Biểu hiện β galactosidase trong vi khuẩn bacillus subtilis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------------------

Nguyễn Thị Thúy

BIỂU HIỆN β-GALACTOSIDASE
TRONG VI KHUẨN Bacillus subtilis

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.................................................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................................... 2
1. Sơ lƣợc về vi khuẩn B. subtilis.............................................................................................. 2
1.1. Lịch sử, đặc điểm phân loại theo hệ thống Bergey, đặc điểm hình thái và sự phân

bố của vi khuẩn B. subtilis........................................................................................................ 2
1.2. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn B. subtilis........................................ 3
1.3. Cấu trúc genome.................................................................................................................. 5
1.4. Tính an toàn và ứng dụng của B. subtilis................................................................... 6
2. Cấu trúc operon lac, gen lacZ và β- galactosidase......................................................... 9
2.1. Cấu trúc operon lac............................................................................................................ 9
2.2. Gen lacZ và β-galactosidase......................................................................................... 12

3. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn.................................................................................. 16
3.1. Đặc điểm của plasmid..................................................................................................... 16
3.2. Những vector tách dòng và vector biểu hiện trong E. coli................................ 18
3.3. Vector biểu hiện trong B. subtilis................................................................................. 21
3.3.1. Hệ thống vector biểu hiện pHT........................................................................... 21
3.3.2. Hệ thống vector biểu hiện pAL............................................................................ 22
3.4 Cài nhập vector biểu hiện vào B. subtilis.................................................................. 22
3.4.1. Cơ chế của quá trình cài nhập vào B. subtilis............................................... 23
3.4.2. Các kiểu cài nhập vào B. subtilis....................................................................... 24
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.................................................................. 27
2.1 Nguyên liệu và thiết bị......................................................................................................... 27
2.1.1. Tế bào và plasmid.......................................................................................................... 27
2.1.2. Hóa chất............................................................................................................................ 28
2.1.3. Môi trường nuôi cấy..................................................................................................... 29
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm........................................................................................................ 29
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................................... 30


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu........................................................................................................... 30
2.2.2. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật.................................................................. 30
2.2.3 Các phương pháp sinh học phân tử......................................................................... 31
2.2.4. Các phương pháp hóa sinh........................................................................................ 35
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................... 37
3.1 Thiết kế vector pUL1(PrrnO-RBS (spoVG)) dựa trên vector pET28b..............37
3.2 Nhân dòng gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase trong vector pUL1
............................................................................................................................................................... 41

3.2.1. Khuếch đại gen lacZ từ vector pDG268............................................................... 41
3.2.2. Nhân dòng gen lacZ trong vector pUL1............................................................... 42
3.3 Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364 tạo pUL2 44
3.3.1. Khuếch đại đoạn DNA gồm promoter PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong pUL1
........................................................................................................................................................... 44

3.3.2. Nhân dòng đoạn PrrnO-RBS(spoVG)-lacZ trong vector pDG364.............46
3.4 Cài nhập đoạn PrrnO-RBS(spoVG)-lacZ trong vector pDG364 vào genome
của B. subtilis PY79 và kiểm tra sự cài nhập này.............................................................. 48
3.4.1. Cài nhập đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ trong vector pDG364 vào genome vi

khuẩn B. subtilis......................................................................................................................... 48
3.4.2 Kiểm tra sự cài nhập..................................................................................................... 49
3.5. Xác định hoạt độ của enzyme β-galactosidase........................................................... 50
3.5.1. Xác định hoạt tính β-galactosidase bằng cơ chất X-gal................................. 51
3.5.2. Xác định hoạt độ β-galactosidase với cơ chất ONPG..................................... 51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................................................... 54
KẾT LUẬN:......................................................................................................................................... 54
KIẾN NGHỊ......................................................................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................................. 55


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh B. subtilis [41, 68]......................................................................................... 3
Hình 1.2. Hình ảnh bào tử B. subtilis với các độ phóng đại khác nhau [69, 76, 77]...4

Hình 1.3. Cơ chế thủy phân của enzyme β- galactosidase................................................. 10
Hình 1.4. Cấu trúc operon lac [70].............................................................................................. 10
Hình 1.5. Cơ chế điều hòa của operon lac................................................................................ 12
Hình 1.6. Cấu trúc của β-galactosidase ở E. coli [66, 67].................................................. 13
Hình 1.7. Cơ chế thủy phân X-gal của enzyme β-galactosidase [71]............................14
Hình 1.8. Sơ đồ minh họa một tế bào vi khuẩn chứa plasmid ở bên trong..................16
(1) DNA nhiễm sắc thể, (2) Plasmid........................................................................................... 16
Hình 1.9. Mô hình đoạn DNA của vector pHV32 đƣợc chèn vào nhiễm sắc thể của
B. subtilis [35]..................................................................................................................................... 23
Hình 1.10. Mô hình trao đổi chéo đơn (single crossover) minh họa việc sử dụng một
vector cài nhập cơ bản để xây dựng một đột biến knockout trong một khung đọc mở
(orfA) [11]............................................................................................................................................. 24
Hình 1.11. Mô hình trao đổi chéo kép (double crossover) minh họa việc sử dụng
một vector cài nhập (ectopic integration vector) để chèn một khung đọc mở (orfA)
vào trong vị trí đích trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn B. subtilis [11]............................ 25
Hình 3.1. Kết quả khuếch đại đoạn PrrnO từ genome của B. subtilis...........................38
Hình 3.2. Sơ đồ tạo vector pUL1................................................................................................. 39
Hình 3.3. Kết quả PCR colony kiểm tra đoạn chèn PrrnO các khuẩn lạc thu đƣợc 40
Hình 3.4. Kết quả khuếch đại đoạn lacZ từ vector pDG268.............................................. 42
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR colony kiểm tra đoạn lacZ chèn trong
plasmid pUL1 của 5 khuẩn lạc...................................................................................................... 43
Hình 3.6. Kết quả điện di trên gel agarose 1% kiểm tra sản phẩm chèn lacZ vào
pUL1....................................................................................................................................................... 44
Hình 3.7. Kết quả PCR khuếch đại đoạn PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ từ pUL1-lacZ45
Hình 3.8. Sơ đồ tạo vector pUL2................................................................................................. 46


