Báo cáo nghiên cứu khoa học: " NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN β-GALACTOSIDASE TRONG E. COLI BL21" pdf

89

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009


NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN β-GALACTOSIDASE TRONG E. COLI BL21
Tr n V n Giang
Tr
ng i h c S ph m, i h c Hu
TÓM TẮT
-galactosidase là enzyme xúc tác ph n ng thu phân liên k t – 1,4-D galactoside
trong phân t
ng lactose thành glucose và galactose. bi u hi n c enzyme này trong E.
coli BL21, chúng tôi
ã ti n hành chèn gene ích ã tinh s ch vào vector bi u hi n pET, sau ó
chúng tôi
ã tinh s ch vector tái t h p, ti n hành bi n n p vào t bào E. coli BL21 và ã bi u
hi
n c protein này nhi t và pH thích h p sau khi c m ng v i IPTG.

1. M
ở đầu
β-galactosidase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết β-1,4-D
galactoside trong phân t
ử đường lactose thành glucose và galactose, được ứng dụng
r
ộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa, trong y học để chế biến thuốc hỗ trợ tiêu hoá.
Trên th
ế giới, đã có một số công trình công bố về tạo dòng và biểu hiện β-galactosidase

t
ừ Lactobacillus reuteri 103 [1] và Bacillus megaterium [2]. Ở Việt Nam, Nguyễn Văn
Cách (2008)
đã tạo dòng β-galactosidase từ Aspergillus oryzae và xác định một số tính
ch
ất lý-hóa của nó [3]. Trần Văn Giang, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2008)
đã tạo dòng và phân tích trình tự gen mã hóa β-galactosidase từ chủng Bacillus subtilis
G1 [4].
Nhi
ều người khi uống sữa có hiện tượng đau bụng và tiêu chảy do bị dị ứng với
đường lactose trong sữa, đây là một dạng đường chủ yếu trong thành phần sữa. Sau khi
u
ống sữa nếu bị khó tiêu, đầy hơi, sôi bụng hay tiêu chảy, đau bụng thì chắc chắn họ bị
dị ứng với lactose trong sữa. Lactose khi vào đến ruột sẽ được thủy phân thành
galactose
và glucose nhờ vào enzyme lactase (β-galactosidase ở vi khuẩn) có ở thành
ru
ột non. Trong trường hợp thiếu lactase, lactose không được thủy phân sẽ bị tống ra
ngoài dưới dạng tiêu chảy. Những người không tiêu hóa được lactose do họ thiếu lactase
b
ẩm sinh hoặc lactase bị thoái hóa từ thuở thơ ấu.
Trên th
ế giới và Việt Nam đã có một số nghiên cứu về β-galactosidase có nguồn
g
ốc từ các sinh vật. Tuy nhiên, ở Việt Nam những nghiên cứu về β-galactosidase mới
d
ừng lại ở nghiên cứu cơ bản và chưa đưa vào sản xuất enzyme này [3]. Vì vậy, cần
nghiên c
ứu biểu hiện β-galactosidase để làm cơ sở cho việc sản xuất enzyme này và góp
ph

ần giúp các nhà sản xuất sữa Việt Nam có thêm sản phẩm sữa dễ tiêu hóa.


90

2. Nguyên liệu và phương pháp
2.1. Nguyên li
ệu và hóa chất
Ch
ủng vi sinh vật tái tổ hợp sinh tổng hợp β-galactosidase đã được tuyển chọn
Baccillus subtilis G1 [4]. Vector pET22b(+) (Invitrogen) dùng
để biểu hiện β-
galactosidase trong E. coli BL21. Các thi
ết bị và hóa chất để biểu hiện được Phòng
Công ngh
ệ sinh học enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công Nghệ
Vi
ệt Nam cung cấp.
2.2. Khu
ếch đại gen bằng PCR
Để khuếch đại gen mã hóa β-galactosidase của chủng Bacillus subtilis G1, sử
d
ụng mồi xuôi GalF: 5'-GCG GAT CCG GTG ATG TCA AAG CTT GAA AAA ACG
C-3' và m
ồi ngược GalR: 5'-GCG CGG CCG CAT GTG TGT TTA CGA CAA T-3',
được thiết kế dựa vào trình tự nucleotide của gen mã hóa β-galactosidase B. subtilis trên
GenBank (mã s
ố NC_000964), có bổ sung điểm cắt hạn chế BamHI và NotI để chèn
vào vector bi
ểu hiện pET-22b(+). Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 2,5 µl đệm 10x

