Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen GmGLP1 vào cây đậu tương (glycine max) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------

Đỗ Thị Như Quỳnh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY
ĐẬU TƯƠNG (Glycine max) THÔNG QUA
VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------

Đỗ Thị Như Quỳnh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY
ĐẬU TƯƠNG (Glycine max) THÔNG QUA
VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng
TS. Lê Hồng Điệp

Hà Nội – 2015


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Nguyễn Văn
Đồng – người thầy luôn kiên nhẫn và hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình tôi thực hiện luận văn.
Tôi xin gửi tới TS. Lê Hồng Điệp lời cảm ơn chân thành, người đã luôn hỗ trợ
và giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình, những ý
kiến đóng góp quý báu cũng như sự chỉ dẫn tận tình của TS. Nguyễn Anh Vũ trong
suốt quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Kỹ sư Lương Thanh Quang cùng tập thể cán bộ
Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Di truyền Nông
Nghiệp về sự nhiệt tình giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể thực
hiện được đề tài này một cách suôn sẻ và thuận lợi.
Cuối cùng, tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị, người thân cùng bạn bè lời cảm ơn
thân thương nhất - những người đã luôn sát cánh, quan tâm và dành cho tôi tình cảm
chân thành trong suốt thời gian tôi học tập và hoàn thành luận văn này cũng như đã
luôn luôn bên cạnh và ủng hộ tôi trong cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Học viên cao học

Đỗ Thị Như Quỳnh


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU......................................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................. 3
1.1. Đậu tương và tầm quan trọng của cây đậu tương...................................................... 3
1.1.1. Giới thiệu chung về đặc điểm sinh học của cây đậu tương.................................. 3
1.1.2. Vai trò của cây đậu tương đối với đời sống của con người.................................. 6
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên Thế giới và Việt Nam.................................... 7
1.2. Cơ chế chống chịu các yếu tố phi sinh học của thực vật....................................... 10
1.3. Đặc tính chịu hạn và một số gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu
tương.......................................................................................................................................... 12
1.3.1. Đặc tính chịu hạn ở cây đậu tương.......................................................................... 12
1.3.2. Các gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu tương............................... 13
1.4. Gen GmGLP1................................................................................................................... 14
1.5. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật.............................................................. 15
1.5.1. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens........................... 15
1.5.2. Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen............................................................... 18
1.5.3. Phương pháp chuyển gen bằng xung điện............................................................. 18
1.5.4. Phương pháp chuyển gen qua ống phấn................................................................. 19
1.6. Nguồn gốc và đặc tính sinh học của 4 giống đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26
và DT84..................................................................................................................................... 20
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................................ 22
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu............................................................................... 22
2.2. Vật liệu nghiên cứu......................................................................................................... 22
2.2.1. Vật liệu........................................................................................................................... 22
2.2.2. Hóa chất và môi trường.............................................................................................. 23
2.2.3. Thiết bị và dụng cụ...................................................................................................... 23
2.2.4. Trình tự mồi và enzyme cắt giới hạn sử dụng trong nghiên cứu......................24
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................................... 24


2.3.1. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.......................... 24
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá.................................................. 26

2.3.3. Phương pháp nhân bản trình tự ADN bằng kỹ thuật PCR................................. 27
2.3.4. Phương pháp thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR.............................................. 28
2.3.5. Phương pháp lai Southern blot................................................................................. 29
2.4. Các tiêu chí đánh giá...................................................................................................... 31
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................... 32
3.1. Kết quả đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của 4 giống đậu tương
ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84............................................................................................. 32
3.1.1. Đánh giá nguồn vật liệu khởi đầu............................................................................ 32
3.1.2. Khả năng tái sinh tạo đa chồi.................................................................................... 33
3.1.3. Khả năng tái sinh rễ tạo cây hoàn chỉnh................................................................. 35
3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của gen cần chuyển GmGLP1 bằng kỹ thuật PCR..........38
3.3. Phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T1........................................................................ 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................................. 49
KẾT LUẬN................................................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................................... 50
PHỤ LỤC...................................................................................................................................... 60


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Tình hình sản xuất đậu tương trên Thế giới trong những năm gần đây . 7
Bảng 2. Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên Thế giới.............8
trong những năm gần đây.................................................................................................... 8
Bảng 3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam trong những năm gần đây......9
Bảng 4. Trình tự cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm................................................... 24
Bảng5. Thành phần phản ứng PCR................................................................................. 28
Bảng 6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR.................................................................. 28
Bảng 7. Thành phần phản ứng cắt giới hạn bằng enzyme Bam HI.........................30
Bảng8. Kết quả khảo sát tỷ lệ này mầm của 4 giống đậu tương.............................. 33
ĐT22, ĐT26, ĐVN9, DT84.............................................................................................. 33

Bảng 9. Khả năng phát sinh chồi của 4 giống đậu tương nghiên cứu sau 14 ngày
34
Bảng 10. Khả năng sống sót sau chọn lọc và khả năng kéo dài chồi của 4 giống
đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84...................................................................... 35
Bảng 11. Sự phát sinh rễ tái sinh cây hoàn chỉnh........................................................ 36
Bảng 12. Cây tái sinh hoàn chỉnh sống sót và phát triển ở môi trường ngoài.....36
Bảng 13. Tỷ lệ cây sống sót sau khi phun basta........................................................... 38
Bảng 14. Thống kê số cây T0 sinh trưởng và phát triển tốt sau khi phun basta và
đã dương tính với PCR....................................................................................................... 41
Bảng 15. Phân tích cây T1 chuyển gen dựa vào tỷ lệ phân ly 3:1 và 15:1.............43
Bảng 16. Kết quả phân tích cây chuyển gen T1........................................................... 47


