Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 05 locus penta e, d18s51, d21s11, TH01 và d3s1358 phục vụ giám định

́

ĐAỊ HOCC̣ QUÔC GIA HÀNÔỊ
TRƢỜNG ĐAỊ HOCC̣ KHOA HOCC̣ TƢC̣NHIÊN
---------------------------------------

Bùi Nguyên Hải

NGHIÊN CƢƢ́U XÂY DƢNGC̣ THANG ALEN CHỈTHI C̣
HUỲNH QUANG CHO 05 LOCUS PENTA E, D18S51,
D21S11, TH01 VÀ D3S1358 PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH

LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨ KHOA HOCC̣

Hà Nội, năm 2012


́

ĐAỊ HOCC̣ QUÔC GIA HÀNÔỊ
TRƢỜNG ĐAỊ HOCC̣ KHOA HOCC̣ TƢC̣NHIÊN
-----------------------------

Bùi Nguyên Hải

NGHIÊN CƢƢ́U XÂY DƢNGC̣ THANG ALEN CHỈTHI C̣
HUỲNH QUANG CHO 05 LOCUS PENTA E, D18S51,
D21S11, TH01 VÀ D3S1358 PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH
Chuyên ngành: Di truyền hocC̣
Mã số: 60.42.70

LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨ KHOA HOCC̣

̃

NGƢỜI HƢỚNG DÂN KHOA HOCC̣:
PGS.TS. Đinh Đoàn Long

Hà Nội, năm 2012


BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ/ chữ
viết tắt
ADN
APS
LD
bp
dNTP
dATP
dTTP
dGTP
dCTP
FL
M50
OD
PCR
PBS
RFLP
STR

Taq
TBE
TE
TEMED
VNTR
w/v

Nghĩa tiếng Anh
Acid Deoxyribonucleic
Amonium persulfate
Allelic ladder

Base pair
Deoxynucleoside
triphosphate Deoxyadenine
triphosphate Deoxythymidine
triphosphate Deoxyguanine
triphosphate Deoxycytozine
triphosphate Fluorescein
Marker 50bp
Optical density
Polymerase chain reaction
Phosphate buffer saline
Restriction fragment
length polymophism
Short Tandem Repeat
Thermus aquaticus
Tris-Boric acid-EDTA
Tris-EDTA
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine

Variable number of tandem
repeat
Weight/volume

Nghĩa tiếng Việt

Thang alen chỉthi chuẩṇ
Cặp bazơ nitơ

Chất nhuộm huỳnh
quang Fluorescein
Thang kích thƣớc ADN
50bp Mật độ quang
Phản ứng chuỗi trùng hợp
Đa hình theo chiều dài các đoạn
bị cắt bằng enzyme giới hạn
Các đoạn lặp lại ngắn

Các đoạn lặp nối tiếp có số
lƣợng khác nhau Khối
lƣợng/ thể tích


Mở đầu
Chƣơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1

Phƣơn
1.1.1

Cơ sở

1.1.2

Các kỹ

1.1.2.1 Kỹ thu

1.1.2.2 Các kỹ
1.2

Đại cƣ
cá thể
1.2.3

Các lo

1.2.4

Các lo

1.3

Các ph
1.3.1

Phươn

1.3.2

Phươn

1.3.3

Phươn

1.3.4

Phươn

1.4

Đại cƣ

tớch A
1.4.1

Khỏi n

1.4.2

Ứng d

1.5

Tình h
1.5.1

Tỡnh h

1.5.2

Tỡnh h


CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1

Nguyê

2.1.1

Đối tƣ

2.1.2

Thiết b

2.1.3

Mồi ch

2.1.4

Hoỏ ch

2.2

Phƣơn

2.2.1

Phƣơn

2.2.2

Phƣơn

2.2.3

Phƣơn

2.2.4

Kỹ thu

2.2.5

Phƣơn

2.2.5.1 Phát hiện băng ADN bằng Ethidium bromide
2.2.5.2

Phát h

2.2.6

Phƣơn

2.2.7

Thu th

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1

Kết qu

3.2

Kết qu

3.3

Kết qu

3.4

Kết qu

3.5

Kết qu

3.6

Kết qu

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1

Kết lu


4.2
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC (Bảng và Hỡnh ảnh)

