Tuyển Chọn Và Khảo Sát Điều Kiện Nuôi Cấy Dõng Vi Khuẩn Hiếu Khí Có Khả Năng Thủy Phân Bã Mía

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIÊN TIẾN

TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI
CẤY DÕNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ CÓ KHẢ NĂNG
THỦY PHÂN BÃ MÍA

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
ThS. VÕ VĂN SONG TOÀN
ThS. DƢƠNG THỊ HƢƠNG GIANG

Cần Thơ, Tháng 11/2010

SINH VIÊN THỰC HIỆN
Nguyễn Thị Thanh Trúc
MSSV: 3064492
LỚP: DA0666T1


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

ThS. Võ Văn Song Toàn

SINH VIÊN THỰC HIỆN

Nguyễn Thị Thanh Trúc

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

ThS. Dƣơng Thị Hƣơng Giang

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2010
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG


LỜI CẢM TẠ
Để đề tài luận văn tốt nghiệp được hoàn thành thật tốt, em xin chân thành gửi lời tri ân
đến:
Ths. Võ Văn Song Toàn và Ths. Dương Thị Hương Giang và BGĐ Viện Nghiên
cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình hướng dẫn,
truyền đạt kiến thức và chỉ dạy em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tốt
nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô đã tận tình giảng dạy và cung cấp những
kiến thức quý báu và đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập.
Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Xuân Dung, cán bộ Viện Nghiên cứu
và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình hỗ trợ, đóng góp
những ý kiến quý báu trong suốt quá trình làm luận văn.

Các anh chị cán bộ phòng Vi sinh vật, phòng Sinh học phân tử, phòng thực phẩm
đã tạo mọi điều kiện cho em thực hiện tốt luận văn.
Chân thành cảm ơn gia đình nơi đã cưu mang và hỗ trợ em rất nhiều trong suốt
thời gian dài làm luận văn. Cám ơn bạn bè đã hỗ trợ, động viên cho em hoàn thành nhiệm
vụ trong thời gian học tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin kính chúc quý thầy cô dồi dào sức khỏe, thành công trên mọi
lãnh vực.


TÓM LƢỢC
Đề tài “Tuyển chọn và khảo sát các điều kiện nuôi cấy dòng vi khuẩn hiếu khí
có khả năng thuỷ phân bã mía” tiến hành xác định dòng vi khuẩn có khả năng thuỷ
phân bã mía cho hoạt độ thuỷ phân cao nhất, từ đó tiến hành tối ưu hoá các điều kiện
môi trường ảnh hửơng lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi khuẩn. Kết quả cho
thấy rằng trong 12 dòng vi khuẩn hiếu khí được phân lập từ bã mía, chỉ có 2 dòng vi
khuẩn 5 và 22 có khả năng thuỷ phân bã mía cho hoạt độ thuỷ phân cao nhất. Kết quả
khảo sát cũng cho thấy rằng, 2 dòng vi khuẩn này sinh tổng hợp cellulase tốt nhất
trong điều kiện pH 5,0 và 7,0 ở nhiệt độ 350C và 300C lần lượt cho dòng vi khuẩn 22
và 5. Dòng vi khuẩn 5 cho hoạt tính endoglucanase và exogucanase tối ưu (0,0076
U/ml và 0,0049 U/ml) sau 96 giờ ủ lắc (120 vòng/phút), trong khi đó hoạt tính
endoglucanse và exoglucanase của dòng vi khẩn 22 đạt cực đại sau 48 giờ ủ lắc (120
vòng /phút) với hoạt tính thu được lần lượt là 0,0268 U/ml và 0,0235 U/ml. Hàm
lượng protein thu được tương thích với thời gian tối ưu. Môi trường có bổ sung beef
extract 0,2% (w/v) và 0,5% (w/v) được xem là hiệu quả nhất cho sự sinh tổng hợp
cellulase của dòng vi khuẩn 22 và 5.
Từ khoá: bã mía, cellulase, beef extract, endoglucanase, exoglucanase,...

i

MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ........................................................................................................
LỜI CẢM TẠ .................................................................................................................
TÓM LƢỢC ..................................................................................................................i
MỤC LỤC ................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................................vi
CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU ........................................................................................1
CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................3
2.1 Tổng quan về bã mía và các thành phần chính trong bã mía .............................3
2.1.1. Bã mía .......................................................................................................3
2.1.2. Các thành phần chính trong bã mía ..........................................................3
2.1.2.1.

Cellulose ........................................................................................3

2.1.2.2.

Hemicellulose ................................................................................5

2.1.2.3.

Lignin ............................................................................................5

2.2. Cellulase và cơ chế thuỷ phân cellulose..............................................................6
2.2.1.

Cơ chế thuỷ phân cellulose ......................................................................6

2.2.2.

Cellulase ...................................................................................................8

2.2.2.1.

Sơ lược về vi sinh vật phân huỷ cellulose .....................................8

2.2.2.2.

Một số ứng dụng của cellulase ....................................................10

2.3. Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp cellulase12
2.3.1. Nguồn carbon .........................................................................................13
2.3.2. Nguồn nitrogen .......................................................................................13
2.3.3. Nhiệt độ nuôi cấy ...................................................................................14
2.3.4. pH môi trường ........................................................................................14
2.4. Sơ lƣợc một số phƣơng pháp nghiên cứu .........................................................15
2.4.1.

Các phương pháp vi sinh ........................................................................15
ii


2.4.1.1.

Phương pháp pha loãng vi sinh vật .............................................15

2.4.1.2.

Phương pháp đếm mật số VSV bằng phương pháp đếm sống ....15

2.4.1.3.

Phương pháp đo đường kính thuỷ phân ......................................15

2.4.2. Các phương pháp sinh hóa phân tích .....................................................15
2.4.2.1.

Phương pháp định lượng cellulose ..............................................15

2.4.2.2.

Phương pháp đinh lượng protein bằng phương pháp Bradford

(1976). ................................................................................................16
2.4.2.3.

Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Nelson-Somogyi

(1944) .................................................................................................16
2.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC...........................16
CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............19
3.1. PHƢƠNG TIỆN .................................................................................................19
3.1.1.

Thời gian và địa điểm .............................................................................19

3.1.2.

Nguyên liệu ............................................................................................19

3.1.3.

Thiết bị và hóa chất ................................................................................19

3.1.3.1.

Thiết bi ........................................................................................19

3.1.3.2.

Hoá chất.......................................................................................20

3.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................
3.2.1.

Mục đích thí nghiệm...............................................................................20

3.2.2.

Nguyên vật liệu ......................................................................................20

3.2.2.1.

Nguồn vi khuẩn ...........................................................................20

3.2.2.2.

Bã mía .........................................................................................20

3.2.2.3.

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn .....................................................20

3.2.3.

Phương pháp thí nghiệm ........................................................................21

3.2.3.1.

Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần cellulose trong bã mía ........21

3.2.3.2.

Thí nghiệm 2: Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn hiếu

khi có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao................................................22
3.2.3.3.

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng tương tác của nhiệt độ và pH

đến sự sinh tổng hợp cellulase của vi khuẩn................................................23
iii


3.2.3.4.

Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình

thủy phân bã mía của dòng vi khuẩn hiếu khí. ............................................24
3.2.3.5.

Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của các nguồn nitơ lên quá

trình thuỷ phân bã mía của vi khuẩn hiếu khí ..............................................24
3.2.3.6.

Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nitơ lên sự sinh

tổng hợp cellulase của vi khuẩn ...................................................................25
CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................26
4.1. Khảo sát hàm lượng cellulose trong cơ chất bã mía .............................................26
4.2 Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn hiếu khí có khả năng thủy phân bã
mía cao ........................................................................................................................27
4.2.1

Phân lập sơ bộ một số dòng vi khuẩn hiếu khí có khả năng thủy phân bã

mía

................................................................................................................27

4.2.2

Tuyển chọn dòng vi khuẩn hiếu khí có khả năng thủy phân bã mía mạnh

nhất

................................................................................................................29

4.3 Ảnh hưởng tương tác của nhiệt độ và pH đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
của vi khuẩn ..................................................................................................................32
4.4 Ảnh hưởng của thời gian lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi khuẩn .....34
4.5 Ảnh hưởng của nitrogen lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi khuẩn ......38
4.6 Ảnh hưởng của nồng độ beef extract lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi
khuẩn ............................................................................................................................39
CHƢƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................

iv


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1:

Thành phần hóa học trong bã mía ..................................................................3

Bảng 2:

Thành phần môi trường................................................................................21

Bảng 3:

Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ lên quá trình sinh tổng hợp cellulase
của vi khuẩn .................................................................................................25

Bảng 4:

Kết quả phân tích hàm lượng cellulose trong bã mía. .................................26

Bảng 5:

Phần trăm các thành phần chính trong bã mía. ............................................27

Bảng 6.

Hình dạng và đặc tính của vi khuẩn và khuẩn lạc của 12 dòng vi khuẩn hiếu
khí.................................................................................................................27

Bảng 7:

Đường tròn đường kính thủy phân (Dhalo) của 12 dòng vi khuẩn hiếu khí ......
......................................................................................................................30

Bảng 8:

Bảng tóm tắt kết quả xác định hoạt tính endoglucanase và exoglucanase của
2 dòng vi khuẩn 5 và 22 ...............................................................................37

v


DANH SÁCH HÌNH
Hình 1:

Cấu trúc phân tử của cellulose .......................................................................4

Hình 2:

Cấu trúc và liên kết hydro bên trong và bên ngoài chuỗi phân tử cellulose ..4

Hình 3:

Cấu trúc phân tử của lignin ............................................................................5

Hình 4:

Sơ đồ cơ chế thủy phân cellulose của phức hệ enzyme cellulase ..................8

Hình 5:

Một số thiết bị thí nghiệm ............................................................................19

Hình 6:

Sơ đồ chuẩn bị bột bã mía ............................................................................20

Hình 7:

Sơ đồ xác định hàm lượng cellulose trên bã mía .........................................22

Hình 8:

Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn ...............................................................29

Hình 9:

Hình dạng vi khuẩn .....................................................................................29

Hình 10: Hình gram âm của vi khuẩn .........................................................................29
Hình 11 : Dòng vi khuẩn có hoạt tính và không có hoạt tính cellulase .......................30
Hình 12: Tương tác pH và nhiệt độ của dòng vi khuẩn 5 ...........................................32
Hình 13: Tương tác pH và nhiệt độ của dòng vi khuẩn 22 .........................................34
Hình 14: Hoạt tính endoglucanase và exoglucanase theo thời gian của dòng vi khuẩn
5....................................................................................................................35
Hinh 15: Hoạt tính endoglucanase và exoglucanase theo thời gian của dòng vi khuẩn
22..................................................................................................................35
Hình 16: Hàm lượng protein theo thời gian của dòng vi khuẩn 5 và 22 .....................36
Hình 17: Ảnh hưởng của các nguồn nitrogen khác nhau lên khả năng sinh tổng hợp
cellulase của 2 dòng vi khuẩn .....................................................................38
Hình 18: Ảnh hưởng của nồng độ beef extract lên quá trình sinh tổng hợp cellulase
của 2 dòng vi khuẩn 5 và 22 .......................................................................40

vi


PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: PHƢƠNG PHÁP VI SINH ..................................................................
1.

Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí ................................................................

2.

Các bước chuẩn bị môi trường nuôi cấy .................................................................

3.

Phương pháp pha loãng ...........................................................................................

4.

Phương pháp đếm mật số vi khuẩn bằng cách đếm sống ........................................

5.

Phương pháp nhuộm gram ......................................................................................

6.

Phương pháp kiểm tra hoạt tính cellulose bằng đường kính đường tròn thủy phân

PHỤ LỤC 2: PHƢƠNG PHÁP SINH HÓA ..............................................................
1.

Phương pháp phân tích cellulose .............................................................................

2.

Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford (1976) .........................

3.

