Ứng Dụng Kỹ Thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Để Nghiên Cứu Đa Dạng Di Truyền Virus Đốm Trắng
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (909.26 KB, 45 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN
REACTION) ĐỂ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN
VIRUS ĐỐM TRẮNG (WHITE SPOT SYNDROME VIRUS)
TRÊN TÔM BẠC (Fenneropenaeus merguiensis), TÉP TRẤU
(Macrobrachium lanchesteri) VÀ TÔM SÚ (Penaeus monodon)
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
ThS. BÙI THỊ MINH DIỆU
VIỆN NC&PT CNSH
SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN THÁI HỌC
MSSV: 3064388
LỚP:CNSH K32
Cần Thơ, Tháng 5/2010
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên)
(ký tên)
Bùi Thị Minh Diệu
Nguyễn Thái Học
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày
tháng
năm 2010
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)
LỜI CẢM TẠ
Trước tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đển tất cả quý thầy cô trong trường Đại
học Cần Thơ đã hỗ trợ em trong suốt bốn năm dài trên con đường đi tìm tri thức. Em
xin cám ơn các thầy, cô, anh, chị của Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh
học, Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ và tạo mọi đều kiện thuận lợi cho em trong
suốt quá trình học tập và rèn luyện cũng như trong quá trình thực hiện luận văn này.
Đặc biệt em xin chân thành cám ơn cô cố vấn Trần Thị Xuân Mai và cô Bùi Thị Minh
Diệu- người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, luôn động viên và cung cấp nhiều tài
liệu, kiến thức quý báu, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi và tốt nhất để em hoàn
thành luận văn này.
Em xin chân thành cám ơn thầy Nguyễn Thanh Phương- Khoa Thủy Sản,
trường Đại Học Cần Thơ; cô Kim Hường- Khoa Nông Nghiệp & Thủy Sản, trường
Đại học Trà Vinh và anh Phạm Văn Mười- Cà Mau và tất cả bà con nông dân đã nhiệt
tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thu mẫu thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp.
Cám ơn các bạn trong lớp Công Nghệ Sinh Học K32 đã luôn bên cạnh em và
cùng em chia sẻ biết bao buồn vui trong những ngày sống xa nhà. Cám ơn các bạn đã
cho mình rất nhiều kỉ niệm đẹp trong suốt quãng đời sinh viên.
Và cuối cùng em vô cùng biết ơn Ba mẹ đã hi sinh thầm lặng để nuôi dưỡng,
che chở cho con đến ngày khôn lớn cùng tất cả anh chị em trong gia đình đã yêu
thương, thông cảm cho con và đã miệt mài cùng con trong suốt những chặng đường
dài.
Em xin chân thành cám ơn!
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
TÓM TẮT
Qua một số nghiên cứu cho thấy virus đốm trắng (White Spot Syndrome VirusWSSV) có sự biến đổi về bộ gen theo vị trí địa lý, khi thay đổi ký chủ khác nhau thì
cũng có thay đổi một số kiểu gen và có khả năng lây nhiểm trở lại tôm sú (Penaeus
monodon) gây bùng phát dịch bệnh trên diện rộng…, gây thiệt hại nặng nề cho
nghành nuôi tôm. Do đó vấn đề đặt ra là cần phải tìm hiểu sự biến đổi di truyền của
virus đốm trắng trên các ký chủ khác nhau để từ đó làm tiền đề định hướng cho các
phương pháp ngăn ngừa và phòng trị đạt hiệu quả cao nhất góp phần tăng giá trị kinh
tế của tôm sú. Nội dung của đề tài này là tìm ra các chỉ thị phân tử thể hiện sự khác
biệt về di truyền trên các ORF thuộc vùng gen VNTRs (variable number tandem
repeats) của các chủng WSSV (White Spot Syndrome Virus) trích trên tôm sú, tôm bạc
(Fenneropenaeus merguiensis) và tép trấu (Macrobrachium lanchesteri) ở huyện
Hồng Dân, Đông Hải thuộc tỉnh Bạc Liêu và huyện Đầm Dơi tỉnh Cà Mau. Kết quả
thu được có thể sử dụng ORF75 để so sánh sự khác biệt di truyền của các chủng
WSSV trên tôm sú ở trong phạm vi từng ao và ORF125 để so sánh sự khác biệt về di
truyền của WSSV trên tôm sú, tép trấu giữa các ao với nhau thông qua kiểu gen đặc
trưng của từng ao. Với tỉ lệ sự giống nhau cao về thông tin di truyền của các mẫu
WSSV trên tôm sú và tôm bạc ở 3 ORF được khảo sát có thể cho rằng tôm bạc là
nguồn lây nhiễm WSSV chính cho tôm sú trong ao.
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
i
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ..........................................................................................................
LỜI CẢM TẠ ...................................................................................................................
TÓM TẮT ...................................................................................................................... i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................... iv
DANH SÁCH HÌNH ......................................................................................................v
CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................................... vi
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ...........................................................................................1
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................3
2.1 Sơ lƣợc tình hình nuôi tôm và bệnh tôm ở nƣớc ta ..........................................3
2.1.1 Diện tích và sản lượng tôm nuôi .....................................................................3
2.1.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm sú .....................................................................4
2.2 Sơ lƣợc về các ký chủ trung gian ........................................................................5
2.3 Bệnh đốm trắng ....................................................................................................5
2.3.1 Dấu hiệu bệnh lý .............................................................................................6
2.3.2 Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) ...............................................................6
2.4 Các nghiên cứu liên quan vấn đề phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên
các ký chủ .................................................................................................................12
2.5 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)……………………………… 13
2.5.1 Phản ứng PCR ...............................................................................................13
2.5.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến sản phẩm PCR ..................................................14
2.5.3 Ứng dụng kỹ thuật PCR ................................................................................15
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP..............................................16
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu .....................................................................16
3.2 Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ và hóa chất ........................................................16
3.2.1 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................16
3.2.2 Dụng cụ .........................................................................................................16
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
ii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
3.2.2 Mồi, hóa chất .................................................................................................16
3.3 Phƣơng pháp tiến hành ....................................................................................17
3.3.1 Thu và bảo quản mẫu tôm và ký chủ ............................................................17
3.3.2 Ly trích và kiểm tra chất lượng ADN ..........................................................17
3.3.3 Thực hiện phản ứng PCR và điện di .............................................................18
3.3.4 Xác định số đơn vị lặp lại của ORF94 và ORF125 ......................................19
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................20
4.1 Đa dạng sinh học của WSSV trên tôm sú và tép trấu ở huyện Hồng Dân ...20
4.1.1 Đa dạng của WSSV trên tôm sú ở huyện Hồng Dân ....................................20
4.1.2 Đa dạng của WSSV trên tép trấu ở huyện Hồng Dân ...................................21
4.1.3 Mối liên hệ di truyền của WSSV trên tôm sú và tép trấu ở huyện Hồng Dân
................................................................................................................................22
4.2 Đa dạng sinh học của WSSV trên tôm sú, tôm bạc và tép trấu ở huyện Đông
Hải tỉnh Bạc Liêu và huyện Đầm Dơi tỉnh Cà mau ..............................................24
4.2.1 Đa dạng của WSSV trên tôm sú ở huyện Đông Hải và Đầm Dơi ................25
4.2.2 Đa dạng di truyền của WSSV trên tép trấu và tôm bạc ở Đông Hải và Đầm
Dơi ..........................................................................................................................26
4.2.3 Mối liên hệ di truyền giữa các mẫu WSSV trên tép trấu, tôm bạc và tôm sú ở
2 huyện Đông Hải và Đầm Dơi. .............................................................................26
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................28
5.1 Kết luận ...............................................................................................................28
5.2 Đề nghị ................................................................................................................28
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................29
PHỤ LỤC .........................................................................................................................