Kiến nghị


MỞ ĐẦU
Những năm cuối thế kỷ XX đã chứng kiến sự phát triển nhanh chóng
của kỹ thuật di truyền kể từ khi James Watson và Francis Cric phát hiện ra cấu
trúc chuỗi xoắn kép ADN (năm 1953), và Kary Mullis phát minh ra phƣơng
pháp nhân bội ADN từ một lƣợng ADN rất nhỏ ban đầu trong ống nghiệm
(năm 1985). Những thành tựu này nhanh chóng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong
các nghiên cứu về y, sinh học và trong khoa học hình sự nhằm mục đích xác
định đặc trƣng cá thể ngƣời.
Có thể kể đến những ứng dụng đầu tiên để phân biệt cá thể đƣợc tiến
hành tại Anh vào năm 1985 với công trình nghiên cứu của Alec Jeffreys và
cộng sự khi nghiên cứu các đoạn gen mã hóa protein Myoglobin trong máu
ngƣời. Họ đã phát hiện trên đoạn gen có một trình tự bao gồm những bazơ
nitơ đƣợc lặp lại một số lần, điều đáng chú ý là các đoạn lặp này ở các cá thể
khác nhau thì có số lƣợng đoạn lặp khác nhau. Jeffreys coi đây là một đặc
điểm quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể.
Với sự phát triển của kỹ thuật gen, nhiều đoạn lặp lại đa hình khác lần
lƣợt đƣợc phát hiện sau đó. Từ việc phát hiện các đoạn đa hình có trình tự lặp
lại bằng phƣơng pháp sử dụng enzyme giới hạn (RFLP) đến phƣơng pháp lai
đầu dò (ADN probe), các đoạn lặp lại ngẫu nhiên có độ dài đơn vị lặp lại

trung bình (VNTR) hoặc các đoạn có đơn vị lặp lại ngắn, chỉ từ 2-4 đôi bazơ
nitơ (STR) kết hợp kỹ thuật PCR, các phƣơng pháp nhận dạng và phân biệt cá
thể đã phát triển lên một tầm cao mới. Cũng từ đây, giám định tƣ pháp về gen
ra đời. Giám định gen đã khắc phục đƣợc những hạn chế của các phƣơng
pháp huyết thanh học trƣớc đây, giúp các nhà điều tra truy nguyên đƣợc đến
cá thể ngƣời, xác định đƣợc quan hệ huyết thống cha-con, mẹ-con, xác định
đƣợc hài cốt, xây dựng cơ sở dữ liệu và tàng thƣ gen tội phạm.

1


Nghiên cứu tìm kiếm các trình tự gen đa hình để phân biệt cá thể ngƣời
đồng thời nghiên cứu chế tạo các bộ KIT phục vụ cho mục đích này đƣợc
nhiều công ty Công nghệ sinh học để ý bởi tiềm năng ứng dụng lớn. Ngay từ
giữa những năm 90 của thế kỷ trƣớc, hai hãng sản xuất các chế phẩm sinh học
là Perkin Elmer và Promega (Mỹ) đã cho xuất xƣởng nhiều bộ KIT khác
nhau, các bộ KIT đơn locus, 3 locus, 9 locus, 12 locus và 16 locus đã lần lƣợt
ra đời. Mỗi bộ KIT phân tích ADN bao giờ cũng có kèm thang alen chuẩn,
một thành phần quan trọng không thể thiếu.
Thang alen là một hỗn hợp bao gồm tất cả các alen có thể xuất hiện
trong một quần thể ngƣời nhất định. Sự có mặt của thang alen cho phép xác
định đƣợc chính xác kiểu gen của mẫu phân tích. Bất kỳ một thí nghiệm phân
tích xác định cá thể ngƣời nào đều cần sử dụng thang alen. Tuy nhiên, các bộ
KIT đƣợc thƣơng mại hóa của các hãng kể trên có giá thành rất cao, thủ tục
nhập khẩu đòi hỏi thời gian, gây trở ngại cho việc áp dụng rộng rãi ở Việt
Nam.
Do đó, để chủ động về công nghệ, đồng thời phục vụ cho các thí
nghiệm phân tích gen ngƣời Việt Nam nói chung, trong lĩnh vực khoa học
hình sự nói riêng, tiến tới có thể triển khai rộng công nghệ phân tích gen tới
các phòng thí nghiệm địa phƣơng chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 05 locus Penta E,
D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 phục vụ giám định.
Mục tiêu chính của đề tài là chế tạo đƣợc thang alen chỉ thị gắn huỳnh
quang cho 05 locus gen đa hỡnh STR nờu trờn ở dạng đơn lẻ và ở dạng phức
hợp để cú thể sử dụng phõn tớch trờn thiết bị scan gel huỳnh quang phục vụ
công tác giám định cá thể.

2


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phƣơng pháp xác định cá thể dựa trên chỉ thị ADN
1.1.1. Cơ sở khoa học của phân tích ADN xác định cá thể
Với sự nghiên cứu của các nhà khoa học, con ngƣời đã phát hiện ra bản
chất di truyền nằm trên cấu trúc phân tử ADN. ADN (axit deoxyribonucleic)là
một chuỗi nucleotide gồm 4 loại bazơ nitơ: Adenin (A), Guanin (G), Cytozin
(C) và Timin (T) sắp xếp kế tiếp nhau, sự khác nhau trong trình tự của 4 loại
nucleotide trong phân tử ADN của 23 đôi nhiễm sắc thể có trong mỗi tế bào
của mỗi cá thể là cơ sở cho giám định gen để xác định cá thể.