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Cơ chế chống chịu của thực vật với stress.............................................................. 12
Hình 2. Hạt đậu tương của 4 giống ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 được sử dụng
trong thí nghiệm........................................................................................................................... 22
Hình 3. Cấu trúc vector biểu hiện gen GmGLP1 trong vector pZY101Asc..................23
Hình 4. Quy trình chuyển gen đậu tương thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.............37
Hình 5. Cây phản ứng với Basta sau 5 ngày phun............................................................... 37
Hình 6a. Ảnh điện di kiểm tra chất lượng DNA tổng số cây T0 giống ĐT22...............38
Hình 6b. Ảnh điện di kiểm tra chất lượng DNA tổng số cây T0 giống đậu tương
ĐT26 và DT84............................................................................................................................. 39
Hình 6. Ảnh điện di DNA tổng số cây đậu tương chuyển gen giống ĐT22 ở thế
hệ T0............................................................................................................................................... 39
Hình 7a. Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT22 được
chuyển gen thế hệ T0.................................................................................................................. 40
Hình 7b. Phân tích PCR gen cần chuyển - GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT26 và
DT84 được chuyển gen thế hệ T0............................................................................................ 40
Hình 7. Phân tích PCR gen cần chuyển – GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT22, ĐT26

và DT84 được chuyển gen thế hệ T0...................................................................................... 40
Hình 8. Cây đậu tương chuyển gen dương tính với PCR giống ĐT22 ở thế hệ T0 . 42
Hình 9. Hạt cây đậu tương chuyển gen giống ĐT22 ở thế hệ T0..................................... 42
Hình 10. Phản ứng của cây chuyển gen ở thế hệ T1 với Basta........................................ 43
Hình 11. DNA tổng số cây T1sống sót sau khi phun Basta............................................... 44
Hình 12. PCR kiểm tra sự có mặt của gen GmGLP1 trong cây T1.................................. 45
Hình 13. Kết quả lai Southern Blot......................................................................................... 46


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
A.tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

ADN

Axit deoxyribonucleic

AS

Acetosyringone

BAP

6 – benzylaminopurine

Bar

Gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase

Bp

Base pair

CCM

Cocultivation medium – môi trường đồng nuôi cấy

Cs

Cộng sự

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

ĐT22

Giống đậu tương ĐT22

ĐT26

Giống đậu tương ĐT26

DT84

Giống đậu tương DT84

ĐVN9

Giống đậu tương ĐVN9

EDTA

Ethylene Diamine Tetra Acetic

GA3

Gibberelic acid

GM

Germination medium – môi trường nảy mầm hạt

GmGLP1

Glycine max Germin – like protein 1

IBA

Indole-3-butyric acid

Kb

Kilo base

OD

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi polymerase

RM

Rooting medium – môi trường ra rễ

SDS

Sodium dodecysulfat

SEM

Shoot elongation medium – môi trường kéo dài chồi

SIM

Shoot induction medium – môi trường tạo đa chồi

T0

Cây chuyển gen

T1

Cây chuyển gen thế thệ thứ nhất

TAE

Tris – acetate – EDTA

v/p

vòng/phút

YEP

Yeast extract peptone


MỞ ĐẦU
Đậu tương (Glycine max(L.) Merr ) [1] hay còn gọi là cây đậu nành là cây
công nghiệp ngắn ngày có hiệu quả kinh tế và giá trị dinh dưỡng cao. Đậu tương là
cây trồng lấy hạt, và là cây cho dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới, chỉ đứng hàng
thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô. Do có khả năng thích ứng rộng nên cây đậu
tương được trồng khắp các châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ - chiếm
tỷ lệ 76,96%, tiếp đến là Châu Á – 18,54% [85]. Ở Việt Nam, diện tích gieo trồng đậu
tương đang được mở rộng, tính đến tháng 11/2013 diện tích gieo trồng đậu tương
khoảng 117,8 triệu ha, sản lượng đạt khoảng 168,3 nghìn tấn [8].
Tuy nhiên, hiện nay cả thế giới đang phải đối mặt với hiện tượng biến đổi khí
hậu, nền nhiệt hằng năm tăng cao dẫn đến tình trạng hạn hán. Mức độ hạn hán thường
khó dự đoán do phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm tần suất và sự phân bố lượng
mưa, mức độ nước bay hơi, và khả năng giữ nước của đất [76, 29]. Theo Boyer
(1982) [13], hạn hán là yếu tố phi sinh học có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất cây
trồng trên toàn thế giới, đồng thời hạn hán có khả năng tác động lên nhiều giai đoạn
phát triển khác nhau của cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng
[29]. Bởi sự ấm lên của khí hậu toàn cầu, và nhu cầu thực phẩm tăng ngày càng cao

dưới áp lực của gia tăng dân số, tần suất và sự ảnh hưởng của hạn hán càng trở nên rõ

rệt [68, 63, 22]. Trước thực trạng đó, việc nghiên cứu phát triển những giống cây
trồng mới có khả năng thích ứng, chống chịu tốt trong điều kiện hạn hán đang là một
trong những mục tiêu hàng đầu của các nhà khoa học trên thế giới cũng như các nhà
khoa học Việt Nam.
Các nghiên cứu trước đây về cơ chế phân tử chỉ ra rằng tính trạng chịu hạn ở
thực vật được kiểm soát bởi nhiều gen và được chia làm hai nhóm chính là nhóm các
gen điều hòa và nhóm các gen chức năng [38, 61, 11]. Trong nhóm gen chức năng thì
họ gen mã hóa cho germin-like proteins (GLPs) đóng vai trò thiết yếu đối với tiềm
năng chịu hạn ở cây. Ở đậu tương, họ gen GmGLP được biết đến gồm 21 gen [45],
GLPs được biết đến với khả năng SOD, POD là các hoạt tính enzyme chống oxi hóa.
Nhờ đó đóng vai trò quan trọng trong việc thể hiện khả năng chống