Phụ lục 1. Thông tin mẫu thí nghiệm
Phụ lục 2. Số liệu đo OD của các mẫu phân tích
Phụ lục 3. Kết quả hình gel của các mẫu thí nghiệm
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
iii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Diện tích các vùng nuôi tôm năm 2001 và 2003 ..................................... 3
Bảng 2. So sánh các đơn vị lặp lại của các ORF mang các lặp lại có định hướng,
thuộc vùng không tương đồng giữa ba chủng WSSV ........................................... 9
Bảng 3. Danh sách các mẫu sử dụng trong nghiên cứu của Dieu et al., 2004 .... 11
Bảng 4. Các primer được sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 16
Bảng 5. Kiểu gen VNTRs của mẫu WSSV trên tôm sú và tép trấu ở huyện Hồng
Dân ...................................................................................................................... 22
Bảng 6. Kiểu gen VNTRs của mẫu WSSV trên tôm sú, tôm bạc và tép trấu ở
huyện Đông Hải và Đầm Dơi .............................................................................. 24
Bảng 7. Nguồn gốc và ký hiệu các mẫu dùng phân tích thí nghiệm ......................
Bảng 8. Kết quả OD của các mẫu phân tích ...........................................................
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
iv
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Phân tích bootstrap (100 bản sao) của cây phát sinh loài không rễ của protein
ADN polymerase tạo nên bởi thuật toán phân tích PAUP. Đường đậm chỉ sự giống
nhau đến trên 70% (giá trị bootstrap >70) (van Hulten et al., 2001a) ............................ 7
Hình 2. Mô hình virion của WSSV (Mark, 2005) ........................................................... 8
Hình 3. Chu kì gia nhiệt của phản ứng PCR đối với primer VP26 ............................... 18
Hình 4. Kết quả PCR với ORF75 của các mẫu WSSV trên tôm sú .............................. 20
Hình 5. Kết quả PCR với ORF125 của các mẫu WSSV trên tôm bạc và tép trấu ........ 25
Hình 6. Kết quả PCR với ORF75 của các mẫu WSSV trên tôm sú ..................................
Hình 7. Kết quả PCR với ORF75 của mẫu WSSV trên tôm bạc và tép trấu ....................
Hình 8. Kết quả PCR với ORF94 của các mẫu WSSV trên tôm sú .................................
Hình 9. Kết quả PCR với ORF94 của mẫu WSSV trên tôm bạc và tép trấu ....................
Hình 10a. Kết quả PCR với ORF125 của các mẫu WSSV trên tôm sú ............................
Hình 10b. Kết quả PCR với ORF125 của các mẫu WSSV trên tôm sú ............................
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
v
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
CÁC TỪ VIẾT TẮT
CBV
Chinese baculovirus
ĐBSCL
Đồng bằng sông Cửu Long
FAO
Food and Agriculture Organization
HHNBV
Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Baculovirus
ICTV
the International Committee on Taxonomy for Viruses
OIE
Office International des Epizooties
ORF125
Open Reading Frame 125
ORF75
Open Reading Frame 75
ORF94
Open Reading Frame 94
PCR
Polymerase chain reaction
OD
Optical Density
PRDV
Penaid rod-shaped DNA virus
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphisms
RU
Repeat Unit
RV-PJ
Rod-shaped nuclear virus of Penaeus japonicus
SEMBV
Systemic ectodermal and mesodermal baculovirus
VNTRs
Variable number tandem repeats
TH-96-II
Chủng WSSV có ly trích từ mẫu tôm thu ở Thái Lan vào năm 1996
WSBV
White Spot Baculovirus
WSD
White Spot Disease
WSSV
White Spot Syndrome Virus
WSSV-CN
Chủng WSSV ly trích từ các mẫu tôm thu được ở Trung Quốc
WSSV-TH
Chủng WSSV ly trích từ các mẫu tôm thu được ở Thái Lan
WSSV-TW
Chủng WSSV ly trích từ các mẫu tôm thu được ở Đài Loan
WSSV-VN
Chủng WSSV ly trích từ các mẫu tôm thu được ở Việt Nam
YHD
Yellow Head Virus
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
vi
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
Ngày nay ngành nuôi trồng thủy hải sản đang phát triển rộng khắp trên toàn thế
giới nhằm góp phần đáng kể vào sự tăng trưởng kinh tế đồng thời đáp ứng nhu cầu tiêu
dùng gia tăng, bên cạnh đó còn ngăn ngừa hiện tượng khai thác quá mức nguồn tài
nguyên thiên nhiên đang có nguy cơ cạn kiệt. Trong đó, tôm sú là loài rất được chú
trọng do phù hợp với thị hiếu và khẩu vị của người tiên dùng và tôm sú cũng đã mang
lại giá trị lợi nhuận đáng kể cho người nuôi, tăng thu nhâp cho nền kinh tế quốc dân.
Tuy nhiên,trong khoảng thời gian gần đây hiện tượng nuôi bùng phát thiếu kiểm soát,
người nuôi không đủ trình độ kỹ thuật đã gây nên nhiều vấn đề nghiêm trọng như
không rà soát hết được nguồn gốc tôm giống do đó không đảm bảo tính ổn định về
chất lượng, sử dụng các loại nhiều loại hóa chất gây ô nhiễm môi trường nuôi trầm
trọng,… Từ đó các loại dịch bệnh có cơ hội bùng phát và lây lan nhanh chóng thành
dịch gây nên nhiều khó khăn cho nhà quản lý và nhất là thiệt hại rất lớn về kinh tế cho
người nuôi - thời vàng son của con tôm sú cũng từ đó trôi qua. Trong đó phải kể đến
các bệnh do virus và vi khuẩn gây ra, nó đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự ổn
định và lợi nhuận của nền công nghiệp nuôi tôm trên toàn thế giới (van Hulten et al.,
2001). Hiện nay, người ta biết được có trên 20 loại virus là tác nhân gây bệnh ở tôm
(Walker et al., 2009), hầu hết các loại virus này là thành viên của các họ Pavorividae,
Baculoviridae, Picornaviridae, Togaviridae và một số họ khác. Phổ biến nhất hiện
nay phải kể đến virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV), virus đầu vàng (YHV),
Baculovirus (MBV) và IHHNV (virus nhiễm dưới vỏ gây hoại tử cơ quan tạo máu).