Hình 1. Cấu trúc phân tử ADN

Trong quá trình tìm kiếm trên cơ sở nghiên cứu cấu trúc phân tử ADN,
các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều công cụ hữu hiệu cho phép xác định

3


sự khác nhau với mục đích phân biệt cá thể ngƣời này với cá thể ngƣời khác.

Một trong những phƣơng pháp đó là dựa các dạng đa hình trong trình tự của
phân tử ADN [21].
Trình tự các nucleotide trên sợi kép ADN có hai dạng đa hình [1, 2,
23]:


Đa hình theo trình tự: các gốc nucleotide ngẫu nhiên trong đoạn ADN
không theo một trình tự nào:
Ví dụ: ở cá thể thứ nhất tại locus A ta có trình tự:

ở cá thể thứ hai:
Nhƣ vậy tại vị trí số 3 và vị trí số 8 của dãy thứ nhất đã đƣợc thay thế
A bằng C và T bằng G.


Đa hình theo chiều dài: Một số gốc nucleotide đƣợc lặp đi lặp lại nhiều
lần trên chiều dài của đoạn ADN.
Ví dụ: Cá thể thứ nhất:
- ATAT ATAT ATAT-



3 đoạn lặp ATAT.

Cá thể thứ hai



ATAT ATAT ATAT ATAT ATAT - 5 đoạn lặp ATAT.
Trong quá trình hình thành và phát triển của loài và của cá thể, sự biến

-

đổi trình tự nucleotide trên sợi kép ADN đã xảy ra, do vậy mà con ngƣời đã
ghi nhận đƣợc rất nhiều sự biến đổi đó. Khái niệm alen đƣợc thống nhất để
chỉ những trạng thái khác nhau của mỗi gen hoặc mỗi locus. Nhƣ vậy, với
mỗi gen hay locus, con ngƣời đã ghi nhận đƣợc rất nhiều những alen khác
nhau.
Chính sự khác nhau trong trình tự nucleotide của các alen trong cùng
locus của các phân tử ADN trên các nhiễm sắc thể là cơ sở cho giám định gen
hình sự để truy nguyên cá thể và giám định huyết thống.

4


Bên cạnh đó, khi nghiên cứu về cấu trúc gen, ngƣời ta phát hiện thấy
nhiều gen của sinh vật nhân chuẩn và một số sinh vật nhân sơ mang các đoạn
không mã hóa sản phẩm (protein) xen giữa các đoạn mã hóa. Đoạn mã hóa
đƣợc gọi là exon, đoạn không mã hóa gọi là intron. Thông thƣờng, các đoạn
intron có chứa các trình tự lặp lại, các trình tự này đƣợc chia làm 2 loại:
-

Các trình tự lặp lại nhiều lần chiếm 10-15% bộ gen động vật có vú.
Đó là những trình tự lặp lại khoảng 10-20kb, không mã hóa, thƣờng
tập trung ở vùng tâm động hoặc ở đầu nhiễm sắc thể.

-

Các trình tự có số lần lặp lại trung bình chiếm khoảng 25-40% bộ gen
ngƣời. Chúng có kích thƣớc lớn hơn (100-1000kb) và đa dạng hơn
những trình tự lặp lại nhiều lần, các trình tự này không tập trung mà

phân tán trên toàn bộ hệ gen.

1.1.2. Các kỹ thuật xác định tính đa hình của ADN
1.1.2.1. Kỹ thuật RFLP
Dùng enzyme giới hạn để cắt ADN đã đƣợc tinh sạch thành những
đoạn có trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn rồi so sánh các đoạn thu đƣợc với nhau.
Đó là cơ sở của kỹ thuật RFLP. Các enzyme giới hạn sẽ cắt các vùng nằm ở
hai đầu đoạn lặp lại. Sau đó các đoạn lặp đƣợc phân tích bằng điện di trên gel
agarose hoặc poly acrylamide. Các cá thể khác nhau ở đoạn lặp sẽ cho kết quả
các băng dài ngắn khác nhau. Với những băng có độ dài hơn kém nhau một
vài nucleotide, khả năng phân biệt rất khó khăn. Ngƣời ta thƣờng sử dụng kỹ
thuật RFLP với các hệ thống chỉ thị MLP và SLP (multi locus probe và single
locus probe). Đó là các sợi ADN đơn, có trình tự bổ sung với một trong hai
sợi của đoạn ADN cần xác định. Các mẫu dò đƣợc đánh dấu đồng vị phóng
xạ, chất phát quang hóa liên kết enzyme. Phƣơng pháp lai ADN đã đƣợc sử
dụng thành công lần đầu ở Anh năm 1983 để phân tích ADN tinh dịch của tội
phạm [19].

5


Tuy nhiên phƣơng pháp này có nhiều bất lợi trong thực tiễn của công
tác giám định hình sự vì những lý do sau:
1.

Phân tích RFLP đòi hỏi mẫu ADN phải nguyên vẹn với một lƣợng đủ
lớn (ít nhất là 50ng).

2.