1


chịu của cây trồng với các điều kiện bất lợi. Ở đậu tương, gen mã hóa cho protein này
được đặt tên là Glycine max GmGLP1 – Soybean Oxalate oxidase.
Việc nghiên cứu và sử dụng hệ thống gen chống chịu với các điều kiện bất lợi
trong việc chọn tạo giống cây trồng biến đổi gen có khả năng kháng hạn đã và đang
là tâm điểm của hàng loạt các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới.
Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu
khả năng tiếp nhận gen GmGLP1 vào cây đậu tương (Glycine max) thông qua vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens”
Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu biến nạp gen GmGLP1 vào 4 giống đậu tương Việt Nam: ĐT22,
ĐVN9, ĐT26 và DT84.
Yêu cầu của nghiên cứu
Biến nạp thành công gen GmGLP1 vào một trong bốn giống đậu tương ĐT22,
ĐVN9, ĐT26 và DT84.
Phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T0 và cây T1.

2


CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đậu tương và tầm quan trọng của cây đậu tương
1.1.1. Giới thiệu chung về đặc điểm sinh học của cây đậu tương
Đậu tương hay còn gọi là đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine
max(L.) Merr theo khóa phân loại của Hymowitz, và Newel (1981) [37].Căn cứ vào
đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể, đậu tương được xếp
vào Bộ (Fabales), Họ (Fabaceae), Phân họ (Leguminosae), Chi (Glycine). Đậu tương
có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 40.
Đặc điểm hình thái học của cây đậu tương Glycine max(L.) Merr
- Rễ đậu tương bao gồm: rễ chính và rễ phụ. Rễ chính có thể ăn sâu 30-50cm
và có thể trên 1m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ tập trung nhiều ở tầng đất 7-8cm
2

rộng 30-40cm [1] Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần.
- Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông

nhỏ, thân trung bình có 14-15 lóng. Toàn thân có 1 lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao
phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cả cuống lá.
- Lá cây đậu tương có 3 loại lá:
* Lá mầm (lá tử diệp): lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi

tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh
* Lá nguyên (lá đơn): Lá nguyên xuất hiện sau khi cây mọc từ 2-3

ngày và mọc phía trên lá mầm. Lá đơn mọc đối xứng nhau.
* Lá kép: Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét. Lá chét mọc so le,

lá kép thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu.
- Hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân. Hoa mọc thành từng chùm,

mỗi chùm có từ 1-10 hoa và mỗi chùm thường có 3-5 hoa. Hoa đậu tương thuộc loại
hoa lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa, có 10 nhị
và 1 nhụy, vì thế cây đậu tương là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phẩn rất thấp chỉ chiếm
0,5 – 1%.
- Số quả đậu tương biến động từ 2-20 quả ở mỗi chùm hoa và có thể đạt tới

400 quả trên một cây. Một quả chứa từ 1-5 hạt, nhưng hầu hết ở các giống đậu

3


tương thường thấy chỉ có từ 2-3 hạt. Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, có chiều dài
từ 2-7cm hoặc hơn. Quả có màu sắc biến động từ vàng đến trắng tới vàng sẫm hoặc
đen.
- Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt,... Rốn

hạt có màu sắc khác nhau và đặc trưng cho mỗi giống.
Đặc điểm quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương
Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương được chia làm hai giai
đoạn chính là (i): giai đoạn phát triển sinh dưỡng và (ii): giai đoạn sinh sản. Trong
từng giai đoạn trải qua các bước khác nhau.
(i). Giai đoạn phát triển sinh dưỡng: chia ra làm 6 giai đoạn nhỏ.
- Giai đoạn nảy mầm: hạt đậu tương bắt đầu nảy mầm khi hấp thụ đủ lượng

nước bằng hoặc tương đương 50% khối lượng hạt. Rễ chính xuất hiện đầu tiên rồi
đến thân mầm sau đó lá mầm xuất hiện. Sự nảy mầm hạt diễn ra trong vòng từ 5 – 10

ngày. Hạt nảy mầm phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ môi trường, độ ẩm và độ sâu
của hạt trong đất… Trong 5 ngày tính từ ngày gieo hạt, lông rễ xuất hiện và có chức
năng hấp thu chất dinh dưỡng và nước cho cây. Rễ thứ sinh bắt đầu phát triển từ rễ
chính. Thân mầm tiếp xúc với ánh sáng, kéo lá mầm lên khỏi mặt đất, trụ lá mầm bắt
đầu sinh trưởng, lá đơn xuất hiện.
- Giai đoạn lá mầm: giai đoạn lá mầm bắt đầu khi những lá đơn xuất hiện.

Trong giai đoạn này, lá mầm duy trì nguồn dinh dưỡng cần thiết cho cây non. Khoảng
70% khối lượng khô của lá mầm dần bị mất đi bởi quá trình chuyển dinh dưỡng từ lá
mầm tới các phần còn lại của cây.
- Giai đoạn xuất hiện lá kép đầu tiên: giai đoạn này được đánh dấu bằng sự

xuất hiện của chiếc lá kép đầu tiên.
- Giai đoạn lá kép thứ 2: cây cao khoảng 15,24 – 20,32 cm, xuất hiện 3 đốt

trên thân và có thêm chiếc lá kép thứ 2. Ở giai đoạn này, quá trình cố định nito từ vi
khuẩn bắt đầu diễn ra. Các nốt sần của rễ xuất hiện trong phạm vi 25,4 cm từ mặt đất
xuống rễ. Những nốt sần có màu sắc khác nhau, nốt sần có mầu hồng hay đỏ

4


diễn ra sự cố định nitơ tích cực; trong khi đó những khối u màu trắng, nâu hay xanh
lá cây không diễn ra sự cố định nitơ.
- Giai đoạn lá kép thứ 3 tới giai đoạn sinh trưởngthứ 5: cây cao khoảng 17,78

– 22,86 cm, có 4 đốt và 3 lá kép. Đến giai đoạn 5, cây cao từ 25,4 – 30,48 cm, lá kép
tiếp tục xuất hiện. Ở giai đoạn 5 này, xuất hiện các chồi phụ ở đỉnh – các chồi này sau
này sẽ phát triển thành chùm hoa.
- Giai đoạn xuất hiện hoa sớm: cây cao từ 30,48 – 35,56 cm. Lá mầm và lá

đơn trong giai đoạn này có thể bị già hóa.
(ii): Giai đoạn sinh sản: chia ra làm 7 giai đoạn nhỏ:
- Bắt đầu nở hoa: ít nhất 1 hoa nở ra từ một trong các đốt phát triển từ thân

chính của cây.
- Nở hoa hoàn toàn: xuất hiện một hoa đã nở từ 1 trong 2 đốt ở phần ngọn cây.

