Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm linh chi ganoderma lucidum (leyss ex fr ) karst

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

PHẠM THANH BÌNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH
HỌC CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM (LEYSS
EX. FR.) KARST

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

PHẠM THANH BÌNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM (LEYSS EX. FR.)
KARST
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN: 1. TS. NGUYỄN TIẾN ĐẠT
2. TS. TRẦN MẠNH TRÍ

Hà nội – Năm 2018

1


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã
nhận được sự động viên và giúp đỡ rất nhiều từ gia đình, cá nhân và tập thể.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Tiến
Đạt – Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao công nghệ, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, TS. Trần Mạnh Trí – giảng viên trường
Đại học Khoa học Tự nhiên đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận
tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Hóa học và
Phòng sau đại học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã đào tạo và
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng
nghiệp đã cổ vũ động viên tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn!

2


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là: Phạm Thanh Bình
Học viên cao học: Chuyên ngành Hóa hữu cơ – K26
Tôi xin cam đoan luận văn thạc sĩ này là một công trình nghiên cứu này
là trung thực và chưa từng được sử dụng trong bất kì công trình nào khác.

Các thí nghiệm để thu thập số liệu trong luận văn đã được chính
bản thân tôi tiến hành thí nghiệm tại phòng Hoạt chất Sinh học, Viện Hóa
sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với sự đồng ý
hướng dẫn của TS. Nguyễn Tiến Đạt và TS. Trần Mạnh Trí.
Các số liệu phục vụ cho phân tích, nhận xét đánh giá được tôi thu
thập từ các nguồn có ghi rõ trong tài liệu tham khảo.

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Phạm Thanh Bình

3
MỤC LỤC


LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................
LỜI CAM ĐOAN ...........................................................................................................
MỤC LỤC .......................................................................................................................
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................
DANH MỤC VIẾT TẮT ...............................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................
Chương 1: TỔNG QUAN ............................................................................................

1.1.Đặc điểm thực vật ..................................................
1.2.Giới thiệu về nấm Linh chi ...................................
1.2.1. Phân bố và sinh thái của nấm Linh chi ........................................................
1.2.2. Thành phần hóa học của nấm Linh chi ........................................................
1.2.3. Tác dụng dược lý..........................................................................................
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................

2.1.Đối tượng nghiên cứu ...............................................
2.2.Phương pháp nghiên cứu ..........................................
2.3.Phương pháp xác định cấu trúc ................................
2.4.Phương pháp thử hoạt tính .......................................
2.4.1. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-Amylase ...............................
2.4.2. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ...........................
2.4.3. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm .......................................................

Chương 3. THỰC NGHIỆM .......................................................................................
3.1.Xử lý mẫu nghiên cứu: ..............................................
3.2.Quy trình phân lập các chất sạch .............................
3.3.Thông số hóa lý các hợp chất phân lập được ..........
3.3.1. Hợp chất 1 (GL-1): ergosterol......................................................................
3.3.2. Hợp chất 2 (GL-2): ergosterol peroxide ......................................................
3.3.3. Hợp chất 3 (GL-3): 3β,26-dihydroxy-5α-lanosta-8,24-dien-11-one ...........
3.3.4. Hợp chất 4 (GL-4): ganoderic aldehyde A (3-hydroxy-11-oxolanosta-8,24dien-26-al) ..............................................................................................................
3.3.5. Hợp chất 5 (GL-5): 3β,24S,25S,26-tetrahydroxy-5α-lanosta-8-en-11-one ..

4


3.3.6. Hợp chất 6 (GL-6): ganoderma acid AM1 (3β-hydroxy-7,11,15,23-tetraoxo

5α-lannost-8-en-26-oic acid) ..................................................................................
3.3.7. Hợp chất 7
tetraoxo-5α-lanost-8-en-26-oic acid). ....................................................................
3.3.8. Hợp chất 8
3.3.9. Hợp chất 9
3.3.10. Hợp chất 10 (GL-10): methyl 3β-hydroxy-12β-acetoxy-7,11,15,23tetraoxo-5α-lanosta-8-en-26-oate ...........................................................................