Phương pháp xác định hoạt tính enzyme (Nelson-Somogyi, 1944) .......................

PHỤ LỤC 3:

HÌNH MINH HOẠ

PHỤ LỤC 4:

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

PHỤ LỤC 5:

KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ

vii


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
Chất thải công nghiệp và nông nghiệp là những tác nhân to lớn gây ảnh hưởng
đến môi trường. Những chất thải nông nghiệp như rơm, bã mía, trấu (chứa khoảng 4050% cellulose) được thải vào tự nhiên và sau một thời gian bị vi sinh vật phân huỷ có
mùi thối ngấm xuống đất gây ô nhiễm môi trường và ô nhiễm nguồn nước rất nặng.
Cellulose là hợp chất cao phân tử phổ biến nhất trên trái đất với ước tính hàng năm có
khoảng 180 tỷ tấn thải ra trong tự nhiên (Amor et al., 1995; Delemer, 1999). Tuy
nhiên, việc sử dụng nguồn nguyên liệu này phụ thuộc vào sự thủy phân của nó cho ra
những oligo- và monosaccharides có thể tận dụng được. Cellulose có thể được chuyển
đổi thành glucose bằng phương pháp hóa học, vật lý hoặc enzyme thủy phân. Acid
hoặc nhiệt độ cao không cho hiệu quả cao, bởi vì các đường sinh ra có một phần bị
phân hủy và các sản phẩm phụ không có lợi cho môi trường. Thông thường, các chất
thải hữu cơ có chứa cellulose này thường được đốt để làm sạch và hậu quả là làm ô
nhiễm không khí rất nặng nề (Miyamoto, 1997).
Các thành phần trong thành tế bào thực vật bao gồm cellulose 24-36%, 8-38%
hemicelluloses 4,3-8% lignin (Winkelmann, 1992). Các hợp chất cao phân tử cellulose

không phân nhánh, không hòa tan và mức độ polymer hóa rất cao lên đến 14000 đơn
vị glucose phân tử được nối với nhau bằng liên kết ß-1,4-glycoside. Tính chất đặc
trưng của cellulose là có khuynh hướng tạo thành một mạng lưới từ những sợi đơn.
Một dãy các sợi liên kết lại với nhau bằng những liên kết hydro bên trong và bên ngoài
để hình thành một cấu trúc phức tạp (Winkelmann., 1992). Nhiều nghiên cứu trên thế
giới cho thấy rằng enzyme cellulase là một hệ thống đa enzyme phức tạp - hoạt động
rất có hiệu quả trong việc thuỷ phân mạng lưới cellulose này và giải phóng ra những
gốc đường glucose đơn giản. Các enzyme cellulase đã thu hút sự chú ý trong những
năm gần đây do tiềm năng to lớn của nó công nghệ sinh học và trong công nghiệp.
Enzyme cellulase được sử dụng rất có hiệu quả trong việc chuyển đổi những chất thải
trong các ngành công nghiệp thực phẩm và trong nông nghiệp thành sản phẩm có giá
trị (Bothast và Saha, 1997).
Việt Nam có một tiềm năng cellulose đáng kể là những phụ, phế phẩm trong quá
trình chế biến nông lâm sản như rơm rạ, trấu, cỏ, lá, mùn cưa, bã mía và một số chất
Chuyên ngành công nghệ sinh học

1

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

thải nông nghiệp khác. So với nguồn nhiên liệu sinh khối từ gỗ khoảng 75-80 triệu
tấn/năm, tương đương 26-28 triệu tấn dầu/năm, năng lượng sinh khối từ phụ phẩm
nông nghiệp chiếm khoảng 30 triệu tấn/năm tương đương với 10 triệu tấn dầu/năm
đáng kể là các nguyên liệu trấu, rơm rạ, bã mía, mùn cưa. Trong đó lượng bã mía thải
ra từ các nhà máy mía đường khoảng 3,5 triệu tấn mỗi năm, chiếm khoảng 20% mía

nguyên liệu (www.epu.com.vn). Hàng trăm khối bã mía được nén lại thành hình
vuông, một phần bán cho các nhà máy sản xuất giấy, một phần được thải ra sông ngòi
trôi theo hướng biển. Đây là loại rác thu được sau quá trình ép mía cây của nhà máy
đường không có kế hoạch tiêu thụ mà được đưa xuống sông gây cản trở hoạt động
đường thủy, vướng vào lưới khai thác thủy sản và ô nhiễm môi trường rất nghiêm
trọng. ( Tuy cũng đã có
một số biện pháp xử lý như sản xuất phân hữu cơ vi sinh, sản xuất điện,...nhưng việc
tái sử dụng nguồn nguyên liệu này vẫn chưa được tiến hành triệt để. Do đó, việc
nghiên cứu sản xuất enzyme cellulase từ những chất thải nông nghiệp có thể được
dùng như môi trường chuyên biệt cho sự sản sinh cellulase sẽ góp phần làm tăng giá
trị sử dụng của các phụ phẩm nông nghiệp, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và khuyến
khích quá trình tìm tòi, nghiên cứu quy trình sản xuất enzyme cellulase. Đó cũng là
tiền đề cho nghiên cứu này, từ dòng vi sinh vật hiếu khí có khả năng tổng hợp
cellulase trên cơ chất bã mía, tiến hành khảo sát điều kiện tối ưu (nồng độ cơ chất,
nhiệt độ, pH, thời gian) ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme cellulase của dòng
vi khuẩn trên cơ chất bã mía.

Chuyên ngành công nghệ sinh học

2

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 TỔNG QUAN VỀ BÃ MÍA VÀ CÁC THÀNH PHẦN CHÍNH TRONG BÃ

MÍA
2.1.1.