Một trong hai đốt này có 1 lá đã phát triển hoàn toàn. Chiều cao cây đạt 50% chiều
cao của cây trưởng thành, và đạt 50% tổng số đốt ở cây trưởng thành. Rễ phụ hướng
sâu vào lòng đất, sự cố định nitơ tăng lên nhanh chóng.
- Hình thành quả đậu:một quả phát triển từ 4 đốt trên cùng dài khoảng 0,15

cm. Nhiệt độ, độ ẩm ảnh hưởng lên tổng số quả được hình thành, số lượng hạt được
tạo thành trên mỗi quả và kích thước của hạt.
- Hình thành quả: giai đoạn diễn ra sự phát triển nhanh của quả, sự phát triển

của hạt bắt đầu diễn ra. Khối lượng khô của quả tăng nhanh từ giai đoạn hình thành
quả tới giai đoạn hình thành hạt. Có một quả đậu dài 1,9 cm phát triển từ 4 đốt trên
cùng. Quá trình hình thành hoa diễn ra ở đỉnh thân chính. Đây là giai đoạn quan trọng
đối với năng suất tạo hạt. Bất kỳ điều kiện bất lợi nào cũng làm giảm năng suất cây.
- Hình thành hạt:hạt có kích thước 0,31 cm trong quả phát triển từ 4 đốt trên

cùng của thân chính. Vào giữa giai đoạn này, cây đạt được chiều cao tối đa, số lượng
đốt tối đa và diện tích bề mặt lá tối đa. Sự cố định nitơ đạt đỉnh và bắt đầu giảm. Hạt
vẫn tiếp tục tích lũy hàm lượng khô. Cuối giai đoạn này, sự tích lũy dinh

5

dưỡng trong các lá cây đạt đỉnh và bắt đầu quá trình dịch chuyển sinh dưỡng đến hạt.
Khả năng phục hồi của cây với điều kiện bất lợi là rất thấp.
- Hình thành hạt hoàn toàn: khối lượng hạt trong giai đoạn này đạt đỉnh. Tốc

độ sinh trưởng diễn ra nhanh nhưng bị chậm lại ở giữa giai đoạn này, và đạt đỉnh ở
giai đoạn bắt đầu trưởng thành. Trong giai đoạn này, hạt phát triển chiếm hết không
gian trong khoang hạt. Sự hóa vàng của lá bắt đầu diễn ra. Sự sinh trưởng của rễ diễn
ra hoàn toàn vào khoảng giữa giai đoạn này.
- Bắt đầu trưởng thành: giai đoạn này được đánh dấu bằng việc một quả trên

thân chính có màu nâu, màu xanh của vỏ quả chuyển sang màu vàng. Chất khô trong
mỗi hạt bắt đầu đạt đỉnh. Ở bước trưởng thành về mặt sinh lý, các hạt đạt khoảng
60% độ ẩm. Điều kiện bất lợi ở giai đoạn này hay sau đó hầu như không gây ra ảnh
hưởng lên năng suất của cây trồng.
- Hoàn toàn trưởng thành: 95% số quả trên cây chuyển sang màu nâu.

1.1.2. Vai trò của cây đậu tương đối với đời sống của con người
Cây đậu tương đóng vai trò quan trọng trong đời sống con người bởi nó là
nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giàu đạm, giàu chất béo, giàu các chất
khoáng và các vitamin. Hàm lượng protein trung bình khoảng 35,5 – 40% trong khi
đó, hàm lượng protein trong gạo chỉ từ 6,2 – 12%, ngô từ 9,8 – 13,2%, thịt bò 21%,
thịt gà 20%, cá từ 17 – 20% và trứng từ 13 – 14%. Hàm lượng lipit trung bình từ 15
– 20% và với thành phần chủ yếu là các axit béo không no khoảng 60 – 70% có hệ số
đồng hóa cao và mùi vị thơm như axit linoleic khoảng 52 – 65%, oleic khoảng 25
– 36%, linolenolic khoảng 2 – 3% [1].
Vai trò của cây đậu tương với ngành công nghiệp
Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau: chế biến
cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi
trơn trong ngành hàng không. Tuy nhiên, đậu tương chủ yếu được dùng làm nguyên
liệu để ép dầu:hiện nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên

liệu cho ép dầu, chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật.

