Phân lập vi sinh vật từ cây rong biển thuộc tỉnh khánh hòa và nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của chúng
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.32 MB, 70 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------
Lê Thị Hồng Nhung
PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ CÂY RONG BIỂN THUỘC
TỈNH KHÁNH HÒA VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT
TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------
Lê Thị Hồng Nhung
PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ CÂY RONG BIỂN THUỘC
TỈNH KHÁNH HÒA VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT
TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 8420101.07.
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Hữu Cường
PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà
Hà Nội - 2019
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Hữu
Cường và PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà, người thầy đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo
em trong quá trình hoàn thành đề tài luận văn này, cũng như chia sẻ với em rất
nhiều kinh nghiệm quý báu cho con đường phát triển sự nghiệp sau này.
Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô trong Bộ môn Vi sinh vật học cùng
toàn thể cán bộ Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN)
đã giảng dạy, tạo điều kiện giúp đỡ và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 2 năm
học tập và nghiên cứu tại trường.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ phòng Sinh học
thực nghiệm, Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên,Viện Hàn lâm Khoa học và
Công Nghệ Việt Nam đã ủng hộ và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận
văn.
Cuối cùng em muốn gửi lời cảm ơn bố mẹ và gia đình, bạn bè đã luôn ở bên
cạnh ủng hộ và động viên em trong suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Học viên
Lê Thị Hồng Nhung
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
BCS
Bovine
DPPH
2,2-Dip
trinitrop
pNPG
4-Nitro
LB
Luria B
MEME
Minimu
Eagle’s
NAA
Non-ess
PCR
Polyme
PDA
Potato d
PSF
Penicill
fungizo
VSV
Vi sinh
OTU
operatio
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Hoạt tính ức chế enzyme glucosidase và giá trị IC50 của mẫu..........26
Bảng 3.2. Hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết nấm................................................ 28
Bảng 3.3. Giá trị SC50 bao vây gốc tự do DPPH* của 9 mẫu lựa chọn............30
Bảng 6.1. Các chủng vi khuẩn được phân lập trên các mẫu rong.......................... 42
Bảng 6.2. Các chủng nấm phân lập trên các mẫu rong khác nhau........................ 45
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Ảnh minh họa sự đa dạng vi sinh vật trên bề mặt rong biển [6]..........8
Hình 1.2. Ảnh minh họa vi khuẩn, nấm trên rong biển sản xuất một số chất
trao đổi thứ cấp [29]...................................................................................................................... 11
Hình 1.3. Bảng phân bố các hợp chất mới từ nấm có nguồn gốc biển khác
nhau [32].............................................................................................................................................. 12
Hình 3.1. Ảnh phân lập vi khuẩn nội sinh......................................................................... 22
Hình 3.2. Ảnh một số nấm sợi nội sinh phân lập trên rong...................................... 23
Hình 3.3. Quá trình lên men và thu cao chiết vi sinh vật........................................... 25
Hình 3.4. Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase.................................... 26
Hình 3.5. Hình ảnh khuẩn lạc nấm HN37.......................................................................... 27
Hình 3.6. Ảnh thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào người HepG2 (trái) và LU
(phải), ô khoanh chữ nhật, màu trắng là có hoạt tính gây độc (lặp lại 2 lần) . 29
Hình 3.7. Khuẩn lạc chủng nấm HN22............................................................................... 29
Hình 3.8. Xác định hoạt tính bao vây gốc tự do DPPH* của các mẫu...............30
Hình 3.9. Khuẩn lạc nấm HN33.............................................................................................. 31
Hình 3.10. Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi EF4f/EF3r nhân gene
18S rRNA của nấm HN22, HN37 và HN33..................................................................... 32
Hình 3.11. Cây phát sinh chủng nấm HN37 dựa trên trình tự 18S rDNA, sử
dụng phần mềm MEGA7, phương pháp Neibor Joining, giá trị Bootstrap sử
dụng là 500......................................................................................................................................... 33
Hình 3.12. Cây phát sinh chủng nấm HN22 dựa trên trình tự 18S rDNA, sử
dụng phần mềm MEGA7, phương pháp Neibor Joining, giá trị bootstrap sử
dụng là 500......................................................................................................................................... 34
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU............................................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN........................................................................................................... 3
1.1. Vi sinh vật sống trên rong biển và mối quan hệ giữa chúng......................3
1.1.1. Rong biển.................................................................................................................................. 3
1.1.2. Vi sinh vật sống trên rong biển...................................................................................... 3
1.2. Vi sinh vật sống nội sinh và trên rong................................................................... 4
1.2.1. Đa dạng vi sinh vật sống trên rong.......................................................................... 4
1.2.2. Sự tương tác giữa vi sinh vật và rong biển........................................................... 9
1.2. Tình hình nghiên cứu hợp chất tự nhiên và hoạt tính sinh học từ vi
sinh vật sống trên rong biển................................................................................................... 11
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................................. 14
2.1. Vật liệu....................................................................................................................................... 14
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................................... 14
2.1.2. Hóa chất và thiết bị....................................................................................................... 15
2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................................... 15
2.2.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật............................................................................ 15
2.2.2. Phương pháp lên men và thu cao chiết vi sinh vật........................................... 18
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học........................................................... 18
2.2.4. Phương pháp định danh và phân loại..................................................................... 20
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................................... 22
3.1. Phân lập các vi sinh vật sống trên rong................................................................ 22
3.1.1. Vi khuẩn.................................................................................................................................. 22
3.1.2. Vi nấm...................................................................................................................................... 23
3.2. Lên men vi sinh vật và thu cao chiết....................................................................... 24
3.3. Hoạt tính sinh học của cao chiết vi sinh vật....................................................... 25
3.3.1. Hoạt tính ức chế enzyme-glucosidase................................................................. 25
3.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư người................................................................ 27
3.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa của cao chiết nấm........................................................ 30
3.3.4. Vị trí phân loại của các chủng vi sinh vật............................................................ 31
KẾT LUẬN....................................................................................................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................................... 37
MỞ ĐẦU
2
Với chiều dài hơn 3.260 km bờ biển và diện tích bề mặt hơn một triệu km ,
vùng biển nước ta được đánh giá là một trong 16 trung tâm đa dạng sinh học lớn của
thế giới. Vì vậy, công tác điều tra, nghiên cứu môi trường và tài nguyên sinh vật
biển là vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu. Trong đó, theo ước tính ở Việt nam
có 638 loài rong biển, hơn 100 loài trong số đó có tiềm năng sử dụng và khoảng 60
loài hiện đang được sử dụng làm thực phẩm, thuốc và là nguồn sản xuất keo công
nghiệp (agar, carrageenan) hay alginate, fucoidan (một loại polysaccharide dùng
trong điều trị ung thư) [13].
