Thiết kế vector biểu hiện mang gen scfv kháng cd47 và biểu hiện protein trong vi khuẩn e coli​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Vân Anh

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN
scFv KHÁNG CD47 VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN
TRONG VI KHUẨN E. coli

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Vân Anh

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN
scFv KHÁNG CD47 VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN
TRONG VI KHUẨN E. coli

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS. TS Nguyễn Quang Huy
2. TS. Lã Thị Huyền

Hà Nội - 2019


LỜI CẢM ƠN
Không có sự thành công của một học viên nào mà không có sự hỗ trợ,
giúp đỡ và đóng góp của các Thầy cô. Trong suốt thời gian học tập, nghiên
cứu tại trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, em đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn
và giúp đỡ của các Thầy cô trong Trƣờng và đặc biệt là các Thầy cô trong
Khoa Sau đại học.
Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.
TS Nguyễn Quang Huy – Trƣởng khoa Hoá sinh Trƣờng Đại học Khoa học
Tự Nhiên Hà Nội, TS. Lã Thị Huyền – Phòng công nghệ động vật viện hàn
lâm khoa học công nghệ Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn và dìu dắt em trong
suốt thời gian em học tập và hoàn thành luận văn.
Tiếp theo, em xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô của
Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy và tạo
điều kiện giúp đỡ để em có thể hoàn thành luận văn.
Em cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các GS, TS, cán bộ nghiên cứu
của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, luôn
tận tình sát sao chỉ bảo, chia sẻ những kinh nghiệm và cho em những lời
khuyên quý báu trong công việc cung nhƣ cuộc sống.
Và cuối cùng, bằng tình cảm chân thành và yêu mến em xin đƣợc gửi
lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và ngƣời thân, những ngƣời luôn ủng hộ, động
viên và tạo cho em những điều kiện tốt nhất về tinh thần cũng nhƣ vật chất
trong suốt thời gian học tập và thực tập.
Hà Nội, ngày
tháng năm 2019
Học viên

Nguyễn Thị Vân Anh


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN...........................................................................................................1
MỞ ĐẦU...................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................3
1.1. Tổng quan về bệnh ung thƣ............................................................................3
1.1.1. Ung thư.................................................................................................3
1.1.2. Ảnh hưởng của bệnh ung thư................................................................5
1.1.3. Nguyên nhân gây ung thư.....................................................................5
1.2. Protein kháng nguyên CD47 và kháng thể kháng CD47...............................7
1.2.1. Protein kháng nguyên CD47- đích trong điều trị ung thư.....................7
1.3.3. Các thành tựu sử dụng kháng thể kháng CD47 trong điều trị ung thư............9
1.3. Kháng thể và kháng thể đơn chuỗi ứng dụng trong điều trị bệnh ung thƣ
................................................................................................................................. 10
1.4. Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv).......................................................... 11
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................... 13
2.1. Vật liệu............................................................................................................. 13
2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm....................................................................... 13
2.2. Thiết bị............................................................................................................. 13
2.3.1. Nhân gen mã hóa scFv kháng CD47 bằng phản ứng PCR.................14
2.3.2. Điện di trên gel agarose..................................................................... 14
2.3.5. Gắn nối sản phẩm PCR vào vector pET22b+..................................... 16
2.3.6. Biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng
phương pháp sốc nhiệt.................................................................................. 16
2.3.7. Tách plasmid từ vi khuẩn E.coli theo phương pháp mini-prep của
Sambrook...................................................................................................... 17
2.3.8. Chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang gen antiHer2 bằng phương

pháp PCR..................................................................................................... 17
2.3.9. Quy trình biểu hiện kháng thể kháng CD47 ở hệ thống biểu hiện
E.coli............................................................................................................ 18


2.3.10. Quy trình điện di protein SDS-PAGE................................................ 18
2.3.11. Tinh sạch kháng thể anti-CD47 tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký
ái lực với Ni-NTA resin................................................................................. 19
2.3.12. Nuôi cấy dòng tế bào Jurkat............................................................. 19
2.3.13. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang............................................... 20
3.1. Kết quả nhân gen mã hóa kháng thể kháng CD47....................................... 22
3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện tái tổ hợp pET22b+ mang gen anti-CD47
................................................................................................................................. 22
3.2.1. Cắt vector pET22b+ và sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn.....22
3.2.2. Kết quả gắn tạo thành công vector tái tổ hợp mang gen anti-CD47...23
3.3. Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng thể kháng CD47 ở hệ thống biểu hiện
E. coli...................................................................................................................... 28
3.4. Kết quả tinh sạch kháng thể anti-CD47........................................................ 29
3.5. Xác định khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể anti-CD47 với kháng
nguyên CD47.......................................................................................................... 30
KẾT LUẬN............................................................................................................. 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 34