6


Vai trò của cây đậu tương với ngành nông nghiệp
Trước tiên, đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, với tỉ lệ 1kg hạt đậu
tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Các bộ phận thân, lá, rễ, quả, hạt của
cây đậu tương đều có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân, lá
tươi và nghiền khô đều là thức ăn tổng hợp cho gia súc. Sản phẩm phụ công nghiệp
như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao (N: 6,2% ; P 2O5: 0,7% ; K2O: 2,4%)
và cũng được dùng sản xuất thức ăn cho gia súc [1].
Tiếp đến, cây đậu tương đóng vai trò trong việc cải tạo đất. Đậu tương là cây
luân canh cải tạo đất tốt. Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ
cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng vụ sau, góp phần tăng năng
suất cả hệ thống cây trồng đồng thời giảm chi phí cho việc bón nitơ. Thân, lá đậu
tương có thể dùng để bón ruộng thay phân hữu cơ bởi hàm lượng nitơ trong thân
chiếm 0,05% trong lá chiếm 0,19% [1].
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam
Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới
Với những giá trị kinh tế và sử dụng của cây đậu tương, nên cây đậu tương
được xem là một trong những loại cây trồng chiến lược trên toàn thế giới, đứng ở vị
trí thứ 4 chỉ sau cây lúa, cây ngô và cây lúa mì. Do có khả năng thích nghi rộng với
các điều kiện môi trường khác nhau nên cây đậu tương được trồng rộng rãi trên toàn
thế giới, nhưng điều kiện khí hậu khác nhau ở các châu lục do đó, cây đậu tương
được trồng nhiều nhất ở Châu Mỹ chiếm tỷ lệ 76,96%, tiếp đến là Châu Á chiếm tỷ lệ
18,54%[85]. Theo thống kê của tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp Quốc,
diện tích gieo trồng đậu tương trên thế giới tăng khoảng 11,6 triệu ha trong vòng 4
năm trở lại đây (diện tích gieo trồng năm 2009 là 99,34 triệu ha đến năm 2013 diện
tích gieo trồng tăng lên 111,27 triệu ha) (bảng 1) [27].

Bảng 1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới trong những năm gần đây
Năm
2009
2010

7


2011
2012
2013
(Nguồn: FAOSTAT, 2014)
Trong đó, 4 quốc gia sản xuất nhiều đậu tương nhất là Mỹ, Brazil, Argentina
và Ấn Độ (Bảng 2). Mỹ là nước có diện tích gieo trồng và sản lượng đậu tương lớn
nhất trên thế giới vào khoảng 30,7 triệu ha năm 2013.
Tuy diện tích gieo trồng đậu tương tăng đều qua các năm (bảng 1), nhưng sản
lượng đậu tương trên thế giới lại biến động không đồng đều qua các năm. Năm 2009
sản lượng đậu tương trên toàn thế giới đạt 223,41 triệu tấn, năm 2010 sản lượng tăng
lên 265,04 triệu tấn nhưng tới năm 2011 sản lượng giảm xuống 261,94 triệu tấn, năm
2012 sản lượng đậu tương tiếp tục giảm xuống còn 241,14 triệu tấn, tới năm 2013 sản
lượng tăng trở lại 276,4 triệu tấn cao nhất trong 4 năm trở về trước.
Bảng 2. Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên thế giới
trong những năm gần đây
Năm

2011

2012

2013

(Nguồn: FAOSTAT, 2014)
Trong năm năm trở lại đây, năng suất đậu tương trên thế giới cũng biến động
không ngừng (bảng 1), năm 2010 năng suất đậu tương đạt 25,78 tạ/ha cao nhất trong
năm năm qua. Bốn quốc gia có diện tích gieo trồng và sản lượng đậu tương lớn nhất
trên thế giới, cũng có những biến động về sản lượng đậu qua các năm. Tuy


8


Mỹ là quốc gia có diện tích gieo trồng và tổng sản lượng đậu tương cao nhất trên thế
giới nhưng Mỹ không phải là quốc gia có sản lượng đậu tương lớn nhất trên thế giới
(sản lượng đậu tương của Mỹ năm 2013 là 29,15 tạ/ha thấp hơn so với Brazil sản
lượng đậu tương đạt 29,32 tạ/ha)
Có nhiều nguyên nhân gây ra sự không ổn định về năng suất và sản lượng đậu
tương mặc dù diện tích đất canh tác đậu tương qua các năm tăng đồng đều, chẳng hạn
như là do dịch bệnh, yếu tố kỹ thuật. Nhưng đáng chú ý nhất là do tình hình biến đổi
khí hậu và hạn hán là yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất đậu tương trên toàn
thế giới. Theo thống kê của cơ quan nông nghiệp Hoa Kỳ, sản lượng đậu tương của
Argentina đạt hơn 49 triệu tấn năm 2009, năng suất khoảng hơn 25 tạ/ha. Nguyên
nhân gây ra tình trạng này là do tình trạng hạn hán của một số nước Châu Mỹ Latinh
trong đó có Argentina. Sự tụt giảm nắng suất của Ấn Độ và Argentina gây ra sự suy
giảm sản lượng đậu tương trên thế giới.
Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam
Cây đậu tương đã được gieo trồng từ lâu đời ở Việt Nam. Tuy nhiên, Việt Nam
là một quốc gia có nền nông nghiệp truyền thống lâu đời, ngành nông nghiệp hoạt
động chủ yếu dựa trên phương pháp canh tác truyền thống, nên năng suất cây trồng
thấp và sản xuất còn nhỏ lẻ. Nhưng do những giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như giá
trị về mặt công nghiệp của cây đậu tương là rất lớn nên hằng năm Việt Nam nhập
khẩu một lượng lớn đậu tương từ các quốc gia khác trên thế giới (năm 2013, Việt

Nam nhập khẩu khoảng 556 nghìn tấn đậu tương từ Hoa Kỳ).
Bảng 3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam trong những năm gần đây
Năm
2011
2012
2013
2014*
2015*
(Nguồn:Tổng cục thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn, *: Số liệu dự báo của USDA [86])
Ở nước ta, cây đậu tương đang được trồng tại 25 tỉnh thành trong cả nước, với

khoảng 65% tại các khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực phía Nam, khu

