phathienvadinhdanhvcholarae

TRƯỜNG ĐẠI HỌC
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
--------

MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH V.CHOLERAE


Thành viên nhóm:
1.Nguyễn Lê Ý Nhi
2.Trần Thị Huỳnh Như
3.Trần Thị Mỹ Nhi
4.Huỳnh Thị Bích Ngọc
5.Thạch Ngọc Thanh Nga


I.TỔNG QUAN VỀ V.CHOLERAE
II.NỘI DUNG QUI TRÌNH
III.ĐẶC ĐIỂM CỦA VIBRIO CHOLERAE TRÊN MÔI TRƯỜNG MERCK
IV.VÍ DỤ GIẢI THÍCH QUY TRÌNH
V.CÁC KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ VỆ SINH SỬ DỤNG CHỈ TIÊU TRONG BÁO CÁO Ở VIỆT
NAM
VI.SỬ DỤNG CHỈ TIÊU THEO HƯỚNG DẪN TRONG KẾ HOẠCH HACCP


I.TỔNG QUAN VỀ V.CHOLERAE
Vibro cholerae là vi sinh vật gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo hình hình dấu phẩy, di
động, sống kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H 2S.
V.Cholerae có phản ứng oxidase (+), ADH(-), LDC(+), lên men được sucrose, có thể tăng trưởng
trong môi trường có chứa 0-3% NaCl, không phát triển được trong các môi trường có chứa 6,8,10%

muối.


Click icon to add picture

Vi khuẩn V.Cholerae


1.GIỚI THIỆU ĐẶC ĐIỂM VI SINH VẬT V.CHOLERAE

Vibrio cholerae sinh độc tố ruột và nội độc tố trong đường tiêu hóa,
kích thích nghiêm trọng màng nhày tạo ra dịch dạ dày, gây tiêu chảy
nặng, mất nước, choáng, thậm chí gây tử vong với tỉ lệ lên tới 25-50%.
Biện pháp điều trị tốt nhất là bổ sung nước và chất điện giải thay thế.
Vibrio cholerae là vi khuẩn gây ra bệnh dịch tả (bệnh tả là bệnh truyền
nhiễm cấptính do phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae) gây ra, lây truyền
bằng đường tiêu hoá. Bệnh có biểu hiện lâm sàng là đi ngoài lỏng và
nôn nhiều lần, nhanh chóng dẫn đến mất nước - điện giải, suy tim
mạch và tử vong nếu không được điều trị kịp thời.


2.PHÂN LOẠI PHÂN TỬ CỦA V.CHOLERAE
HÌNH DẠNG TẾ BÀO


SỢI PILI


HÌNH DẠNG KHUẨN LẠC

SẮC TỐ


3.ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA V.CHALERAE
VÒNG ĐỜI


DINH DƯỠNG & PHÁT TRIỂN


DI TRUYỀN



GÂY BỆNH


II.NỘI DUNG QUY TRÌNH
1.PHẠM VI ÁP DỤNG
Phương pháp này được tham chiếu theo TCVN 7905-1:2008 (ISO 21872-1:2007) dùng để phát
hiện V.Cholerae trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi.
2.NGUYÊN TẮC
Phát hiện V. Cholerae trong thực phẩm được thực hiện bằng cách cân một lượng mẫu xác định và
nuôi ủ trong môi trường lỏng chọn lọc. Từ đây dịch khuẩn được cấy chuyển sang môi trường rắn
chọn lọc. Những khuẩn lạc giống V.Cholerae sẽ được thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa.


3.MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT
Môi trường và hóa chất

Mục đích

APW ( Alkaline Phosphat Water)

Tăng sinh chọn lọc

TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose)

Phân lập

NA/TSA

Phục hồi

TSI/KIA
Đĩa giấy Oxidase

Khẳng định sơ bộ

Dung dịch NaCl

KOH 3%

Thử String test để khẳng định sơ bộ

Arginine dehydrolase
Ornithine decarboxylase
Lysine decarboxy
TW( Tryptone Water)

ONPG

Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định


4.QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH V.CHOLERAE


5.CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Bước 1: Tăng sinh
0
Cân 25g mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng, thêm 225ml APW, dập mẫu 60s,ủ ở 37 C trong 6h và
16-24h.
Bước 2: Phân lập
0
Từ môi trường tăng sinh, cấy ria lên môi trường thạch TCBS, ủ ở 37 C trong 24giờ. Trên môi
trường thach TCBS khuẩn lạc V. cholerae tròn, lớn có màu vàng → khuẩn lạc có màu vàng do lên
men được sucrose sinh ra khí CO2, khi đó môi trường có tính acid ( chất chỉ thị bromthymol blue).


Bước 3: Phục hồi trên môi trường dinh dưỡng NA/TSA
Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ đĩa trên môi trường phân lập TCBS. Nếu trên một đĩa
có ít hơn 5 khuẩn lạc điển hình hoặc khuẩn lạc nghi ngờ,thì lấy tất cả các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi
ngờ đó cấy ria lên NA/TSA có bổ sung 1.5% NaCl. Ủ ở 37±1 0C trong 24 giờ.
Trường hợp 1: Từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng, nếu cho các kết quả thử nghiệm sinh hóa phù
hợp thì kết luận phát hiện.
Trường hợp 2: Nếu khuẩn lạc đầu tiên cho kết quả thử nghiệm sinh hóa không phù hợp thì tiến hành thử
bốn khuẩn lạc còn lại đã được đánh dấu, một trong bốn khuẩn lạc này cho kết quả thử nghiệm sinh hóa
phù hợp thì kết luận phát hiện và ngược lại thì kết luận không phát hiện.

Bước 4: Khẳng định sinh hóa và kháng huyết thanh
Từ các khuẩn lạc đã chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy vào các môi trường thử nghiệm sau:
Bước 4.1. Các phép thử nhận dạng giả định

Phép thử

Phản ứng tiêu biểu của
V.Cholerae

Tính di động

+

Oxidase

+


Thử nghiệm tính di động

Thử nghiệm oxidase


Bước 4.2. Thử nghiệm khẳng định
Phép thử

Phản ứng tiêu biểu của V.Cholerae

ADH

-

ODC

+

LDC

+

ONPG

+

TSI

Vàng/Vàng, không H2S và khí

Indol

+
 

Thử nghiệm khả năng chịu mặn
 
-0% NaCl
+
-2%
+

-6%
-8%
-10%
-


Thử nghiệm kháng huyết thanh
Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và 1 giọt nước muối sinh lý lên 1 vị trí khác nhau
chuyển vi khuẩn từ TSA lên 2 giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi
có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước
muối.
6. ÐỌC KẾT QUẢ
Phát hiện hoặc không phát hiện được V. cholerae trong 25 g mẫu.


III.ĐẶC ĐIỂM CỦA VIBRIO CHOLERAE TRÊN MÔI TRƯỜNG MERCK

Trên tiêu bản nhuộm Gram, phẩy khuẩn bắt màu Gram âm, đứng rải rác (nếu nhuộm từ môi trường
lỏng nuôi cấy vi khuẩn) hoặc xếp thành từng đàn cá đang bơi (nếu nhuộm từ bệnh phẩm là phân).