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Liệu pháp nhắm đích CD47/SIRPα...........................................................9
Bảng 1.2. Các kháng thể nhắm đích CD47/SIRPα................................................... 10

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Bản đồ ung thƣ thế giới.............................................................................3
Hình 1.2. Bản đồ ung thƣ tại Việt Nam.....................................................................4
Hình 1.3: Đột biến bất hoạt gen ức chế khối u gây ung thƣ......................................6
Hình 1.5: Mô hình cấu trúc thụ thể CD47.................................................................7
Hình 1.6. Các cơ chế nhắm trúng đích con đƣờng CD47- SIRPα trong ung thƣ .....8
Hình 3.1. Kết quả nhân gen anti-CD47 bằng phản ứng PCR................................... 22
Hình 3.2. Cắt vector pET22b+ bằng enzyme cắt giới hạn....................................... 23
Hình 3.3. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối gen giữa sản phẩm PCR (khuếch đại
gen antiCD47)......................................................................................................... 24
Hình 3.4. Kiểm tra sơ bộ các dòng plasmid tái tổ hợp mang gen anti-CD47...........25
Hình 3.5. Kiểm tra các dòng plasmid mang gen anti-CD47.................................... 26
Hình 3.7. Kiểm tra sự biểu hiện của kháng thể kháng CD47 ở tế bào vi khuẩn E.coli 28

Hình 3.8. Kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể anti-CD47...................................... 30
Hình 3.9. Khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể anti-CD47 với kháng nguyên
CD47 biểu hiện trên bề mặt tế bào Jurkat................................................................ 31


DANH SÁCH C

Amp

Am

AML

Tế

Bp

Ba

CD47

Cl

DNA

De

E. coli

Es

EDTA

Eth

EtBr

Eth

HEK

Tế

HSC

Tế

IPTG

Iso

MCS

Mu

LB

Lu

LSC

Tế

NHL

No

OKT3

Or

PEG

Po

RNA

Ri

V/p

Vò

Fc

Kh

SIRPα

Sig

ScFv

Mả

Fab

Fra


MỞ ĐẦU
CD47 là glycoprotein chuyển màng thuộc siêu họ globulin miễn dịch. CD47 có khối
lƣợng phân tử 50 kDa bao gồm vùng IgV ngoại bào chứa đầu N, 5 vùng chuyển
màng và đuôi nội bào ngắn chứa đầu C. CD47 liên kết đặc hiệu với một số protein
bao gồm integrins, thrombospondin-1, và liên quan đến các quá trình sinh lý tế bào
nhƣ di chú tế bào, hoạt hóa tế bào T và tế bào tua, và sự phát triển của sợi trục thần

kinh [16]. Ngoài ra, CD47 còn là phối tử đặc hiệu của SIRPα . Protein này biểu hiện
trên bề mặt của các tế bào đại thực bào. Tƣơng tác CD47-SIRPα ức chế quá trình
thực bào bởi đại thực bào và tế bào tua [44].
CD47 đƣợc xác định là kháng nguyên ung thƣ buồng trứng ngƣời lần đầu tiên
vào những năm 1980 [17]. Sau đó, CD47 đƣợc xác định biểu hiện ở nhiều loại khối u
ngƣời bao gồm AML, CML [11], ALL [7], bạch cầu không liêu quan đến lympho bào
NHL [8], đa uy tủy [21], ung thƣ bàng quang [32] và các khối u rắn khác [11]. Điều
đặc biệt là, CD47 biểu hiện yếu ở các tế bào bình thƣờng và biểu hiện mạnh ở các tế
bào khối u. Xác định mức độ biểu hiện CD47 ở hai mẫu tế bào HSC và tế bào LSC
bằng phƣơng pháp flow cytometry cho thấy mật độ kháng nguyên CD47 ở tế bào LSC
cao hơn ở tế bào HSC [10; 7]. Định lƣợng CD47 mRNA trong mẫu máu ngoại vi của
một nhóm gồm 132 bệnh nhân AML bằng phƣơng pháp real-time PCR cho thấy hàm
lƣợng CD47 mRNA của bệnh nhân AML cao hơn so với nhóm chứng [40]. Các kết quả
đã công bố cho thấy CD47 không những là marker hữu dụng để nhận dạng LSC, AML
và một số tế bào khối u khác mà còn là đích để phát triển các loại thuốc đặc hiệu và liệu
pháp miễn dịch tiêu diệt tế bào ung thƣ biểu hiện kháng nguyên CD47.