Trong số đó thì virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) là tác nhân gây ra thiệt hại
nghiêm trọng nhất (Rosenberry, 2004 ),…
Một số nghiên cứu đã cho thấy các chủng WSSV ở các vị trí địa lý khác nhau có
sự khác biệt về bộ gen (Nadala and Loh, 1998; Lo et al., 1999; Wang et al., 2000;
Marks et al., 2004; Dieu et al., 2004), và một chủng WSSV khi chuyển qua kí chủ
khác cũng thay đổi một số kiểu gen (Dieu et al., 2004). WSSV có thể tồn tại trên nhiều
kí chủ khác nhau như cua, tép tạp và một số loài giáp xác khác (Lo et al., 1996a; Wang
et al., 1998) và theo các ký chủ này lây lan từ ao này sang ao khác, vùng này sang
vùng khác,… rất khó kiểm soát gây bùng phát dịch trên diện rộng. Do đó vấn đề cấp
thiết đặt ra là cần phải tìm hiểu thông tin di truyền của virus đốm trắng trên các ký chủ
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
1
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
khác nhau để từ đó hiểu được mối liên hệ di truyền giữa chúng hầu làm tiền đề định
hướng cho các phương pháp ngăn ngừa sự lan truyền virus. Vì vậy đề tài “ đa dạng di
truyền của virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus) trên tôm bạc
(Fenneropenaeus merguiensis), tép trấu (Macrobrachium lanchesteri) và tôm sú
(Penaeus monodon)” được thực hiện.
Mục tiêu đề tài
Sử dụng các kỹ thuật SHPT để xác định các dấu phân tử cho thấy sự đa khác biệt
về bộ gen của WSSV trên các mẫu ký chủ thường tồn tại trong ao nuôi tôm khác nhau.
Góp phần làm sáng tỏ các nguyên nhân đẫn đến dịch bệnh lan rộng trên các ao nuôi
nhanh chóng từ đó định hướng nghiên cứu cho các phương pháp khống chế, ngăn ngừa
sự phát dịch, làm giảm rủi ro trong sản xuất, làm tăng giá trị kinh tế con tôm, mang lại
lợi nhuận nhiều hơn cho người nuôi.
Tìm ra dấu phân tử thích hợp để khảo sát sự khác biệt di truyền của các chủng
WSSV trên các ký chủ khác nhau.
Nội dung đề tài
Ứng dụng kỹ thuật PCR để phân tích các mẫu ADN chiết tách từ tôm sú, tép trấu
và tôm bạc thu được ngẫu nhiên trong các ao tôm đang phát triển hoặc các ao bị nhiễm
WSSV.
Sử dụng các dấu phân tử mang các đơn vị trình tự lặp lại thuộc các vùng biến đổi
chính trên bộ gen WSSV để khảo sát sự đa dạng di truyền của WSSV trên các ký chủ
này.
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
2
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lƣợc tình hình nuôi tôm và bệnh tôm ở nƣớc ta
2.1.1 Diện tích và sản lượng tôm nuôi
Hiện nay, Việt Nam là một trong những nước có nghành nuôi trồng thủy sản phát
triển trên thế giới. Theo thống kê của Bộ thủy sản năm 1999, tổng diện tích nuôi tôm
sú ở miền Bắc là 39.429 ha, ở miền Trung là 12.530 ha và ở miền Nam là 238.279 ha
trong đó Cà Mau và Bạc Liêu có diện tích nuôi lớn nhất cả nước. Diện tích thả nuôi
ngày càng tăng nhanh thể hiện trong năm 2001 và 2003 ở các vùng khác nhau trong cả
nước như sau:
Bảng 1. Diện tích các vùng nuôi tôm năm 2001 và 2003
Khu vực
2001
2003
Đồng bằng sông Hồng
12.421,7
15.171
Bắc trung bộ
8.879.9
12.081
Duyên hải nam trung bộ
13.312,6
13.477,6
Đông nam bộ
7.165,5
10.363
Đồng bằng sông Cửu Long
429.927,2
518.557
(Nguồn: Bộ thủy sản, 2005. , ngày 22/05/2009)
Tính đến năm 2006, đồng bằng sông Cửu Long (ĐSCL) có hơn 600.000 ha đất
nuôi trồng thủy sản trong đó có hơn 450.000 ha đất nuôi tôm sú. Tỉnh Cà Mau hiện có
gần 250.000 ha nuôi tôm sú. Trong khi đó, diện tích nuôi tôm của tỉnh Bạc Liêu là
120.000 ha trong đó việc bố trí nuôi công nghiệp là 11.000 ha, bố trí nuôi tôm lúa là
22.000 ha, dự kiến sẽ nâng lên 30.000 ha. ( ngày 12/03/2009)
Sản lượng tôm nuôi cũng tăng theo diện tích nuôi. Năm 2001, sản lượng tôm
toàn quốc là 154.911 tấn, năm 2003 tăng lên 237.880 tấn. Riêng ở vùng ĐBSCL có sự
tăng trưởng đáng kể nhất với sản lượng năm 2001 là 118.432,4 tấn tăng lên 182.221
tấn vào năm 2003 (Bộ thủy sản, 2006, www.fistenet.gov.vn, ngày 22/05/2009) . Và ở
hầu hết các nơi thì tôm đều được nuôi đưới nhiều hình thức khác nhau như thâm canh,
bán thâm canh, nuôi tôm luân canh trồng lúa, nuôi quảng canh cải tiến,… và nổi bật
nhất là mô hình nuôi công nghiệp và bán công nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế rất
cao.
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
3
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
2.1.2 Tình hình dịch bệnh trên tôm sú
Cùng với mức độ thâm canh và sự mở rộng diện tích nuôi tăng lên tràn lan thiếu
kiểm soát thì dịch bệnh cũng theo đà đó gia tăng. Ngay từ đầu những năm 90, với sự
phát triển của nghề nuôi tôm công nghiệp, dịch bệnh trên tôm ở Việt Nam cũng bắt
đầu xuất hiện và lây lan nhanh chóng. Theo thống kê của bộ Thủy sản năm 1995 thì từ
năm 1993-1995, dịch bệnh tôm đã báo động trên toàn quốc làm thiệt hại số tiền lên
đến hàng ngàn tỉ đồng. Trong năm 1994 tổng diện tích có dịch bệnh là 84.558 ha với
sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn với tổng trị giá khoảng 294 tỷ đồng. Đến nay,
dịch bệnh vẫn còn tồn tại và tiếp tục lây lan trên diện tích ngày càng rộng gây tổn thất
nghiêm trọng cho người nuôi tôm. Ước tính đến 06/2006, cả nước có khoảng 100.000
ha diện tích tôm nuôi bị thiệt hại, tập trung nhiều nhất ở các tỉnh như Cà Mau, Bạc
Liêu, Sóc Trăng,… Bộ Thủy Sản cho biết tình hình nuôi tôm trên cả nước vẫn diễn
biến phức tạp và có chiều hướng gia tăng, đặc biệt là tình trạng tôm chết xảy ra phổ
biến ở các vùng nuôi tôm thâm canh và công nghiệp. (www.thitruong.vnn.vn, ngày
22/05/2009).