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm cắt pUL2........................................................................ 47
Hình 3.10. Sơ đồ cài nhập đoạn PrrnO- RBS (spoVG)-lacZ từ vector pUL2 vào
genome của B. subtilis PY79......................................................................................................... 49
Hình 3.11. Kết quả thử hoạt tính amylase trên môi trƣờng tinh bột (0,1%) của thể
biến nạp.................................................................................................................................................. 50
Hình 3.12. Kết quả thử hoạt tính β-galactosidasetrênđĩa có bổ sung X-gal.................51
Hình 3.13. Xác định hoạt độ β-galactosidase trong các chủng 2, 4 và 7 tại thời
điểm 12h................................................................................................................................................ 52
Hình 3.14. Biểu đồ hoạt độ β-galactosidase của các thể tái tổ hợp tại các thời điểm
khác nhau............................................................................................................................................... 52


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme β-galactosidase [50]..............15
Bảng 1.2. Một số vector thƣơng mại dùng tách dòng và biểu hiện trong E. coli [75]........20
Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng........................................................................................... 27
Bảng 2.3. Thành phần các loại đệm và dung dịch............................................................... 28
Bảng 2.4. Các thiết bị thí nghiệm........................................................................................ 29
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR..................................................................................32
Bảng 2.6. Các thành phần, điều kiện của phản ứng nối ghép gen....................................... 33
Bảng 3.1.Thành phần, điều kiện phản ứng PCR PrrnO.......................................................38
Bảng 3.2. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR lacZ.....................................................41
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt lacZ và pUL1............................................................. 42
Bảng 3.4.Thành phần phản ứng nối lacZ và pUL1..............................................................43
Bảng 3.5. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR PrrnO-RBS (spoVG)-lacZ..................45

Bảng 3.6. Thành phần và điều kiện cắt pDG364.................................................................48


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

CÁC TỪ VIẾT TẮT
amyEb

Phần gen amyE phía sau

amyEf

Phần gen amyE phía trƣớc

β-gal

β-galactosidase

BGSC

Bacillus Genetic Stock Center

BLAST

Basic local alignment search tool

bp

base pair

CFU

Colony forming unit

dNTP

2-Deoxynucleoside 5-triphosphate

DSM

Difco Sporulation Medium

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylenediamine tetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

IPTG

Isopropyl β-D- thiogalactoside

kbp

Kilo base pair

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria Bertani

M

Marker

MCS

Multiple cloning site

NAD

Nicotinamide adenine dinucleotide

OD

Optical density

ONPG

Ortho-netrophenol-β-galactosidase

PCR

Polymerase Chain Reaction

RBS

Ribosome binding site

rRNA

Ribosome Ribonucleic acid

Sol

Solution

TAE

Tris - Acetate - EDTA

U

Unit

v/v

volume/volume

w/v

Weight/volume

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

MỞ ĐẦU
Hiện nay, phần lớn các hệ vector (cả hệ vector nhân dòng và vector biểu
hiện) cho Escherichia coli đều đã đƣợc thƣơng mại hóa [75]. Tuy nhiên, E. coli
đƣợc xem là sinh vật có khả năng gây bệnh và tiết độc tố. Chính vì vậy, việc sử
dụng E. coli nhƣ tế bào vật chủ để biểu hiện gen còn nhiều hạn chế. Bên cạnh đó,
Bacillus subtilis, đại diện tiêu biểu của nhóm vi sinh vật Gram dƣơng, với vai trò là
tế bào vật chủ, đã thể hiện nhiều ƣu điểm hơn so với E. coli. Đó là khả năng không
gây bệnh (B. subtilis đƣợc Hiệp hội Thuốc và Thực phẩm của Mỹ FDA coi là
“genereally regarded as safe”- GRAS) và khả năng chịu đựng các điều kiện nuôi
cấy, bảo quản khắc nghiệt hơn [18, 25]. Trong nghiên cứu cơ bản, B. subtilis đã
đƣợc sử dụng nhƣ mô hình để nghiên cứu khả năng biệt hoá và cơ chế điều hoà
hoạt động của gen trong tế bào [24]. Trong hƣớng phát triển các vacxin thế hệ mới,
B. subtilis đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu nhƣ một công cụ chuyển kháng nguyên
an toàn và tiềm năng [19, 17, 59]. Mặc dù có nhiều ƣu điểm với vai trò là tế bào vật
chủ so với E. coli nhƣng các vector thƣơng phẩm dùng cho việc tách dòng và biểu
hiện gen sử dụng cho vi khuẩn B. subtilis vẫn chƣa xuất hiện rộng rãi trên thị
trƣờng. Nguyên nhân là gen ngoại lai cần đƣợc cài nhập thẳng vào nhiễm sắc thể

của vi sinh vật này, và gen ngoại lai cần phải có đầy đủ các yếu tố cần thiết cho việc
biểu hiện gen.
Ở

Việt Nam, cho đến thời điểm này mới chỉ có rất ít các công trình nghiên

cứu về biểu hiện gen trong B. subtilis nhƣ biểu hiện gen trên vỏ bào tử [14], hoặc
biểu hiện gen trong tế bào sinh dƣỡng, có sử dụng chất cảm ứng IPTG [7] và vẫn
chƣa có nghiên cứu nào công bố về việc biểu hiện gen trong tế bào sinh dƣỡng của
B. subtilis mà không cần sử dụng chất cảm ứng. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Biểu hiện β-galactosidase trong vi khuẩn B. subtilis” với mục đích biểu hiện gen
trong tế bào sinh dƣỡngs, mà không cần sử dụng chất cảm ứng nhằm góp phần mở
rộng khả năng ứng dụng vi sinh vật an toàn này trong lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và
nghiên cứu ứng dụng.

1


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.