Ở Việt Nam cũng như trên thế giới, nhiều loài rong biển đã được ứng dụng
trong y dược để chữa bệnh với các vai trò như kháng khuẩn, kháng virus, giảm
cholesterol, chống tiểu đường, chống ung thư, lão hóa. Bởi chúng chứa các hợp chất
có giá trị như peptide, axit amin, vitamin, chất màu, chất polysaccharide (như
fucoidan), các chất trao đổi thứ cấp khác [1].
Rong biển là nơi cư trú của nhiều loài sinh vật như vi khuẩn, nấm, vi tảo, ấu
2
trùng giáp xác, virus, trong đó vi khuẩn chiếm chủ yếu, với mật độ 10 -10
2
7
4
CFU/cm mẫu, so với nấm khoảng 10 . Bề mặt rong là nơi có tính cạnh tranh cao
bởi nguồn thức ăn giới hạn và không gian khắc nghiệt do vi sinh vật tiết kháng sinh
nên các vi sinh vật trên rong có tính đặc thù nhất định. Vi sinh vật có cơ chế tổng
hợp các chất trao đổi thứ cấp, các chất kháng sinh tiêu diệt hoặc ức chế vi khuẩn
hoặc sự cố định của vi khuẩn lên rong. Theo ước tính, các hợp chất được phát hiện
từ nấm biển sống trên rong là chiếm đa số (21%), tiếp sau là bọt biển (19%), cây
đước biển (16%) và thấp nhất ở nước biển (chỉ 1%). Chính vì vậy, nguồn chất có
hoạt tính sinh học từ các vi sinh vật có liên quan tới rong biển được cho là rất có
tiềm năng [32].
Việc phân lập vi sinh vật sống trên rong và nghiên cứu hoạt tính sinh học có
liên quan tới lĩnh vực y dược là rất cần thiết. Với vi sinh vật, chúng ta có thể chủ
động lên men, sản xuất các chất có hoạt tính nhằm tăng năng suất và rút ngắn thời
1
gian sản xuất hoạt chất, đảm bảo tính hiệu quả, ổn định trong sản suất. Hơn nữa,
việc tìm kiếm các loài vi sinh vật mới ở biển nhiệt đới cũng rất có ý nghĩa khoa học
và thực tiễn. Chính vì vậy, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài: “Phân lập vi sinh vật
từ cây rong biển thuộc tỉnh Khánh Hòa và nghiên cứu một số hoạt tính
sinh học của chúng’’ với mục tiêu tìm kiếm các chủng vi sinh vật sống trên rong có
các hoạt tính có thể ứng dụng trong ngành y dược.
Mục tiêu của đề tài
-
Tạo bộ sưu tập 100 chủng vi sinh vật từ cây rong biển thuộc tỉnh Khánh
Hòa, Việt Nam.
-
Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các vi sinh vật phân lập được.
Nội dung chính của luận văn gồm:
Phân lập 100 chủng vi sinh vật (gồm cả vi khuẩn và nấm) từ các loài rong
biển.
-
Lên men các chủng vi sinh vật 50-100 chủng/0,5 L mỗi chủng. Từ dịch lên
men đó, chiết các chất trao đổi thứ cấp để thu cao chiết .
Đánh giá 3 hoạt tính (i) gây độc tế bào ung thư; (ii) chống oxi hóa và
(iii)
ức chế enzyme -glucosidase của 50-100 cao chiết vi sinh vật.
-
Xây dựng cây phát sinh loài của chủng có hoạt tính (mỗi hoạt tính, chọn 1
chủng) dựa trên trình tự gene 18S rRNA.