PCR; 2 µl 2,5 mM dNTP; 2 µl 25 mM MgCl
2
; 1 µl (0,1µg/ml)DNA khuôn mẫu; 0,5 µl
(5u/µl )Taq polymerase và 1 µl (10u/µl) m
ồi mỗi loại bổ sung nước cất đến thể tích 25
µl. Ph
ản ứng được thực hiện trong điều kiện: 94°C/3 phút; 35 chu kỳ: 94°C/1 phút,
54°C/1 phút, 72°C/1 phút; cu
ối cùng 72°C/10 phút.
2.3. Gắn sản phẩm PCR
Ph
ản ứng gắn sản phẩm PCR từ vector tạo dòng với vector biểu hiện gồm: 2 µl
đệm gắn dính DNA T4 10x; 3µl DNA tinh sạch; 3 µl (0,5µg/ml) plasmid pET-22b(+)
c
ắt mở vòng; 1,5 µl (5u/µl) DNA T4 ligase; bổ sung nước cất đến thể tích 20 µl. Hỗn
h
ợp phản ứng được ủ ở 22°C từ 30 phút đến 3 giờ hoặc qua đêm.
2.4. Biến nạp vector biểu hiện vào E. coli BL21
Phân
đoạn DNA sau khi gắn vào vector pET-22b(+) được biến nạp vào tế bào
kh
ả biến E. coli BL21 theo phương pháp sốc nhiệt và hóa học. Một khuẩn lạc E. coli
BL21
được cấy chuyển vào 3 ml môi trường LB, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. 15
ml môi tr
ường LB lỏng được tiếp giống với 150 µl dịch tế bào đã nuôi qua đêm. Sau khi
ti
ếp giống, dịch này được nuôi lắc ở 37°C với 200 vòng/phút trong khoảng 2-3 giờ, đến
khi OD
600nm

đạt 0,4 - 0,6. Sau đó dịch nuôi cấy được đặt vào đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 5
phút
ở 4°C với 4000 vòng/phút. Tủa tế bào được hòa đều trong 7,5 ml 0,1 M CaCl
2
vô
trùng
đã để lạnh, ủ đá lạnh 30 phút và ly tâm như trên. Tủa tế bào lại được hòa đều
trong 7,5 ml 0,1 M CaCl
2
vô trùng đã để lạnh, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 5 phút với
4000 vòng/phút. T
ủa tế bào được hòa vào 750 µl 0,1 M CaCl
2
vô trùng, lạnh. Dịch tế
bào
được chia nhỏ 50 µl/ống Eppendorf 1,5 ml khử trùng, dùng biến nạp ngay hoặc bổ
sung 50 µl 75% glycerol b
ảo quản ở -80°C để biến nạp sau. Năm µl dung dịch plasmid
ho
ặc hỗn hợp phản ứng gắn dính được hòa với 50 µl dịch tế bào khả biến vừa chuẩn bị


91

xong (hoặc tế bào khả biến ở -80°C đã giải đông), ủ 20-30 phút trong đá. Hỗn hợp được
gây s
ốc nhiệt 45 giây ở 42°C. Sau đó được đặt ngay vào đá lạnh khoảng 2 phút rồi bổ
sung 250 µl môi tr
ường SOC lỏng đã khử trùng. Sau khi ủ lắc hỗn hợp khoảng 60 phút
ở 37°C với 200 vòng/phút, 50-250 µl dịch tế bào đã biến nạp plasmid được cấy trải trên

đĩa thạch chứa ampicillin với nồng độ 0,1% (w/v), ủ qua đêm ở 37°C để cho khuẩn lạc
m
ọc và sàng lọc tiếp.
2.5. Nuôi cấy E. coli và biểu hiện
Khu
ẩn lạc E. coli BL21 tái tổ hợp được nuôi lắc qua đêm (200 vòng/ phút) trong
môi tr
ường LB lỏng có bổ sung 0,1% (w/v) ampicillin trong bình tam giác 25 ml. Tiếp
1% gi
ống vào bình tam giác 250 ml, lắc 200 vòng/phút. Sau 2 giờ, dịch nuôi được cảm
ứng bằng 1% (w/v) IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside), tiếp tục nuôi và tiến
hành l
ấy mẫu sau thời gian 1,5; 3 và 4,5 giờ ở 37°C. Mỗi lần lấy 1 ml mẫu dịch nuôi
bi
ểu hiện đã được cảm ứng. Đối chứng là khuẩn lạc E. coli BL21 không biến nạp. Sau
đó, các mẫu được ly tâm thu cặn và hòa trong nước khử ion để tiến hành điện di kiểm
tra. Protein t
ổng số đo được sau khi biểu hiện theo phương pháp Bradford. Phương pháp
này d
ựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue sẽ hình
thành ph
ức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu
t
ỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Nồng độ β-galactosidase được xác định
d
ựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò 1 mg/ml.
2.6.
Điện di SDS trên polyacrylamide gel
Điện di biến tính protein trên polyacrylamide gel 12,5% theo Laemmli (1970)
[5]. Sau khi