Năm 2003, cả nước có 546.757 ha tôm nuôi nước lợ thương phẩm, trong đó diện
tích ao nuôi tôm bệnh và chết là 30.083 ha, tập trung nhiều ở các tỉnh ven biển từ Đà
Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha tôm chết nhiều, chiếm tỉ lệ 97,06% diện tích
tôm chết cả nước. Trong năm 2003-2004 tỉnh Cà Mau có tỉ lệ diện tích bị bệnh trên
50%, và tập trung nhiều ở các mô hình nuôi với mật độ cao như công nghiệp, bán công
nghiệp, thâm canh,… và ở từng khu vực khác nhau trong tỉnh thi tỉ lệ thiệt hại cũng
khác nhau. Tương tự ở tỉnh Trà Vinh tính đến tháng 03/2006 toàn huyện Duyên Hải có
8.250 ha thả nuôi (chiếm trên 50% số hộ của huyện năm 2006) với trên 452 triệu con
giống trên diện tích gần 11.050 ha. Trong đó đã có 1.910 hộ thả tôm bị chết dưới 45
ngày tuổi với số lượng khoảng 100 triệu con trên diện tích khoảng 1.350 ha. Toàn tỉnh
bị gần như mất trắng (Trần Vũ và Trần Phương, 2006).
Vào năm 2008, mùa tôm mới của ĐBSCL đã bước vào hơn hai tháng, vậy mà
tình trạng tôm sú chết hàng loạt đã diễn ra gay gắt, trên khoảng 100.000 ha, trong đó
hơn 85% là diện tích luân canh lúa - tôm sú kết hợp. Tại các tỉnh Cà Mau, Trà Vinh,
Bạc Liêu, Sóc Trăng, Kiên Giang,... mức độ thiệt hại từ 20%-90%, cá biệt có nhiều
vùng tôm ở Kiên Giang mức thiệt hại đến 100% diện tích. Tại các tỉnh Trà Vinh, trong
1,8 tỷ con tôm sú giống thả nuôi trên diện tích 22.620 ha có 11.280 ha bị thiệt hại, số
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
4
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
tôm bị chết hơn 818 triệu con, chiếm gần 50% diện tích thả nuôi. Tôm chết do bệnh
đốm trắng, đỏ thân,… nên nông dân thu hoạch non ở giai đoạn 30 đến 60 ngày tuổi.
Thiệt hại nặng nhất trong cơn dịch bệnh này là các huyện Duyên Hải, Cầu Ngang và
Châu Thành.Theo các nhà khoa học, tôm chết phần nhiều do chất lượng con giống
kém, bị nhiễm virus MBV (tôm không có sức đề kháng, chậm lớn), có đốm trắng, đỏ
thân,... Ngoài ra, còn có yếu tố thời tiết và môi trường.
( ngày 22/05/2009)
Tóm lại trên hầu hết các diện tích bị thiệt hại trên thì nguyên nhân chủ yếu phải
kể đến là các bệnh do virus gây nên. Nhất là bệnh do virus đốm trắng (WSSV), bệnh
đầu vàng,… Bệnh lây lan nhanh chóng và gây tổn thất nặng nề đến thu nhập của người
nuôi tôm. Bệnh có thể lây lan qua nhiều đường khác nhau như nguồn giống, từ mẹ
sang con, qua nguồn nước hay thông qua các kí chủ mang mầm bệnh. Chính vì vậy
gây nên tâm lý hoang mang cho người nuôi cũng như đặt vấn đề lớn cho các nhà quản
lý và nghiên cứu.
2.2 Sơ lƣợc về các ký chủ trung gian
Trong các ao tôm nuôi thường có tồn tại nhiều ký chủ khác nhau như: còng
(Geocarcinus ruricola), ghẹ xanh (Portunus pelagicus); tép trấu (Macrobrachidium
lanchesteri); tép bạc (Fenneropenaeus merguiensis),... Các ký chủ này cùng thuộc lớp
giáp sát, cư trú trong ao tôm và dễ bị nhiễm WSSV. Nhưng khác với tôm sú, các đối
tượng này thường không bị ảnh hưởng nhiều khi bị nhiễm WSSV, vì vậy đây là các bộ
máy trung gian chứa và lan truyền virus (Lo et al., 1996a.; Wang et al., 1998). Hơn
nữa các ký chủ trung gian này luôn di chuyển và mang WSSV từ các vùng bị nhiễm
đến nơi không bị nhiễm, chúng chẳng những là mối đe dọa lớn cho các vùng nuôi tôm
mà còn có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh thái biển trên toàn thể giới (Flegel, 1997).
2.3 Bệnh đốm trắng
Bệnh đốm trắng (White Spot Disease - WSD) là bệnh trên đối tượng tôm he
(penaeid) gây ra do virus gây hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome virus WSSV) hiện là một trong những vấn đề lớn và gây nhiều khó khăn cũng như thiệt hại
cho nghành nuôi tôm (Rosenberry, 2004). Khi tôm bị nhiễm và phát bệnh thường gây
nên hiện tượng chết đồng loạt với tỉ lệ lên tới 100% trong vòng 3- 10 ngày (Lightner,
1996). Bệnh được phát hiện đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 1991 (Nakano et al.,
1994), rồi sau đó lan nhanh đến Đài Loan, hầu hết các nước nuôi tôm ở Châu Á vào
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
5
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
năm và một số tiểu bang của Mĩ vào năm 1995 (Rosenberry, 1996). Năm 1999 dịch
bệnh bùng phát trên những khu vực nuôi tôm ở Nam Mỹ (Rosenberry, 2000). Đến năm
2002 WSSV đã được tìm thấy ở các nước châu Âu và các nước Trung Đông
(Rosenberry, 2002). Như vậy từ khi có phát hiện đầu tiên về WSSV thì trong vòng 11
năm virus này đã lây lan nhanh chóng khắp thế giới.
2.3.1 Dấu hiệu bệnh lý
- Tôm yếu, ăn giảm.
- Bơi lên mặt nước hoặc vào bờ.
- Bơi không định hướng.
- Xuất hiện nhiều đốm trắng (đường kính cỡ 2-3mm) ở vùng mang (khu vực đầu)
và vùng thân (đốt cuối thân).
- Đôi khi toàn thân có màu đỏ.
- Tôm chết khá nhiều trong khoảng thời gian 5-7 ngày.