Ung thƣ máu cấp tính có tốc độ phát triển rất nhanh ở tủy xƣơng cùng với sự
biểu hiện của một số kháng nguyên bề mặt bao gồm CD19, CD22, CD33, CD123,
và CD47. Trong đó, CD47 biểu hiện mạnh ở cả tế bào ung thƣ máu và tế bào gốc
ung thƣ máu. Tế bào gốc ung thƣ máu là một trong những nhân tố tiềm tàng khiến
cho bệnh ung thƣ máu dai dẳng, khó điều trị dứt điểm và dễ tái phát. Do đó, CD47

1


là một trong các đích để tấn công nhằm tiêu diệt tận gốc bệnh ung thƣ bạch cầu cấp
tính.
Mảnh kháng thể scFv là một trong những định dạng phổ biến nhất của mảnh
kháng thể tái tổ hợp. Mặc dù chúng là những đại diện khá nhỏ của dạng kháng thể

tái tổ hợp (26-28 kDa) nhƣng chúng cung cấp đầy đủ các đặc tính của kháng thể và
vị trí gắn kết kháng nguyên không bị thay đổi. So với các kháng thể đầy đủ chúng ít
phức tạp hơn, bao gồm chỉ các miền biến đổi của chuỗi nặng kháng thể (VH) và
vùng biến đổi của chuỗi nhẹ kháng thể (VL), các VH và VL đƣợc liên kết bởi một
polypeptide linh hoạt.
Với sự ra đời của công nghệ DNA tái tổ hợp từ những năm 1970, protein bắt
đầu đƣợc biểu hiện nhiều ở dạng tái tổ hợp trong các tế bào vi sinh vật một cách
nhanh hơn và thuận tiện hơn so với nguồn tự nhiên. Trong những năm gần đây, kỹ
thuật sản xuất protein tái tổ hợp trong các hệ thống sinh học ngày càng đƣợc ứng
dụng rộng rãi. Trong đó, các ―nhà máy‖ vi khuẩn đƣợc lựa chọn sử dụng nhiều do
các ƣu điểm nhƣ chi phí thấp, sinh khối lớn và tốc độ sản xuất nhanh. Chủng biểu
hiện Escherichia coli là chủng đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu cũng
nhƣ trong sản xuất protein tái tổ hợp.
Do đó, tác giả lựa chọn đề tài: ―Thiết kế vector biểu hiện mang gen scFv
kháng CD47 và biểu hiện protein trong vi khuẩn E.coli‖ với mục tiêu: Thiết kế thành
công vector biểu hiện mang gen scFv đặc hiệu CD47 và biểu hiện đƣợc protein
trong vi khuẩn E.coli.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về bệnh ung thƣ
1.1.1. Ung thƣ
Ung thƣ là một thuật ngữ trong y học để chỉ khối u ác tính. Đây là một loại
bệnh mà một nhóm tế bào biểu thị sự tăng sinh không kiểm soát (các tế bào có sự phân
chia vƣợt quá giới hạn bình thƣờng), sau đó xâm nhập và tiêu diệt các mô liền kề nó,
đôi khi tế bào di căn (xâm nhập vào các vùng khác trên cơ thể theo đƣờng bạch huyết
hoặc máu) [1; 2]. Có khoảng 200 loại bệnh ung thƣ đã đƣợc khoa học tìm ra.

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 2018 công bố tình hình ung thƣ hiệu
chỉnh theo độ tuổi tại 185 quốc gia và vùng lãnh thổ.

Hình 1.1. Bản đồ ung thƣ thế giới [18]

Trong đó, 10 quốc gia có tỉ lệ ung thƣ cao nhất đều là những nƣớc phát triển:
Úc đứng số 1 với tỉ lệ mắc ung thƣ cả 2 giới ở mức 468/100.000 dân; New Zealand
(438); Ireland (373); Hungary (368); Mỹ đứng thứ 5 với tỉ lệ 352, kế đó là Bỉ, Pháp,
Đan Mạch, Na Uy, Hà Lan...
Trong khu vực Đông Nam Á, Singapore có tỉ lệ mắc ung thƣ cao nhất, kế đó
là Philippines (163, vị trí 89 thế giới); Thái Lan vị trí 92 thế giới (152); thứ 4 khu
vực là Lào (154, vị trí 97 thế giới).
Việt Nam xếp vị trí 99/185 quốc gia và vùng lãnh thổ với tỉ lệ mắc ung thƣ
151,4/100.000 dân, xếp 19 châu Á và thứ 5 tại khu vực Đông Nam Á. Vào năm
2015, Việt Nam xếp vị trí 107 và thời điểm 2013 xếp ở vị trí 108.