Các mẫu dò có gắn đồng vị phóng xạ phải có độ nhạy cao mới có thể
xác định đƣợc băng ADN. Hơn nữa, việc sử dụng phóng xạ không có
lợi cho sức khỏe ngƣời nghiên cứu.

3.

Phân tích RFLP đòi hỏi kỹ thuật viên phải có tay nghề cao và mất
nhiều thời gian.

4.

Kỹ thuật phân tích RFLP khó tự động hóa bằng các thiết bị tin học.

1.1.2.2. Các kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)
Kỹ thuật PCR do Karry Mullis phát minh vào năm 1985 đã đánh dấu
một bƣớc đột phá, có tính cách mạng trong sinh học phân tử bởi khả năng áp
dụng có hiệu quả trong phân tích gen mà các phƣơng pháp trƣớc đó chƣa có
đƣợc. Nhờ có PCR ngƣời ta có thể nhân một đoạn ADN đích ban đầu lên
hàng triệu bản sau 30 chu kì chỉ trong vài giờ. Lƣợng ADN này đủ lớn để có
thể phát hiện bằng các phƣơng pháp thông thƣờng khác [24]. Với những ƣu
điểm nổi bật của mình, PCR đã nhanh chóng đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh
vực phân tích ADN, kể cả lĩnh vực sinh học hình sự. Kỹ thuật này đã thay thế
kỹ thuật RFLP vì những lý do sau:
-

Độ nhạy và tính đặc hiệu cao,

-

Tiết kiệm thời gian và giảm bớt khó khăn cho công tác giám định,

-

Có thể xác định đƣợc đối với những mẫu ADN bị biến tính một
phần,

-

Có thể đồng thời xác định nhiều locus khác nhau và tự động hóa
đƣợc quy trình phân tích.

6


1.2. Đại cƣơng về các locus STR đƣợc sử dụng trong nhận dạng cá thể
ngƣời
Khi nghiên cứu cấu trúc các trình tự lặp lại, các nhà khoa học đã tìm ra
trong hệ gen ngƣời có những đoạn ADN đƣợc lặp lại liên tiếp nhau. Các đoạn
cấu trúc này đƣợc gọi là VNTR (Variable number of tandem repeats) hay còn
gọi là các minisatellite DNA do cấu trúc này phần lớn phân bố theo kiểu “vệ
tinh” so với ADN genom. Trong số các đoạn VNTR, có những đoạn có cấu
trúc với các đơn vị lặp lại từ 2-6bp đƣợc gọi là các đoạn lặp lại ngắn (hay
STR). Các cấu trúc VNTR hay STR đều mang tính bảo thủ cao, đƣợc di
truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trƣng cho cá thể. Đó là nền tảng cho
giám định gen. Ngày nay, hầu hết các cơ sở giám định gen trên thế giới đều
ứng dụng phân tích các đoạn STR với mỗi đơn vị lặp lại 4 nucleotide vì đặc
tính ƣu việt của chúng [22].
Theo cỏc cụng trỡnh nghiờn cứu đó đƣợc công bố của cỏc tỏc giả
Edwards et al (1991) [26], Beckman et al (1992), có xấp xỉ khoảng 200,000 vị
trí trên genome ngƣời có các trỡnh tự STR với cỏc nhõn lặp kớch thƣớc 3, 4

base với kích thƣớc mỗi trỡnh tự khoảng 15kb, cỏc trỡnh tự này nằm rải rỏc
tại cỏc vựng intron (vựng khụng mó húa gene) hoặc gần tõm động của 23 cặp
NST. [28,33].
Một locus STR đƣợc sử dụng cho mục đích xác định cá thể ngƣời phải
thỏa mãn một số yêu cầu nhất định nên không phải đoạn lặp nào cũng có thể
sử dụng đƣợc. Thứ nhất, locus STR phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử
cao. Điều này giúp các nhà phân tích chỉ sử dụng một số locus tối thiểu đã đạt
đƣợc sự phân biệt cá thể một cách tốt nhất. Thứ hai, các STR có độ dài ngắn,
trung bình từ 100 - 400 bp so với các đoạn đa hình ngẫu nhiên khác (VNTR).
Các đoạn ADN ngắn có độ bền vững cao, ít bị đứt gãy trong quá trình tác
động của điều kiện bên ngoài, do vậy phản ứng PCR thực hiện sẽ hiệu quả

7


hơn.. Thứ ba, các locus STR sử dụng tốt nhất đƣợc di truyền độc lập, do vậy
chúng phải nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau, điều này đảm bảo cho tính
độc lập của từng locus. Các STR thông thƣờng có rất nhiều alen, độ dài của
các alen thông thƣờng khác nhau một số đôi bazơ nitơ, do vậy, việc sử dụng
các STR có độ dài dƣới 400bp phải dễ dàng phân tích bằng phƣơng pháp
điện di trong gel poly acrylamide là yêu cầu cần thiết trong quá trình lựa chọn.
Những locus STR có nhân lặp kích thƣớc lặp lại 4 base đƣợc nghiên
cứu và sử dụng rộng rói nhất trong lĩnh vực khoa học hỡnh sự vỡ chỳng mang
bốn đặc tính tiêu biểu sau:


Tính đa hỡnh và mức độ dị hợp tử cao, nằm trên các NST khác nhau



Dễ dàng phối hợp thành các bộ KIT phân tích đồng thời (multiplex
PCR)



Đột biến gen thấp.