3.4. Thử hoạt tính sinh học của 10 hợp chất sạch phân lập được từ nấm Linh chi (G.

lucidum). .....................................................................................................................
3.4.1. Thử hoạt tính ức chế enzyme α-amylase .....................................................
3.4.2. Thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ................................................
3.4.3. Thử hoạt kháng viêm ...................................................................................
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................
4.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ nấm Linh chi. ..........................................
4.1.1. Hợp chất 1: (GL-1): ergosterol ...................................................................
4.1.2. Hợp chất 2: (GL-2): ergosterol peroxide .....................................................
4.1.3. Hợp chất 3: (GL-3): 3β,26-dihydroxy-5α-lanosta-8,24-dien-11-one ..........
4.1.4. Hợp chất 4 (GL-4): Ganoderic aldehyde A (3-hydroxy-11-oxolanosta-8,24dien-26-al) ..............................................................................................................
4.1.5. Hợp chất 5 (GL-5): 3β,24S,25S,26-tetrahydroxy-5α-lanosta-8-en-11-one ..
4.1.6. Hợp chất 6 (GL-6): ganoderma acid AM1 (3β-hdroxy-7,11,15,23-tetraoxo
5α-lannost-8-en-26-oic acid) ..................................................................................
4.1.7. Hợp chất 7 (GL-7): Ganoderic acid C6 (3β,12β-dihydroxy-7,11,15,23tetraoxo-5α-lanost-8-en-26-oic acid). ....................................................................
4.1.8. Hợp chất 8 (GL-8): ganoderic acid C ..........................................................
4.1.9. Hợp chất 9 (GL-9): Ganodermadiol (Lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol) 70
4.1.10. Hợp chất 10 (GL-10): methyl 3β-hydroxy-12β-acetoxy-7,11,15,23tetraoxo-5α-lanosta-8-en-26-oate ...........................................................................
4.2. Hoạt tính sinh học các chất phân lập được từ nấm Linh chi G. lucidum ............
4.2.1. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase ............................................................
4.2.2. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase .......................................................
4.2.3. Hoạt tính kháng viêm ...................................................................................
KẾT LUẬN ...................................................................................................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................
CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ...................................................................................
5


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Bảng số liệu 13C NMR của các hợp chất sạch từ nấm Linh chi (G. lucidum) 42

Bảng 2. Số liệu phổ hợp chất GL-5 ................................................................................
Bảng 3. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase. ................................................................
Bảng 4. Kết quả thử hoạt tính enzyme α-glucosidase. ...................................................
Bảng 5. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm ....................................................................
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Một số loài nấm thuộc chi Ganoderma .............................................................
Hình 2. Mẫu nấm linh chi (G. lucidum Karst) ...............................................................
Hình 3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm Linh chi (G. lucidum) .............................
Hình 4. Cấu trúc hợp chất GL-1 .....................................................................................
1

Hình 5. Phổ H của hợp chất GL-1 ................................................................................
13

Hình 6. Phổ C NMR của hợp chất GL-1 .....................................................................
Hình 7. Phổ DEPT của hợp chất GL-1 ..........................................................................
Hình 8. Phổ MS của hợp chất GL-1 ...............................................................................
Hình 9. Cấu trúc hợp chất GL-2 .....................................................................................
1

Hình 10. Phổ H NMR của hợp chất GL-2 ....................................................................
13

Hình 11. Phổ C NMR của hợp chất GL-2 ...................................................................
Hình 12. Phổ DEPT của hợp chất GL-2 ........................................................................
Hình 13. Phổ HSQC của hợp chất GL-2 ........................................................................
Hình 14. Phổ HMBC của hợp chất GL-2 .......................................................................
Hình 15. Phổ MS hợp chất GL-2 ...................................................................................

Hình 16. Cấu trúc hợp chất GL-3 ...................................................................................
1

Hình 17. Phổ H NMR của hợp chất GL-3 ....................................................................
13

Hình 18. Phổ C NMR của hợp chất GL-3 ...................................................................
Hình 19. Phổ DEPT của hợp chất GL-3 ........................................................................
Hình 20. Phổ MS của hợp chất GL-3 .............................................................................
Hình 21. Cấu trúc hợp chất GL-4 ...................................................................................
1

Hình 22. Phổ HNMR của hợp chất GL-4 .....................................................................
13

Hình 23. Phổ C NMR của hợp chất GL-4 ...................................................................
6


Hình 24. Phổ DEPT của hợp chất GL-4 ........................................................................
Hình 25. Phổ MS của hợp chất GL-4 .............................................................................
Hình 26. Cấu trúc hợp chất GL-5 ...................................................................................
1

Hình 27. Phổ H của hợp chất GL-5 ..............................................................................
13

Hình 28. Phổ C NMR của hợp chất GL-5 ...................................................................
Hình 29. Phổ DEPT của hợp chất GL-5 ........................................................................
Hình 30. Phổ HSQC của hợp chất GL-5 ........................................................................