Sơ lƣợc về vi khuẩn B. subtilis

1.1. Lịch sử, đặc điểm phân loại theo hệ thống Bergey, đặc điểm hình thái
và sự phân bố của vi khuẩn B. subtilis
Vào năm 1835, vi khuẩn B. subtilis (tên ban đầu là Vibrio subtilis) đƣợc phát

hiện bởi Christian Gottfried Ehrenberg. Sau đó, (năm 1872) Ferdinand Cohn đã
phân loại và đổi tên thành B. subtilis [69]. B. subtilis là một trong những vi khuẩn
đầu tiên đƣợc nghiên cứu nhƣ mô hình của quá trình biệt hóa và phát triển tế bào.
Theo hệ thống phân loại của Bergey (1994) thì B. subtilis thuộc:
Giới (regnum):

Bacteria

Ngành (divisio):

Firmicutes

Lớp (class):

Bacilli

Bộ (ordo):

Bacillales

Họ (familia):

Bacillaceae

Chi (genus):

Bacillus

Loài:

B. subtilis

Năm 2011, Rooney và cộng sự đã phát hiện thêm một chủng nữa của loài B.
subtilis là B. subtilis subsp. inaquosorum. Nhƣ vậy, hiện nay có ba phân loài
(subspecies) là B. subtilis subsp. inaquosorum, B. subtilis subsp. spizizenii và B.
subtilis subsp. subtilis [69, 10, 56].
B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram dƣơng, kích
thƣớc 0,41-0,58 µm X 1,5–3 µm, đứng đơn lẻ hay tạo thành chuỗi ngắn. B. subtilis
có khả năng di động (có từ 8 - 12 tiên mao) và có khả năng sinh nội bào tử (hình
bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào). B. subtilis có khả năng thích
nghi với môi trƣờng bằng cách hấp thu các DNA ngoại lai tạo DNA tái tổ hợp hoặc
nội bào tử B. subtilis phát triển bằng cách nảy chồi [13, 72].

2


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

Hình 1.1. Hình ảnh B. subtilis [41, 68]

B. subtilis là tế bào hình que, tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn Gram dƣơng,
đƣợc tìm thấy tự nhiên trong đất và thảm thực vật mục, trong thực phẩm hỏng,
trong không khí và cả trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật. Số lƣợng vi
6

7

khuẩn B. subtilis trong đất khoảng 10 - 10 CFU/g [72]. Nhiệt độ tối ƣu để nó phát

0

0

triển là 25 C đến 35 C [72]. Khi gặp điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt, B. subtilis
có khả năng hình thành bào tử. Thông thƣờng đến 60% B. subtilis tìm thấy trong
đất tồn tại ở dạng bào tử [72].
Vi khuẩn B. subtilis là vi khuẩn hiếu khí. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây
cho thấy rằng B. subtilis thực sự có thể phát triển trong điều kiện yếm khí [44]. Các
vi khuẩn có thể tạo ra ATP trong điều kiện yếm khí thông qua quá trình lên men
butanediol hay sử dụng ammoni nitrate [44]. B. subtilis khác với các vi khuẩn yếm
khí tùy ý khác ở chỗ nó trải qua quá trình lên men không có chất nhận điện tử ở bên
ngoài [72]. Trong quá trình lên men, sự tái tạo NAD+ chủ yếu qua chất trung gian
lactate dehydrogenase (đƣợc tìm thấy trong tế bào chất). Lactate dehydrogenase
chuyển hóa pyruvate thành lactate [72].
1.2. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn B. subtilis
Trong các điều kiện môi trƣờng không thuận lợi, vi khuẩn B. subtilis hình
thành nội bào tử. Nội bào tử ở trung tâm có kích thƣớc 0,5-0,8 X 0,4 µm. Bào tử
trƣởng thành có thể có hình tròn hay hình elip, với chiều dài khoảng 1,5-1,8 µm, có

3


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

bề mặt tích điện âm và hơi kỵ nƣớc [73]. Bảo tử có cấu trúc đặc biệt bao gồm cấu
trúc lõi và các lớp vỏ xung quanh. Cấu trúc lõi là nhiễm sắc thể ở trạng thái bị nén
chặt và bất hoạt. Các lớp vỏ xung quanh lõi tính từ trong ra ngoài bao gồm lớp

cortex chứa nhiều peptidoglycan, tiếp đến là các lớp vỏ có chứa các loại protein
khác nhau. Vì vậy, nội bào tử có tính kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm,
tia tử ngoại, phóng xạ,…[68, 31].

Hình 1.2. Hình ảnh bào tử B. subtilis với các độ phóng đại khác nhau [69, 76,
77]

Sự hình thành bào tử xảy ra trong nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để
hoàn tất. Đầu tiên, nucleotid kéo dài trở thành một sợi trục. Sau đó, tế bào hình
thành một vách ngăn và bắt đầu phân chia thành hai phần. Phần nhỏ hơn của tế bào
đƣợc gọi là các tiền bào tử (forespore) và phần lớn hơn đƣợc gọi là tế bào mẹ [54].
Tế bào mẹ nuôi dƣỡng tiền bào tử. Khi hình thành vách ngăn, 30% số nhiễm sắc thể
đã nằm bên trong tế bào mẹ, 70% nhiễm sắc thể còn lại chuyển vào tiền bào tử
thông qua một loại protein vận chuyển đƣợc gọi là SpoIIIE [60]. Các tế bào mẹ
chứa các bào tử bên trong bằng cách thực bào. Do đó, các tiền bào tử sẽ có hai lớp
màng tế bào chất với một lớp murein dày bảo vệ giữa chúng và tế bào mẹ. Tại thời
điểm này, tiền bào tử sẽ trải qua những thay đổi bên trong. Cuối cùng, tiền bào tử
tách khỏi tế bào mẹ sau khi tế bào mẹ chết [54]. Bào tử trƣởng thành không có hoạt
động trao đổi chất với môi trƣờng nhƣng nó vẫn đáp ứng các tín hiệu dinh dƣỡng
đặc thù bằng cách nảy chồi khi môi trƣờng giàu chất dinh dƣỡng và thuận lợi cho
sự phát triển [60, 61].