Kích thƣớc ngắn, khó bị phân hủy bởi các tác động cơ học và hóa
học nên có thể thu đƣợc từ những mẫu đó bị phõn hủy một phần.

Nhiều đoạn đa hình có trình tự lặp lại chứa các đơn vị lặp từ 4
nucleotide đã đƣợc nghiên cứu và đáp ứng đƣợc yêu cầu của quy trình phân
tích cá thể ngƣời.
1.2.1. Các locus STR ứng dụng trong phân tích cá thể người
Những locus STR đang đƣợc sử dụng thông dụng hiện nay để nhận
dạng cá thể ngƣời lần đầu tiên đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm của TS.
Thomas Caskey tại học viện y Baylor [26] và tại cơ sở dịch vụ khoa học pháp
lý tại Anh [27] vào đầu những năm 1990. Sau đó Hãng Promega của Mỹ đã
mua lại bản quyền một số locus đƣợc coi là những đoạn đánh dấu, trong khi
đó hãng Perkin Elmer (PE) đồng thời tìm kiếm những locus STR và phát triển
một số locus đánh dấu khác.

8


Bộ STR đầu tiên đƣợc nghiên cứu phát triển phục vụ cho ngành pháp
lý là bộ STR 4 đoạn STR đánh dấu : TH01, FES/FPS, vWA và F13A1 [29] .
Đây là bộ đánh dấu thế hệ thứ nhất. Xác suất hai cá thể trùng nhau khi sử

dụng bộ KIT bốn gen này khoảng 1/10000. Bộ KIT thế hệ thứ hai gồm 6 locus
là TH01, vWA, FGA, D8S1179, D18S51 và D21S11 với xác suất hai cá thể
trùng nhau là 1/50.000.000. Những locus nêu trên đều sử dụng các phƣơng
pháp huỳnh quang để phát hiện.
Từ năm 1996 phòng thí nghiệm của FBI đã đỡ đầu cho việc nghiên cứu
và xây dựng cơ sở dữ liệu từ 13 đoạn FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358,
D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, D18S51, CSF1PO, D8S1179 và
D21S11. 13 locus đánh dấu này đƣợc chia thành 4 nhóm chính [18]:
-

Nhóm thứ nhất: trình tự lặp lại chứa các trình tự giống nhau: TPOX,
CSF1PO, D5S818, D13S317, D16S539.

-

Nhóm thứ hai: Một vài trình tự có những alen không đồng nhất:
TH01, D18S51, D7S820.

-

Nhóm thứ ba: Cấu trúc kép với các alen khác nhau:vWA, FGA,
D3S1358, D8S1179.

-

Nhóm thứ tƣ: Cấu trúc dạng lặp dạng phức: D21S11.

1.2.2. Cỏc locus sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 1. Thông tin về các locus trong nghiên cứu

TT

Locus

1

Penta E

2

D18S51

3

D21S11


9


4 TH01

5 D3S1358

Bảng 1 thống kê số đoạn lặp có thể có theo số liệu của Short Tandem
Repeat DNA Internet Database. Tuy nhiên, trong mỗi quần thể ngƣời khác
nhau, sự xuất hiện của các alen hay tần suất của mỗi alen là khác nhau. Do đó,
trong nghiên cứu đối với mẫu thu từ quần thể ngƣời Việt, số lƣợng các alen
có thể thu thập đƣợc sẽ khác so với bảng thống kê, hoặc có thể xuất hiện thêm
alen mới không có trong bảng.

Kích thƣớc sản phẩm PCR đƣợc tạo thành còn tùy thuộc vào các bộ
mồi thiết kế. Số liệu đƣợc thống kê trong bảng 1 là kích thƣớc thu đƣợc với
bộ mồi đang đƣợc sử dụng tại Phòng Công nghệ gen và Vi sinh (P3 - H57 TC IV - Bộ Công an)
1.3. Các phƣơng pháp phát hiện ADN
Từ khi bắt đầu phát triển các xét nghiệm này đến nay, có ba phƣơng pháp
chính phát hiện các phân tử ADN sau điện di là:


Nhuộm Ethidium Bromide;



Đánh dấu phóng xạ - phóng xạ tự ghi;



Nhuộm bạc;



Đánh dấu huỳnh quang.

Bảng 4 đánh giá phƣơng pháp và các thiết bị khác nhau đƣợc sử dụng
để phát hiện chỉ thị ADN trong các xét nghiệm dựa trên kĩ thuật PCR từ trƣớc
đến nay (sắp xếp theo năm áp dụng)[21].