Hình 31. Phổ HMBC của hợp chất GL-5 .......................................................................
Hình 32. Phổ COSY của hợp chất GL-5 ........................................................................
Hình 33. Phổ NOESY của hợp chất GL-5 .....................................................................
Hình 40. Cấu trúc của hợp chất GL-7 ............................................................................
1

Hình 41. Phổ H của hợp chất GL-7 ..............................................................................
13

Hình 42. Phổ C NMR của hợp chất GL-7 ...................................................................
Hình 43. Phổ DEPT của hợp chất GL-7 ........................................................................
Hình 44. Phổ HSQC của hợp chất GL-7 ........................................................................
Hình 45. Phổ HMBC của hợp chất GL-7 .......................................................................
Hình 46. Phổ MS của hợp chất GL-7 .............................................................................
Hình 47. Cấu trúc của hợp chất GL-8 ............................................................................
1

Hình 48. Phổ H của hợp chất GL-8 ..............................................................................
13

Hình 49. Phổ C NMR của hợp chất GL-8 ...................................................................
Hình 50. Phổ DEPT của hợp chất GL-8 ........................................................................
Hình 51. Phổ MS của hợp chất GL-8 .............................................................................
Hình 52. Cấu trúc hợp chất GL-9 ...................................................................................
1

Hình 53. Phổ H của hợp chất GL-9 ..............................................................................
13

Hình 54. Phổ C NMR của hợp chất GL-9 ...................................................................

Hình 55. Phổ DEPT của hợp chất GL-9 ........................................................................
Hình 56. Phổ MS của hợp chất GL-9 .............................................................................
Hình 57. Cấu trúc của hợp chất GL-10 ..........................................................................
1

Hình 58. Phổ H của hợp chất GL-10 ............................................................................
13

Hình 59. Phổ C NMR của hợp chất GL-10 .................................................................
Hình 60. Phổ DEPT của hợp chất GL-10 ......................................................................
Hình 61. Phổ MS của hợp chất GL-10 ...........................................................................
7


DANH MỤC VIẾT TẮT
Kí hiệu
13

C-NMR

1

H-NMR

A-549
CC
DEPT
DMSO
HMBC
HSQC

IC50
RP-18
SRB
TMS

8


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hóa học các hợp chất thiên nhiên, một bộ phận của chuyên ngành hóa hữu
cơ, đang có xu hướng phát triển mạnh mẽ. Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên
vô cùng phong phú và quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh
học. Xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính
sinh học cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu
hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là độc tính
thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp.
Việt Nam có hệ thực vật đa dạng và phong phú do nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió
mùa. Theo ước tính, nước ta có khoảng gần 13.000 loài thực vật bậc cao trong đó có khoảng
hơn 5.000 loài được sử dụng làm thuốc. Nhân dân ta từ lâu đã biết sử dụng các loại cây cỏ
trong tự nhiên để làm thuốc chữa bệnh. Bắt nguồn từ kinh nghiệm dân gian, cùng với sự phát
triển nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, đến nay rất nhiều dược liệu đã được nghiên cứu, sử
dụng rộng rãi trong cuốc sống và khoa học.

Nấm Linh chi là một trong những dược liệu quý, cây thuốc quan trọng tại các
nước Đông Nam Á. Trong những năm gần đây, các nhóm nghiên cứu trong và ngoài
nước quan tâm thực hiện và bước đầu đã thu được nhiều kết quả khả quan. Các công
bố trong nước cũng như quốc tế chỉ ra rằng, thành phần hóa học chính trong nấm
Linh chi có phổ hoạt tính sinh học rộng phải kể đến như: điều hòa hệ miễn dịch, kháng
khuẩn, kháng viêm, giảm mỡ máu, hạ huyết áp, hoạt tính chống oxy hóa, chống ung
thư… Xuất phát từ những lợi ích của nấm Linh chi, các hoạt tính sinh học của nó

mang lại cho con người, cũng như để hiểu sâu hơn và thành phần hóa học và hoạt
tính sinh học của nấm Linh chi, đã thúc đẩy tác giả tiến hành nghiên cứu đề tài này,
nhằm góp phần nhỏ của mình vào việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học của cây nấm Linh chi nhằm mục đích phát hiện các dược tố mới, phục vụ
công cuộc bảo vệ sức khỏe cộng đồng, chúng tôi lựa chọn đề tài:

“Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm Linh chi
Ganoderma lucidum (Leyss ex. Fr.) Karst”.
Mục tiêu của đề tài là thực hiện các nội dung sau:
1. Phân lập các hợp chất từ cây nấm Linh chi (G. lucidum);
2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ cây nấm Linh chi (G. lucidum);
3. Đánh giá một số hoạt tính các hợp chất phân lập được.

9


Chương 1: TỔNG QUAN

1.1. Đặc điểm thực vật
Theo hệ thống phân loại thực vật Donk. (1948), cây nấm Linh chi
(Ganoderma

lucidum

(Leyss

ex.

Fr.)