4


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

1.3. Cấu trúc genome

Toàn bộ bộ gen của B. subtilis đã đƣợc giải trình tự vào năm 1997 [39]. Tế
bào vi khuẩn B. subtilis chỉ có một phân tử DNA nằm trong một nhiễm sắc thể tròn.
Kích thƣớc tổng thể của DNA là 4.214.814 cặp bp (4,2 Mbp). Khoảng 87% bộ gen
(bao gồm 4.100 gen) mã hóa cho protein. Trong 4.100 gen thì có 192 gen đƣợc cho
là không thể thiếu và 79 gen đƣợc cho là cần thiết cho các quá trình sống của B.
subtilis. Hầu hết các gen cần thiết tham gia vào quá trình trao đổi chất. Một nửa
trong số các gen thiết yếu có trách nhiệm xử lý thông tin, một phần năm trong số
chúng có trách nhiệm tổng hợp thành tế bào, phân chia tế bào và tạo chất nguyên
sinh và một phần mƣời trong số chúng chịu trách nhiệm về năng lƣợng cho tế bào
hoạt động [37, 39]. Bộ gen của B. subtilis có hơn 74% khung đọc mở và 94% gen
ribosome đƣợc phiên mã cùng hƣớng và đƣợc sao chép lại. Chỉ có 53% các gen
của B. subtilis là gen đơn bản, số còn lại thuộc họ đa gen (có 2-77 bản sao). Trong
hệ gen này có khoảng 220 yếu tố điều hòa phiên mã đã đƣợc xác định. Tuy tất cả
các gen của B. subtilis đã đƣợc giải trình tự nhƣng chỉ khoảng 58% các gen đƣợc
biết chức năng, 42% các gen còn lại vẫn chƣa biết rõ chức năng và đang đƣợc
nghiên cứu [68]. Ngoài ra, B. subtilis còn chứa nhiều gen liên quan đến các chất
chuyển hóa trung gian và một trong số các chất trung gian đó là kháng sinh. Một vài
gen mã hóa protein tiết có vai trò quan trọng đã đƣợc xác định và đó là các gen
secA, secD, secE, secF, secY, FFh và ftsY [39].
B. subtilis có một nhiễm sắc thể duy nhất với chiều dài 2 mm đƣợc nén chặt
vào một nucleoid đƣờng kính 1 µm [26]. Nhiễm sắc thể của B. subtilis có duy nhất
1 điểm mở đầu sao chép (oriC). Quá trình sao chép đƣợc tiến hành hai hƣớng theo
chiều kim đồng hồ và ngƣợc chiều kim đồng dọc theo nửa nhiễm sắc thể. Sao chép
nhiễm sắc thể đƣợc hoàn thành khi các nhánh đến điểm cuối cùng, đó là vị trí đối
diện với điểm mở đầu sao chép trên bản đồ nhiễm sắc thể. Cơ chế của quá trình sao
chép này cũng giống nhƣ quá trình sao chép nhiễm sắc thể của E. coli. Tuy nhiên có
một số protein tham gia vào quá trình sao chép của B. subtilis là khác so với E. coli
[26].

5

Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

1.4. Tính an toàn và ứng dụng của B. subtilis
Tính an toàn của B. subtilis đối với ngƣời và động vật
Ở

châu Âu và ở Mỹ, B. subtilis đƣợc chỉ định là đủ điều kiện về an toàn và

không hề có tác dụng phụ (QPS, Qualified Presumption of Safety) hay GRAS
(Genrally Regarded As Safe) [21]. Một số chủng B. subtilis và họ hàng gần của nó
là B. licheniformis, B. pumulis, B. megaterium có khả năng sản xuất lecithinase, một
enzyme có khả năng phá vỡ màng động vật có vú. Tuy nhiên, vẫn chƣa có bằng
chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên ngƣời [21]. Trong một số các trƣờng
hợp ngƣời ta vẫn phát hiện ra B. subtilis ở những bệnh nhân bị ung thƣ phổi, hoại
thƣ bạch cầu, áp xe khi lắp bộ phận giả…, nhƣng tỉ lệ các trƣờng hợp này là rất
hiếm (chỉ có 2 trong 1034 ca phát hiện có B. subtilis) [21]. Bacillus anthracis là một
loài của Bacillus gây bệnh than nguy hiểm cho ngƣời [61, 21].
Hầu hết những loài B. subtilis an toàn với động vật. Các nghiên cứu cho thấy
khi bổ sung B. subtilis vào thức ăn của vật nuôi, B. subtilis tiết ra các enzyme phân
hủy rất hiệu quả các chất trong thức ăn nhƣ carbonhydrate, chất béo và đạm thành
những đơn vị nhỏ giúp vật nuôi hấp thụ tốt hơn. Ngoài ra, B. subtilis có khả năng
sinh kháng sinh hạn chế vi khuẩn có hại trong đƣờng ruột và trong môi trƣờng,
giúp vật nuôi chuyển hoá hiệu quả thức ăn và khống chế vi khuẩn gây bệnh. Do
vậy, B. subtilis đƣợc áp dụng sản xuất probiotic để xử lý môi trƣờng nuôi thủy sản,
xử lý đáy ao, xử lý mùi hôi, xử lý rác thải, phối trộn với thực phẩm tạo hệ men tiêu
hóa, phòng ngừa các bệnh đƣờng ruột tăng cƣờng khả năng kích thích miễn dịch,

…và đƣợc ứng dụng trong ngành nuôi thủy sản và chăn nuôi thú y [46]. Sử dụng
chế phẩm có B. subtilis trong chăn nuôi là hƣớng đi có ý nghĩa thực tiễn về khía
cạnh bảo vệ môi trƣờng và đảm bảo hiệu quả sản xuất [5, 46].
Ứng dụng của B. subtilis trong nghiên cứu cơ bản
Qua nghiên cứu quá trình hình thành bào tử từ tế bào mẹ của B. subtilis, các nhà
nghiên cứu đã xây dựng đƣợc mô hình biệt hóa tế bào. Dựa trên các kết quả thí
nghiệm và mô hình toán học, các nhà nghiên cứu của trƣờng Đại học Oxford đã giải

