NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI COKER312 VÀ VN36P BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens(Phần phụ)

LỜI CẢM TẠ
Tôi chân thành cám ơn :
 Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban
chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy đã truyền đạt kiến
thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
 Ban Giám đốc Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long
 TS. Trần Thị Cúc Hòa, trưởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa
Đồng Bằng Sông Cửu Long đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian thực tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
 Các anh chị tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông
Cửu Long đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập tốt
nghiệp.
 Các bạn trong lớp Công nghệ sinh học 27 và ngoài lớp đã chia sẽ cùng tôi
những vui buồn trong thời giam học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong
thời gian thực tập tốt nghiệp.
 Con xin tỏ lòng biết ơn to lớn đối với ba mẹ và gia đình đã lo lắng, nuôi
con ăn học đến ngày hôm nay.
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005
NGÔ VIỆT DUY
iii
TÓM TẮT
NGÔ VIỆT DUY, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “NGHIÊN
CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI COKER 312
VÀ VN36P BẰNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ”.
Giáo viên hướng dẫn: TS. TRẦN THỊ CÚC HOÀ
Bông vải là một trong những cây trồng quan trọng ở nước ta. Với sự phát triển
của công nghệ sinh học, các gen mong muốn có thể chuyển vào cây bông vải nhằm nâng
cao năng suất, chất lượng xơ cũng như khả năng kháng sâu bệnh bằng các phương pháp
khác nhau trong đó phương pháp chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens được sử dụng phổ biến nhất. Trong qui trình chuyển nạp gen vào cây trồng,

hệ thống chọn lọc thông thuờng nhất là dùng các chất kháng sinh làm tác nhân chọn lọc.
Việc chuyển nạp gen đánh dấu chọn lọc kháng chất kháng sinh vào cây trồng để sử
dụng chất kháng sinh làm tác nhân chọn lọc đã gây nên những lo ngại về tính an toàn
sinh học của cây biến đổi gen. Gần đây để khắc phục nhược điểm này, hệ thống chọn
lọc mới bằng mannose đã được nghiên cứu để thay thế hệ thống chọn lọc dùng các chất
kháng sinh.
Mục đích khóa luận này nhằm nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai
giống bông vải Coker 312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, trong
đó chủ yếu nghiên cứu hiệu quả của hệ thống chọn lọc bằng mannose, vì đây là hệ thống
chọn lọc mới ở cây bông vải.
Trong khoá luận này, vắc tơ (vector) pManCa đã được thiết kế mang gen đánh
dấu chọn lọc pmi (để sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose) và gen gus. Mô khởi
đầu dùng để nuôi cấy là các khúc cắt trụ hạ diệp của cây mầm in vitro 5 – 7 ngày tuổi.
Thanh lọc mannose được thực hiện qua 3 vòng.
Kết quả thu được như sau:
Qua 2 vòng chọn lọc trên môi trường mannose, số mẫu mô sẹo sống sót vẫn đạt
tỷ lệ cao ở cả mẫu đốI chứng không chuyển nạp gen. Đến vòng chọn lọc thứ 3, khi số
mẫu mô sẹo được tách nhỏ, kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sót ở giống Coker
312 là 10,4% và ở giống VN36P là 13,6%, so với mẫu đối chứng (không chuyển nạp
gen) có 0% tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sót. Điều này cho thấy hệ thống chọn lọc mannose có
hiệu quả trong thanh lọc chuyển nạp gen.
Kết quả cho thấy giống bông Việt Nam VN36P cho hiệu quả cao trong nuôi cấy
mô như giống bông đối chứng quốc tế Coker 312. Giống bông VN36P có thể được lưu
ý trong chương trình tạo giống bông Việt Nam biến đổi gen.
Để hoàn thiện qui trình chọn lọc mannose đối với bông vải cần tiếp tục nghiên
cứu thêm về các mức liều lượng đường mannose và glucose ở mỗi vòng thanh lọc và
thời gian chọn lọc để nâng cao hiệu quả chọn lọc, giảm thiểu điều kiện cho hiện tượng
thoát mẫu.
iv
ABSTRACT