Kars),

họ

Nấm

lim

(Ganodermataceae) có vị trí phân loại như sau:
Giới: Nấm (Fungi)
Ngành: Nấm đảm (Basidiomycota)
Lớp: Nấm đảm (Agaricoycetes)
Bộ: Nấm đa tầng (Polyporales)
Họ: Nấm lim (Ganodermataceae)
Chi: Ganoderma
Loài: G. lucidum (Leyss ex. Fr.)
Kars [7]. 1.2. Giới thiệu về nấm Linh chi
Các nhóm nấm có tính chất dược lý quý được xác định là thuộc họ
Ganodermataceae. Họ Ganodermataceae (1948) có khoảng 171 loài với các chi như:

Amauroderma M., Elfvingia K., Ganoderma K., Haddowia S., Huhreya S. và

Magoderma S., trong đó nổi bật là 2 chi Ganoderma và Amauroderma [8, 9].
- Chi Ganoderma P, Karst. (1881): anamorph Thermophymatospora,

có khoảng 80 loài, được phân bố rộng đặc biệt là ở vùng nhiệt đới.
+ G. australe: sống trên các thân gỗ mục, nấm dược liệu.
+ G. applanatum: làm mục cây gỗ, nấm dược liệu.
+ G. lucidum: gây mục cây, nấm dược liệu.
+ G. philipii (G. pseudoferreum): kí sinh trên dễ của ca cao, cà phê, cao su…

+ G. orbiformum (G.boniense): kí sinh trên rễ của các cây họ cau dừa.
- Chi Amauroderma Murrill (1905): có khoảng 30 loài, phân bố rộng đặc biệt là
ở vùng nhiệt đới. Tuy nhiên nấm Linh chi (G. lucidum) được nghiên cứu

nhiều nhất bởi đặc tính dược lý và lợi ích kinh tế mà chúng đem lại.
Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum (Leyss. Ex. Fr) Karst. Trên
thế giới có khoảng 80 loài khác nhau và phân bố rộng ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt
đới và ôn đới. Nấm Linh chi có nhiều tên gọi khác nhau như Bất lão, Chi linh, Đoạn

10


G. tornatum (Pers.) Bres

G. amboinense (Lam.) Pat.

G. australe (Fr.) Pat.

G. lobatum (Schwein.) G.F. Atk

G. sinense J.D. Zhao

Hình 1. Một số loài nấm thuộc chi Ganoderma
11


thảo, Nấm lim… Nấm Linh chi chứa nhiều thành phần khoáng vi lượng,
trong đó có một số khoáng tố như: selenium, germanium… Nấm Linh chi
được chứng minh là một loại thảo dược để chống ung thư, lão hóa, xơ
vữa thành mạch, viêm gan, bảo vệ cấu trúc nhân tế bào.

- Đặc điểm hình thái: Quả thể có cuống dài, ngắn hoặc hầu như không cuống và mũ
đính lệch hay đính bên màu nâu đỏ, bóng nhoáng. Mũ nấm mới hình thành có dạng cục lồi,
tròn; sau khi phát triển thành dạng thận, dạng bán cầu, dạng quạt, có khi tròn. Mặt mũ nấm có
vân tròn đồng tâm, lượn sóng nhiều hay ít, mép nấm mỏng hoặc hơi tù lượn sóng. Mũ nấm
sinh ra có màu trắng có sắc thái vàng lưu huỳnh sau chuyển sang vàng rỉ sắt, nâu, nâu đỏ, nâu
hồng tím… tạo nên một lớp vỏ bóng nhoáng như quét sơn hoặc vecni. Kích thước mũ nấm 22,5 3- 30 cm; dày 0,5- 1,5 cm. Thịt nấm bằng chất lie cứng, khi non màu trắng, sau đó chuyển
sang màu vàng nhạt, màu nâu vàng. Mô đồng nhất, không phan tầng. Hệ sợi dimitric gồm sợi
không vách ngang và sợi bện, kích thước từ 2 - 7μm, màng dày, nội chất hầu như không màu,
trong suốt. Bào tầng dạng ống nhỏ, mỗi milimet có 4 -5 (6) ống, miệng ống nấm tròn đều, ống
nấm sâu 0,2 – 0,7 cm. Miệng ống nấm khi non màu trắng, khi già chuyển sang màu vàng nhạt.
Bào tử hình trứng nhọn một đầu, kích thước 5 – 11,5 μm 8,5 – 11,5 μm, màng hai lớp (lớp ngoài
nhẵn, không màu, lớp trong có gai nhẹ), có màu nâu gỉ sắt. Đảm đơn bào, hình chùy ngắn, kích
thước 7 - 10 μm 12 -14 μm, màng là một lớp mỏng, nội chất không màu trong suốt. Cuống nấm
ngắn, thường đính bên phần lõm của mũ nấm. Cuống nấm có màu sắc như màu mũ nấm và có
lớp vỏ bóng loáng, thường có hình trụ tròn hay hơi dẹt, kích thước 0,5 – 1,5