Bã mía

Bã mía là chất thải của công đoạn ép mía, bã mía chiếm 25-30% trọng lượng
mía đem ép. Trong bã mía chứa trung bình 49% là nước, 48% là xơ (trong đó chứa 4555% cellulose) 2,5% là chất hoà tan (đường). Bã mía có thể dùng làm nguyên liệu đốt
lò, hoặc làm bột giấy, ép thành ván dùng trong kiến trúc, cao hơn là làm ra Furfural là
nguyên liệu cho ngành sợi tổng hợp (www.wikipedia.org\wiki\mía). Các thành phần
hóa học trong bã mía được trình bày trong bảng sau:
Bảng 1: Thành phần hóa học trong bã mía.

(Chu Thị Thơm, 2006)

2.1.2 Các thành phần chính trong bã mía
2.1.2.1 Cellulose
Cellulose là hợp chất cao phân tử phổ biến nhất trên trái đất và cũng là thành
phần chủ yếu của vách tế bào thực vật. Các hợp chất cao phân tử cellulose không
phân nhánh, không hòa tan và mức độ polymer hóa rất cao lên đến 14000 đơn vị
glucose/phân tử được nối với nhau bằng liên kết ß-1,4-glycoside (hình 1). Cellulose có
cấu tạo dạng sợi, các sợi này liên kết nhau thành những bó nhỏ gọi là các microfibrin
có cấu trúc không đồng nhất, chúng có những phần kết tinh và phần vô định hình.
Grardner và Blackwell (1937) đã giả định cấu trúc kết tình và mô hình chuỗi song
song của phân tử cellulose. Trong đó các phân tử nằm trên cùng một hướng và được
Chuyên ngành công nghệ sinh học

3

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học

Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

nối với nhau bằng một mạng lưới liên kết hydro với một liên kết bên trong và 2 liên
kết bên ngoài (Hình 2). Sự hiện diện của những liên kết hydro này làm cho cấu trúc
phân tử cellulose vô cùng chặt chẽ và cứng ngắc. Mặc dù tinh bột có cấu trúc cơ bản
giống với cellulose - nó cũng là một polysaccharide - nhưng các đơn vị glucose được
gắn theo cách cho phép các phân tử tinh bột dễ dàng xoay chuyển. Nói cách khác, các
phân tử tinh bột là linh hoạt, trong khi các phân tử cellulose là cứng nhắc.

Hình 1: Cấu trúc phân tử của cellulose

Hình 2: Cấu trúc và liên kết hydro bên trong và bên ngoài chuỗi phân tử
cellulose
Đƣờng chấm vạch: liên kết hydro bên trong chuỗi
Đƣờng nhiều chấm: liên kết hydro bên ngoài chuỗi
(*Nguồn: www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S167704202007000100001&lng=ene&nrm=iso&tlng=ene-ngày 10/11/2010)

Chuyên ngành công nghệ sinh học

4

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

2.1.2.2 Hemicellulose
Hemicellulose cũng là một phần polysacaride thường gặp trong vách tế bào
thực vật với hàm lượng lớn sau cellulose. Trong gỗ cây lá kim, chủ yếu hemicellulose
được tạo nên từ loại đường 6 cacbon: galactam, manan…Khác với cellulose, phân tử
hemicellulose nhỏ hơn nhiều thông thường không quá 150 gốc đường được nối với
nhau không chỉ bằng liên kết β-1,4 mà còn bằng liên kết β-1,3 và β-1,6 glycoside tạo
ra mạch ngắn và phân nhánh.Vì độ polymer thấp, phân nhánh và hỗn hợp nhiều đường
nên hemicellulose không có cấu trúc chặt chẽ như ở cellulose và độ bền hóa lý cũng
thấp hơn.
(*Nguồn: 10/07/2010 )

2.1.2.3 Lignin
Vách của tế bào thực vật còn có một hợp chất cao phân tử khác gọi là lignin.
Lignin có nghĩa là chịu nước. Nó nâng đỡ thành tế bào, giữ cho chúng khỏi bị sụp đổ.
Điều này đặc biệt quan trọng trong xylem, bởi vì các cột nước trong tế bào xylem rỗng
phải chịu sức căng (do áp suất âm) và nếu không có sự nâng đỡ của lignin các tế bào
sẽ sụp đổ. Lignin đóng vai trò nâng đỡ cho thân cây và lá đồng thời cung cấp sức
mạnh và độ cứng cho vách tế bào thực vật, cung cấp sức mạnh cần thiết để cây có thể
phát triển đạt được độ cao trên 100 m. Nếu không có lignin những cây này sẽ sụp đổ.
Ngoài ra, lignin cùng với các thành phần vách tế bào khác cung cấp khả năng chống
bệnh, côn trùng, nhiệt độ lạnh, và các áp lực khác. Lignin còn đóng một phần quan
trọng trong việc điều hành sự hấp thụ nước
trong

thân

cây.

Các

thành

phần

polysaccharide của vách tế bào thực vật rất
ưa nước và do đó thấm nước, trong khi
lignin là thành phần kị nước. Các liên kết
của polysaccharides bằng lignin là một trở
ngại cho sự hấp thụ nước vào thành tế bào.
Như vậy, lignin là thành phần làm cho các
mô mạch của cây có thể thẩm thấu nước
một cách hiệu quả. Lignin có trong tất cả
Hình 3: Cấu trúc phân tử của lignin
Chuyên ngành công nghệ sinh học

5

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

các thực vật có mạch, nhưng không có trong rêu, điều này giúp khẳng định rằng chức
năng chính của lignin là hạn chế sự vận chuyển nước trong cây.
(*Nguồn: ttp://sci.waikato.ac.nz/farm/content/plantstructure.html-ngày 10/07/2010)