- Trước khi xuất hiện triệu chứng 2-3 ngày, tôm ăn nhiều một cách không bình
thường.
- Tôm vào vó nhiều so với bình thường.
2.3.2 Virus gây bệnh đốm trắng (WSSV)
a. Phân loại
WSSV (White Spot Syndrome Virus) là một trong những virus gây dịch bệnh
trên toàn cầu ở tôm (penaeid). Virus này được gặp ở hầu như bất cứ nơi nào có nuôi
tôm (Mark, 2005). Vị trí của WSSV trong hệ thống phân loại được xác định bằng cách
sử dụng phép phân tích sự phát sinh loài dựa trên các gene đóng vai trò quan trọng
trong sự sao chép và cấu trúc của WSSV, bao gồm các tiểu đơn vị lớn và nhỏ của
ribonucleotide reductase (van Hulten et al., 2000b), protein kinase (Liu et al., 2001),
endonuclease (Witteveldt et al., 2001), chimeric thymidine-thymidylate kinase (Tsai et
al, 2000b) và ADN polymerase (van Hulten et al, 2001a). ADN polymerase của các họ
virus khác nhau được dùng để xây dựng cây không rễ (hình 1) biểu hiện mối quan hệ
họ hàng (Tidona and Darai, 2000). Không có mối quan hệ gần nào giữa WSSV với các
thành viên của họ ADN virus (van Hulten et al, 2001a). Cùng với các dữ liệu về phân
loại học của gene các WSSV, cây hình thái này đã cho thấy sự khác biệt của WSSV so
với các loại virus khác.
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
6
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
Hình 1. Phân tích bootstrap (100 bản sao) của cây phát sinh loài không rễ
của protein ADN polymerase tạo nên bởi thuật toán phân tích PAUP. Đƣờng đậm
chỉ sự giống nhau đến trên 70% (giá trị bootstrap >70) (van Hulten et al., 2001a)
Các gene ADN polymerase được dùng và lượng thêm vào của chúng: EHV1: Equine
herpesviRUs 1 (NP_041039), HHV1: Human herpesviRUs 1 (NP_044632), CIV: Chilo iridescent
viRUs (AAD48150), SAV: Spodoptera frugiperda ascoviRUs 1 (CAC19170), ASFV: African swine
fever viRUs (NP_042783), PbCl: Paramecium bursaria Chlorella viRUs 1 (NP_048532), Bov: Bos
tauRUs (P28339), Hs: Homo sapiens (S35455), CuniNPV: Culex nigripalpus nucleopolyhedro
baculoviRUs (AF274291), XcGV: Xestia c-nigrum granulo baculoviRUs (NP_059280), PxGV:
Plutella xylostella GV (NP_068312), SeMNPV: Spodoptera exigua multiple NPV (NP_037853),
AcMNPV: Autographa californica MNPV (NP_054095), MsEPV: Melanoplus sanguinipes
enTômopoxviRUs (NP_048107), VACV: Vaccinia viRUs (NP_063712), FPV: Fowlpox viRUs
(NP_039057).
Dựa trên những phân tích phân loại học mở rộng, cùng với cấu trúc bộ gene cơ
bản và thành phần cũng như đặc điểm hình thái khác biệt của virion, năm 2002, “Hội
Đồng Quốc Tế về Phân Loại học của Virus” (the International Committee on
Taxonomy for Viruses–ICTV) đã phê chuẩn đề xuất ý kiến xem xét WSSV như một
họ virus mới gọi là Nimaviridae, để chỉ phần mở rộng dạng sợi trên phần tử virus
(Nima: tiếng Latin nghĩa là sợi) (hình 2). Họ virus này chỉ có một giống (Whispovirus)
và trong đó White spot syndrome virus I (WSSV) là loài duy nhất. Có lẽ tất cả các
chủng WSSV đã biết là các biến thể của cùng một loài (Mark, 2005).
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
7
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
Hình 2. Mô hình virion của WSSV (Mark, 2005)
Các chủng địa lý WSSV đã nhận biết rất giống nhau về hình thái học và bộ gene,
cho thấy rất ít khác biệt qua phân tích RFLP. Việc so sánh trình tự cả bộ gene của
những chủng WSSV có nguồn gốc từ Thái Lan (WSSV-TH) >< chủng WSSV có
nguồn gốc từ Trung Quốc (WSSV-CN) >< chủng WSSV có nguồn gốc từ Đài Loan
(WSSV-TW) cho thấy sự giống nhau về nucleotide đến 99.32% (Mark, 2005).
b. Bộ gen của WSSV
Virion của WSSV chứa một ADN sợi đôi, siêu xoắn, dạng vòng, ước tính khoảng
300 kilobase pairs (kb). Một số sự đa hình về chiều dài các đoạn cắt giới hạn giữa các
chủng WSSV khác nhau về địa lý đã chỉ ra một số biến đổi trong bộ gene (Wang et al,
2000b)
Bộ gene WSSV-TH là bộ gene đầu tiên được xác định trình tự một cách hoàn
chỉnh và gồm khoảng 292,967 cặp base (bp) (van Hulten et al., 2001a). Những phân
tích với sự giúp đỡ của máy tính về bộ gene WSSV-TH đã nhận biết 184 ORF được
cho là mã hóa cho những protein có trên 50 acid amin, những protein này có kích
thước từ 50 đến 6077 acid amin. Trong số những ORF này, có 10 họ gene chứa 2 đến
4 ORF có sự tương tự về các base đến 40% hay hơn, đã nhận biết được. Dựa trên sự
tương đồng với những gene khác trong GenBank, chỉ 10 trong số 184 WSSV ORF là
đảm nhận một chức năng nào đó. Đa số các gene được biết này mã hóa cho các
enzyme liên quan đến sự sao chép ADN, biến dưỡng nucleotide và biến đổi protein.
Bên cạnh những ORF này, các gene mã hóa cho 6 protein cấu trúc chủ yếu (VP664,
VP28, VP26, VP24, VP19 và VP15) và khoảng 40 protein cấu trúc thứ yếu của virion
được nhận biết trong bộ gene của WSSV (van Hulten et al., 2000a). Gần đây, ORF170
được chứng minh là mã hóa protein kháng sự chết theo chương trình (Wang et al.,
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
8
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
2004). Tuy nhiên, chức năng của hầu hết các ORF của WSSV vẫn chưa được xác định
(Mark, 2005).
c. Các vùng gen biến đổi chính trên bộ gen WSSV
Bốn trong số 9 vùng tương đồng (homologous repeats- hr) cho thấy sự khác biệt
ở số lần lặp lại giữa WSSV-TH, WSSV-CN và WSSV-TW. Khi được so sánh với
WSSV-CN và WSSV-TW, WSSV-TH có một đơn vị lặp lại ở hr1 và hr8, và thêm 2
đơn vị lặp lại nữa ở hr3, trong khi WSSV-CN có thêm một đơn vị lặp lại ở hr9 so với 2
chủng kia. Các biến thể của WSSV, cũng như baculovirus và ascovirus, có sự khác
biệt về số đơn vị lặp lại trong vùng tương đồng (Bigot et al., 2000), đây có lẽ là nét đặc
biệt phổ biến ở các virus sợi đôi ADN vòng kín lớn.