(2) cm 3 – 17 cm. Mô của cuống nấm và mũ đồng nhất [6].
- Chi nấm Linh chi (Ganodermataceae) được đặt tên khoa học bởi

Karsten vào năm 1881. Hiện nay, nhờ hệ thống phân tích sinh hóa bằng cách
sử dụng trình tự thông tin DNA có nguồn gốc rDNA, ty thể SSU đã làm rõ mối
quan hệ giữa các loài nấm Linh chi và chia thành 6 nhóm đơn ngành [3]:

+ Nhóm nấm Linh chi G. applanatum
+ Nhóm nấm Linh chi G. tsugae
+ Nhóm nấm Linh chi Châu Á G. lucidum

12

+ Nhóm nấm Linh chi G. merrdithiae
+ Nhóm nấm Linh chi G. resinaceum.

Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh Linh chi có tác dụng điều trị
bệnh như: rối loạn tiền đình, tăng huyết áp, viêm phổi, tiểu đường, tăng
hàm lượng cholesterol trong máu [7, 29].
1.2.1. Phân bố và sinh thái của nấm Linh chi
Nấm Linh chi phân bố đa dạng và phong phú nhất ở các khu rừng nhiệt đới và
cận nhiệt đới. Ngoài ra chúng còn sinh trưởng và phát triển ở khu vực Bắc Mỹ. Ở Việt
Nam, nấm Linh chi có thể tìm thấy ở hầu hết các tỉnh vùng núi từ Lào Cai (Sa Pa) đến
Lâm Đồng (Lang Biang). Ở các vùng rừng trước kia có nhiều cây lim khác đã bị khai
thác, trên gốc hoặc phần thân cành còn lại đều có thể thấy nấm này mọc, như vùng
thuộc lâm trường Hương Sơn (Hà Tĩnh), tỉnh Thanh Hoá, Tam Đảo (Vĩnh Phúc)…

Nấm Linh chi thường hoại sinh trên gỗ mục hoặc trên đất ngay ở nơi
có gốc cây gỗ đã mục, thuộc đại diện của các họ Caesalpiniaceae (Lim, Lim
xẹt, Muồng đen, Me…) và Fagaceae (một số loài thuộc các chi Quercus,
Lythocarpus, Castanopsis…). Môi trường sống của nấm thường ở rừng kín
thường xanh ẩm, độ cao từ vài chục mét đến nghìn mét [2].

1.2.2. Thành phần hóa học của nấm Linh chi
Nấm Linh chi đã được dùng làm thuốc từ lâu và đã có nhiều công bố về thành
phân hóa học và hoạt tính sinh học. Trong nấm Linh chi chứa nhiều thành phần khác
nhau, nhưng thành phân hóa học chủ yếu trong cây chứa hàm lượng lớn lớp chất
triterpenoid, sau đó là polysaccharide, hợp chất phenolic, peptid và protein.

Triterpenoid
Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có độ dài mạch carbon là bội số của 5 như:
menthol (monoterpene) và β-caroten (tetraterpene). Phần lớn các terpenoid có cấu trúc
mạch vòng. Triterpenoid là một phân lớp của terpenoid và có công thức tổng quát C 30H48,

cấu trúc hoá học của các triterpenoid có thể là mạch hở, 3, 4, hoặc 5 vòng với 33 khung
carbon cơ bản. Trong nấm Linh chi, cấu trúc hoá học của các triterpene có dạng
lanostane, tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol (1), quá trình sinh tổng hợp

13


giúp hình thành nên các squalen mạch vòng. Những triterpenoid đầu tiên
được Kubota T. và cộng sự đã phân tách từ nấm Linh chi là acid
ganoderic A (2) và acid ganoderic B (3) [20].

Những nghiên cứu sau đó cũng đã phân lập được các hợp chất có khung
lanostane như: n-butyl ganoderate H (n-butyl 12β-aceroxy-3β-hydroxy-7,11,15,23tetraoxo-5α-lanost-8-en-26-oate)

(4)

[21],

ganolucidic

acid

A

(5),

methyl

ganolucidate A (methyl 15α-hydroxy-3,11,23-trioxo-5α-lanost-8-en-26-oate) (6) và
ethyl 12β-acetoxy-3,7,11,15,23-pentaoxo-5α-lanost-8-en-26-oate (7) [11].