9


vực trồng đậu tương chính tập trung ở vùng Đồng bằng sông Hồng. Diện tích canh
tác đậu tương ngày càng bị thu hẹp, bên cạnh đó sản lượng đậu tương qua các năm
tương đối đồng đều nhưng tổng sản lượng chung qua các năm biến động và theo
chiều hưởng giảm (bảng 3) [8]. Mặc dù chưa có thống kê cụ thể nguyên nhân của
việc diện tích đất gieo trồng đậu tương ngày càng bị thu hẹp, tuy nhiên, kết hợp với
tình hình đánh giá sản lượng đậu tương của các Quốc gia trên thế giới có thể ban đầu
kết luận rằng hạn hán cũng đang góp phần ảnh hưởng tới năng suất và diện tích gieo
trồng đậu tương.
Trước những thực trạng ở cả Việt Nam và trên thế giới, việc nghiên cứu tìm ra
gen có khả năng kháng hạn và chuyển vào cây trồng nói chung và cây đậu tương
đang là vấn đề cấp bách nhất. Thêm vào đó, ngày 16 tháng 5 năm 2013, Bộ Tài
Nguyên và Môi trường đã ban hành Thông tư số 08/2013/TT-BTNMT quy đinh trình
tự, thủ tục cấp và thu hồi Giấy chứng nhận an toàn sinh học với cây trồng biến đổi

gen, từ đó cho phép người nông dân được canh tác các loại cây trồng biến đổi gen,
cũng như mở ra triển vọng cho các nhà khoa học Việt Nam nghiên cứu tạo ra những
loại cây trồng có khả năng kháng hạn nói chung và cây đậu tương có khả năng kháng
hạn nói riêng.
1.2. Cơ chế chống chịu các yếu tố phi sinh học của thực vật
Trước những diễn biến của khí hậu theo hướng bất lợi như nền nhiệt độ cao
dẫn tới hạn hán, nước biển xâm lấn đất liền dẫn đến đất nhiễm mặn … Thực vật là
đối tượng chịu ảnh hưởng nhiều nhất bởi các yếu tố phi sinh học bởi thực vật không
có khả năng di chuyển như các loài động vật. Do đó, để sống sót và tiếp tục duy trì
nòi giống thực vật có những cơ chế chống chịu khác nhau với các yếu tố phi sinh học.
Các nhân tố phi sinh học (abiotic stress) như hạn hán, mặn và lạnh là những
điều kiện môi trường bất lợi ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng và năng suất cây
trồng trên toàn thế giới [42]. Thực vật thường là đối tượng chịu sự tác động trước hết
của các điều kiện môi trường bất thuận như các yếu tố phi sinh học - nguyên nhân
gây ra các tác nhân phi sinh học ảnh hưởng đến năng suất cây trồng

10


[13] cũng như gây ra sự phân bố của các loài thực vật trên các loại môi trường khác

nhau [14]. Thực vật thường phải đối mặt với các điều kiện bất lợi phi sinh học như sự
thiếu hụt về nước, sự khắc nghiệt về nhiệt độ (nóng hoặc lạnh), nguồn dinh dưỡng
trong đất bị suy giảm hoặc do sự dư thừa của các ion độc hại, thừa ánh sáng và sự
khô cằn của đất làm cản trở quá trình sinh trưởng của rễ [75]. Thực vật có khả năng
đáp ứng hoặc thích nghi với môi trường khác nhau một cách trực tiếp hoặc gián tiếp
liên quan đến tính bền vững và khả năng phục hồi của quá trình quang hợp, đồng thời
kết hợp với các quá trình khác để sinh trưởng và phát triển đặc biệt là sinh sản [14].
Một điểm nổi bật của khả năng thích ứng với điều kiện bất lợi phi sinh học là sự kích
hoạt các đáp ứng phức tạp bao gồm tương tác gen và xen kẽ (crsoss-talk) với nhiều

con đường phân tử khác nhau.
Các điều kiện bất lợi hạn, lạnh và mặn đều là những điều kiện bất lợi mang
tính thẩm thấu. Đầu tiên chúng gây ra hiện tượng mất nước ở tế bào và dẫn tới làm
giảm khả năng thẩm thấu của tế bào. Tuy nhiên, mức độ mất nước của tế bào gây ra
bởi các điều kiện bất lợi khác nhau là khác nhau: i) điều kiện bất lợi do muối làm
giảm hàm lượng nước trong tế bào do giảm thế năng nước bên ngoài, làm nồng độ
+

-

ion tăng (chủ yếu là Na và Cl ) dẫn đến khó hấp thu nước qua rễ và vận chuyển nước
đến các tế bào thực hiện hoạt động trao đổi chất; ii) điều kiện bất lợi do lạnh gây ra
làm giảm hàm lượng nước tế bào có thể gọi là hạn sinh lý, tức là không có khả năng
vận chuyển nước có sẵn trong đất đến các tế bào sống, chủ yếu diễn ra ở phần thịt lá;
iii) sự giảm hàm lượng nước trong tế bào gây ra bởi điều kiện bất lợi hạn là do tình
trạng thiếu nước trong đất hoặc trong khí quyển. Để thích nghi với các điều kiện bất
lợi của ngoại cảnh, thực vật phản ứng lại các điều kiện bất lợi thông qua hai con
đường chính là con đường phụ thuộc acid absisic (ABA) và con đường không phụ
thuộc ABA (hình 1).

11


Hình 1. Cơ chế chống chịu của thực vật với điều kiện bất lợi
Thực vật có khả năng chống lại tất cả các yếu tố phi sinh học ảnh hưởng tới sự
sinh trưởng và phát triển của cây. Trong tất cả các yếu tố phi sinh học, yếu tố nào
cũng đang là bài toán đối với các nhà khoa học và các nhà chọn giống trên toàn thế
giới. Tuy nhiên, trong phạm vi đề tài nghiên cứu này, chúng tôi chỉ quan tâm và đưa
ra giải pháp cho vấn đề chịu hạn ở thực vật mà đối tượng chính ở đây là cây đậu
tương.