Bảng 1. So sánh các đơn vị lặp lại của các ORF mang các lặp lại có định
hƣớng, thuộc vùng không tƣơng đồng giữa ba chủng WSSV.
Chiều dài
Vị trí trong bộ gene
đơn vị
(WSSV-TH)
lặp lại
Số đơn vị lặp lại (chiều dài đơn vị)
WSSV-TH
WSSV-CN
WSSV-TW
9
-
-
32
44830-48294 (ORF30)
63
55.5
55.5
55.5
93118-93219 (ORF65)
3
34
33
33
97066-97400 (ORF67)
56/84
2.5 (84) và 2 (56)
2.5 (84) và 2 (56)
2.5 (84) và 2 (56)
107965-108675 (ORF75)
45/102
3 (102) và 9 (45)
4 (102) và 11 (45)
5 (102) và 16 (45)
119018-119311 (ORF84)
84
3.5b
3.5
3.5
142744-143067 (ORF94)
54
6
12
6
42
2.75
2.75
2.75
66/6
3 (66) và 4 (6)
3 (66) và 7 (6)
3 (66) và 7 (6)
(bp)
11167-11454a (chỉ ở
WSSV-TW-TW 021)
176987-177100
(ORF116)
180619-180834
(ORF119)
So sánh WSSV-CN
187899-188312
với WSSV-TH nhận thấy 16 khác biệt có kích thước từ 3 đến
69
6
8
8
324 bp,(ORF125)
chỉ được nhận biết tại các trình tự lặp lại trực tiếp, từ đó chỉ ra rằng những
vùng286717-286878
này dễ bị đột biến nhất trong bộ gene của WSSV. Chỉ một vùng lặp lại trực tiếp
54
3
3
3
có thể (ORF177)
biến đổi là hiện diện ở vùng giữa hai gene trong khi tất cả những vùng khác
a
Cùng vị trí với WSSV-TW.
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
9
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Một đơn vị lặp lại có thêm 3bp ở WSSV-TH.
b
In đậm: các lặp lại theo một hướng duy nhất, không tương đồng có chứa sự khác nhau giữa ba
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
hiện diện trong các ORF. 6 trong số 16 khác biệt được nhận biết trong những lặp lại
không trực tiếp không phải vùng tương đồng. Những đơn vị lặp lại này là những trình
tự 100 bp hiện diện ít nhất hai bản sao trên cùng một sợi và theo một hướng duy nhất,
với tính đồng nhất giữa những bản sao này đến 80% hay hơn (Mark, 2005). 10 lặp lại
không thuộc vùng không tương đồng theo một hướng duy nhất, tất cả đều là lặp lại
liên tiếp, hiện diện trong bộ gene của WSSV-TH, ít nhất một lặp lại hiện diện trong
WSSV-TW mà không hiện diện ở WSSV-CN và WSSV-TH. Trong 10 ORF có chứa
các đoạn lặp lại theo một hướng thuộc vùng không tương đồng hiện diện trong bộ gene
của WSSV-TH (bảng 2) thì 6 ORF có chứa sự khác biệt giữa 3 chủng (in đậm trong
bảng 2). Trong 6 ORF đó thì 5 lại có sự khác biệt về số đơn vị lặp lại trong những lặp
lại này (gạch dưới trong bảng 2). 3 sự thay đổi lớn nhất định vị trong vùng bộ gene mã
hóa cho ORF75, ORF94 và ORF125 (Mark, 2005).
Ba vùng gen mang các đơn vị lặp lại liên tục, không tương đồng, trong vùng mã
hóa ORF75, ORF94 và ORF125, được chứng minh là có thể biến đổi ở số đơn vị lặp
lại (RUs) giữa các chủng WSSV đã nhận biết (Mark et al., 2004). Các lặp lại có vị trí ở
giữa của các ORF, mà không có lặp lại ở đầu 5’ và 3’. Cả ORF75 và ORF94, khoảng
50% vùng mã hóa có chứa các lặp lại, trong khi ORF125, khoảng 20% vùng mã hóa
chứa các lặp lại. Sự khác biệt ở số RUs không gây thay đổi các ORF tương ứng, vì
chiều dài của những RU này luôn là đa phân của 3 bp. Protein mã hóa bởi ORF75
được trình bày hiện diện trong virion WSSV (Huang et al., 2002b). ORF94 có thể có
chức năng tương tự như ORF75, vì đơn vị lặp lại của cả hai ORF cùng đóng góp một
kiểu chung ở cấp độ protein bao gồm 4 amino acid cơ bản (R hay K) theo sau bởi 2
alanine, 2 hay 3 proline và sự kéo dài của các amino acid có tính acid (E hay D)
(Mark, 2005).
a. ORF75
Với tất cả các chủng được mô tả rõ, ORF75 có hai loại RUs với chiều dài lần
lượt là 102 bp và 45 bp. 45 nucleotide đầu tiên của RUs 102 bp giống với RUs của 45
bp. So sánh tất cả các RUs trong một chủng, chúng có chứa SNP ở vị trí 3, 15, 30, 40,
42 và 44, RUs của 102 bp có thêm SNP ở vị trí 83. Mỗi RUs có thể được nhận biết bởi
SNP đặc trưng của nó (Mark et al., 2004).
Số RUs được nhận biết ở mỗi chủng phù hợp với kích thước tương ứng của các
đoạn PCR của chúng. Chủng K, T, L và X ở VN giống nhau ở điểm này. Chủng A ở
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
10
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
VN có thêm 1 RUs 45 bp, mà dựa trên các SNP, được xác định nằm sau đơn vị lặp lại
thứ hai. Chủng S ở VN có số RUs cao hơn và, dựa trên các SNP, giống với genotype
của WSSV -CN hơn (Dieu et al., 2004).
Bảng 2. Danh sách các mẫu sử dụng trong nghiên cứu của Dieu et al., 2004.
Các chủng WSSV-VN ở miền Trung
Các chủng WSSV-VN ở miền Nam
Chủng
Tỉnh
K
Đà Nẵng
T
Quảng Ngãi
L
Bình Định
X
Phú Yên
S
Phú Yên
A
Ninh Thuận
Tv
Trà Vinh
Kg
Kiên Giang
b. ORF94
Ở tất cả các chủng WSSV được mô tả rõ, ORF94 có RUs kế tiếp của 54 bp với
một SNP ở vị trí 48 (guanine hoặc thymine) khi so sánh với các RUs lẫn lộn trong một
chủng. Số RUs có thể khác biệt lớn giữa các chủng mà locus này được mô tả: WSSVTW, WSSV-CN, WSSV-TH, và 55 chủng khác từ Thái Lan. Số RUs thay đổi từ 6 đến
20 đơn vị lặp lại (Mark et al., 2004).