14


Acid ganoderic δ ((23S)-7α,15α,23β-trihydroxy-3,11-dioxo-5α-lanost-8,24(E)dien-26-oic acid) (8), acid ganoderic ε ((23S)-3β,7β,23β-trihydroxy-11,15-dioxo-5αlanost-8,24(E)-dien-26-oic acid) (9), acid ganoderic ζ ((23S)-3β,23β-trihydroxy7,11,15-trioxo-5α-lanost-8,24(E)-dien-26-oic acid) (10) và acid ganoderic η ((23S)3β,7β,12β,23β-trihydroxy-11,15-dioxo-5α-lanost-8,24(E)-dien-26-oic acid) (11) [24].

Komoda Y. và cộng sự đã phân lập được các hợp chất từ nấm Linh chi vào năm

1985: (20E)-7β,15α-dihydroxy-3,11,23-trioxo-5α-lanost-8,20-dien-26-oic acid (12),
(20E)-3β,7β-dihydroxy-11,15,23-trioxo-5α-lanost-8,20-dien-26-oic acid (13), (20E)-

3β,7β,15α-trihydroxy-11,23-dioxo-5α-lanost-8,20-dien-26-oic

acid (14),

(20E)-7β-

hydroxy-3,11,15,23-tetraoxo-5α-lanost-8,20-dien-26-oic acid (15) [18].

15


3β,7β-dihydroxy-11,15,23-trioxo-5α-lanost-8,16-dien-26-oic acid (16), 3β,7βdihydroxy-11,15,23-trioxo-5α-lanost-8,16-dien-26-oic acid methyl ester (17), 12βacetoxy-3β,7β-dihydroxy-11,15,23-trioxo-5α-lanost-8,16-dien-26-oic acid (18) [12].

Lanosta-7,9(11),24-trien-15α-acetoxy-3α-hydroxy-23-oxo-26-oic
lanosta-7,9(11),24-trien-3α,15α-diacetoxy-3α-hydroxy-23-oxo-26-oic

acid
acid

(19),
(20),

lanosta-7,9(11),24-trien-3α-acetoxy-15α-hydroxy-23-oxo-26-oic acid (21), lanosta7,9(11),24-trien-3α,15α-diacetoxy-3α,22β-dihydroxy-23-oxo-26-oic acid (22) [31].

20-hydroxy lucidelic acid D2 (23), 20-hydroxy
lucidelic acid E2 (24), 20-hydroxy lucidelic acid F (25) và 20-hydroxy
lucidelic acid N (26) [8].
16


Nghiên cứu mới gần đây về cây G. lucidum của nhóm nghiên cứu
người Trung Quốc Chen B. và các cộng sự đã phân lập được 81 hợp chất
sạch triterpenoid và meroterpenoid, trong đó có 8 hợp chất mới và 73 hợp
chất đã biết. Sau đây là một số hợp chất có trong báo cáo: Ganolucinins A
(27), ganomycin J (28), ganomycin I (29) và ganoleuconin P(30) [10].

17


Ganomastenol A (31), ganomastenol B (32), ganomastenol C (33) và
ganomastenol D (34) [30].

Yoshiyuki Mizushin và các cộng sự đã phân lập từ quả thể nấm được
các hợp chất acid lucidenic O (35), lucidenic lacton (36) từ G. lucidum [25].
O
O
COOH

HOH2C

O

HO

Với những nghiên cứu trên cho thấy tất cả chúng đều là dẫn xuất của
lanosterol như acid ganoderic, ganoderiol, ganolucidic, acid lucidenic...

Polysaccharide
Nấm Linh chi có chứa rất nhiều polysaccharide có khối lượng phân tử lớn, các hợp
chất này mang hoạt tính sinh học và được tìm thấy trong tất cả các bộ phận của nấm Linh chi.
Hơn 200 loại polysaccharide được phân lập từ quả thể, bào tử của nấm Linh chi [14]. Các
polysaccharide có cấu tạo lập thể dạng xoắn ốc chủ yếu định vị cố định bằng liên kết hydro, có
khối lượng phân tử lớn từ vài trăm đến vài triệu. Trong quả thể của nấm Linh chi cũng có
heteropolisaccarit tan trong nước (β-glucan và glucurono-β-

18


glucan) được cấu tạo bởi đường D-glucose, D-galactose, D-mannose, Dxylose và L-fucose.

OH

Các hợp chất phenolic
Ngoài 2 lớp hoạt chất sinh học chính của nấm Linh chi thì còn có rất nhiều những

phân tử có hoạt tính sinh học như các terpenoid, steroid, nucleotide và phenolic. Các
hợp chất phenolic có hoạt tính sinh học và dược lý đặc biệt, hoạt tính sinh học của
các hợp chất phenolic liên quan đến khả năng tạo phức kim loại, ức chế lipoxygenase
và khả năng quét các gốc tự do. Flavonoid là một phân lớp của polyphenol có khả

năng quét gốc tự do, ức chế quá trình thuỷ phân và oxy hoá của enzyme, kháng viêm.
Trong nghiên cứu của Kim Min Young và các cộng sự đã xác định được 28 hợp
chất phenolic trong mẫu nấm bằng phương pháp HPLC, kết quả cho thấy hàm lượng
trung bình của các hợp chất phenolic là 326 µg/g, hàm lượng flavonoid là 76 µg/g [16].