2.2 Cellulase và cơ chế thuỷ phân cellulose

2.2.1 Cơ chế thuỷ phân cellulose.
Cellulose là một polymer trùng hợp của D-anhydroglucopyranose nối với nhau
bởi β-1,4-glycoside với độ trùng hợp (DP) từ 100 đến 20,000 (Krassig, 1993;
O'Sullivan, 1997; Tomme et al., 1995; Zhang and Lynd, 2004). Anhydrocellobiose là
đơn vị lặp đi lặp lại của cellulose. Sự bắt cặp của 2 chuỗi cellulose lân cận bằng các
liên kết hydro và van der Waal sắp xếp thẳng hàng tạo thành một cấu trúc tinh thể
mạch thẳng, các sợi siêu phân tử lớn ổn định, sức căng mạnh và khả năng thẩm thấu
thấp (Demain et al., 2005; Krassig, 1993; Nishiyama et al., 2003; Notley et al., 2004;
Zhang and Lynd, 2004; Zhbankov, 1992). Các phân tử cellulose rất bền vững với chu
kì phân hủy từ 5-8 triệu năm cho sự phân cắt liên kết β-glycoside tại 250C (Wolfenden
and Snider, 2001) trong khi các quá trình phân hủy sinh học cellulose bằng enzyme lại
diễn ra nhanh hơn để trả lại nguồn carbon quan trong cho bầu khí quyển (Berner,
2003; Cox et al., 2000; Falkowski et al., 2000; Schlamadinger and Marland, 1996).
Cơ chế phân hủy cellulose được chấp nhân rộng rãi hiện nay là sự đồng hoạt
động của 3 loại enzyme endoglucanase (EC 3.2.1.4), exoglucanase hoặc cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), và β-glucosidase (EC3.2.1.21) (Henrissat, 1994; Knowles et
al., 1987; Lynd et al., 2002; Teeri, 1997; Wood and Garica-Campayo, 1990; Zhang
and Lynd, 2004). Endoglucanases thủy phân liên kết β-glucosidise của mạng lưới
cellulose một cách ngẫu nhiên để sản xuất chuỗi mới; exoglucanases tiếp tục phân cắt
các phân tử cellulose mới này thành những phân tử cellobiose hòa tan hoặc glucose; βglucosidases thủy phân phân tử cellobiose thành glucose để loại trừ những phân tử
cellobiose ức chế. Ba quy trình thủy phân xảy ra đồng thời như hình 4. Quá trình thủy
phân đầu tiên xuất hiện trên bề mặt của cơ chất rắn giải phóng những phân tử đường
hòa tan với độ trùng hợp (DP) lên đến 6 trong pha lỏng của quá trình thủy phân của
endoglucanases và exoglucanases. Tiến trình phân cắt các chuỗi polymer hóa của 2
loại enzyme này là bước giới hạn trong toàn bộ quá trình thủy phân cellulose. Quá
trình thủy phân thứ 2 xuất hiện trong pha lỏng chủ yếu là sự phân cắt cellobiose thành
Chuyên ngành công nghệ sinh học

6

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học

Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

glucose bởi β-glucosidases, mặc dù một số β-glucosidases cũng có khả năng phân cắt
thành những chuỗi cellodextrin dài hơn (Zhang and Lynd, 2004). Trong suốt quá trình
thủy phân cellulose, đặc điểm bề mặt của cơ chất rất khác nhau bao gồm (1) thay đổi
trong điểm kết thúc của chuỗi cellulose là kết quả của sự phân cắt của endoglucanases
và sự tiêu thụ của exoglucanases (Kleman-Leyer et al., 1992; Kongruang et al., 2004;
Srisodsuk et al., 1998; Zhang and Lynd, 2005). (2) thay đổi trong đặc tính của phân tử
cellulose do sự tiêu thụ cơ chất và những mảnh vỡ cellulose (Banka et al., 1988;
Boisset et al., 2000; Chanzy et al., 1983; Din et al., 1991; Halliwell and Riaz, 1970;
Lee et al., 2000; Saloheimo et al., 2002; Walker et al., 1990; Wang et al., 2003;
Woodward et al., 1992). Hoạt động kết hợp của endoglucanase và exoglucanase sẽ dẫn
đến sự thay đổi đặc điểm bề mặt của phân tử cellulose từ đó sẽ làm cho tỷ lệ thủy phân
thay đổi nhanh chóng.
Các tương tác phức tạp giữa endoglucanases, exoglucanases, và sự thay đổi bề
mặt cơ chất trong quá trình thủy phân đã được mô phỏng bằng một mô hình toán học
dựa trên chức năng của chúng (Zhang and Lynd, 2004). Mô hình này dựa trên một tập
hợp các thông số của endoglucanase , cellobiohydrolases với một loạt các cơ chất khác
nhau với 2 đặc tính quan trọng của cơ chất: các thông số của các liên kết β-glycoside
dễ bị phân cắt bởi cellulase (Zhang and Lynd, 2004) và độ trùng hợp (DP) (Okazaki
and Moo-Young, 1978; Zhang and Lynd, 2004). Bằng cách này, thông tin từ các
nguồn khác nhau đã được giới thiệu một cách mạch lạc tạo điều kiện cho sự hiểu biết
rõ hơn về quá trình thủy phân cellulose. Ví dụ, tỷ lệ phản ứng được tính toán theo mô
hình trên phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đó, bao gồm những tác động của đặc
điểm cơ chất lên hoạt tính của exoglucanase và endo glucanase; các tác động của đặc
điểm cơ chất và điều kiện thí nghiệm về mức độ tổng hợp của endo-exo; và tác động

của enzyme hoạt động với tốc độ phản ứng khác nhau đối với các cơ chất khác nhau.
Mô hình này cũng cho thấy rằng gần như không thể dự đoán hiệu suất thủy phân của
cellulase từ một cơ chất rắn này với một cơ chất rắn khác vì sự khác biệt lớn trong
nồng độ cellulase tổng, tỷ lệ endo/exocellulases, thời gian phản ứng, và đặc điểm cơ
chất. Do đó, khôi phục lại nguồn enzyme có thể được tiến hành để thu được được khả
năng thủy phân tốt hơn cho một cơ chất chuyên biệt (Knauf và Moniruzzaman, 2004).