10

Bảng 2. Các phƣơng pháp/thiết bị phát hiện ADN
Kỹ thuật/
Thiết bị sử dụng
Gắn huỳnh quang/
ABI 373 hoăc 377

Điện di lai trực tiếp
Đánh dấu đồng vị
phóng xạ tự ghi
Gắn huỳnh quang/
Bechman CE
Nhuộm bạc
Gắn huỳnh quang/
Scaner
Gắn huỳnh quang/
mao quản
Gắn huỳnh quang/
LICOR
Gắn huỳnh quang/
ALF Sequencer
Gắn huỳnh quang/
FMBIO Scaner
Gắn huỳnh quang/
ABI 310
Gắn huỳnh quang/
ABI 3100 và ABI
3100 advant

11

Dƣới đây chúng tôi sẽ trình bày kĩ hơn về các phƣơng pháp phát hiện phân tử
này.
1.3.1. Phương pháp nhuộm Ethidum bromide
Ethidium bromide đƣợc sử dụng để phát hiện băng ADN trên gel
agarose và gel poly acrylamide, chất này có khả năng xen kẽ vào ADN sợi
kép. Nó có độ nhạy khoảng 1 ng/ băng ADN. Sau khi nhuộm băng, ADN
đƣợc phát hiện bằng tia UV. Phƣơng pháp này thao tác đơn giản, nhanh
chóng, thuận lợi và ít tốn kém nên đƣợc sử dụng phổ biến. Tuy nhiên,
Ethidium bromide là hóa chất gây ung thƣ do đó phải thận trọng trong quá
trình bảo quản, sử dụng và cần phải đƣợc xử lý khi loại bỏ. Mặt khác, bản gel
sau khi nhuộm Ethidium Bromide không giữ đƣợc lâu, cần phải chụp ảnh
ngay[36].
1.3.2. Phương pháp đánh dấu phóng xạ
Các chất đồng vị phóng xạ thƣờng dùng để đánh dấu mẫu dò là P 32, S35
và H3. Trong đó thì P32 đƣợc sử dụng nhiều nhất, nó phát tia β- có năng
lƣợng rất cao nên tín hiệu nhận đƣợc rõ và thời gian phơi sáng ngắn. Một số
phƣơng pháp đánh dấu phóng xạ phổ biến [22, 25]:


Đánh dấu ở đuôi.



Đánh dấu bằng dịch chuyển điểm đứt



Đánh dấu bằng kéo dài đoạn mồi.

Nhìn chung, ƣu điểm của phƣơng pháp này là có độ nhạy cao, cho tín
hiệu mạnh với thời gian phơi sáng ngắn. Nhƣng chúng lại có nhƣợc điểm là
rất hại cho sức khỏe ngƣời thao tác, đặc biệt là P32 phát tia có độ xuyên sâu,
đòi hỏi phải có nhiều biện pháp bảo đảm an toàn và gây tốn kém trong các
thao tác cũng nhƣ xử lý chất thải.
1.3.3. Phương pháp nhuộm bạc

12


Phƣơng pháp nhuộm bạc đƣợc sử dụng cho bản gel poly acrylamide đã
điện di để phát hiện các băng ADN. Quá trình nhuộm bạc thƣờng đƣợc thực
hiện trên máy lắc (ngang hoặc xoay), bản gel đã điện di đƣợc lắc liên tục trong
khay nhuộm với các dung dịch khác nhau để làm hiện băng ADN. Đầu tiên là
dung dịch nhuộm chứa nitrat bạc để bạc gắn vào các phân tử ADN trong gel, bạc
sau đó kết hợp với formaldehyde có trong dung dịch hiện tạo thành lớp bạc kim
loại, hiện rõ các băng ADN. Bản gel sau đó đƣợc để khô và chụp (hoặc scan)
lƣu giữ bản kết quả, hoặc có thể đƣợc bảo quản lâu dài[36].

Đƣợc sử dụng đầu tiên ở bộ KIT thƣơng mại phân tích STR của hãng
Promega và hiện các bộ KIT này vẫn đƣợc bán trên thị trƣờng mặc dù các bộ
KIT phân tích chỉ thị huỳnh quang đang đƣợc sử dụng phổ biến. Tuy nhiên,
do các thao tác chủ yếu phải thực hiện bằng tay, khó tự động hóa đƣợc các
bƣớc, nên phƣơng pháp này không thuận lợi bằng phƣơng pháp sử dụng mồi
đánh dấu huỳnh quang.
1.3.4. Phương pháp đánh dấu huỳnh quang
Phát hiện huỳnh quang dựa trên các chất đánh dấu phát quang đã đƣợc
sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm pháp y do chúng cho phép giảm
thiểu các thao tác kĩ thuật, có thể đọc kết quả tự động với các thiết bị - phần
mềm chuyên dụng, cho phép phân tích nhiều locus trên cùng một phản ứng

(với nhiều màu đánh dấu huỳnh quang) nên giảm thiểu thời gian phân tích.
Đánh dấu huỳnh quang sản phẩm PCR có thể thực hiện bằng ba
cách, mỗi phƣơng pháp đều có ƣu và khuyết điểm riêng [21,25]:


Kết hợp một thuốc nhuộm huỳnh quang vào sản phẩm nhân bội bằng
mồi đã đƣợc đánh dấu huỳnh quang.