6


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

thích cách kích hoạt các yếu tố phiên mã chính. Nguyên nhân để xác định con
đƣờng biệt hóa tế bào là do sự khác biệt về khối lƣợng giữa tiền bào tử và tế bào
mẹ [12]. Quá trình hình thành bào tử ở B. subtilis cần tới sự biểu hiện của hơn 200
gen, các gen này chỉ cần thiết cho quá trình hình thành bào tử mà không cần cho sự
sinh trƣởng và sống sót của tế bào sinh dƣỡng. Thêm nữa, thông qua tìm hiểu cơ
chế điều hòa phiên mã, các nhà nghiên cứu còn giải thích đƣợc mô hình điều hòa
hoạt động của gen trong tế bào [43]. Ban đầu các gen này đƣợc phiên mã theo trình
tự thời gian. Các yếu tố sigma F, E, G, K xuất hiện theo trình tự sẽ quyết định trình
tự phiên mã các gen bị chi phối bởi các yếu tố sigma này. Các yếu tố sigma đóng vai
trò điều khiển quá trình phiên mã các gen đặc thù cho từng loại tế bào. Ví dụ, yếu tố
sigma F và sigma G điều khiển quá trình phiên mã các gen của tiền bào tử, yếu tố
sigma E và sigma K điều khiển quá trình phiên mã các gen của tế bào mẹ. Vì vậy,
cơ chế biểu hiện gen có sự phối hợp giữa tiền bào tử và tế bào mẹ để điều hòa hoạt
động của các gen [43].
Ứng dụng của B. subtilis trong y học

Do những nhƣợc điểm của các vacxin thế hệ cũ (nhƣ yêu cầu nghiêm ngặt về
nhiệt độ bảo quản, kỹ thuật sử dụng để đƣa vacxin vào cơ thể con ngƣời…) đã dẫn
đến nhu cầu cấp thiết phải phát triển vacxin thế hệ mới nhƣ các vacxin thế hệ thứ
hai và thế hệ thứ ba. Trong hƣớng phát triển này, B. subtilis đƣợc phát hiện và
đƣợc nghiên cứu nhƣ công cụ chuyển kháng nguyên an toàn và tiềm năng [19].
Gần đây, các nghiên cứu đã thành công trong việc biểu hiện một số kháng nguyên
trên bề mặt bào tử của B. subtilis để sản xuất các vacxin nhƣ vacxin kháng bệnh
than, vacxin phòng virus Rota gây bệnh tiêu chảy, vacxin uốn ván, bạch hầu, ho gà,
… [61]. Do đó, B. subtilis đƣợc xem nhƣ nhà máy sản xuất các loại vacxin dạng
uống ổn định và an toàn [33, 40, 59].
Ở

Nhật Bản, một chủng B. subtilis đã đƣợc sử dụng trong các món ăn cổ truyền

từ hàng nghìn năm trƣớc để sản xuất nattokinase – một enzyme có nhiều tác dụng
có lợi cho sức khỏe giúp chống đông máu, kích thích hệ miễn dịch, phòng tránh

7


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu ở ngƣời cao tuổi [61, 33]. B. subtilis có khả năng lây
nhiễm và gây chết ấu trùng của muỗi Anophelis aulicifacies (côn trùng chính gây
sốt rét ở Ấn Độ) [28]. Do đó, nó đƣợc sử dụng nhƣ tác nhân kiểm soát sinh học
phòng chống bệnh sốt rét.
Ứng dụng của B. subtilis trong công nghiệp
Trong môi trƣờng dinh dƣỡng hạn chế, B. subtilis có khả năng sản xuất một

số enzyme (bao gồm cả protease, amylase, cenlulase, lipase, β-galactosidase,
nattokinase,….) và kháng sinh [72]. Các hãng sản xuất đã dựa vào khả năng tiết các
enzyme của B. subtilis nhƣ nhà máy để sản xuất các enzyme này trên quy mô công
nghiệp. Các enzyme đƣợc ứng dụng để sản xuất một số phụ gia trong chất tẩy rửa
và các sản phẩm khác [74]. Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn đƣợc
sản xuất vào năm 1956 với tên BIO-40. Đến nay, tất cả các protease bổ sung vào
chất tẩy dùng trên thị trƣờng đều là serine protease, đƣợc sản xuất từ các chủng
Bacillus và chủ yếu là từ B. subtilis. Trên thế giới, mỗi năm ngƣời ta đã sử dụng
89% các loại enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong đó có hai công ty
lớn là Novo Nordisk và công ty đa quốc gia Genencor mỗi năm đã cung cấp cho
toàn cầu hơn 95% lƣợng enzyme protease [74]. Dựa vào khả năng tiết kháng sinh
mà B. subtilis đã đƣợc sử dụng để sản xuất thuốc kháng sinh (bao gồm cả subtilin,
surfactin, bacillomycin, bacilysin, và fengycin) trên quy mô công nghiệp. Các chất
này đƣợc sử dụng nhƣ thuốc kháng khuẩn và kháng nấm [74]. Ngoài ra, B. subtilis
đã đƣợc sử dụng để chuyển đổi vật liệu nổ thành các hợp chất vô hại vì nó loại bỏ
các chất thải phóng xạ hạt nhân [74]. Do khả năng hình thành màng sinh học, B.
subtilis còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc chống ô nhiễm và xử lý bằng biện
pháp sinh học trong ngành chế biến thực phẩm. Vi khuẩn này cũng giúp làm giảm
ăn mòn thép ở mức độ nhẹ [46].
Ứng dụng của B. subtilis trong nông nghiệp
B. subtilis đƣợc ứng dụng trong nông nghiệp vì chúng tham gia tích cực vào
chu trình cacbon và nitơ, phân hủy vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại

8


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

enzyme ngoại bào [72]. B. subtilis có khả năng hình thành các màng sinh học
(biofilm) -lớp màng sinh học này giúp hỗ trợ cho hệ thống thân rễ cạnh tranh với
nấm gây bệnh và các loại vi khuẩn có hại cho cây trồng [22, 46]. Do vậy, ngƣời ta
dùng B. subtilis nhƣ tác nhân kiểm soát sinh học phòng trừ vi sinh vật (nấm
Rhizoctonia solani, Fusarium sp., Pylicularia oryzae,…) gây bệnh cho cây trồng
nhƣ bằng cách ngâm với hạt giống trƣớc khi gieo trồng [61]. Một số chủng có họ
gần với vi khuẩn B. subtilis nhƣ Bacillus thuringiensis có khả năng sản xuất độc tố
đối với côn trùng nên đƣợc sử dụng nhƣ thuốc diệt ấu trùng chống lại nhiều loại
sâu bƣớm để bảo vệ mùa màng [22]. Xu hƣớng hiện nay trên thế giới là sử dụng
thuốc trừ sâu có chứa các chủng Bacillus thuringiensis vì nó an toàn với động vật và
thân thiện với môi trƣờng hơn các loại thuốc trừ sâu tổng hợp [63].
2.