2
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Vi sinh vật sống trên rong biển và mối quan hệ giữa chúng
1.1.1. Rong biển
Rong biển là tảo lớn (macro algae) sống ở biển và có cấu tạo đa bào
(multicellular). Chúng chủ yếu là những sinh vật quang tự dưỡng và được chia làm 3
ngành chính gồm: ngành rong đỏ (Rhodophyta), ngành rong nâu (Phaeophyta) và
ngành rong lục (Chlorophyta) [25]. Rong biển khác thực vật bậc cao ở chỗ chúng
không thực sự có rễ, thân hoặc lá. Tuy nhiên, ở những loài rong lớn, chúng thường xuất
hiện rễ giả hoặc một phần có hình dạng như thân cây gọi là cuống (stipe) hay hình dạng
phiến mỏng giống lá (như ở chi Laminaria). Một vài loài có kiểu đĩa dẹt (như rong lục
Ulva). Ở những loài rong biển nhỏ, chúng cấu trúc dạng sợi là chủ yếu.
Rong biển có chứa nhiều polysaccharide (từ 20-76%), protein (15-40%),
carotenoid, các khoáng chất và các axit béo không no như omega-3 (acid béo),
docosahexanoic acid (DHA). Nhiều thành phần hoạt chất trong đó đã được chứng
minh là có khả năng giúp cải thiện sức khỏe và ngăn ngừa các bệnh tật liên quan
đến chuyển hóa [19].
1.1.2. Vi sinh vật sống trên rong biển
Vi sinh vật là thành phần thiết yếu của sinh quyển, đặc biệt ở biển chúng đa
dạng và có số lượng rất lớn. Một mL nước biển chứa hàng triệu vi rút, vi khuẩn,
hàng nghìn nấm, các vi tảo và hàng trăm cấu trúc nhỏ, bào tử [10]. Các yếu tố môi
trường biển sẽ hỗ trợ việc tạo các màng sinh học (biofilm) trên bề mặt sinh vật sống
như rong, động vật, thực vật trôi nổi là nơi sống của các vi sinh vật nhỏ khác.
Rong biển và quần thể vi sinh tạo nên một hệ sinh thái phức tạp và luôn biến
động, gồm các loại vi sinh vật đa dạng (Hình 1.1). Quần thề vi sinh vật sống trên bề
mặt rong, trong đó vi khuẩn là thành phần chiếm ưu thế, tiếp theo là các vi tảo và
nấm biển [12]. Trong khi một số rong biển có chứa nhiều vi sinh vật cố định trên
chúng, thì có những rong khác hầu như không có vi khuẩn bám cho dù chúng sống
3
trong cùng môi trường. Điều này chứng tỏ rằng cơ chế chống xâm nhập của rong
chỉ xảy ra trên một số rong nhất định [39].
Bằng các phương pháp khác nhau như: phương pháp nuôi cấy truyền thống;
phương pháp sử dụng kính hiển vi và phương pháp sinh học phân tử phân tích ADN
ribosome. Ta có thể phát hiện được nhiều loài vi sinh vật sống trên rong.
Một số hình thức sống của vi sinh vật trên rong:
+
Hình thức sống bám (epibiosis): vi sinh vật cố định và sống trên bề mặt của
rong. Dạng sống này thường tạo màng sinh học (biofilm) trên rong và đôi khi gây
hại cho rong, hạn chế sự sống và tính đàn hồi của mô. Màng cũng có thể hạn chế sự
trao đổi khí và giảm cường độ ánh sáng, giảm hoạt động quang hợp [6].
+
Hình thức sống nội sinh (endobiosis): vi sinh vật sống bên trong mô của
rong và chúng không gây triệu chứng nhiễm bệnh hay tác hại cho rong. Có tác giả
cho rằng trong quá trình tiến hóa một số vi sinh vật có khả năng xâm nhập mô chủ
và cùng tiến hóa, thích nghi với môi trường bên trong cơ thể. Chúng có thể sống nội
sinh bắt buộc hoặc tùy tiện [11].
Chúng có thể đóng vai trò hỗ sinh, hoại sinh, gây bệnh hoặc ôn hòa đối với
rong. Các vi sinh vật bám hoặc nội sinh ở rong biển đa dạng hơn so với các động
thực vật đa bào khác.
1.2.
Vi sinh vật sống nội sinh và trên rong
1.2.1. Đa dạng vi sinh vật sống trên rong
Phương pháp phân lập thường được áp dụng để tìm các loài mới, nuôi cấy và
ứng dụng chúng vào các lĩnh vực công nghệ sinh học, y dược.
Manmadhan (2008) phân lập 92 chủng vi sinh vật từ 9 loài tảo đỏ. Trong số
đó, có 33 loài có hoạt tính kháng vi sinh vật, một số thuộc nhóm Bacillus, Vibrio,
Microbacterium và Psychrobacter [15].
Trong nghiên cứu khác của tác giả Mahadevan và cs (2013) tìm thấy 10 loài
vi khuẩn đã được phân lập từ rong Ulva reticulata. Trong số đó, 2 loài Bacillus sp.
và Pseudomonas sp. có hoạt tính kháng vi khuẩn. Ở rong Ascophyllum nodosum có
4
25 vi khuẩn được phân lập, chủ yếu thuộc 3 chi Vibrio, Fladobacterium và
Pseudomonas với mật độ cao hơn nghìn lần so với ở môi trường nước [26].