3


Theo thống kê của WHO, số ca mắc mới ung thƣ tại Việt Nam không ngừng
tăng, từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 năm 2010. Năm 2018, số ca mắc mới tăng
lên gần 165.000 ca/96,5 triệu dân, trong đó gần 70% trƣờng hợp tử vong, tƣơng
đƣơng 115.000 ca.
Nhìn tổng quan trên bản đồ ung thƣ thế giới, tỉ lệ mắc của Việt Nam không
cao, tuy nhiên tỉ lệ tử vong tƣơng đối lớn, xếp vị 56/185 quốc gia và vùng lãnh thổ
với tỉ lệ 104,4/100.000 dân. Vào năm 2016, tỉ lệ tử vong của Việt Nam ở mức
110/100.000 dân.

Hình 1.2. Bản đồ ung thƣ tại Việt Nam [18]

Tính chung cả 2 giới, 5 loại ung thƣ có tỉ lệ mắc nhiều nhất tại Việt Nam
gồm: Ung thƣ gan, hơn 25.000 ca (15,4%), kế đó là ung thƣ phổi (14,4%), ung thƣ
dạ dày (10,6%), ung thƣ vú, ung thƣ đại tràng.
5 loại ung thƣ phổ biến nhất ở nam giới Việt gồm: Ung thƣ phổi (21,5%),

ung thƣ gan (18,4%), ung thƣ dạ dày, ung thƣ đại tràng; ung thƣ hầu họng. Ở nữ
giới, hàng đầu vẫn là ung thƣ vú, ung thƣ đại tràng, ung thƣ phổi, ung thƣ gan.
Tổ chức sáng kiến toàn cầu về ung thƣ (GICR, thuộc WHO) cho biết, các số
liệu có đƣợc dựa trên những nguồn tốt nhất đƣợc cung cấp tại mỗi nƣớc.

4


WHO cho biết, ung thƣ đang là một trong những thách thức sức khoẻ cộng
đồng quan trọng nhất của thế kỷ 21. Khoảng 40% trƣờng hợp ung thƣ có thể đƣợc
ngăn ngừa bằng cách giảm tiếp xúc với các yếu tố nguy cơ bao gồm chế độ ăn uống,
dinh dƣỡng, hoạt động thể chất.
1.1.2. Ảnh hƣởng của bệnh ung thƣ
Bệnh ung thƣ gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến đời sống và kinh tế ở mỗi
quốc gia. Không những dẫn đầu về nguyên nhân gây tử vong trên thế giới, bệnh ung
thƣ vẫn là một căn bệnh mà cho đến nay vẫn chƣa có biện pháp điều trị triệt để.
Đối với một nƣớc phát triển nhƣ Mỹ, mỗi năm có khoảng 0,5% dân số đƣợc chẩn
đoán ung thƣ. Hiện nay, vẫn đang còn rất nhiều ngƣời phải sống và chống chọi với
căn bệnh này với chi phí điều trị rất lớn. Các nhà khoa học, bác sĩ trên toàn thế giới
đang nỗ lực không ngừng để tìm ra các biện pháp phát hiện sớm, phòng ngừa và
chữa trị ung thƣ. Đây là một vấn đề rất quan trọng đối với mỗi quốc gia và thế giới,
đòi hỏi tập trung nguồn nhân lực trình độ cao và tài chính lớn.
1.1.3. Nguyên nhân gây ung thƣ
Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thƣ. Các nhà khoa học xác định
rằng các dạng ung thƣ đều có nguyên nhân từ những bất thƣờng trong gen của các

tế bào bị biến đổi. Sự bất thƣờng này do ảnh hƣởng của các chất sinh ung thƣ nhƣ
khói thuốc lá, chất phóng xạ, chất hóa học,… Một số nguyên nhân ung thƣ khác có
thể là do sai sót mang tính di truyền trong quá trình tự sao của ADN, do đó tất cả
các tế bào đều tăng sinh bất thƣờng. Sự di truyền của ung thƣ đƣợc xác định do
ảnh hƣởng của các yếu tố gây ung thƣ và hệ gen chủ. Một số yếu tố di truyền khác
ảnh hƣởng đến ung thƣ là sự methyl hóa ADN và ARNs micro [1;2;4].
Bình thƣờng sự cân bằng giữa tốc độ của quá trình sinh sản và quá trình chết
của tế bào đƣợc điều hòa để đảm bảo tính toàn vẹn của cơ quan và mô. Tuy nhiên
khi các gen đột biến gây ung thƣ trong tế bào đƣợc hoạt hóa thì tế bào tránh đƣợc
sự chết theo chƣơng trình (apoptosis) và phân chia không kiểm soát, có khả năng
hình thành các khối u lành hoặc ác tính (ung thƣ) [4].

