trung ương bằng hai phương pháp từ đó đánh
giá hiệu quả phục vụ điều trị ngộ độc cấp PQ dựa vào nồng độ PQ trong
huyết tương.
2
Với các mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm:
-
Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích PQ bằng phương pháp
HPLC/DAD: tìm các điều kiện tối ưu để phân tích PQ trên thiết bị HPLC, nghiên
cứu quy trình chiết PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương, xác nhận giá trị sử dụng của
phương pháp phân tích.
-
Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích PQ bằng phương pháp CE 4
4
C D: tìm các điều kiện tối ưu để phân tích PQ trên thiết bị CE - C D, nghiên cứu
quy trình chiết PQ ra khỏi nền mẫu huyết tương, xác nhận giá trị sử dụng của
phương pháp phân tích.
-
Áp dụng phân tích PQ trong huyết tương của bệnh nhân ngộ độc PQ tại
Trung tâm Chống độc - Bệnh viện Bạch Mai bằng cả hai phương pháp, so sánh kết
4
quả phân tích bằng phương pháp CE - C D với kết quả phân tích bằng sắc k lỏng
4
hiệu năng cao (HPLC) để xác định độ tin cậy của phương pháp phân tích CE - C D.
-
Đánh giá hiệu quả áp dụng quy trình phân tích PQ trong huyết tương
phục vụ chẩn đoán và điều trị bệnh nhân ngộ độc cấp paraquat.
2.
Những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn của luận án
Về mặt khoa học
-
Phát triển được quy trình phân tích paraquat trong mẫu huyết tương với
quy trình xử lý mẫu đơn giản sau đó phân tích bằng phương pháp HPLC DAD. Quy trình này được sử dụng làm quy trình đối chứng để kiểm tra chéo
4
kết quả phân tích theo phương pháp mới CE - C D, thích hợp với phân tích
định lượng PQ tại các cơ sở xét nghiệm tuyến trung ương hoặc tuyến t nh.
-
Xây dựng được quy trình phân tích paraquat trong huyết tương người trên
cơ sở xử l mẫu huyết tương bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) sử dụng cột
tách C18 sau đó phân tích trên thiết bị điện di mao quản sử dụng detector độ
4
dẫn không tiếp xúc (CE - C D). Quy trình này có khả năng áp dụng để phân
tích PQ ngay tại tuyến cơ sở.
3
Về mặt thực tiễn
- Kết quả định lượng PQ trong 364 mẫu huyết tương của 199 bệnh nhân
ngộ
độc cấp PQ tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai đã giúp bác s xác
định mức độ ngộ độc, tiên lượng nguy cơ tử vong, đánh giá hiệu quả điều trị
lọc máu hấp phụ và xây dựng được phác đồ lọc máu hấp phụ cho bệnh nhân
dựa trên nồng độ PQ huyết tương.
4
- Phương pháp CE - C D với các ưu điểm về hệ thiết bị gọn nhẹ, giá thành
thấp, ngày càng được ứng dụng rộng rãi, phù hợp với hoàn cảnh, điều kiện
kinh tế, xã hội ở Việt Nam. Các quy trình phân tích xây dựng trong luận án
đơn giản, dễ thực hiện, có độ chính xác cao, rất phù hợp để áp dụng phân tích
PQ trong huyết tương, đáp ứng đầy đủ điều kiện từ các bệnh viện tuyến cơ sở
đến trung ương.
4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về paraquat
1.1.1. Công thức hóa học, tính chất lý hóa học của paraquat
Công thức hóa học
Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là 1,1'dimethyl-4,4' bipyridilium. PQ có khối lượng mol phân tử là 186,2 g/mol, có công
thức hóa học như hình 1.1:
Hình 1.1. Công thức hóa học của paraquat
ính chất lý hóa học của paraquat
o
PQ thường có màu trắng hơi vàng, không mùi, tỷ trọng ở 20 C là 1,240 o
o
1,260, điểm chảy 175 - 180 C, điểm sôi khoảng 300 C và pH của dung dịch PQ
trong nước 6,5 - 7,5. PQ thường ở dạng dimethylsulphate hoặc dichloride. Dạng
dichloride tinh thể trắng, dạng dimethylsulphate chảy rữa. PQ n định trong dung
dịch môi trường axít hoặc trung tính và không n định trong môi trường kiềm. PQ
o
tan tốt trong nước (độ tan 700 g/l ở 20 C), ít tan trong cồn và hầu như không tan
trong các dung môi hữu cơ khác.