Zifeng (2009) đã phân lập và phân tích sự đa dạng của vi khuẩn ở 4 loài rong
thuộc chi Gracilaria, Ulva pertusa, Laminaria và Polysiphonia. Kết quả cho thấy, 4
loài vi khuẩn thuộc chi Vibrio gồm Halomonas venusta, Vibrio tasmaniensis, Vibrio
lentus và Vibrio splendidus. Rong Polysiphonia có mật độ và sự đa dạng cao hơn cả,
rong lục Ulva pertusa chỉ chứa 1vi khuẩn là V. lentus, rong câu đỏ Gracilaria chứa
1 loài Halomonas venusta [20]. Rong lục Ulva pertusa có 4 chi vi khuẩn được phát
hiện là Vibrio, Micrococcus, Aeromonas và Enterobacterium. Rong P. yezoensis có
5 chi vi khuẩn gồm Vibrio, Staphylococcus, Micrococcus, Enterrobacteriaceae và
Corynebacterium. Trong số đó, Vibrio sp. được phân lập với tần suất và số lượng
nhiều hơn cả [20].
Zheng và cs (2005) đã phân lập 175 chủng vi khuẩn từ 7 loại rong biển khác
nhau, với số lượng là 18-40 chủng cho mỗi rong [37]. Boyd và cs (1999) phân lập vi
khuẩn bám trên 7 loài rong bao gồm rong lục, rong nâu và rong đỏ. Trong nghiên
cứu này, tác giả sử dụng 6 loại môi trường khác nhau cho phân lập [16]. Kết quả tác
giả thu được 280 chủng với mỗi môi trường sử dụng, trung bình phân lập được 8-9
chủng. Các loài thuộc chi Pseudoaltermonas, Alteromonas, Brevibacterium,
Bacillus,
Vibrio,
Staphylococcus,
Micococcus,
Leucobacter,
Salinispora,
Eutintinnus được phân lập trong 6 loài rong [34].
Năm 2008, Wiese và cs đã nghiên cứu rất tỉ mỉ về vi sinh vật trên rong nâu
Laminaria saccharina bằng phương pháp phân lập trên nhiều loại môi trường và
mẫu thu trong thời gian 2 năm. Tác giả đã phân lập được 103 chủng vi khuẩn thuộc
21 chi khác nhau trong nhóm Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria,
Gammaproteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria.
Ngoài vi khuẩn sống trên rong, nấm men và nấm mốc cũng thường được
phân lập và nghiên cứu. Tuy mật độ nấm được cho là thấp hơn so với vi khuẩn,
nhưng chúng cũng thể hiện sự đa dạng cao về loài. Loque (2010) phân lập nấm ở ba
loài rong là Adenocystis utricalaris, Desmarestia anceps và Palmaria decipiens ở
Nam cực thì thu được tổng số 75 loài nấm, trong đó có 27 loài nấm sợi và 48 loài
5
nấm men. Các nấm thuộc các chi Geomyces, Antarctomyces, Oidiodendron,
Penicillium, Phaeosphaeria, Aureobasidium, Cryptococcus, Leucosporidium,
Metschnikowia và Rhodotorula [24].
Ở
rong A.utricularis chứa tới 25 loài nấm sợi, trái lại D.anceps chỉ có 2 loài
nấm sợi. Loài nấm Geomycespannorum tập trung nhiều nhất ở loài rong A.utricalaris.
Zuccaro và cs (2008) phân lập nấm từ rong nâu Fucus serratus với các mẫu rong thu
thập ở các vị trí địa lý và tại mùa khác nhau trong năm. Kết quả tác giả phân lập được
42 loài nấm (336 isolate), nằm trong 35 chi khác nhau. Theo tác giả, các nấm thường
gặp nhất là Sterilia mycelia (56 isolate), Sigmoidea marina (56 isolate), Cladosporium
sp. (31 isolate), Acremonium fuci (29 isolate). Điều đặc biệt, các rong khỏe mạnh thì có
độ đa dạng nấm và tần suất xuất hiện cao hơn so với rong bị bệnh [38].
*Các phương pháp sinh học phân tử hiện đại (metagenomes, thư viện gene rDNA,
PCR-DGGE và T-RFLP) xác định sự đa dạng của vi sinh vật trên rong
Như đã biết, các vi sinh vật trong môi trường biển rất đa dạng. Tuy nhiên, chỉ
0,1-2% trong số chúng có thể được phân lập, nuôi cấy mục đích nghiên cứu các đặc
tính lý hóa học và đặc tính sinh học. Các vi sinh vật phân lập chưa phản ánh được
sự đa dạng của quần thể vi sinh vật trong môi trường nhất định. Vì vậy, việc nghiên
cứu quần thể vi sinh vật ở rong biển không qua nuôi cấy, sử dụng kỹ thuật sinh học
phân tử là rất quan trọng và hữu hiệu [8]. Việc ứng dụng đặc điểm của các phương
pháp như PCR-DGGE, T-RFLP, cloning/sequencing hoặc pyrosequencing đã được
đề cập chi tiết [36].
Ở
rong lục Ulva australis, các nhóm vi khuẩn Alphaproteobacteria và
Bacteroidetes là chiếm ưu thế. Đặc biệt là các họ sau Rhodobacteriaceae,
Sphingomonadaceae, Flavobacteriaceaeand, Sapropiraceae.