Chuyên ngành công nghệ sinh học

7

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

Hình 4: Sơ đồ cơ chế thủy phân cellulose của phức hệ enzyme cellulase.
(*Nguồn: Zhang, Y.H.P. et al., (2006))

2.2.2 Cellulase
2.2.2.1 Sơ lƣợc về vi sinh vật phân huỷ cellulose
Như đã được miêu tả cellulase là phức hệ enzyme có khả năng xúc tác quá
trình thủy phân cellulose thành glucose. Trong tự nhiên, có rất nhiều loại vi sinh vật có
khả năng tổng hợp cellulase như: nấm, vi khuẩn, động vật nguyên sinh…khi được nuôi
dưỡng trong môi trường có cellulose.
Nấm mốc là một trong những đối tượng vi sinh vật có khả năng sinh tổng
hợp cellulose

mạnh nhất. Nhiều chủng nấm mốc thuộc các chi

Aspergillus,

Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete đã được nghiên cứu là có khả năng sinh
tổng hợp cellulose mạnh như: Aspergillus niger (Coral et al., 2002; Dahot and
Noomri, 1996), A. flavus, A. fumigatus (Das et al., 1997),
2008), Trichoderma reesei
brasilianum

(Palonen et al., 1999),

(Henning et al., 2005), Penicillium sp.

A. terreus (Gao et al ,

Penicillium

persicinum, P.

(Trịnh Đình Khá, 2006)

Phanerochaete chrysosporium (Henriksson at el., 1999).
Bên cạnh nấm mốc, vi khuẩn cũng được xem là một trong những đối tượng
có khả năng sinh tổng hợp cellulose khá phong phú. Nhiều loài vi khuẩn hiếu khí đã
Chuyên ngành công nghệ sinh học

8

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học

Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

được nghiên cứu là có thể kể đến như Acidothemus cellulobuticus (Bergquist et al.,
1999), Bacillus pumilis (Gordon et al., 1973) Cellulomonas flavigena, C. udai
(Bagnaga et al., 1987), Pseudomonas fluoressens (Kim, 1987). Không chỉ có các vi
khuẩn hiếu khí mà một số vi khuẩn kỵ khí cũng có khả năng sinh tổng hợp cellulose
mạnh điển hình là loài Clostridium (Sharma and Hagen, 1995).
Nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces, Streptomyces cũng có khả
năng sinh tổng hợp cellulose. Một số ví dụ có thể kể đến như: Actinomyces griseus
(Nguyễn Đức Lượng và Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999), Streptomyces reticuli (Wachinger
et al., 1989).
Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì vi sinh vật được xem là nguồn
cung cấp enzyme với nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa so với
enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật. Vì thế, chúng được sử dụng rộng rãi
trong quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme.
Trước hết, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với
số lượng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con người chủ động tạo ra được. Chu
kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16-100 giờ). Vi sinh vật sinh trưởng, phát
triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng và kích thước rất nhỏ nhưng tỷ lệ
enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ
dàng, hiệu suất thu hồi cao. Hơn nữa, enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, hơn
hẳn các sinh vật khác. Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối vi
sinh vật làm nguồn sản sinh enzyme.
Vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trường, thành phần dinh
dưỡng nuôi chúng cũng như một số tác nhân lý hóa, cơ học khác. Do đó có thể thay
đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn những chủng cho hàm lượng enzyme đáng kể

với hoạt tính xúc tác cao. Có thể nói rằng, với vi sinh vật, người ta có thể điều khiển
sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn trên các đối tượng khác để tăng lượng enzyme
được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme. Tuy vậy, trong quá trình chọn
nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố
để có biện pháp xử lý thích hợp.

Chuyên ngành công nghệ sinh học

9

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

2.2.2.2 Một số ứng dụng của cellulase
Tuy được nghiên cứu sau các enzyme như protease hoặc lipase nhưng
cellulase thu hút được sự chú ý của các nhà khoa học bởi vì sự đa dạng trong ứng dụng
của nó đối với đời sống. Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công
nghiệp như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công
nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy,
đặc biệt trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh.
Trong công nghiệp thực phẩm
Các ứng dụng của cellulase trong sản xuất thực phẩm bao gồm thủy phân
cellulose trong các chất thải từ cam chanh, tăng đặc tính thơm của các loại nước ép
trái cây thông qua việc thủy phân các tiền chất glucoside tạo hương vị , làm giảm vị
đắng của các loại nước ép chanh qua việc thủy phân prunin, loại bỏ chất xơ từ bánh
dầu có thể ăn được, tăng thu hồi tinh bột từ khoai tây, nâng cao hiệu suất chiết xuất

protein từ lá cây và cỏ, làm mềm trái cây và rau trước khi nấu ăn, tăng hiệu suất chiết
xuất tinh dầu và hương liệu từ sự thủy phân cellulose trong các mô thực vật, chiết xuất
các thành phần trong trà xanh, thay đổi cấu trúc các nguồn thực phẩm như rau, đậu
nành

và

lúa

để

tăng

hàm

lượng

của

các

chất

dinh

(www.govnews.org/mhonarc/gov/usfed/nara/fed-register/rules/msg00487.html).

dưỡng
Các

sản phẩm mới có giá trị kinh tế cao thu được bằng cách xử lý nguồn phế phẩm
cellulose bằng enzyme cellulase là các carbohydrates, được sử dụng trực tiếp làm làm
thực phẩm chức năng hoặc lên men rượu, hoặc dùng trong ngành công nghiệp hóa chất
và đồ uống (Winkelmann, 1992).
Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Sử dụng cellulase xử lý nguyên liệu giàu cellulose, glucan trước khi lên men đã
làm tăng hiệu suất thu hồi dung môi lên trung bình là 1,5%. Nhiều chế phẩm enzyme
đã đuợc sử dụng trong ngành công nghiệp này như neutrase 0,5 lít có chứa cellulose
sử dụng trong công nghiệp sản xuất ethanol. Đồng thời, nhiều chủng vi sinh vật kỵ
khí trong chi Clostridium sinh tổng hợp cellulase sử dụng trong công nghệ lên men
sản xuất dung môi hữu cơ, acetic acid (Cheryan et al.,1997) sản xuất acetone, butanol
và isopropanol (Duree, 1998).
Chuyên ngành công nghệ sinh học