1.3. Đặc tính chịu hạn và một số gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu
tương
1.3.1. Đặc tính chịu hạn ở cây đậu tương
Khi gặp các điều kiện bất lợi về nước, thực vật có ba cơ chế chính để có thể
thích ứng sinh trưởng và phát triển: (i): cơ chế trốn thoát điều kiện hạn, (ii): cơ chế
tránh hạn; (iii): cơ chế chống chịu hạn. Ở đậu tương, cơ chế trốn thoát điều kiện hạn
hán cho phép cây hoàn thành chu kỳ sống của mình sớm và thường các giống đậu
tương có cơ chế trốn thoát điều kiện hạn hán là những giống đậu tương ngắn ngày và
chín rất sớm (xem mục 1.1.1). Đối với giống đậu tương có cơ chế tránh hạn sẽ có
12


các cơ chế để duy trì lượng nước trong cây trong suốt giai đoạn hạn thông qua việc
tăng khả năng hấp thụ nước từ rễ và giảm sự thoát hơi nước ở những bộ phận khác
của cây. Các giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn, cây sẽ có khả năng duy trì
sức căng của các mô và tế bào, do đó các quá trình trao đổi chất có thể diễn ra bình
thường trong điều kiện lượng nước bên ngoài môi trường xuống rất thấp [49].
1.3.2. Các gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu tương
Trong những năm gần đây, các nghiên cứu tìm ra những gen có khả năng
kháng hạn ở thực vật đang được hết sức quan tâm. Bởi không phải bất kỳ loài thực
vật nào cũng có khả năng tự mình chống chịu lại với điều kiện hạn hán. Do đó việc
tìm ra những gen có khả năng kháng hạn, phân lập và chuyển vào cây trồng quan tâm
đang được tiến hành ở hầu hết các phòng thí nghiệm về thực vật. Cho tới nay, có rất
nhiều công bố liên quan tới việc phân lập tách chiết cũng như chuyển thành công
đoạn gen kháng hạn vào cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng.
Gen GmDREB2 và gen P5CR là hai trong số các gen có chức năng chịu hạn đã
từng được nghiên cứu và biến đổi ở cây đậu tương[23, 16]. Cả hai gen GmDREB2 và
P5CR, mã hóa lần lượt cho Dehydration Responsive Element Binding protein và L1

∆ -Pyrroline-5-Carboxylate Reductase, đều có mặt tự nhiên trong hệ gen của đậu

tương [24]. Trong điều kiện hạn hán, gen GmDREB2 được kích hoạt biểu hiện và mã
hóa cho một yếu tố phiên mã có khả năng liên kết với yếu tố di truyền DRE của nhiều
gen tham gia vào phản ứng chịu hạn, góp phần kích hoạt phản ứng thích ứng với môi
trường thiếu nước. Chính từ đặc điểm này, các nhà nghiên cứu đi đến hướng tăng
cường sự biểu hiện của gen GmDREB2 nhằm nâng cao tính chống chịu trong điều
kiện môi trường thiếu nước ở thực vật, mà Arabodopsis chính là một ví dụ liên quan.
Trong khi đó, theo Ronde và các cs (2004)[23], với việc chuyển thêm bản copy của
gen P5CR vào trong cây, đậu tương được xác định có khả năng chống chịu với hạn
hán tốt hơn. Theo nghiên cứu này chỉ ra rằng số lượng gen P5CR có mối liên hệ đến
hàm lượng nước trong tế vào, cũng như hàm lượng proline tự do. Lý do cây chịu hạn
tốt hơn là vì proline tự do sẽ liên kết và làm ổn định màng tế bào.

13


1.4. Gen GmGLP1
Germin-like proteins (GLPs) là những proteins có trình tự tương đồng với
những protein germin được tìm thấy ở cây lúa mỳ và lúa mạch – do vậy GLPs cũng
có các motif germin [45] – và được tìm thấy ở rêu, cây một lá mầm và cây hai lá mầm
[62]. Các phân tích hệ gen ở nhiều loài thực vật cho thấy GLPs được mã hóa bởi các
họ gen gồm nhiều gen thành viên. Trong đó, riêng ở đậu tương đã xác định có một họ
gen GmGLP có 21 gen [45]. Khác với những germin – được biểu hiện ở hạt đang nảy
mầm – các gen GLPs được biểu hiện ở nhiều bộ phận khác nhau của cây, như ở lá
mầm, rễ, lá, hoa, và hạt [45, 62]. Sự biểu hiện này phản ánh vai trò đa dạng của GLPs
trong quá trình phát triển của cây: thực tế, GLPs tồn tại ở dạng glycoprotein thường
kết chuỗi lại trong ma trận ngoại bào nhờ các liên kết ion, và có các chức năng
isomerase, cyclase, dioxygenase. Ngoài ra, một số gen GLPs có biểu hiện tăng cường
trong điều kiện khô hạn [40]. Hai trong số những chức năng nổi bật đã biết của họ
gen GLPs là: mã hóa cho proteins đóng vai trò thụ thể của auxin—phân tử tín hiệu
thực vật tham gia vào rất nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển ở thực vật; mã hóa

cho proteins mang hoạt tính enzyme superoxide dismutase (SOD) giúp chống oxy hóa
và giúp cây chống chịu với nấm gây bệnh như Rhizoctonia solaani và Verticillium
longisporum [41, 62]. Năm 2010, Joydeep Banerjee và cs [10] sử dụng chủng vi
khuẩn A.tumefacien LBA4404 mang đoạn gen OsGLP1 chuyển nạp gen vào cây
thuốc lá bằng phương pháp lây nhiễm qua lá để xác định ảnh hưởng của gen OsGLP1
tới chiều cao cây và khả năng kháng sâu bệnh. Cũng năm 2010, Katrin Knecht và cs
[41] sử dụng vi khuẩn A.tumefacien chủng GV3101 mang gen BvGLP1 chuyển nạp
vào Arabidopsis thaliana thông qua phương pháp tổn thương lá, kết quả thu được cho
thấy biểu hiện của gen BvGLP1 trong cây Arabidopsiskháng được hai loại nấm gây
bệnh là Verticillium longisporum và Rhizoctonia solaani. Năm 2009, Yuqin Ke và cs
[40], nghiên cứu sự biểu hiện khác nhau của các loại protein và photphoprotein trong
điều kiện hạn hán ở cây lúa, nghiên cứu chỉ ra rằng trong điều kiện khô hạn, protein
GLP1 bị giảm mức độ photphoryl hóa mạnh.