Rong đỏ Delisea pulchra mọc ở bờ biển Sydney cũng có các vi khuẩn thuộc
Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Planctomycetia và Bacteroidetes, đặc
biệt thuộc các họ Rhodobacteriaceae, Sphingomonadaceae, Flavobacteriaceae và
Planctomycetaceae [3], [23].
Các nghiên cứu về quần thể vi sinh vật trên rong cho thấy mỗi loài rong đều
có những loại vi sinh vật đặc hiệu cho loài rong đó và có thể không thấy trong môi
6
trường biển xung quanh. Ví dụ ở loài tảo bẹ Laminaria hyperborea, một đơn vị loài
(OTU) được phát hiện ở 78% các mẫu tảo trong tất cả các mùa. Các vi sinh vật đặc
hiệu này có thể thay đổi theo thời gian hoặc vị trí địa lý rong biển. Cùng một loài
rong sẽ chứa thành phần vi sinh vật tương đối giống nhau, cho dù rong sống ở các
vùng địa lý khác nhau.
Mặc dù vậy, cũng có các nghiên cứu cho thấy những nhận định sau về sự
khác nhau của quần thể vi sinh vật trên một loài rong: vi sinh vật không đặc thù, và
chúng có thể khác nhau ở các cá thể chủ cùng loài. Loài rong Ulva australia sống ở
các vùng sâu khác nhau sẽ có sự sai khác về quần thể vi sinh vật (tới 40% sai khác,
dựa vào phân tích DGGE). Khi phân tích trình tự rộng hơn, Burke và cs. (2011b)
cho thấy dưới 20% trình tự gen 16S rRNA (tương đồng >97%) là có ở 6 mẫu rong
Ulva australia. Rong Laminaria hyperborea sống ở các vùng khác nhau, cũng có
những quần thể vi sinh vật khác nhau trên chúng [33].
Quần thể vi sinh vật trên rong cũng khác nhau theo mùa, được thấy ở các loài
như Fucus vesiculosus, Gracilaria vermiculophylla, và Ulva intestinali. Một số loài
rong có sự khác nhau lớn đến mức không có các quần thể vi sinh vật đặc hữu.
Bề mặt rong là nơi có tính cạnh tranh cao (không gian, thức ăn), khắc nghiệt do
vi sinh vật tiết chất kháng lại vi sinh hoặc do cây chủ tự sản xuất chất tiêu diệt vi
sinh vật có hại nên các vi sinh trên rong có tính đặc thù nhất định và có cơ chế đặc
biệt mới tồn tại được. Sự đa dạng vi sinh vật trên một loài rong nhất định phụ thuộc
vào nhiều yếu tố (mùa trong năm, nhiệt độ, môi trường biển). Rong là nguồn phân
lập nhiều vi sinh vật mới.
Mối quan hệ giữa vi sinh vật và cây rong chủ đã được xác định. Một loạt các
đặc điểm vật lý, hóa học, sinh học trên bề mặt rong được cho là có vai trò
quan trọng đến số lượng cũng như thành phần vi sinh vật trên rong. Các tác nhân
như dịch chiết của rong, oxi từ rong, CO2, dịch chiết vi sinh vật, có tính chất
quyết định. Rong cung cấp các chất hữu cơ, oxi cho vi sinh vật sinh sống. Trong khi
đó, vi sinh vật cung cấp CO 2, chất khoáng và sản xuất chất trao đổi thứ cấp bảo vệ
rong khỏi các sinh vật gây thối, gây bệnh cho cây, các chất kích thích sinh trưởng
(auxin).Vi sinh vật cố định đạm (Agrobacterium và Rhizobium) cung cấp nitơ cho
rong chủ.
7
Vi sinh vật sản xuất các enzyme (peroxidase, catalase) trung hòa các gốc tự
do (ROS) do rong tạo ra, làm giảm thiệt hại cho rong. Các chất hữu cơ, chất trao đổi
thứ cấp ở rong cũng có tác dụng lựa chọn các loài vi sinh vật nhất định sống trên
chúng, đảm bảo lợi ích cho rong. Một số vi khuẩn oxi hóa amonium được phát hiện
trên rong với số lượng tương đối nhiều, nhằm giải độc N cho rong. Mối quan hệ hỗ
sinh giữa rong và vi sinh vật thể hiện ở chỗ rong cung cấp các chất dinh dưỡng hữu
cơ cho vi khuẩn có lợi, mặt khác, vi khuẩn sản xuất chất kháng sinh tiêu diệt hoặc
làm giảm sự cố định của các vi khuẩn có hại, gây bệnh cho rong chủ. Theo nhiều
công bố, có từ 30-50% vi khuẩn trên rong có khả năng sản xuất chất kháng vi sinh
vật, nhiều hơn nhiều so với tỉ lệ <10% vi sinh vật sống tự do trong nước biển hoặc
bùn đáy.
Một vài loài vi khuẩn thuộc chi Proteobacteria, Bacteroidetes và Firmicutes
có tác dụng giúp rong lục Ulva có hình dáng bình thường nhờ chất cảm ứng
thallusin. Trong chu trình sống của mình, bào tử rong cần được cố định và nảy
mầm, điều này là quan trọng trong chu trình sống của chúng. Nhiều nhóm vi khuẩn
giúp bào tử động của rong cố định lên màng sinh học (biofilm).