điện di, gel được nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue trong 3 giờ. Sau đó,
gel
được rửa bằng dung dịch rửa (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid) cho đến
khi n
ền gel trở nên trong còn các băng protein xuất hiện màu xanh.
3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
3.1. Chèn gene
β-galactosidase tinh sạch vào vector biểu hiện
Phân
đoạn gen gal (β-galactosidase) và vector plasmid pET-22b(+) mở vòng
được tinh sạch bằng kit của hãng Invitrogen để sử dụng cho phản ứng gắn (Hình 1).
Dung d
ịch của phản ứng gắn được biến nạp vào E. coli BL21 bằng phương pháp
s
ốc nhiệt, sau khi biến nạp, dịch tế bào được nuôi lắc phục hồi và trải lên đĩa thạch để
nuôi c
ấy chọn lọc. Plasmid tái tổ hợp được tách chiết, tinh sạch và kiểm tra bằng điện di
agarose. Plasmid tái t
ổ hợp (pEGal) có kích thước lớn hơn plasmid đối chứng pET-
22b(+) (Hình 2). Hình
ảnh điện cho thấy plasmid đối chứng (ĐC) chạy nhanh hơn các
plasmid tái t
ổ hợp (1 - 4).


92


Hình 1.

i n di phân o n gen gal (1) tinh s ch sau khi c t ra kh i vector nhân dòng và pET-
22b(+) (2)
ã c tinh s ch. M: DNA marker (1kb)


Hình 2. Vector bi u hi n


Hình 3. i n di plasmid i ch ng pET-22b(+) ( C)
và các plasmid tái t
h p pEGal (1-4).

3.2. H
ệ thống biểu hiện E. coli BL21/pEGal
Để biểu hiện thành công gen ngoại lai cần phải có vector thích hợp. Vector tái tổ
h
ợp pEGal (vector biểu hiện pET-22b(+) mang gen gal) được biến nạp vào chủng E.
coli BL21 b
ằng phương pháp sốc nhiệt và hóa học, tạo ra hệ thống biểu hiện E. coli
BL21/pEGal. D
ịch tế bào E. coli BL21/pEGal được thu sau 1,5; 3; và 4,5 giờ cảm ứng
v
ới IPTG để xác định mức độ biểu hiện của β-galactosidase tái tổ hợp.
D
ịch nuôi cấy biểu hiện sau khi thu được đo độ hấp thụ quang (OD). Từ độ hấp
2000
5000
500
10000
M

2

1 M
1 2 ĐC 3 4


93

thụ của protein tổng số (trong đó cóβ-galactosidase) đo được trên máy quang phổ, đối
chi
ếu với đồ thị chuẩn đã được xây dựng dựa trên BSA (Bovine serum albumin) để tính
ra n
ồng độ protein tổng số .Nồng độ protein tổng số của các mẫu biểu hiện được thể
hi
ện qua bảng (1). Dựa vào nồng độ protein tổng số để tính toán hiệu suất thu hồi sau
khi tinh s
ạch β-galactosidase.
B
ảng 1 cho thấy khi không cảm ứng IPTG thì hàm lượng protein tổng số ở các
ch
ủng tái tổ hợp và đối chứng sai khác không đáng kể. Nhưng sau 1,5; 3; và 4,5 giờ cảm
ứng IPTG, hàm lượng protein tổng số ở chủng tái tổ hợp đã tăng lên rất nhiều. Điều đó
ch
ứng tỏ promoter của vector biểu hiện đã được cảm ứng và β-galactosidase đã được
t
ổng hợp. Để khẳng định chắc chắn hơn, dịch nuôi cấy biểu hiện đã được điện di trên
polyacrylamide gel
.