Các chủng WSSV ly trích từ các mẫu tôm thu được ở Việt Nam (WSSV–VNcentral) chứa từ 7 đến 17 RUs, phù hợp với kích thước các sản phẩm PCR tương ứng
của chủng. Chủng X và S giống nhau, trong khi các chủng khác, mặc dù có cùng số
RUs, tất cả đều có mô hình khác biệt về nucleotide tại vị trí 48. Chủng K, T và L ở VN
có sự mất 1 thymine tại vị trí 143149 (cùng vị trí với WSSV-TH), tại đầu 3’ cùng có
sự lặp lại. Vì nó nằm ngoài vùng mã hóa nên sẽ không gây thay đổi ORF94 (Dieu et
al., 2004).
c. ORF125
ORF này chứa các RUs liền kế dài 69bp, với hai RUs đầu tiên cũng như cuối
cùng có thể nhận biết bằng các SNP đặc trưng của chúng khi so sánh các RUs trong
một chủng. Những RUs khác (từ RUs thứ ba đến RUs áp chót) có SNP ở vị trí 8, 18,
25, 66 và 69. Các chủng WSSV–VN-central chứa 5 đến 7 RUs, phù hợp với kích
thước tương ứng với các đoạn PCR của chúng. Chủng X và S ở VN (Việt Nam), cũng
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
11
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
như chủng A và L ở VN, giống nhau ở locus này. Genotype của chủng A và L ở VN
thì giống với genotype của WSSV-TH (Dieu et al., 2004).
2.4 Các nghiên cứu liên quan vấn đề phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên
tôm sú, tép trấu và tôm bạc
Balakrishnan Pradeep et al. (2008) đã miêu tả sự biến đổi của ở các vùng gen của
WSSV ở Ấn Độ. Đề tài tập trung nghiên cứu các biến đổi ở ORF23/24 và ORF14/15
trên 81 chủng WSSV thu được ở Ấn Độ. Dựa trên phản ứng khuyếch đại PCR, kết quả
cho thấy các chủng Ấn Độ bị xóa mất một đoạn 10.970 bp ở ORF23/24 cho thấy có
liên quan đến chủng WSSV-TW và WSSV-TH đã được giải trình tự trước đó. Khi
phân tích ở vùng ORF14/15 cho thấy có sự tái kết hợp, đồng thời không có chủng nào
có sự chuyển đổi hoặc VP35 giống chủng WSSV-TW. Từ đó rút ra kết luận các chủng
WSSV ở Ấn Độ có liên quan chặt chẽ với các chủng đến từ Thái Lan, hay nói cách
khác chủng WSSV-TH có sự lây lan rộng đến nhiều nơi trên thế giới trong đó bao gồm
cả Ấn Độ.
Dieu et al. (2004) đã thực hiện đề tài “ Dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh
đốm trắng (WSSV) trên tôm ở Việt Nam”. Nghiên cứu đã dùng đoạn mồi 16S rRNA
và VP26 để kiểm tra sự nhiễm WSSV của 8 ao tôm ở Việt Nam. Chọn những mẫu
dương tính để thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi ORF23/24, ORF14/15,
ORF75, ORF94, ORF125 để xác định các dòng WSSV ở Việt Nam và sự lây lan của
chúng. Kết quả cho thấy các chỉ thị phân tử của bộ gen WSSV có cùng nguồn gốc với
WSSV-TW và WSSV–TH.
Hoa et al. (2005) đã thiết lập và sử dụng qui trình PCR - genotyping để kiểm tra
sự khác nhau của các chủng WSSV phân lập từ tôm và các loài giáp xác khác thu ở
các khu vực khác nhau của ĐBSCL. Kết quả này cho thấy rằng qui trình PCR genotyping có thể giúp xác định được những chủng WSSV đặc trưng và có thể giúp
truy ra nguồn gốc lây nhiễm, dịch bệnh bộc phát.
Rajendran et al. (1999) thử nghiệm về cảm nhiễm của WSSV trên các đối tượng
khác như cua (Scylla sp.), tôm hùm (Panulirus sp.), tôm nước ngọt (Macrobrachium
Rosenbergii) ở Ấn Độ bắng cách tiêm hoặc cho ăn WSSV có từ các mẫu tôm sú nhiễm
WSSV thu từ phía đông nam bở biển Ấn Độ. Sau đó tiến hành theo dõi và xét nghiệm,
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
12
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
kết quả tất cả các đối tượng được cảm nhiễm đều có mang WSSV nhưng có sự khác
biệt về mức độ biểu hiện bệnh và tỉ lệ chết khác nhau.
Tóm lại, qua nhiều nghiên cứu khác nhau về sự biến đổi kiểu gen ở một số vùng
nhất định thể hiện sự đa dạng di truyền của WSSV có sự phụ thuộc vào vị trí địa lý và
mức độ độc tính trên đối tượng tôm sú đã gợi mở thêm nhiều khía cạnh mới có liên
quan. Trong đó vấn đề nguồn gốc lây nhiễm của WSSV và sự đa dạng hay sự biến đổi
về kiểu gen của WSSV trên các ký chủ khác nhau được đặt ra. Do đó vấn đề tìm ra sự
đa dạng di truyền của các chủng WSSV trên các ký chủ khác nhau, làm cơ sở so sánh
với vật chủ về kiểu gen, mức độ độc lực,... nhằm tìm ra định hướng khống chế sự lây
lan và ngăn chặn sự tái nhiễm của WSSV giữa các vụ nuôi, cũng như các biện pháp để
hạn chế ảnh hưởng của WSSV lên đối tượng nuôi chính là tôm sú.
2.5 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kỹ thuật PCR là một kỹ thuật in vitro để tổng hợp ADN dựa trên khuôn là một
trình tự đích ADN ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành
hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc
hiệu cho đoạn ADN này. Kỹ thuật này do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào năm
1985.
2.5.1 Phản ứng PCR
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bước:
Bước1 (bước biến tính-denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm
các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao
hơn Tm của phân tử, thường là ở 94 – 950C trong vòng 30 – 60 giây. Mạch đôi ADN
tách ra thành dạng mạch đơn.
Bước2 (bước lai- anealation): trong bước này, nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của
các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này
dao động trong khoảng 40 – 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30
– 60 giây.
Bước3 (bước tổng hợp - elongation): nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp ADN
polymerase (là polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của
bước này tùy thuộc độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây
đến nhiều phút.
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
13
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
2.5.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến sản phẩm PCR
a. Khuôn ADN có vai trò rất quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR.