Hình 1.1. Ảnh minh họa sự đa dạng vi sinh vật trên bề mặt rong biển [6]
Sự liên quan về sinh thái học giữa cộng đồng vi sinh vật sống trên rong hiện
nay vẫn chưa được hiểu chi tiết. Trước đây, nghiên cứu mối tương tác giữa vi
khuẩn-rong gặp khó khăn trong vấn đề phân lập, nuôi cấy và xác định mối quan hệ
8
[4], [21]. Việc phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử như phương pháp nhận dạng
vi sinh qua giải mã gen 16S rRNA. Kỹ thuật fingerprinting DNA, bao gồm điện di
gel biến tính DNA (PCR-DGGE), đa hìnhchiều dài đoạn gen cắt giới hạn (T-RFLP),
pyrosequencing đã giúp việc phân tích phân loại và đa dạng các vi sinh vật sống
trên rong [23, 33].
Gần đây Feng L và cs. (2010) phát hiện rằng, vi khuẩn gây bệnh Vibrio
parahaemolyticus sống tự do ở biển, có khả năng nhiễm 100% vào rong đỏ
Grateloupia turuturu. Khi nhiễm vào, vi khuẩn này thay đổi hình dạng và trở thành
không thể nuôi cấy được. Chỉ các phương pháp sinh học phân tử mới có khả năng
phát hiện và nghiên cứu khả năng gây bệnh và mối tương tác với rong chủ [22].
Trong một nghiên cứu vi khuẩn ở rong Delisea pulchra, Fernandes và cs.
(2012) sử dụng phương pháp sinh học phân tử (thư viện 16S rDNA) để mô tả sự
thay đổi thành phần vi sinh vật ở rong bệnh và rong khỏe. Tác giả thấy rằng có sự
thay
đổi
ở
taxa
Colwelliaceae,
Rhodobacteraceae,
Thalassomonas,
và
Parvularcula. Số lượng các OTU vi khuẩn ở rong bệnh là 364, nhiều hơn so với ở
rong khỏe 133. Có tới 19 họ/chi được phát hiện với hàng trăm OTU khác nhau,
chứng tỏ sự đa dạng vi sinh vật trên rong là rất cao.
Rong biển rất dễ nhiễm bởi vi sinh vật bám bởi chúng sống trong môi trường
có tính cạnh tranh mạnh với các sinh vật sống ở đáy khác. Chúng liên tục bị các vi
sinh vật cũng như động vật ăn mồi (ăn rong, cỏ v.v…) tấn công. Các vi khuẩn trong
nước biển phải có cơ chế bảo vệ chúng khỏi tia cực tím nguy hại và kẻ thù, trong
khi đó cộng đồng vi sinh vật trên bề mặt sinh học sống sẽ tạo được cấu trúc bảo vệ
khỏi áp lực của môi trường.
1.2.2. Sự tương tác giữa vi sinh vật và rong biển
Các nghiên cứu miêu tả về vi khuẩn phân lập được từ bề mặt rong được công
bố sớm từ năm 1875 [14]. Trong những thập kỷ gần đây, sự quan tâm về quần thể vi
khuẩn sống tương tác với rong biển đã ngày càng tăng. Trong 40 năm gần đây, đã có
107 nghiên cứu trên 148 loài rong (36 rong lục, 46 rong nâu, 55 rong đỏ và 12 rong
chưa rõ ngành) về cộng động vi khuẩn tương tác với rong. Tuy nhiên, số loài
9
rong được nghiên cứu chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong các loài rong. Các công bố
ngày càng tăng liên quan đến vi khuẩn tương tác với rong biển nhờ vào các phương
pháp cải tiến như nuôi cấy, hiển vi điện tử và sinh học phân tử. Tuy vậy, nhiều câu
hỏi liên quan đến sự xuất hiện, phân bố, và chức năng sinh thái học của các vi
khuẩn này vẫn còn chưa sáng tỏ [10]. Các công cụ phù hợp để nghiên cứu cộng
đồng vi khuẩn bao gồm phương pháp không phụ thuộc nuôi cấy đã khởi sắc từ khi
kỹ thuật phân tử được sử dụng [10].
Nói chung, các sinh vật biển lớn (gồm rong biển) có mối tương tác toàn phần
với vi khuẩn trên bám trên chúng, bao gồm từ thụ động (passive), ngẫu nhiên
(random) đến tương tác đặc hiệu cao và cộng sinh bắt buộc [2].Tảo biển (gồm cả
rong biển) là sinh vật sản xuất sinh khối cơ bản trong hệ sinh thái, và hơn nữa, các
vi khuẩn dị dưỡng đóng vai trò quan trọng trong điều hòa khoáng hóa và chuyển
hóa một phần lớn các chất hữu cơ trong hệ sinh thái biển. Bằng việc sử dụng các
chất từ rong biển, vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong chuỗi thức ăn và biến các
chất cơ bản từ rong sẵn sàng được đồng hóa bởi các loài sinh vật khác [2].