Sử dụng các dNTPs có đánh dấu huỳnh quang khi thực hiện PCR.



Sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang xen vào giữa để gắn vào ADN.

13


Sử dụng thuốc nhuộm xen vào giữa sản phẩm PCR có thể đƣợc thực
hiện sau khi tiến hành PCR và ít tốn kém so với hai phƣơng pháp còn lại. Tuy
nhiên nó chỉ cho kết quả các trình tự ADN có một màu duy nhất, vì thế chỉ có
thể phân biệt các trình tự ADN dựa vào kích thƣớc. Mặt khác, việc bổ sung
thuốc nhuộm huỳnh quang vào đoạn phân tử ADN sẽ tác động đến tính di
động của đoạn ADN đó trong trƣờng điện di (điều này gây ra do kích thƣớc
và hình dạng vật lý của thuốc nhuộm sẽ làm thay đổi kích thƣớc tổng thể của
phân tử lai giữa thuốc nhuộm và trình tự ADN, đồng thời điện tích ion có
trong thuốc nhuộm cũng làm thay đổi tỉ lệ kích thƣớc giữa liên kết của các
acid nucleic).
Sử dụng mồi PCR đƣợc đánh dấu huỳnh quang sẽ khắc phục các nhƣợc

điểm trên, trong phƣơng pháp này, chỉ một sợi đơn của sản phẩm PCR đƣợc
đánh dấu, điều đó sẽ đơn giản hóa việc xử lý dữ liệu, mồi đánh dấu huỳnh
quang cũng cho phép nhân bội nhiều locus đồng thời trong cùng một phản
ứng nhƣng kết quả vẫn đƣợc đọc độc lập. Tuy việc gắn xen huỳnh quang vào
mồi cũng ảnh hƣởng đến tính di chuyển của sản phẩm PCR trong gel hoặc
mao quản, vấn đề này có thể khắc phục bằng các phần mềm, hơn nữa kiểu gen
của mẫu luôn luôn liên quan đến bộ thang alen chỉ thị đi kèm, bộ thang và
mẫu đƣợc nhân bội với cùng mồi thiết kế đặc hiệu nên việc đọc thang alen
không bị ảnh hƣởng bởi các tác động của việc gắn thuốc nhuộm vào trình tự
ADN.
Sự phát hiện huỳnh quang: Nguồn laser đƣợc chiếu vào thuốc nhuộm
huỳnh quang (Fluorophore) đƣợc gắn ở cuối trình tự ADN. Phân tử này hấp
thụ năng lƣợng từ nguồn laser và sau đó phát ánh sáng có mức năng lƣợng
thấp hơn (bƣớc sóng cao hơn). Phin lọc đƣợc sử dụng để ghi nhận ánh sáng
phát ra tại một bƣớc sóng cụ thể hoặc một dãy các bƣớc sóng. Ống quang tử
hoặc một thiết bị tích điện sẽ thu thập và khuyếch đại tín hiệu từ các phân tử

14


phát huỳnh quang và chuyển nó thành tín hiệu điện tử. Những tín hiệu này
biểu hiện mối liên quan và tính chất các đỉnh cộng hƣởng (peak) quan sát
thấy trong trƣờng điện di mao quản hoặc là các băng trên bản gel đã điện di.
Mặc dù trở ngại lớn nhất khi áp dụng phƣơng pháp phân tích này là trang

thiết bị đồng bộ khá tốn kém, đòi hỏi phải có mồi đánh dấu huỳnh quang...
nhƣng với những ƣu điểm trên, hiện nay phƣơng pháp này đƣợc dùng phổ
biến trong các phân tích chỉ thị ADN.
1.4. Đại cƣơng các về chất huỳnh quang và ứng dụng trong phân tích
ADN

1.4.1. Khái niệm về chất huỳnh quang
Huỳnh quang là hiện tƣợng phát xạ ánh sáng bức xạ điện từ của một
chất có hấp thụ bức xạ của bƣớc sóng khác nhau. Trong hầu hết trƣờng hợp,
hấp thụ ánh sáng của một bƣớc sóng nhất định gây ra sự phát xạ của ánh sáng
với bƣớc sóng dài hơn (và năng lƣợng thấp hơn). Tuy nhiên, tại điều kiện bức
xạ cao đang đƣợc hấp thụ, có thể cho một điện tử hấp thụ hai photon (hấp thụ
nhiều photon) và có thể dẫn đến sự phát xạ của bức xạ có bƣớc sóng nhỏ hơn
so với các nguồn kích thích. Sự khác biệt giữa năng lƣợng đƣợc hấp thụ và
phát ra lƣợng tử ánh sáng do tổn thất nhiệt. Ứng dụng thực tế của hiệu ứng
này đƣợc tìm thấy trong khoáng vật, cảm biến hóa học, đánh dấu huỳnh
quang, thuốc nhuộm, máy dò sinh học… Thuật ngữ “huỳnh quang” –
fluorescent, đƣợc đặt bởi George Gabriel Stokes trong bài báo năm 1852, tên
chính nó đƣợc bắt nguồn từ fluorit khoáng (canxi difluoride). Vậy chất huỳnh
quang đƣợc hiểu là những chất mà phân tử của nó có khả năng phát huỳnh
quang.
Các phép đo sự phát quang bắt nguồn từ sự kích thích một phân tử
thuốc nhuộm, sau đó thuốc nhuộm đƣợc kích thích phát sáng và đƣợc đọc
dƣới thiết bị chuyên dụng. Một phân tử có khả năng phát huỳnh quang đƣợc