Cấu trúc operon lac, gen lacZ và β- galactosidase

2.1. Cấu trúc operon lac
Operon lac ở E. coli là operon đầu tiên đƣợc phát hiện và nghiên cứu khá chi
tiết từ năm 1961 bởi Jacob và Monod [2]. Operon lac gồm ba gen cấu trúc là lacZ,
lacY và lacA nằm kề nhau đƣợc điều khiển chung bởi một promoter [70]. Hoạt động
của operon này đƣợc kiểm soát theo hai cơ chế là tích cực và tiêu cực.
Gen lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase. Enzyme này xúc tác phản ứng
thủy phân lactose thành glucose và galactose để cung cấp năng lƣợng cho tế bào.
Ngoài ra, β- galactosidase còn chuyển hóa một phần lactose (liên kết β-1,4-Dglycoside của glucose và galactose) thành một đồng phân là allolactose (liên kết β1,6-D-glycoside của glucose và galactose). Chính allolactose mới là phân tử kích
ứng cho sự biểu hiện operon lac [2, 4].

9


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

Hình 1.3. Cơ chế thủy phân của enzyme β- galactosidase

Gen lacY mã hóa cho protein vận chuyển permease. Pemease nằm xuyên
màng tế bào vi khuẩn và có vai trò vận chuyển chủ động lactose từ môi trƣờng
ngoại bào vào trong tế bào. Gen lacA mã hóa cho enzyme thiogalactoside
transacetylase có vai trò giải độc tế bào đối với các hợp chất thiogalactoside và
enzyme thiogalactoside transacetylase cũng đƣợc vận chuyển vào tế bào nhờ
protein vận chuyển permease [4].

Hình 1.4. Cấu trúc operon lac [70]

Những gen này chỉ đƣợc biểu hiện mạnh khi môi trƣờng có lactose và không
có glucose. Có hai protein điều hòa tham gia điều khiển hoạt động của operon lac.
Đó là protein hoạt hóa CAP và protein ức chế LacI. Gen mã hóa CAP (Catabolite
Activator Protein), còn có tên là CRP (cAMP Receptor Protein), nằm xa operon lac.
LacI đƣợc mã hóa bởi gen lacI nằm về phía đầu 5’ của operon lac. Mỗi protein điều
hòa tiếp nhận một tín hiệu khác nhau từ môi trƣờng và truyền tín hiệu tới operon
lac. Khi môi trƣờng không có lactose, LacI liên kết với operator và ức chế operon

10


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

lac. Khi có mặt lactose, LacI bị bất hoạt và operon lac đƣợc biểu hiện. Ngƣợc lại,
protein CAP khi liên kết operon lac lại có vai trò thúc đẩy operon hoạt động. Tuy

vậy, CAP chỉ liên kết mạnh khi môi trƣờng không có glucose. Vì vậy, sự phối hợp
của hai protein điều hòa CAP và LacI sẽ bảo đảm cho operon chỉ biểu hiện mạnh
khi môi trƣờng có lactose, không có glucose [4].
Ở

operon lac, trình tự điều khiển (operator) gồm 21 bp với trình tự hai đầu

lặp lại đảo chiều, đối xứng qua cặp nucleotide số 11. Cấu trúc đối xứng của operator
đƣợc nhận biết bởi hai tiểu phần của LacI. Do trình tự liên kết của LacI tại operator
phủ lên một phần của trình tự promoter lac nên nó ngăn cản RNA polymerase liên
kết với promoter. Vì vậy, nó cũng ngăn cản quá trình phiên mã của operon lac.
Khi môi trƣờng có lactose, lactose đƣợc chuyển vào tế bào nhờ permease.
Khi vào trong tế bào, một số lactose (liên kết β-1,4) đƣợc chuyển thành allolactose
(liên kết β-1,6) nhờ β-galactosidase. Allolactose là chất cảm ứng, nó gắn vào LacI
làm thay đổi cấu hình của protein này và dẫn đến sự liên kết lỏng lẻo trong liên kết
giữa LacI và operator làm LacI rời khỏi promoter. Lúc này các gen cấu trúc của
operon lac đƣợc bật mở, RNA polymerase bắt đầu phiên mã từ gen cấu trúc.

11


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

z

Hình 1.5. Cơ chế điều hòa của operon lac
I. Cấu trúc operon lac, II. Sơ đồ điều hòa âm tính operon lac. III. Sơ đồ điều hòa
dƣơng tính operon lac [79]

2.2. Gen lacZ và β-galactosidase
Gen lacZ là một trong ba gen cấu trúc nằm trong operon lac của E. coli. Gen
lacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase. Trình tự của β-galactosidase ở E.coli
đƣợc giải mã vào năm 1970 và β-galactosidase có 1024 amino acid, nặng 464 kDa.
Cấu trúc bậc 4 đối xứng của nó đƣợc xác định vào năm 1994 với mỗi một đơn vị βgalactosidase gồm 5 miền [47].

12


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

Hình 1.6. Cấu trúc của β-galactosidase ở E. coli [66, 67]

Trong kỹ thuật sàng lọc thể tái tổ hợp ở tế bào vi khuẩn, gen lacZ (kết hợp
với IPTG và X- gal) đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ gen chỉ thị màu, do tính dễ nhận
biết thể tái tổ hợp nhờ màu sắc khuẩn lạc. Nếu môi trƣờng có mặt X-gal (5-bromo 4-cloro-3-indolyl -β-D- galactopyranoside), enzyme β-galactosidase có khả năng
thuỷ phân X-gal từ một hợp chất không màu thành màu xanh. Do đó, ở môi trƣờng
nuôi cấy vi khuẩn sau khi biến nạp có bổ sung thêm X-gal và chất cảm ứng IPTG
(isopropylthiogalactoside - chất đồng đẳng của lactose), các tế bào vi khuẩn có gen
lacZ nguyên vẹn (không có DNA tái tổ hợp) có khả năng tổng hợp enzyme βgalactosidase thuỷ phân X-gal và các tế bào này phát triển thành khuẩn lạc có màu
xanh. Nếu DNA lạ đƣợc xen vào giữa gen lacZ làm cho gen lacZ mất hoạt tính dẫn
đến enzyme β-galactosidase không đƣợc tổng hợp thì tế bào vi khuẩn phát triển
thành các khuẩn lạc có màu trắng. Sau đó, các khuẩn lạc có màu trắng đƣợc lựa
chọn và cấy chuyển vào môi trƣờng dinh dƣỡng để thu đƣợc dòng tế bào mang
vectơ tái tổ hợp [71].