Bởi vậy, rong biển là một bộ phận quan trọng của môi trường biển, không
những là nơi cư trú cho các động vật không xương, cá, mà còn là nơi cư trú cho
hàng triệu vi sinh vật. Sự tương tác giữa vi sinh vật và rong biển được cho rằng
quan trọng trong việc kiểm soát sự biến động của cả rong và vi sinh.
Cơ chế bảo vệ hóa học:
Rong biển được cho là thiếu sự đáp ứng miễn dịch phụ thuộc tế bào và luôn
phải đối diện với nhiều loại vi sinh vật gây bệnh và các động vật ăn cỏ (rong) khác.
Bởi vậy, có tính hợp lý khi giả thuyết rằng sự sản xuất các chất trao đổi thứ cấp
đóng vai trò như chất kháng vi sinh vật để loại bỏ sự xâm nhập của vi sinh vật [7].
Để hạn chế sự xâm nhập, phát triển và hình thành màng sinh học bởi vi khuẩn, rong
biển có khả năng ảnh hưởng đến sự đồng hóa và mối liên hệ giữa vi sinh vật và tổng
hợp chất kháng khuẩn. Rong biển có khả năng tiết các chất kháng khuẩn ra môi
trường, và giữ lại các chất kháng động vật ăn rong.
Mối quan hệ qua lại có lợi giữa rong biển và vi sinh vật
10
Mối quan hệ có lợi có thể dựa trên khả năng rong biển tổng hợp và tiết các
chất hữu cơ và oxi và cung cấp cho vi sinh vật. Mặt khác, vi sinh vật có thể khoáng
hóa các cơ chất hữu cơ, cung cấp CO 2, N, khoáng chất và các tác nhân sinh trưởng
(IAA, cytokinin) [5]. Hơn nữa, vi sinh vật bảo vệ rong khỏi các tác nhân độc hại
như kim loại nặng, dầu thô, tổng hợp hormon thực vật. Vi sinh vật giữ cho rong ở
hình dạng bình thường, ổn định sự phát triển.
1.2. Tình hình nghiên cứu hợp chất tự nhiên và hoạt tính sinh học từ vi sinh vật
sống trên rong biển
Tập hợp vi sinh vật trên rong biển có thể gồm các nhóm sinh thái khác nhau
như gây bệnh tiềm tàng, nội sinh thật sự hay nội sinh ngẫu nhiên. Khả năng sản xuất
chất trao đổi thứ cấp của các nấm này là đáng phải để ý đến. Chúng có thể tổng hợp
các chất mới với nhiều hoạt tính có tầm quan trọng trong y dược (Hình 1.2) [29].
Hình 1.2. Ảnh minh họa vi khuẩn, nấm trên rong biển sản xuất một số chất trao đổi
thứ cấp [29]
Các nghiên cứu chỉ ra rằng đa số nấm cộng sinh trên rong thuộc chi
Aspergillus (chiếm 17%) và Penicillium (9%). Việc sàng lọc các chủng nấm nội sinh
ở rong để tìm chất có hoạt tính sinh học đã chứng tỏ đây là nguồn vật liệu quan
trọng. Hơn 300 chất tự nhiên được phân lập từ 32 nấm nội sinh, với 22% nấm
11
nghiên cứu thuộc về Aspergillus. Đặc biệt, 43% (139/327) chất được công bố là hợp
chất tự nhiên mới.
Các sinh vật nội sinh rong biển sản sinh các chất có hoạt tính, chống oxi hóa
mạnh. Nấm Epicoccum từ rong Fucus vesiculosus sản xuất epicoccone chống oxi
hóa mới. Ngoài ra, nấm Wardomyces anomalus nội sinh ở rong lục, sản xuất chất
xanthone có hoạt tính chống oxi hóa cao. Việc sản xuất chất chống oxi hóa được cho
là chiến lược của vi sinh vật nội sinh để đối phó với các đáp ứng của rong chủ.
Ngoài ra, nhiều nấm từ rong lục, đỏ và nâu sản xuất chất kháng tảo, kháng nấm, côn
trùng làm cho việc xâm nhập của các vi sinh vật vào rong chủ bị hạn chế và đồng
thời bảo vệ rong khỏi động vật.
Cho dù nấm biển có thể có nguồn gốc từ nấm đất liền, tuy nhiên chúng sản
xuất nhiều chất mới mà nấm đất liền không có. Các chất này có hoạt tính chống ung
thư, kháng vi sinh vật, kháng viêm, tuyến trùng, vi rút và chống hình thành mạch
Chúng sản xuất các polyketide thơm, alkaloids, sesquiterpenes. Vì vậy các nấm này
là nguồn vô cùng quan trọng khai thác chất có hoạt tính y dược hay dẫn xuất để tổng
hợp thuốc.
Dựa trên các nghiên cứu về hóa học của nấm biển, tác giả tổng kết rằng nấm
biển phân lập từ bọt biển là đa dạng nhất, tiếp theo là gỗ trôi nổi, tảo biển, san hô,
thực vật/cỏ biển, cá, động vật thân mềm. Các hợp chất mới phân lập được từ nấm
trên tảo biển (rong và vi tảo) là chiếm tỉ lệ cao, tới 27%, hơn hẳn so với các nguồn
khác như thực vật biển (3%), bùn biển (4%), cá (2%), san hô (2%) (Hình 1.3).