NGO VIET DUY, Nong Lam University. August 2005. “STUDY ON THE ABILITY
OF GENE TRANSFORMATION OF TWO COTTON CULTIVARS, COKER 312
AND VN36P BY USING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ”.
Supervisor: Dr. Tran Thi Cuc Hoa
Cotton is an important crop in Vietnam. With the development of biotechnology,
genes of interest can be engineered into the cotton plant to increase yield, fiber quality
and the ability to resist insect pests as well, using different methods of transformation, of
which Agrobacterium tumefaciens-mediated method is most popular. In the procedure of
plant transformation, the most common selection system was the use of antibiotics as
selective agents. The transfer of gene for antibiotic resistance into plants to allow the
use of antibiotics as selective agents has cause concerns on biosafety of transgenic
plants. Recently to overcome this shortcoming, a new selection system using mannose
was studied to replace the selection system using antibiotics.
The objectives of this assignment were to study the ability of gene transformation
of two cotton cultivars, Coker 312 and VN36P by using Agrobacterium tumefaciens, in
which the focus was to study the use of mannose selection because this selection system
is new for gene transformation of cotton.
In this study, the vector, pManCa harboring the selective marker gene, pmi (to
allow the use of mannose for selection) and the gene gus was used for transformation.
The explants were hypocotyl segments isolated from 5-7 day old seedlings in vitro.
Three selection cycles with mannose were done.
The results obtained from this study are summarized as follows.
After 2 cycles of selection with mannose, the survival percentage of callus
samples in the selective medium were still high, both in the check (non-transformed) and
transformed samples. At the third cycle of selection, when the calli were separated into
smaller pieces, the results of selection showed that the survival percentage of sample
were 10.4% for Coker and 13.6% for VN36P as compared to the non-transformed
samples which showed 0% of survival. This indicated that mannose selection system
was efficient in cotton transformation.
The results showed that the Vietnamese cotton VN36P gave high efficiency in

tissue culture as the international variety, Coker 312. The variety, VN36P should be
given an attention in the breeding program of Vietnamese transgenic cotton varieties.
To perfect the procedures of mannose selection system, studies should be done
further to investigate the mannose concentrations in each cycle of section, duration of
section to increase the selection efficiency and minimize the escape cases during
selection process.

v
MỤC LỤC
CHƯƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ..................................................................................................................iii
Tóm Tắt......................................................................................................................iv
Abstract.......................................................................................................................v
Mục lục......................................................................................................................vi
Danh sách các chữ viết tắt.......................................................................................viii
Danh sách các hình....................................................................................................ix
Danh sách các bảng.....................................................................................................x
1.MỞ ĐẦU.............................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.......................................................................................................1
1.2. Mục tiêu của khóa luận...................................................................................3
1.3. Hạn chế của khóa luận....................................................................................3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................................4
2.1. Sơ lược về Cây bông vải.................................................................................4
2.1.1. Vị trí và phân loại......................................................................................4
2.1.2. Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố........................................................4
2.1.2.1. Loài Gossypium arboreum.................................................................4
2.1.2.2. Loài Gossypium hirsutum...................................................................4
2.1.2.3. Loài Gossypium barbadense..............................................................5
2.1.2.4. Loài Gossypium herbaceum...............................................................5

2.1.2.5. Loài Gossypium tricuspidatum...........................................................5
2.1.3. Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam........................................................5
2.1.4. Tình hình sản xuất bông trên Thế Giới.....................................................7
2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải...............................................9
2.3. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens........................11
2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.....................................11
2.3.2. Ti-plamid ................................................................................................12
vi
2.3.2.1. Chức năng của T-DNA.....................................................................12
2.3.2.2. Chức năng của gen Vir......................................................................14
2.3.2.3. Cơ chế lây nhiễm..............................................................................16
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................18
3.1. Nội dung nghiên cứu.....................................................................................18
3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện....................................................................18
3.3. Vật liệu nghiên cứu.......................................................................................18
3.4. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................18
3.4.1 Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy........................................................................18
3.4.2 Quy trình chuyển nạp gen........................................................................20
3.4.2.1. Nguồn Plasmid .................................................................................20
3.4.2.2. Chuẩn bị vi khuẩn.............................................................................20
3.4.2.3. Lây nhiễm.........................................................................................20
3.4.2.4. Thanh lọc...........................................................................................21
3.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi................................................................................22
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................................................23
4.1. Sự hình thành và phát triển của mô sẹo........................................................23
4.2. Tỷ lệ mẫu sống sót và hình thành mô sẹo sau các lần thanh lọc...................27
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.............................................................................33
5.1. Kết luận.........................................................................................................33
5.2. Đề nghị..........................................................................................................33
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................34

7. PHỤ LỤC......................................................................................................39
vii