B ng 1. N ng protein c a d ch nuôi bi u hi n
Dịch nuôi biểu hiện OD (TB) Nồng độ protein tổng số (µ
µµ
µl)
E. coli
BL21/pEGal (0h)
0,425 977,7
E. coli
BL21/pEGal (1.5h)
0,785 1652,7
E. coli
BL21/pEGal (3h)
0,825 1727,7
E. coli
BL21/pEGal (4.5h)
0,885 1840,2
E. coli BL21 (0h) 0,421 970.2
E. coliBL21 (1.5h) 0,485 726,8
E. coli BL21 (3h) 0,501 746,8
E. coliBL21 (4.5h) 0,542 798,2
3.3 Mức độ biểu hiện β-galactosidase
D
ịch tế bào thu ở các thời gian khác nhau sau cảm ứng được chạy điện di kiểm
tra trên gel polyacrylamide.
β-galactosidase tái tổ hợp đã được biểu hiện sau 1,5 giờ
c
ảm ứng bởi IPTG. Sau thời gian 3 và 4,5 giờ, hàm lượng protein tăng lên không đáng
k
ể.

94


Hình 4. i n di protein hòa tan t ng s c a d ch nuôi c y. Các ng 4-6: ch ng
BL21/pEGal sau 1,5; 3; và 4,5 gi
c m ng IPTG. Các ng 1-3: ch ng BL21/pE-22b(+)
sau 1,5; 3; và 4,5 gi
c m ng IPTG. M: protein chu n.

Theo lý thuy
ết thì β-galactosidase có khối lượng phân tử khoảng 66 kDa. Nếu
được biểu hiện thì trên điện di đồ protein tổng số của chủng BL21/pEGal sẽ xuất hiện
b
ăng có cùng khối lượng phân tử. Kết quả của chúng tôi cho thấy ở các đường 4-6 có
b
ăng to và đậm hơn các giếng khác đồng thời so với protein chuẩn thì thấy có khối
l
ượng phân tử của chúng cũng khoảng 66 kD điều đó chứng tỏ β-galactosidase tái tổ
h
ợp đã được biểu hiện trong chủng E. coli tái tổ hợp BL21/pEGal.
4. Kết luận
β-galactosidase (khoảng 66 kD) của vi khuẩn Baccillus subtilis đã được biểu
hi
ện trong chủng E. coli tái tổ hợp BL21/pEGal. Thời gian cảm ứng IPTG thích hợp là
1,5 gi
ờ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyen TH, Splechtna B, Yamabhai M, Haltrich D, Peterbauer C., Cloning and
expression of the

β
-galactosidase genes from Lactobacillus reuteri 103 in Escherichia
coli. J Biotechnol 129, (2007), 581-591.
2. Li JM, Chiou CY, Lee TR, Chen YS, Shaw GC., Identification of a lactose-responsive
element upstream of the promoter of Bacillus megaterium
-galactosidase-encoding gene mbgA. Cur Microbiol 51, (2005), 31-34.
3. Nguy
n V n Cách, Bùi Th H i Hòa, ng Th Thu, Tách, tinh ch và xác nh c
tính c
a
β
-galactosidase t ch ng n m m c Aspergillus oryzae 3, H i ngh Khoa h c
toàn qu
c l n th IV. Hà N i. Nxb Khoa h c và K thu t, (2008), 287-289.
4. Tr
n V n Giang, Nguy n S Lê Thanh, Quy n ình Thi, Nhân dòng và phân tích trình
35
66
45
18
25


95

t gene mã hóa
β
-galactosidase t ch ng Bacillus subtilis G1, H i ngh Khoa h c toàn
qu
c l n th IV: Hóa sinh và Sinh h c phân t ph c v nông, sinh, y h c và Công

nghi
p th c ph m. Hà N i. Nxb Khoa h c và K thu t, (2008), 691-694.
5. Laemmli UK, Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4, Nature 227, (1970), 680-685.

RESEARCH ON THE EXPRESSION OF β
ββ
β-GALACTOSIDASE IN STRAIN
E. COLI BL21

Tran Van Giang
College of Pedagogy, Hue University
SUMMARY
The
β
-galactosidase coding gene was isolated from Bacillus subtilis G1 and expressed
in E. coli BL21 through pEGal vector (Invitrogen) after 1,5 h of 1% (w/v) IPTG induction. Our
results showed a
β
-galactosidase band of approximately 66 kDa occurred in 12,5%
polyacrylamide gel.