Hình 1.3. Bảng phân bố các hợp chất mới từ nấm có nguồn gốc biển khác
nhau [32]
12
Nấm Aspergillus sp. từ rong nâu Sargassum sp. sản xuất chất
diketopiperazine có hoạt tính kháng vi sinh vật. Nấm Varico sporina ramulosa từ
rong nâu Cytoseira sản xuất một loạt chất macrodiolides, là chất kháng nấm mốc.
Từ mô của loài rong đỏ Liagora viscida, nấm Dresch dematioidea được phân lập và
sản xuất 16 chất bao gồm 10 chất mới mới thuộc sesquiterpens.
Về hoạt tính gây độc tế bào từ nấm trên rong, nấm Leptosphaeria sp. OUPS4 từ rong nâu Sargassum tortile sản xuất chất leptosins. Một chất gây độc tế bào ung
thư mới là sesquiterpenoid nitrobenzoyl esters được tổng hợp từ Penicillus
capitatus tảo xanh ở Caribbean. Hợp chất insulicolide được tổng hợp từ nấm
Aspergillus insulicola từ rong lục. Penicillium sp. OUPS-79 từ tảo sản xuất
communesin A và B [32].
13
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
STT
1
2
3
4
5
6
Các dòng tế bào ung thư gan (HepG-2), ung thư phổi (LU), ung thư màng
tim (RD) được cung cấp bởi phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp
chất thiên nhiên.
14
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
-
Hóa chất nghiên cứu gồm:
+
2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl (DPPH) (SigmaAldrich)
+
4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside (pNPG) (Sigma-Aldrich)
+
Enzyme α-glucosidase (Sigma)
+
Các dung môi hữu cơ thông dụng ethyl acetate, methanol
+
Các KIT sử dụng tách chiết và tinh sạch DNA.
+
Các hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR: master mix 2X, primers
EF4F
và EF3R.
+
Các hóa chất sử dụng cho nuôi cấy vi sinh vật: cao nấm men, pepton, muối
khoáng
+
Thiết bị nghiên cứu
Thiết bị và máy móc dùng trong nghiên cứu từ Phòng Sinh học thực
nghiệm và các phòng thí nghiệm khác của Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, gồm: máy lắc ổn nhiệt, máy nhân
gene, máy ly tâm, máy đo pH, máy điện di, buồng nuôi cấy vi sinh vật và các máy
móc thông dụng khác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật
- Phân lập nấm biển trên cây rong.
+
Môi trường nuôi cấy vi nấm
Chúng tôi sử dụng môi trường PDA (potato-dextrose-agar) có thành phần
như sau để phân lập vi nấm bám trên rong.
Thành phần (g/L): glucose 20 g, nước chiết 300g khoai tây, NaCl 25 g, agar
18 g. Sau khi cân chính xác các thành phần trên, dung dịch nước biển nhân tạo được
bổ sung tới 1L, pH chỉnh về 7,2-7,5 bằng NaOH 0,1N.
15
Dung dịch nước biển có thành phần như sau:
Hóa chất
Na2S04
KBr
MgSO4.7H20
H3BO3
KCl
SrCl2.6H2O
+
Phân lập nấm ngoại sinh (sống bám)
Mẫu rong được rửa nhẹ bằng nước muối đã khử trùng, để ráo nước trong
buồng nuôi cấy. Dùng miếng vải bông đã khử trùng cọ vào các sợi rong (khoảng
2
1cm diện tích). Miếng vải được thả vào 1 mL dung dịch muối biển vô trùng, lắc kỹ
-5
-1
và pha loãng liên tục để đạt nồng độ từ 10 đến 10 .
Hút 50 µl dịch đã pha loãng, cấy trải lên môi trường thạch đã chuẩn bị sẵn
trong đĩa petri (bổ sung 40 g/ml chloramphenicol, streptomycin 100 µg/ml). Các
o
đĩa cấy vi khuẩn được ủ 25 C trong 2-3 tuần cho tới khi các khuẩn lạc mọc.
Từ một khuẩn lạc mọc riêng rẽ và có hình thái, màu sắc đặc thù, cấy ria lên
đĩa thạch mới sao cho các khuẩn lạc được tách rời. Chọn một khuẩn lạc đại diện và
o
cấy vào ống thạch nghiêng có chứa thành phần như trên, ủ 25 C trong 7 ngày và
o
bảo quản tại 4 C, cứ 3-6 tháng cấy chuyển 1 lần.
+
Phân lập nấm cộng sinh
Sau khi mẫu rong đã được rửa bằng nước biển vô trùng, dùng dung dịch khử
trùng bề mặt NaClO và cồn 70% để khử trùng bề mặt trong 60 giây. Mẫu sau đó
được cắt nhỏ thành các mẩu kích thước 0,5×0,5 cm. Các mẫu được đặt trực tiếp lên
bề mặt môi trường thạch sao cho diện tích mặt cắt tiếp xúc với bề mặt môi trường.
o
Với mỗi mẫu rong, ta cần đặt khoảng 10-15 miếng cắt. ủ các hộp lồng tại 25 C
trong thời gian 1-2 tuần cho tới khi tại các miếng rong, xuất hiện các sợi nấm mọc.
16