10

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, nguyên liệu ban đầu được nghiền
cơ học và xử lý hóa học để các sợi gỗ được tách riêng khỏi nhau chuyển thành bột
giấy chứa các sợi và bột mịn. Trong quy trình sản xuất giấy cần loại bỏ lignin khỏi bột
giấy, còn cellulose thì được giữ lại. Phương pháp thông thường là bổ sung dung dịch
chlor hoặc chlor diocide. Đây là một phương pháp tốn kém và thường gây ô nhiễm
môi trường do thành phần chlor tồn dư trong nước thải. Vì thế, trong những năm gần

đây một giải pháp mới được đưa ra để thay thế phương pháp truyền thống, đó là sử
dụng các chế phẩm enzyme trong đó có cellulase để xử lý bột giấy.
Cellulase thường được bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làm thay đổi
nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng
lượng cho quá trình nghiền cơ học. Đồng thời xử lý cellulose trước khi xử lý hóa chất
nghiền bột hóa học sẽ làm phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ, làm tăng khả năng khuếch tán
của hóa chất vào phía trong gỗ, tăng hiệu quả khử lignin (Hồ Sỹ Tráng, 2006). Đặc
biệt trong công nghệ tái chế giấy, cellulose được sử dụng để tẩy mực in bám trên
giấy. Kỹ thuật này đã mở ra triển vọng đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất
giấy và bột giấy tái sinh (Howard et al., 2003).
Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa
Cùng với protease, lipase, amylase, cellulase và hemicellulase được ứng dụng
để sản xuất chất tẩy rửa. Cellulase sẽ thủy phân các tơ sợi của sợi vải là nơi bám của
các phân tử bụi bẩn, loại bỏ chúng khỏi quần áo. Tính đến năm 2002 đã có nhiều
cellulase được sản xuất dùng cho bột giặt như: endoglucanase và exoglucanase từ
Thermomyces lanuginous (Ole et al., 2002).
Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh
Việc sử dụng enzyme quan trọng nhất trong công tác bảo vệ môi trường là sử
dụng enzyme trong xử lý chất thải, chuyển các chất thải thành sản phẩm có ích, hoặc
trong công nghệ tái sử dụng phế thải, chuyển các phế thải thành sản phẩm có ích.
Trong nhiều năm qua cả ở thế giới và Việt Nam, các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp
enzyme phân hủy cellulose đã được ứng dụng rất có hiệu quả để xử lý rác thải sinh
hoạt.
Chuyên ngành công nghệ sinh học

11

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học

Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

Năm 1999, Nguyễn Lan Hương đã phân lập và tuyển chọn được các chủng vi
khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể ủ rác thải đã rút ngắn
được chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5-7 ngày. Nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và
nấm đã được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong quá trình xử lý rác thải ở Việt
Nam (Lý Kim Bảng et al., 1999; Tăng Thị Chính et al., 1999; Đặng Minh Hằng, 1999;
Phạm Thị Ngọc Lan et al., 1999). Nhiều chế phẩm vi sinh trong đó có chứa hệ sinh
vật sinh tổng hợp cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất để xử lý rác thải. Trong
đó, chế phẩm Micromix 3 khi bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được
15 ngày ủ, giảm một nửa thời gian lên men so với đối chứng. Đồng thời, lượng mùn
tạo thành khi xử lý rác bằng chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29% và các chất dinh
dưỡng cao hơn 10% so với đối chứng. Sản phẩm của quá trình xử lý rác thải đươc phối
trộn và bổ sung thêm một số vi sinh vật có ích cố định đạm tạo thành phân bón vi sinh,
được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp đã góp phần nâng cao năng suất cây trồng,
giảm thiểu được nguồn và nguy cơ gây ô nhiễm môi trường (Lý Kim Bảng et al.,
1999).
Ngoài ra, đã có những nghiên cứu ảnh hưởng của cellulase đến nấm gây bệnh
cây trồng như cellulase của Trichoderma harzianum, từ đó ứng dụng sản xuất thuốc
bảo vệ thực vật sinh học (Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng, 2003).
2.3 Ảnh hƣởng của điều kiện môi trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp cellulase.
Trong tự nhiên, đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các nguồn hợp
chất hữu cơ có sẵn trong môi trường thành các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình
sinh trưởng và phát triển của mình. Khả năng sinh trưởng, phát triển cũng như khả
năng sinh tổng hợp các enzyme chịu sự tác động của nhiều yếu tố môi trường như :
nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường, nguồn carbon, nguồn nitrogen…
2.3.1 Nguồn carbon
Các loài vi sinh vật sinh tổng hợp cellulaese có thể sử dụng nhiều nguồn carbon

khác nhau tùy thuộc đặc điểm của từng loài. Có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số
ít nguồn carbon, có loài không đòi hỏi nghiêm ngặt mà có khả năng sử dụng nhiều
nguồn carbon khác nhau. Nguồn carbon có thể đơn giản như các loại đường đơn,
đường đôi hoặc phức tạp như glucan, tinh bột, cellulose.
Chuyên ngành công nghệ sinh học

12

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

Nghiên cứu của Tăng Thị Chính et al. (1999) cho thấy, nguồn carbon thích hợp
cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập
từ bể ủ rác thải là glucose và CMC. Nguồn carbon thích hợp cho sự sinh trưởng và
sinh tổng hợp cellulase của các xạ khuẩn CD6-9 là tinh bột, dòng CD9-9 là CMC và
saccharose, dòng CD5-12 là lactose; Actinomyces griseus là bã mía hoặc mùn cưa.
Nguồn carbon thích hợp đối với các xạ khuẩn ưu ấm là vỏ lạc hoặc rơm (Phạm Thị
Ngọc Lan et al., 1999).
Đối với các chủng nấm mốc, nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp
cellulase và một số loại enzyme khác là các nguồn carbon tự nhiên, đặc biệt là các phế
phụ phẩm nông nghiệp. Theo Acharya et al., (2008), nguồn carbon thích hợp nhất cho
các chủng A. niger sinh tổng hợp endoglucanase là mùn cưa .Còn theo kết quả nghiên
cứu của Ojumu et al., (2003), chủng A. flavus có khả năng sinh tổng hợp cellulase
khi sử dụng mùn cưa, bã mía hay lõi ngô làm nguồn cơ chất, trong đó mùn cưa được
xem là nguồn cơ chất tối ưu.
Các loài Penicillium pinophilum, P. persicinum, P. brasilianum sinh tổng hợp

cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự nhiên, còn đối với nguồn carbon xylan
thì khả năng sinh tổng hợp rất kém (Henning et al., 2005). Theo kết quả nghiên cứu
của Trịnh Đình Khá (2006), nguồn carbon thích hợp nhất cho chủng Penicillium sp.
DTQ-HK1 là rơm.
2.3.2 Nguồn nitrogen
Các loài vi sinh vật khác nhau có nhu cầu khác nhau đối với nguồn nitrogen.
Nhìn chung, các loài đều có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ
nhưng mức độ đồng hóa tùy thuộc từng loài. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu
nhiệt sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong môi trường chứa nguồn nitrogen là
peptone và cao nấm men (Tăng Thị Chính et al., 1999).
Nguồn nitrogen urea và đậu nành ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình sinh tổng
hợp cellulase của chủng A. niger NRRL-363 với hoạt tính cellulase tổng số từ 46 đến
76 IU/g (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003). Nghiên cứu của Taled et al., (2009) cho
thấy, 2 dòng vi khuẩn họ Bacilli có thể sử dụng nhiều nguồn nitrogen khác nhau như:
yeast extract, beef extract, urea, peptone, ammonium nitrate. Trong đó, yeast extract
Chuyên ngành công nghệ sinh học

13

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

là nguồn nitrogen tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp cellulase của 2 dòng vi khuẩn
này.
2.3.3 Nhiệt độ nuôi cấy
Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trưởng, các loài vi sinh vật được chia làm

3 nhóm: các loài ưa lạnh và chịu lạnh; các loài ưa ấm và các loài chịu nhiệt. Các loài
ưa lạnh có khả năng sinh trưởng trong điều kiện dưới 150C, các loài ưa ấm thường
sinh trưởng phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20-370C; còn các loài chịu nhiệt có khả
năng sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 500C.
Khi nghiên cứu các vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải
cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 45550C và có thể chịu được nhiệt độ 65-800C (Tăng Thị Chính et al., 1999). Nghiên
cứu của Nguyễn Lan Hương et al. (2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ
khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 500C . Dòng vi khuẩn
Bacillus Subtillis

có khả năng sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở nhiệt độ 400C

(Mohamed et al., 2010). Trong khi đó, Bakare et al. (2005) trình bày nhiệt độ tối ưu
cho sự sinh tổng hợp cellulase của dòng Pseudomonas Fluorescence trong khoảng 30350C.
2.3.4 pH môi trƣờng
pH môi trường ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của
các chủng vi sinh vật. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trường ban đầu
thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt
sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trường ban đầu là 6,0; còn dòng vi khuẩn
họ Cellumonas, Bacillus, Micrococcus sinh tổng hợp enzyme tối ưu ở pH trung tính
(Immanuel et al, 2006). pH 5,0 là tối ưu cho dòng vi khuẩn Chaetomium crispatum
sinh tổng hợp cellulase (Herman and Vandamme, 1983).
Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các loại
enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác như: thời gian
nuôi cấy, tốc độ lắc và sục khí, mật số vi sinh vật được chủng vào ban đầu.

Chuyên ngành công nghệ sinh học

14

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học


Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010

Trường ĐHCT

2.4. Sơ lƣợc một số phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Các phƣơng pháp vi sinh
2.4.1.1. Phƣơng pháp pha loãng vi sinh vật việc pha loãng mẫu được thực
hiện bằng nước cất. Khi pha loãng, cần đưa ống chứa mẫu lên máy vortex để trộn đều
mẫu.
Nguyên tắc: dịch tế bào sử dụng trong các phòng thí nghiệm có nồng độ
cao, thường nhiều hơn 106 tế bào/ml, nên cần phải pha loãng mẫu. Phương pháp chuẩn
là thực hiện các bước pha loãng để giảm nồng độ tế bào từ 10 đến 100 lần cho đến khi
đạt vài nghìn tế bào/ml (Nguyễn Đức Lượng, 2003). (phụ lục 1)
2.4.1.2. Phƣơng pháp đếm mật số vi sinh vật bằng phuơng pháp đếm
sống
Môi trường được pha loãng nhiều lần rồi chuyển đến dĩa petri và trộn lẫn
với môi trường chứa agar khoảng 450C, để nguội, môi trường đặc lại, đem ủ trong tủ ủ
và đếm số khuẩn lạc (colony) rồi suy ra số tế bào trong dung dịch muốn đếm. Phương
pháp này gọi là phương pháp đếm sống vì chỉ có vi sinh vật sống mới phát triển thành
khuẩn lạc (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002). (phụ lục 1).
2.4.1.3. Phƣơng pháp đo đƣờng kính thủy phân.
Mục đích: Đánh giá sơ lược về khả năng phân hủy bã mía của vi khuẩn,làm
cơ sở khảo sát cho những thí nghiệm sau.
Nguyên tắc: Khi enzim cellulase tác dụng lên cơ chất bã mía trong môi
trường thạch, cơ chất bị phân giải làm cho độ đục môi trường giảm dần và hình thành
vòng tròn thủy phân trong suốt. Đường kính của vòng tròn thủy phân tỉ lệ thuận với
độ hoạt động của cellulase (Nguyễn Đức Lượng, 2003). (phụ lục 1).

2.4.2. Các phƣơng pháp sinh hóa phân tích
2.4.2.1. Phƣơng pháp định lƣợng cellulose
Nguyên tắc: Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền nhiệt
của cellulose đối với acid mạnh và bazơ mạnh, cellulose không bị phân hủy bởi acid
yếu. Các hợp chất đi kèm với cellulose (hemicellulose, lignin, tinh bột,…) ít bền hơn

Chuyên ngành công nghệ sinh học

15

Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học