Peptid, protein
Năm 1997, Kawagishi H. và cộng sự đã phân lập được 2 protein từ các sợi nấm
(GLL-M) và quả thể (GLL-F) của nấm Linh chi. Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Ye đã
tìm thấy ba loại protein có hoạt tính sinh học (LZP-1, LZP-2, LZP-3) từ quả thể và bào
tử của nấm Linh chi [14]. Cùng khoảng thời gian này, You và Lin đã phân lập GLPP từ
nấm Linh chi. GLPP là một phức hợp polysaccharide- protein, đã được cấu tạo từ 16
loại acid amin và 5 loại đường khác nhau (rhamnose, xylose, fructose, galactose,
glucose). Năm 2003, Sripuan T. và cộng sự đã phân lập enzyme α-glucosidase từ quả
thể nấm Linh chi. Enzyme này có khả năng thuỷ phân p–nitro-α- D-galactopyranosid,
cũng như melibiose, raffinose và stachyose [33].


19


1.2.3. Tác dụng dược lý
Từ ngày xưa, ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước
châu Á khác đã sử dụng nấm Linh chi để giúp tăng cường sức khoẻ và kéo dài
tuổi thọ của con người. Trong dược điển Trung Quốc xuất bản năm 2000 đã
công bố nấm Linh chi có tác dụng giảm căng thẳng, giảm ho và hen suyễn,
được sử dụng để điều trị chóng mặt, mất ngủ… Ngày nay nấm Linh chi còn
được biết đến với tác dụng phòng và chống ung thư, kháng khuẩn, chống nấm,
kháng virus, chống HIV, chống viêm, tăng cường khả năng miễn dịch.
Trước những lợi ích mà nấm Linh chi đem lại thì đã có rất nhiều công trình nghiên cứu
về các hoạt chất của chúng, trong đó có những nhóm hoạt chất quan trọng như: saponin

triterpenoid, polysaccharide, steroid, acid amine…. Chúng có vai trò quyết định

trong điều trị các bệnh về tim mạch, gan mật, ung thư, chống oxy hoá và
tăng khả năng miễn dịch cho cơ thể.
Phòng ngừa ung thư
Năm 2012, nghiên cứu của Teekachunhatean và các cộng sự đã chứng minh khả

năng gây độc đối với các tế bào ung thư qua các cơ chế hoạt động khác nhau như:
kích thích quá trình tự chết của tế bào hay những tác động cản trở quá trình phát sinh,
di chuyển, xâm nhập và di căn của dòng tế bào ung thư biểu mô. Vì vậy, các hoạt động
chống ung thư in vivo có thể được biểu hiện thông qua sự kết hợp giữa các triterpene
với các hợp chất có hoạt tính sinh học khác ví dụ như protein miễn dịch L.Zhi-8 [35].

Tăng cường khả năng miễn dịch
Nhiều thành phần trong nấm Linh chi đã được chứng minh có tác dụng tăng cường

sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào lyho, các bạch cầu đơn nhân. Nghiên cứu
của Wang và các cộng sự đã chứng minh polysaccharide có trong nấm Linh chi có tác
dụng làm tăng khả năng hoạt động của các tế bào lyho T và các đại thực bào, bằng
cách làm tăng hàm lượng interleukin IL-1β, TNF-α và IL-6. Đây là những yếu tố tăng tiết
interferon α và γ, do đó chúng được cho là có tác dụng trên hệ miễn dịch [12].

Khả năng kháng HIV
Năm 1998, Sahar và các cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính của nấm Linh chi.
Ban đầu nhóm nghiên cứu thử nghiệm cặn tổng methanol của nấm Linh chi với virut

20


HIV thấy có hoạt động trung bình để ức chế sự sản sinh HIV-1 gây ra trên dòng tế bào MT-4

với giá trị 31.1 μg/mL và có khả năng ức chế enzyme protease của virut HIV-PR. Sau đó
nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân lập phân đoạn đó và tiến hành thử hoạt tính với tế
bào HIV-1 và enzyme của nó HIV-PR. Nhóm nghiên cứu đã phân lập được 13 hợp chất
sạch. Các hợp chất đều là triterpnenoid và có tác dụng kháng virut HIV, trong đó có 5 hợp
chất thuộc họ acid ganoderic A, B, C1, H và α [11].