5


Hai yếu tố quan trọng trong hệ gen dẫn đến ung thƣ là sự tích lũy các đột
biến soma và tăng cƣờng tính bất ổn di truyền.
Số lƣợng đột biến ở tế bào ung thƣ nhiều hơn tế bào bình thƣờng. Khi các
đột biến diễn ra ở các gen sửa chữa ADN, các gen ức chế khối u hay đột biến gen
tiền ung thƣ thành gen ung thƣ đƣợc kết hợp với nhau thì gây ra sự tăng sinh một
cách không kiểm soát của các tế bào [2; 4].

Hình 1.3: Đột biến bất hoạt gen ức chế khối u gây ung thƣ [3]

Sự có mặt của các đột biến khác nhau dẫn đến nguy cơ chọn lọc không mong
muốn trong quần thể tế bào. Trong trƣờng hợp ung thƣ, tế bào nào mang đột biến
tăng cƣờng sinh trƣởng sẽ có ƣu thế đƣợc chọn lọc [2; 4].

6

1.2. Protein kháng nguyên CD47 và kháng thể kháng CD47
1.2.1. Protein kháng nguyên CD47- đích trong điều trị ung thư

Hình 1.5: Mô hình cấu trúc thụ thể CD47 [16]

Gần đây, protein bề mặt tế bào CD47 đã đƣợc phát hiện biểu hiện quá mức ở
nhiều loại tế bào ung thƣ khác nhau[43]. Biểu hiện CD47 tăng cao trong 57 trên 115
(49,5%) mẫu ung thƣ dạ dày giai đoạn đầu (T1b). Hơn nữa, họ phát hiện ra rằng tỷ
lệ sống sót sau 5 năm đối với các trƣờng hợp dƣơng tính với CD47 thấp hơn đáng
kể so với các trƣờng hợp âm tính với CD47 (54,8 so với 79,9%; p = 0,0067), cho
thấy sự biểu hiện quá mức của CD47 có thể là một yếu tố tiên lƣợng xấu độc lập
cho ung thƣ dạ dày. Tƣơng tự, một nghiên cứu gần đây [44] tiết lộ rằng CD47
thƣờng đƣợc biểu hiện quá mức trong khối u của bệnh nhân ung thƣ buồng trứng
và có liên quan đến các đặc điểm lâm sàng bất lợi và tiên lƣợng xấu. Các bệnh ung
thƣ khác ở ngƣời cũng đã đƣợc báo cáo, một số trong đó bao gồm ung thƣ bạch
cầu tủy cấp tính, ung thƣ hạch không Hodgkin (NHL), ung thƣ dạ dày, ung thƣ
gan, ung thƣ phổi tế bào nhỏ và ung thƣ vú [17]. Trong hầu hết các trƣờng hợp,
biểu hiện CD47 cao có liên quan đến di căn xa và tiên lƣợng xấu, cho thấy rằng liệu
pháp chống CD47 là một chiến lƣợc đầy hứa hẹn để chống ung thƣ.
Điều hòa tăng biểu hiện CD47 là một cơ chế đặc biệt quan trọng đƣợc các tế
bào gốc ung thƣ sử dụng để vƣợt qua hệ thống miễn dịch, điều này dẫn tới sự tái
phát của bệnh ung thƣ [6]. Các nghiên cứu trƣớc đây cho thấy sự gia tăng biểu hiện
protein CD47 trên các tế bào tạo máu ở ngƣời, đặc biệt là trong bệnh ung thƣ bạch

7


cầu tủy bào cấp tính (AML) và trong bệnh bạch cầu tủy mãn tính, các tế bào chống
lại quá trình thực bào thông qua tƣơng tác CD47-Sirpα [7; 9].