14


Ở đậu tương gen mã hóa cho protein này được đặt tên là Glycine max
GmGLP1- Soybean Oxalate oxidase ( Gen ID: |EU916269.1|).
1.5. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật đã được nghiên
cứu và ứng dụng vào nhiều loại cây trồng khác nhau như: chuyển gen thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens, chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen, chuyển gen qua ống
phấn, chuyển gen bằng vi tiêm … Nhưng hai phương pháp chuyển gen thành công
nhất và được ứng dụng nhiều nhất là phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens và phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen.
1.5.1. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phương
pháp này sử dụng vi khuẩn A. tumefaciensnhư một vector sinh học
để chuyển một đoạn ADN của chúng vào hệ gen thực vật, kết quả tạo được cây biến
đổi gen [34], [80]. Vi khuẩn A. tumefaciens xâm nhiễm vào cây trồng thông qua vị trí

bị tổn thương của cây. Khi bị tổn thương, mô thực vật sẽ tiết ra một số hợp chất
phenol, hợp chất này đóng vai trò dẫn dụ vi khuẩn A. tumefaciensbiểu hiện vùng gen
Vir nằm trên Ti – plasmid [35]. Kết quả biểu hiện cácgen Vir, sợi đơn T-ADN sẽ được
chuyển và tổng hợp trong hệ gen thực vật. Vấn đề chính của phương pháp chuyển
gen này là làm thế nào để có thể kết hợp giữa tế bào chủ với vector tương ứng.
Mặc dù ban đầu đậu tương không phải là đối tượng được xem xét để lây
nhiễm với vi khuẩn [21] cho tới khi Pederson và cs (1983) [59] đã chứng minh đậu
tương là vật chủ thích hợp với loại vi khuẩn này. Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen vẫn
bị kiểm soát bởi yếu tố giống [25, 54]. Mặt khác, khả năng thu được các chồi chuyển
gen từ những khối mô có khả năng tái sinh như phôi vô tính và nốt lá mầm ban đầu
rất thấp. Để nâng cao hiệu quả chuyển gen ngày càng có nhiều nghiên cứu nhằm tối
ưu quy trình như: bổ sung hợp chất có vai trò xúc tác như acetosyringone để kích
thích sự biểu hiện của các gen Vir, L-cystein [53], thiol [52] hoặc sử dụng các chủng
vi khuẩn có khả năng gây độc tính cao [32], xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu
quả chuyển gen thông qua nốt lá mầm [48, 55], cải tiến nốt lá mầm

15


làm vật liệu biến nạp [58], kết hợp lây nhiễm với tái sinh [15]. Vấn đề khác khi sử
dụng vi khuẩn A. tumefaciens còn phụ thuộc vào chủng khuẩn [47], số lượng bản sao
ADN được tổng hợp trong hệ gen thực vật [60, 71], pH môi trường [65], mức độ gây
tổn thương của cây [65, 70]. Trái ngược với phương pháp chuyển ADN trực tiếp,
chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens có thể cho kết quả với số bản copy
nhiều hơn, có thể là các mảnh hoặc các đoạn được kết hợp trong một khuôn mẫu
không được kiểm soát.
Những cây đậu tương chuyển gen đầu tiên được tao ra bằng phương pháp nốt
lá mầm sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens làm trung gian được báo cáo vào năm 1988
[20]. Nốt lá mầm của giống Peking được lây nhiễm với chủng vi khuẩn A.
tumefaciens mang gen chỉ thị gus, gen kháng kanamycin và glyphosate. Mẫu được

nuôi cấy trong môi trường có chứa BAP để cảm ứng tạo chồi , kanamycin cùng với
các kháng sinh khác có tác dụng loại bỏ lượng vi khuẩn còn lại sau khi đồng nuôi cấy.
Sau một vài tháng, cây con được tái sinh và được kiểm tra thông qua sự biểu hiện của
gen gus hoặc khả năng kháng glyphosate. Chỉ 6% tổng số chồi lựa chọn được chuyển
gen. Tám cây được tái sinh và phân tích, kết quả cho thấy chúng có một sợi ADN
được chèn vào. Mặc dù sự biến nạp cho hiệu quả không cao nhưng báo cáo chỉ ra
rằng có thể tái sinh các tế bào chuyển gen của một giống đậu tương khi được lây
nhiễm với chủng vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp.
Gần đây vi khuẩn A. tumefaciens và phương pháp chuyển gen bằng nốt lá
mầm cũng được sử dụng để chuyển gen tổng hợp protein vỏ của virus Bean Pob
Mottle (một loại virus gây bệnh đốm vỏ trên hạt đậu) vào đậu tương [26]. Tuy nhiên,
tỷ lệ chuyển nạp gen thấp, chỉ có 5 cây chuyển gen sơ khởi của 5 lá mầm khác nhau
được tạo ra từ 400 lá mầm ban đầu. Phân tích Southern blot cho thấy sự tích hợp gen
BPMVCP-P vào bộ gen và thể hiện qua các cây T 1. Khoảng 30% cây T2 có nguồn
gốc từ 1 dòng chuyển gen ban đầu được xét nghiệm ELISA (Enzym-linked Immuno
Sorbent Assay) cho thấy khả năng kháng hoàn toàn với virus này. Tình trạng hình thái
không bị biến đổi so với thế hện T1.

16