13

Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

Hình 1.7. Cơ chế thủy phân X-gal của enzyme β-galactosidase [71]

Enzyme β-galactosidase có trong các vi sinh vật, thực vật và động vật. Các
enzyme này đã đƣợc ứng dụng trong nhiều quy trình công nghệ sinh học. Đặc biệt,
các enzyme từ vi sinh vật đƣợc sử dụng để thủy phân lactose nhằm tăng khả năng
tiêu hóa sữa hoặc để cải thiện các đặc tính chức năng của các sản phẩm từ sữa. Phản
ứng chuyển hoá galactozyl cũng thƣờng đƣợc sử dụng để tạo ra các galactooligosaccharide nhằm cải biến chức năng và cấu trúc của nguyên liệu thực phẩm,
dƣợc phẩm và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác [9].
Hiện nay, các nhà nghiên cứu đã tìm ra đƣợc nhiều chủng vi sinh vật có khả
năng sinh tổng hợp enzyme β-galactosidase với hoạt lực cao. Enzyme này khi đƣợc
tổng hợp có thể ở dạng ngoại bào (tiết ra ngoài môi trƣờng) hoặc nội bào (tích tụ
trong tế bào, có thể ở dạng tự do hoặc ở dạng liên kết với màng, với plasma hoặc
lyzosome của tế bào…) [9, 48]. Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme βgalactosidase đƣợc liệt kê trong bảng 1.1.

14


Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

Bảng 1.1. Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme β-galactosidase [50]

NẤM

Candida pseudtropicalis, Crypotoccus laurenti, Kluyverromyces

MEN

lactic, K. fragilis, K. marxianus, Torulopsis sphaerica, T. versalitis…

NẤM
MỐC

Asperigillus awmori, A. cellulosae, A. foetidus, A. niger, A. oryzae,
Chaetomium globosum, C. funicola, Fusarium maniforme, Penicillum
canescens, Rhizopus acidus, R. niveus,…
Vi khuẩn gram âm: Sphigomonas paucimobilis, Aeromonas cavie, A.
formicans, Agrobacterium rediobacter, Enterobacter cloacae,
iEscherichia coli, Fibrobacter succinogens, Xanthomonas

VI

campertris,…

KHUẨN
Vi khuẩn gram dƣơng: Bacillus acidocaldarius, B. circulans, B.
coagulans, B. macerans, B. subtilis, Clostridium acetobutylicum,
Corynebacterium murisepticum, Lactococcus pneumonira,…

Khối lƣợng phân tử của β-galactosidase dao động từ 19 đến 630 kDa. Cấu
trúc dƣới phân tử của các enzyme này bao gồm nhiều loại khác nhau từ monomer
(enzyme thu từ Kluyveromyces lactic) đến octamer (enzyme thu từ E. coli) [20]. Tuỳ
thuộc vào nguồn thu enzyme mà tính đặc hiệu phân tử của từng loại enzyme là khác

nhau. Các enzyme β-galactosidase có nguồn gốc từ vi khuẩn có pH tối ƣu thuộc
vùng trung tính, trong khi đó hầu hết β-galactosidase từ nấm mốc có pH thuộc vùng
axit, có một số chủng có pH tối ƣu là 2 [48, 49, 16].
Để có hoạt tính một số enzyme β-galactosidase thu từ vi khuẩn cần phải có các
2+

2+

+

+

ion hoá trị 1 và các ion hoá trị 2 nhƣ Mg , Mn , Na , K ,… Ví dụ nhƣ enzyme βgalactosidase từ S. rectivirgula, E. coli, Bifidobacterium bididum, Kluyveromyces
2+

2+

lactis, Bacillus sp. và L. reuteri cần ion Mg , Mn
+

để đạt đến độ bền nhiệt và hoạt

+

tính tối đa. Còn ion Na và K cần cho β-galactosidase của Lactobacilluscasei,
B.bididum, Streptococcus thermophilus và L. reuteri để có hoạt tính [52, 8]. Tuy

15

Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

nhiên, một số -galactosidase khác lại không cần sự có mặt của các ion kim loại
nhƣ enzyme thu từ Rhizobium melioti [16, 8].
Mặc dù rất nhiều enzyme -galactosidase từ vi sinh vật đƣợc biết đến nhƣng
chỉ có một số ít các vi sinh vật đƣợc lựa chọn làm nguồn sinh enzyme trong công
nghiệp. Hầu hết, các vi sinh vật này có nguồn gốc từ nấm mốc nhƣ là
Kluyveromyces lactic, K. fragilis, Aspergillus niger và A. oryzae hoặc từ vi khuẩn
nhƣ E. coli. Những loài vi sinh vật đó đƣợc lựa chọn chính vì chúng có thể tạo ra βgalactosidase với giá rẻ khi cho thêm vào thực phẩm [9].
3. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn
3.1. Đặc điểm của plasmid
Ở vi khuẩn và một số nấm men, ngoài các gen nằm trong genome còn có các
yếu tố di truyền ngoài thể nhiễm sắc, gọi là plasmid. Plasmid là các phân tử DNA
mạch đôi dạng vòng, đôi khi có mạch thẳng hay đƣợc cấu tạo bởi RNA nằm ngoài
DNA nhiễm sắc thể [80] (hình 1.8). Nó thƣờng có trong tế bào vi khuẩn, đôi khi
cũng có ở sinh vật nhân thật (eukaryote) (ví dụ, ở Saccharomyces cerevisiae). Kích
thƣớc của plasmid khoảng từ 1 đến hơn 400 kbp, có thể chứa vài gen đến vài trăm
gen. Plasmid có thể có một bản sao hay tới vài trăm bản sao trong cùng một tế bào.
Số lƣợng bản sao ảnh hƣởng tới đặc tính chống chịu của vi khuẩn, đặc biệt là khả
năng kháng thuốc, do đó nếu vi khuẩn mang plasmid có nhiều bản sao thì khả năng
kháng kháng sinh sẽ càng cao [32, 8].