Tác dụng chống oxy hoá
Nấm Linh chi (G. lucidum) có tác dụng chống oxy hoá, kích thích hoạt động của

hệ miễn dịch, làm giảm tác dụng phụ của thuốc hoá trị liệu ung thư. Năm 2005,
Nguyễn Thượng Dong và cộng sự tiến hành nghiên cứu tác dụng của nấm Linh chi
trên chuột nhắt trắng, nhận thấy cao nước và cao ethanol 80% chiết xuất từ nấm
Linh chi có hoạt tính chống oxy hoá trên mô hình gây viêm gan cấp bằng CCl 4 [4].

Nấm Linh chi đỏ thể hiện hoạt tính khử gốc superoxyd in vitro điển
hình ở các cao chiết EtOH và MeOH, cùng cao chiết phân đoạn n-butanol và
diethyl ether. Theo nhóm nghiên cứu của Trần Thị Văn Thi, cao triterpenoid
tổng từ chiết xuất nấm Linh chi có tác dụng chống oxy hoá (ức chế 19,94 %
sự tăng hàm lượng MDA so với liều 484 mg cao/ kg thể trọng chuột) [5].

Tác dụng bảo vệ gan
Vào năm 2013, Ha và các cộng sự đã nghiên cứu cao chiết methanol và các phân

đoạn n-hexan, dichloromethane, dịch chiết methanol, cùng các hợp chất phân lập
được từ nấm Linh chi (ergosterol, ergosterol peroxyd và ganodermanontriol) có
tác dụng bảo vệ gan in vitro và vitro liên quan đến sự kích hoạt enzyme HO-1 và
các yếu tố GDT kích ứng tác dụng của protein HO-1 thông qua sự kích hoạt yếu tố
chuyển vị trong nhân tế bào Nrf-2, trong các con đường tín hiệu PI3K/Akt và p38;
làm tăng cường mức độ bảo vệ các tế bào gan chống lại t-BHP [34].

Các polisaccarit trong nấm Linh chi có tác dụng tăng tích luỹ anbumin
huyết tương, có tác dụng bảo vệ gan và phục hồi chức năng gan, đặc biệt là
điều trị viêm gan B. Acid ganoderic R và S trong hệ sợi; acid ganoderic A trong
bào tử của nấm Linh chi có tác dụng bảo vệ gan gây ra bởi galactosamin [1].

21


Tác dụng khác
- Tác dụng hạ huyết áp: Năm 1986, Morigiwa A. và cộng sự đã nghiên

cứu dịch chiết methanol từ quả thể của nấm Linh chi có tác dụng ức chế men
chuyển có liên quan trong việc kiểm soát tăng huyết áp. Một số acid ganoderic
như acid ganoderic B, D, F, H phân lập từ nấm Linh chi có tác dụng chống cao
huyết áp, trong đó acid ganoderic F có tác dụng mạnh nhất [26].
- Adenosin trong nấm Linh chi có tác dụng giảm kết tập tiểu cấu, phân giải

thrombin và ngăn ngừa huyết khối. Trong nghiên cứu của Nguyễn Thượng Dong
và cộng sự (2006) cho thấy cao EtOH nấm Linh chi ở cả 2 liều thử tương đương 10
và 20 g dược liệu/ kg chuột có tác dụng cải thiện sự suy giảm khả năng học tập,
nhận thức và sự suy giảm khả năng ghi nhớ gây ra bởi scopolamin [4].
- Tác dụng hạ đường huyết: các glycan A, B và C phân lập từ nấm

Linh chi có tác dụng hạ đường máu rõ rệt ở chuột trắng bình thường và
chuột gây đái tháo đường aloxan [2].

22


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu: Mẫu nấm Linh chi được thu hái tại vườn Quốc gia Chu
Mom Ray tỉnh Kontum.
Mẫu sau khi thu hái sẽ được làm mẫu tiêu bản và giám định tên
khoa học bởi các nhà thực vật học. Mẫu tươi được làm sạch, phơi khô
trong bóng râm, nghiền nhỏ và được bảo quản cho tới khi nghiên cứu.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản

mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F 254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck).
Phát hiện chất bằng tia tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc
dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng,
rồi sấy khô từ từ bằng máy sấy nhiệt cho đến khi hiện màu.
- Sắc ký lớp mỏng điều chế: Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên

bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng
đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun
thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, sấy nóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản
mỏng như cũ để xác định vùng chất; sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp
phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp.
- Sắc ký cột: Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha
thường và chất hấp phụ pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm
(240-430 mesh). Chất hấp phụ pha đảo là octadecylsilyl (ODS) hoặc YMC (30-50 m, Fuji
Silysia Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).

2.3. Phương pháp xác định cấu trúc
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết
hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Phổ NMR đo trên máy Bruker AM500

FT-NMR Spectrometer của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan). Các kỹ thuật
phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
23