1.2.2. Kháng thể kháng CD47 và liệu pháp điều trị đích CD47 trong điều trị ung thư

Nhiều hƣớng nghiên cứu đã đƣợc xây dựng nhằm vô hiệu hóa tƣơng tác
CD47-SIRPα theo các cơ chế khác nhau [37]. Cơ chế thứ nhất, kháng thể kháng
CD47 có thể khóa tƣơng tác giữa CD47 trên tế bào khối u và SIRPα trên các tế bào
thực bào cho phép quá trình thực bào diễn ra.
Cơ chế thứ hai, kháng thể kháng CD47 có thể loại bỏ các khối u thông qua
cơ chế phụ thuộc vào Fc bao gồm gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể và gây độc tề
bào phụ thuộc bổ thể.Một kháng thể kháng CD47 đã đƣợc chứng minh có tác dụng
kích thích gây độc tế bào qua trung gian NK để kháng lại dòng tế bào ung thƣ ở
ngƣời [39]. Cơ chế thứ ba, kháng thể kháng CD47 loại bỏ khối u bằng cách kích
hoạt trực tiếp quá trình apoptosis.Kết quả của một số nghiên cứu đã công bố cho
thấy, một vài kháng thể kháng CD47 kích thích các tế bào ung thƣ chết theo
chƣơng trình thông qua cơ chế không phụ thuộc caspase [38; 41; 24; 42]. Cơ chế
thứ tƣ , kháng thể kháng CD47 có khả năng bất hoạt tƣơng tác CD47-SIRPα dẫn
đến tế bào tua có khả năng tóm bắt khối u và trình diện kháng nguyên cho tế bào TCD4 và T-CD8, kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch kháng lại khối u [15].

Hình 1.6. Các cơ chế nhắm trúng đích con đƣờng CD47- SIRPα trong ung thƣ [10].

8


1.3.3. Các thành tựu sử dụng kháng thể kháng CD47 trong điều trị ung thư
Hiện nay, một số các liệu pháp nhắm đích CD47/ SIRPα đang đƣợc nghiên
cứu thử nghiệm lâm sàng và tiền lâm sàng, bao gồm các kháng thể thông thƣờng,
polypeptide tái tổ hợp và các phân tử bispecific (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Liệu pháp nhắm đích CD47/SIRPa [8,9,35]
Điều trị nhắm mục tiêu CD47/ SIRPα theo phát triển lâm sàng
Công ty
Forty Seven Inc

Hu5F9-G4

Giai đoạn 1

Kháng thể kháng CD47
đƣợc nhân hóa, phân lớp
IgG4 của ngƣời
Kháng thể kháng CD47

Celgen

đƣợc nhân hóa
Protein SIRPα-Fc, phân

Trillium

lớp IgG1 của ngƣời
Biến thể SIRPα có ái lực

Therapeutics Inc

cao
Kháng thể lƣỡng tính

Alexo Therapeutics

kháng đầy đủ
CD47/CD19 Kháng thể

Novimmune

đầy đủ kháng CD47/
Tioma Therapeutics

mesothelin Kháng thể

Surface Oncology

kháng CD47 Kháng thể
kháng CD47 đầy đủ
Kháng thể kháng SIRPα

OSE
Immunotherapeutics

9


Các kháng thể kháng CD47 là các liệu pháp đặc hiệu tốt nhất nhắm tới phức
hệ CD47/ SIRPα. Chúng đã đƣợc chứng minh hiệu quả in vitro và in vivo và các
kháng thể kháng CD47 đã đƣợc thử nghiệm chống lại nhiều khối u máu ác tính và
bệnh lý khối u rắn, và chúng đã bắt đầu đƣợc thử nghiệm lâm sàng (Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Các kháng thể nhắm đích CD47/SIRPa [8,9,35]
Thử nghiệm lâm sàng trị liệu nhắm mục tiêu CD47/SIRPa
Ngày bắt đầu
8/2014
3/2015
11/2015
01/2016

03/2016

09/2016
11/2016
11/2016
02/2017

Hiện nay các nghiên cứu về kháng thể kháng CD47 vẫn đang phát triển trên
thế giới.
1.3. Kháng thể và kháng thể đơn chuỗi ứng dụng trong điều trị bệnh ung thƣ
Kể từ khi cấp phép cho liệu pháp kháng thể đơn dòng (mAb) đầu tiên OKT3 vào
năm 1986, tính đặc hiệu, tính linh hoạt và tính đa dạng của kháng thể và dẫn xuất
kháng thể đã trở thành nhóm dƣợc phẩm sinh học lớn nhất [27]. Kháng thể đơn dòng
có tiền sử sử dụng an toàn, cơ sở khoa học rõ ràng. Tính đến tháng 10 năm 2018, hơn
80 kháng thể đã đƣợc EMA/FDA đƣa ra thị trƣờng hoặc phê duyệt cho nhiều chỉ định
bệnh bao gồm ung thƣ, viêm/tự miễn dịch, cấy ghép, bệnh truyền nhiễm và tim mạch,
huyết học, dị ứng và nhãn khoa. Hơn 500 sản phẩm, bao gồm các sản phẩm thế hệ 2