PQ bị phân hủy dưới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bề
mặt anionic và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc với đất. PQ không
bay hơi. Dung dịch PQ đặc ăn m n thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhôm [111].
5
1.1.2. Thực trạng sử dụng paraquat hiện nay
Paraquat thuộc nhóm trừ cỏ dại Bipyridylium được tập đoàn ICI phát minh
năm 1955, được thương mại hóa và sử dụng năm 1962 [77]. Hiện nay, ngoài công
ty Syngenta (Thụy Sỹ), Sundat (Singapore) và United Phosphorus (Ấn Độ) thì hơn
15 doanh nghiệp thuốc BVTV Trung Quốc sản xuất và đưa ra thị trường thế giới
một lượng lớn thuốc trừ cỏ PQ với tên gọi thường gặp như: Gramoxone, Gfaxone,
Hegaxone, Tungmaxone, Owen... [109]. Một điều đáng nói là công ty sản xuất PQ
lớn nhất trên thế giới hiện nay là Syngenta hay c n gọi là Zeneca đặt nhà máy tại
Trung Quốc nhưng trên đất nước họ đã cấm hoàn toàn PQ, hoạt động kinh doanh
chủ yếu xuất khẩu sang các nước thứ ba [113].
PQ được sản xuất và sử dụng chủ yếu ở 2 dạng chế phẩm SG (hạt tan trong
nước) và SL (dung dịch đậm đặc), PQ và thành phẩm chứa PQ thuộc nhóm độc loại
II, không tồn tại lâu trong môi trường sống, tan nhanh trong nước. Hiện tại, có hơn
90 quốc gia đăng k và sử dụng PQ (với mức độ sử dụng khác nhau), trong đó có
nhiều nước có nền nông nghiệp phát triển. Tuy nhiên, với thực trạng ngộ độc và tử
vong do PQ trên thế giới, rất nhiều quốc gia phải xem xét lại công tác quản lý thuốc
trừ cỏ PQ, rà soát lại mức độ sử dụng, thậm chí có thể hạn chế, cấm sử dụng.
Trong danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng ở Việt Nam (ban hành
kèm theo thông tư số 21/2013/TT-BNNPTNT) ngày 16/4/2013 của Bộ trưởng Bộ
NN & PTNT) có 45 tên thương phẩm thuốc PQ, trong đó 41 thành phẩm dạng dung
dịch chất lỏng tan trong nước (SL), 3 thành phẩm dạng dung dịch nước (AS) và 1
thành phẩm dạng thuốc bột hòa nước (WP). T ng số hóa chất PQ được nhập vào VN
năm 2012 là 10699,374 lít (tăng 15% so sới năm 2011) và năm 2013 là 9953,223 lít
(giảm 7% so với năm 2012). T ng cộng số lượng PQ thành phẩm 20%
được nhập khẩu và sử dụng ở Việt Nam trong 3 năm (2011-2013) là 27548,295 lít
(lượng dùng trung bình từ 1,5 - 2,0 l/ha). Trong số này 17% lượng nhập khẩu từ
Syngenta, 70% từ các công ty Trung quốc, số còn lại từ Singapore và Ấn Độ.
Lượng thuốc trừ cỏ chứa thành phần PQ vẫn được nước ta ưu tiên sử dụng hàng đầu
trong việc diệt cỏ. Bên cạnh việc bị nhiễm độc trong qúa trình sử dụng thì cũng có
6