Đoạn khuôn có thể là ADN mạch kép, mạch đơn. Hàm lượng ADN cao làm tăng sản
phẩm không đặc hiệu (băng phụ), nhưng nếu độ tin cậy tổng hợp là tới hạn, nên dùng
hàm lượng khuôn ADN tối đa cho phép cùng với số chu kỳ PCR giới hạn để tăng tỷ lệ
sản phẩm PCR đặc hiệu. Nồng độ ADN khuôn nằm trong khoảng 0,01 - 1 ng đối với
plasmid hoặc ADN phage và 0,1 - 1µg ADN tổng số cho tổng thể tích phản ứng là 50
µl là thích hợp. Phản ứng PCR tối ưu với các đoạn ADN khuôn hoàn toàn tinh sạch,
khi ADN khuôn không tinh sạch có lẫn protein, hiệu quả PCR giảm tỷ lệ thuận với độ
tinh sạch của ADN khuôn.
b. Nồng độ Taq ADN polymerase thường là 1 - 1,5 unit được sử dụng trong một
hỗn hợp phản ứng 50 µl. Hàm lượng Taq ADN polymerase cao hơn có thể tổng hợp
nhiều sản phẩm PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, nếu các chất ức chế có mặt trong hỗn
hợp phản ứng (ví dụ như khuôn ADN sử dụng không được tinh sạch cao), hàm lượng
Taq ADN polymerase (2 - 3 unit) cao hơn có thể là cần thiết để thu hiệu suất sản phẩm
khuếch đại cao hơn.
c. Mồi là một yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả PCR. Đoạn mồi hoàn hảo
khi tỉ lệ GC trong khoảng 40 - 60%. Khi chọn mồi cần đảm bảo nhiệt độ nóng chảy
(Tm) của mồi xuôi và mồi ngược không chênh lệch quá 50C và kích thước của hai mồi
ít khác nhau, nhiệt độ nóng chảy của hai mồi thường 42 - 650C. Hai mồi xuôi và ngược
tránh bổ sung với nhau nhằm tránh hiện tượng primer - dimer. Nồng độ mồi thường từ
0,1 - 0,5 µmol là thích hợp. Nếu nồng độ cao hơn sẽ tạo ra sản phẩm khuyếch đại giả.
d. Nồng độ Mg2+ trong khoảng 1 - 4 milimol là thích hợp. Tuy nhiên nồng độ
Mg2+ còn phụ thuộc vào khuôn ADN sử dụng cũng như dNTP, buffer thêm vào phản
ứng. Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp sẽ không nhìn thấy sản phẩm khuếch đại, nếu quá
cao sẽ tạo ra sản phẩm phụ. Nồng độ Mg2+ là 1,5 milimol.
e. Nồng độ các loại nucleotid trong một phản ứng thường là 200 µmol. Nồng độ
thấp hơn (10 - 50 µmol) tăng cường tính chính xác của phản ứng nhưng tạo ra ít sản
phẩm, nồng độ cao hơn làm tăng sản phẩm nhưng có thể làm giảm tính chính xác của
phản ứng PCR.
f. Ngoài ra, phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nhiệt độ và thời gian biến tính,
thời gian bắt cặp, thời gian kéo dài. Số chu kỳ khuếch đại cũng ảnh hưởng rất lớn đến
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
14
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
kết quả PCR, nó phụ thuộc lượng mẫu ADN. Nếu mẫu ADN ít hơn 10 bản sao thì số
chu kỳ khuyết đại là 40, nếu lượng mẫu nhiều hơn thì 25 đến 35 chu kỳ là đủ.
2.5.3 Ứng dụng kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ nghiên
cứu khoa học đến sản xuất và đời sống xã hội. Những ứng dụng chính của kỹ thuật
PCR là:
Tách nhanh chóng, chính xác từng gen, hoặc từng đoạn ADN riêng biệt.
Kỹ thuật nền cho các nghiên cứu di truyền phân tử như xác định trình tự gen, đa
hình ADN, xác định marker phân tử cho chọn giống, phát hiện đột biến gen,…
Chẩn đoán nhanh, nhạy các bệnh di truyền, bệnh nhiễm trùng (virus, vi khuẩn,
nấm,…).
Khôi phục gen của các sinh vật cổ cách đây hàng triệu năm.
Xác định nguồn gốc hài cốt, quan hệ họ hàng, xác định cá thể dùng trong việc
xác định huyết thống cũng như trong khoa học hình sự.
Trong thủy sản: giúp phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh ở dạng tiềm ẩn,
đánh giá sự an toàn sản phẩm thủy sản và góp phần vào qui trình xác định trình tự
nucleotide đột biến của các tác nhân gây bệnh hay các loài động vật thủy sản.
Trong đề tài này kỹ thuật PCR được ứng dụng như là kỹ thuật nền quan trọng để
khảo sát đa dạng di truyền của WSSV trên các đối tượng là các ký chủ trung gian
nhằm tìm ra mốc liên quan di truyền giãu chúng với chủng WSSV trên tôm sú. Thông
qua đó có thể đánh giá được tính độc của các chủng virus này nhằm tiến tới tìm ra biện
pháp ngăn ngừa và khống chế sự lan truyền giữa các ao nuôi khác nhau cũng như giữa
các vụ nuôi khác nhau.
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
15
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010
Trường ĐHCT
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển
Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ.
- Thời gian: 01/2010 đến 05/2010.
3.2 Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ và hóa chất
3.2.1 Vật liệu nghiên cứu
Mẫu tôm sú, tép trấu và tôm bạc được thu ở nhiều ao khác nhau thuộc tỉnh Bạc
Liêu và Cà Mau.
3.2.2 Dụng cụ
Máy ly tâm eppendorf 5417C (Đức), máy sấy chân không 5310 (Đức), cân điện
tử Denver Instrument XP-600, lò vi sóng National, máy khuấy từ, máy nghiền mẫu,
máy PCR Perkin Elmer 9700 (Mỹ), máy đọc gel và chụp hình gel BioRad UV 2000
(Mỹ), bộ micropipet Gibson P2,5, P20, P200, P1000,… bộ điện di nhanh Run-one
(Mỹ), các loại tube đựng mẫu và chạy PCR, các loại côn, tủ trữ mẫu -200 C
Electronlux Confor Plus, que nghiền mẫu,…
3.2.2 Mồi, hóa chất
a) Mồi
Bảng 4. Các primer đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Cặp primer
Primer
Trình tự (5’-3’)
ORF75-flank
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
Forward
Reverse
GAAGCAGTATCTCTAACAC
CAACAGGTGCGTAAAAGAAG
GTGCCGCAGGTCTACTC
CATACGACTCTGCTTCTTG
CGAAATCTTGATATGTTGTGC
CCATATCCATTGCCCTTCTC
GGAATTTGGCAACCTAACAAA
TTTACTCGG TCTCAGTGCCAG
ORF94-flank
ORF125-flank
VP 26
Nhiệt độ gắn(0C)/
Thời gian kéo dài (s)
49/80
51/80
52/100
52/50
b) Hóa chất
Hóa chất trích mẫu: Chelex (5%), proteinase K (20mg/ml)
Chuyên nghành Công nghệ Sinh học
16
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