10


và các định dạng kháng thể mới, hiện đang đƣợc thử nghiệm lâm sàng trên toàn thế
giới [27; 28; 29].
Dựa trên bản chất mô hình tự nhiên của kháng thể, cả về cấu trúc và chức
năng, cho phép tạo ra các mảnh liên kết kháng nguyên nhỏ hơn, chẳng hạn nhƣ
mảnh Fab, mảnh đơn chuỗi (scFv), kháng thể đơn miền và mảnh kết tinh (Fc), thông
qua tách dòng phân tử, kỹ thuật kháng thể và thậm chí các phƣơng pháp enzyme.
Các mảnh kháng thể sau đó có thể đƣợc sử dụng một mình hoặc liên kết với các
phân tử hoặc mảnh khác để tạo ra các phân tử lƣỡng tính, đa đặc hiệu, đa liên kết
hoặc đa chức năng để đạt đƣợc nhiều hiệu ứng sinh học [4].

Các mảnh kháng thể có thể cung cấp một số lợi thế so với việc sử dụng các
kháng thể thông thƣờng.
1.4. Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv)
Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv) tạo ra một protein đơn chuỗi có ái lực với
kháng nguyên tƣơng đƣơng với kháng thể gốc. Trình tự và độ dài peptide liên kết
có thể khác nhau giữa các scFv để tối ƣu ái lực đối với kháng nguyên và tăng sự
bền nhiệt. Chiều dài của peptide liên kết có thể tạo ra khoảng cách ~ 3,5nm giữa VL
và VH mà không làm gián đoạn sự hình thành vị trí liên kết kháng nguyên [34].

Hình 1.5. Cấu trúc của scFv
ScFv có một số lợi thế so với mAb thông thƣờng. Đầu tiên, kích thƣớc nhỏ lý
tƣởng cho sản xuất quy mô lớn trong các hệ thống vi sinh vật [35]. Ngoài ra, vì các
chuỗi mã hóa VL và VH đƣợc mã hóa trên cùng 1 gen, không cần phải cân bằng

11


vùng hằng định chuỗi nhẹ (CL) và chuỗi nặng (CH). Điều này cho phép các mảnh
đƣợc sản xuất nhanh hơn, với năng suất cao hơn và với chi phí thấp hơn so với
mAbs kích thƣớc đầy đủ, thƣờng yêu cầu hệ thống biểu hiện động vật có vú [36].
Kích thƣớc nhỏ cũng tạo điều kiện cho sự xâm nhập của mô và gắn kết với các
epitopes, đặc biệt hữu ích cho sự thâm nhập khối u trong liệu pháp miễn dịch ung
thƣ [37; 38]. Việc thiếu vùng Fc sẽ loại bỏ nguy cơ kích hoạt tế bào miễn dịch và
các kháng thể nhƣ gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC), thực bào tế bào
phụ thuộc kháng thể (ADCP), hoặc gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (CDC) [32].

12


CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu
2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm
 Gen mã hóa kháng thể kháng CD47 (anti-CD47) do phòng CNTBĐV
cung cấp.
 Cặp mồi LH47F/LH47R và T7promoter/T7terminator đƣợc tổng hợp bởi
công ty IDT (Mỹ).

Cặp mồi

T7p

 Các chủng vi khuẩn E.coli DH5α, BL21(DE3)
 Vector biểu hiện: pET22b+
 Enzyme cắt giới hạn gồm BamHI và XhoI, enzyme gắn nối T4 ligase
(BioLabs)
 Hóa chất: Cao nấm men (Yeast extraction), Tryptone, Agar, NaCl, Trisbase, Tris-HCl, EDTA, SDS, EtBr, Agarose, Polyarylamide, Bis-acrylamide, IPTG,
X-gal, và các hóa chất khác do hãng Merck cung cấp.
 Kháng sinh và môi trƣờng nuôi cấy: Ampicilin, Penicilin-Streptomycin,
RPMI 1640 (Thermofisher), FBS, môi trƣờng LB lỏng, LB đặc.
 Dung dịch: các dung dịch đệm TAE, SDS-PAGE running buffer, PBS, và
các dung dịch (dung dịch I, dung dịch II, dung dịch III) với các thành phần chi tiết