Hình 1.8. Sơ đồ minh họa một tế bào vi khuẩn chứa plasmid ở bên trong
(1) DNA nhiễm sắc thể, (2) Plasmid

16

Nguyễn Thị Thúy

Luận văn thạc sỹ

Trong tự nhiên plasmid có thể tái bản đồng thời với nhiễm sắc thể của tế bào
hoặc có thể tái bản độc lập. Plasmid mang gen tự kiểm soát vòng đời của chúng,
một vài plasmid còn mang gen ảnh hƣởng tới tế bào vật chủ [80]. Một số plasmid
có khả năng di chuyển từ tế bào vi khuẩn này đến tế bào vi khuẩn khác. Những
plasmid có khả năng di chuyển là loại có kích thƣớc trung bình và kích thƣớc lớn vì
nó đòi hỏi phải có trên 30 gen hoạt động [80]. Trong công nghệ sinh học, ngƣời ta
thƣờng sử dụng plasmid làm vectơ để chuyển ghép gen từ tế bào cho sang tế bào
nhận, từ đó nhân dòng tạo ngân hàng gen hoặc biểu hiện gen nhằm thu sản phẩm
protein có hoạt tính sinh học [2].
Nhiều loại plasmid khác nhau có thể cùng tồn tại trong một tế bào. Đã có 7
plasmid khác nhau đƣợc tìm thấy trong E. coli. Mặt khác, những plasmid có họ
hàng thƣờng không thể cùng tồn tại do không tƣơng hợp (incompatible) và một
trong số chúng sẽ bị loại khỏi tế bào. Vì thế, các plasmid còn đƣợc xếp vào các
nhóm không tƣơng hợp (incompatibility group) dựa vào khả năng cùng tồn tại của
chúng trong một tế bào. Sự sắp xếp theo tính không tƣơng hợp dựa vào cơ chế điều
hòa những chức năng thiết yếu của plasmid [8].
Một cách khác phân loại plasmid còn dựa vào chức năng của chúng và bằng
cách đó ngƣời ta phân plasmid thành 5 nhóm chính [8]:
1.

Nhóm plasmid Col: là các loại plasmid chứa các gen sản xuất protein

(gọi là colicin) giúp cho vi khuẩn chủ chống lại vi khuẩn khác.
2.

Nhóm plasmid R (resistant plasmid): là loại plasmid chứa một hay

nhiều gen có khả năng sản xuất các loại protein (chủ yếu là các enzyme)
kháng lại kháng sinh và dƣợc chất.
3.

Nhóm plasmid phân giải (degradative plasmid): chứa nhiều gen mã

hóa cho các enzyme trao đổi chất, có tác dụng phân giải các hợp chất khác
nhau.
4.

Nhóm plasmid độc lực (virulent plasmid): có tác dụng hỗ trợ tăng

cƣờng độc lực cho vi khuẩn bằng nhiều cách khác nhau.

17


Nguyễn Thị Thúy
5.

Luận văn thạc sỹ

Nhóm plasmid nhân tạo: đó là các plasmid đƣợc tạo ra bằng cách thiết kế từng

thành phần lấy từ các plasmid có nguồn gốc trong tự nhiên. Tùy theo hƣớng sử dụng
mà ngƣời ta thiết kế plasmid để phục vụ công nghệ DNA và protein tái tổ hợp.

Những plasmid chỉ hiện diện với một hoặc một số ít bản sao trong vi khuẩn.
Khi tế bào vi khuẩn phân chia, plasmid sẽ có nguy cơ bị dồn về một trong hai tế bào

con. Để tránh bị mất đi sau phân bào, những plasmid một bản sao có các cơ chế để
chủ động phân phối mỗi bản sao về một tế bào con [8].
Plasmid có vai trò quan trọng trong các phòng thí nghiệm di truyền và sinh
hóa, chúng đƣợc sử dụng để nhân bản hoặc biểu hiện các gen cần quan tâm. Có rất
nhiều plasmid đƣợc thƣơng mại hóa cho các ứng dụng trên. Các plasmid dùng
trong kỹ thuật di truyền đƣợc gọi là các vector [2].
3.2. Những vector tách dòng và vector biểu hiện trong E. coli
Escherichia coli hay còn đƣợc gọi là vi khuẩn đại tràng là một trong những
loài vi khuẩn chính ký sinh trong đƣờng ruột của động vật máu nóng (bao gồm
chim và động vật có vú). E. coli là vi khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý và không hình
thành bào tử. Các tế bào thƣờng hình que dài khoảng 2,0 µm và đƣờng kính là 0,5
mm. E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae. Ƣu điểm của vi khuẩn E. coli là có tốc độ
sinh trƣởng nhanh, khả năng biểu hiện protein mạnh nên giảm đƣợc chi phí công
nghệ và hóa chất. Do đó, E. coli đƣợc chọn làm sinh vật mô hình để nghiên cứu
trong phòng thí nghiệm trên khắp thế giới [79].
Các plasmid đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay là các plasmid đa năng và
chuyên dụng thuộc thế hệ thứ ba. Để tiện cho việc sử dụng nhiều enzyme cắt giới
hạn, nhiều trình tự của chúng đã đƣợc xếp nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là
multiple cloning site (vị trí đa điểm tách dòng) [2].
Nhiều loại plasmid dùng cho E. coli có nguồn gốc từ thiên nhiên đƣợc thiết
kế lại để thuận tiện cho việc sử dụng làm vector nhân dòng (cloning vector) hay để
biểu hiện gen ngoại lai (expression vector). Các plasmid dùng để tạo dòng có đặc
điểm nhƣ sau:
18