15


gọi là một Fluorophore. Các Fluorophore khác nhau về hình dạng, kích thƣớc
và khả năng phát quang, các Fluorophore đƣợc sử dụng chủ yếu trong đánh
dấu ADN là nó có khả năng phát quang trong vùng quan sát của quang phổ
(phạm vi phát sáng khoảng 400nm – 600nm).
Quá trình phát quang miêu tả rõ trong hình 4. Bƣớc đầu tiên, một
photon (Hvex) từ nguồn laser kích thích điện tử từ vùng năng lƣợng cơ sở
(S0) đến vùng dịch chuyển kích thích (S’1). Điện tử này sau đó thay đổi hình
dạng và tƣơng tác với môi trƣờng của nó dẫn đến trạng thái kích thích (S 1).

Bƣớc cuối cùng, một photon (Hvem) đƣợc phát sáng tại mức năng lƣợng
thấp hơn khi các điện tử đƣợc kích thích trở lại trạng thái cơ sở. Vì năng
lƣợng và bƣớc sóng có quan hệ thuận nghịch với nhau, photon phát sáng có
bƣớc sóng cao hơn photon kích thích. Sự khác biệt giữa các đỉnh hấp thụ và
quang phổ phát xạ gọi là dịch chuyển Stokes [9, 25]. Thay đổi này cho phép
sử dụng các bộ lọc quang học phù hợp để phân chia ánh sáng từ nguồn ánh
sáng phát ra. Đặc tính hấp thụ ánh sáng và phát quang của Fluorophore phụ
thuộc vào cấu trúc hóa học của nó và điều kiện môi trƣờng, nên nếu chọn lọc
cẩn thận các bộ lọc quang học khác nhau, có thể lựa chọn đƣợc phổ phát sáng
của các Fluorophore với các phin lọc khác nhau.

16


Hình 2. Quá trình phát huỳnh quang
a) Các bƣớc chuyển năng lƣợng
b) Bƣớc chuyển phát huỳnh quang

Ƣu điểm lớn nhất của phƣơng pháp đánh dấu huỳnh quang đó là khả
năng sử dụng nhiều Fluorophore để đọc nhiều trình tự ADN khác nhau trong
cùng một phản ứng, tỉ lệ đọc mẫu của phức hợp nhiều loại Fluorophore cao
hơn nhiều so với việc phân tích sử dụng đơn Fluorophores. Có một số yếu tố
ảnh hƣởng đến mức phát huỳnh quang của các Fluorophores cần lƣu ý là:


Phân tử gam hệ số dập tắt: khả năng thuốc nhuộm hấp thụ ánh sáng.



Năng suất lƣợng tử: hiệu suất Fluorophores đƣợc kích thích chuyển

đổi hấp thu ánh sáng phát sáng.



Ổn định ánh sáng: khả năng tồn tại lâu bền trong trƣờng kích thích
khi thuốc nhuộm trải qua các chu kì kích thích và phát sáng mà không
bị phá hủy, hoặc trải qua tẩy trắng ảnh.



Môi trƣờng nhuộm: các yếu tố có ảnh hƣởng đến mức độ phát huỳnh
quang bao gồm độ pH, nhiệt độ, dung môi, và sự hiện diện của một số
chất ức chế nhƣ hemoglobin.

Hiệu quả phát huỳnh quang tổng thể của một phân tử thuốc nhuộm phụ
thuộc vào sự kết hợp của bốn yếu tố trên. Thực tế cho thấy độ sáng của một
Fluorophore tỉ lệ thuận với hệ số dập tắt và năng suất lƣợng tử[21].
1.4.2. Ứng dụng chất huỳnh quang trong phân tích ADN
Hiện nay, hầu nhƣ tất cả các bộ KIT STR thƣơng mại đều có sử dụng
mồi đánh dấu huỳnh quang. Bảng 5 tổng kết một số thuốc nhuộm huỳnh
quang thƣờng đƣợc sử dụng để đánh dấu sản phẩm PCR. Các tên hóa chất
đối với thuốc nhuộm đƣợc sắp xếp theo bƣớc sóng kích thích và phát xạ của
chúng.

17