đƣợc trình bày trong bảng phụ lục 2.
2.2. Thiết bị
Máy PCR, máy chạy điện di, máy li tâm lạnh, máy lắc ổn nhiệt, bể ổn nhiệt,
o

lò vi sóng, tủ lạnh sâu(-80 C), máy vortex, máy đo pH, tủ cấy vô trùng, Pipetman

13

các loại (Gilson, Pháp), máy soi chụp gel, kính hiển vi điện tử và các trang thiết bị
khác của phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công Nghệ Sinh Học ,
Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Nhân gen mã hóa scFv kháng CD47 bằng phản ứng PCR
Đoạn gen mã hóa mảnh kháng thể scFv kháng CD47 đƣợc khuếch đại bằng
phản ứng PCR với cặp mồi LH47F/LH47R. Thành phần phản ứng gồm 12.5 μL
GoTaq master mix, 1 μL primer LH47F 10pM, 1 μL primer LH47R 10pM, 2 μL
o

khuôn, 8.5 μL H2O. Chu kỳ nhiệt của phản ứng: bƣớc 1: biến tính 94 C trong 3
o

o

phút; bƣớc 2: chu trình lặp lại 30 chu kỳ (94 C trong 45 giây, 52 C trong 45 giây,
o

o

72 C trong 1 phút 20 giây); bƣớc 3: hoàn thiện sản phẩm ở 72 C trong 8 phút;
o

bƣớc 4: làm mát sản phẩm PCR ở 10 C trong 30 phút.
2.3.2. Điện di trên gel agarose
 Chuẩn bị gel agarose 0,8% : cân 0,8g agarose cho vào 100 ml dung dịch
TAE 1X, đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội xuống khoảng
o

50 C rồi rót dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lƣợc. Sau khoảng
30 phút khi gel đã đông, gỡ lƣợc ra, đặt bản gel vào bể điện di. Rót đệm TAE 1X

vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel 5mm.
 Tra mẫu DNA : Lấy mẫu DNA trộn với loading dye 6X rồi tra vào các
giếng trên bản gel.
 Chạy điện di ở điện thế 95-100V, trong thời gian khoảng 25-30 phút. DNA
di chuyển từ cực âm đến cực dƣơng. Quan sát sự di chuyển màu bromophenol

blue để biết khi nào cần dừng điện di.
 Soi gel: Bản gel đƣợc lấy nhẹ ra khỏi khay và ngâm vào dung dịch EtBr
nồng độ 2 µg/ml trong khoảng 5 phút rồi rửa lại bằng nƣớc. Hiển thị kích thƣớc

DNA dƣới ánh sáng đèn cực tím (UV) của máy soi gel. Ƣớc tính kích thƣớc của
DNA bằng cách đối chiếu với thang DNA chuẩn.

14


2.3.3. Cắt vector và sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn
Sản phẩm PCR nhân gen anti-CD47 với cặp mồi LH47F/LH47R và vector
pET22b+ đƣợc cắt đồng thời bằng hai enzyme cắt giới hạn BamHI và XhoI.
Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR gồm 20 μL sản phẩm PCR, 3 μL
BamHI, 3 μL XhoI, 5 μL Buffer, 19 μL H2O.
Thành phần phản ứng cắt vector pET22b+ gồm 15 μL vector, 3 μL BamHI, 3
μL XhoI, 5 μL Buffer, 24 μL H2O.
o

Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37 C, qua đêm.

2.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và vector pET22b+ sau phản ứng cắt bằng kit
tinh sạch
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bột kit GeneJET PCR purification
(Fermentas). Các bƣớc tinh sạch đƣợc thực hiện theo chỉ dẫn kit:
 Bổ sung dung dịch binding buffer với thể tích bằng thể tích của mẫu cần
tinh sạch, trộn đều.
 Chuyển toàn bộ hỗn hợp ở trên lên cột tinh sạch. Ly tâm cột 12 000 v/ph
trong 1 phút, loại dịch qua cột.
 Bổ sung 700 μL dung dịch washing buffer lên cột. Ly tâm cột 12 000 v/ph
trong 1 phút, loại dịch qua cột.
 Ly tâm cột 12 000 v/ph, 1 phút để loại hoàn toàn dịch, bỏ dịch qua cột.
 Chuyển cột sang ống eppendorf mới. Bổ sung 45 µL H2O lên cột, để cột ở

nhiệt độ phòng khoảng 1-3 phút.
 Ly tâm cột 12 000 v/ph, 1 phút để thu sản phẩm tinh sạch qua cột.
Chúng tôi tiến hành nuôi chủng E.coli BL21 tái tổ hợp trong 50 mL môi trƣờng LB
o

có bổ sung Ampicilin 1000 µg/mL và cảm ứng IPTG 5 mM 3 h ở 37 C, tốc độ lắc
200 vòng/phút. Ly tâm loại dịch môi trƣờng nuôi cấy để thu sinh khối tế bào. Đồng

hóa tế bào trong dung dịch Guanidinium Lysis Buffer (Guanidine HCl 6M, sodium
phosphate 20 mM, pH 7.8, NaCl 500 mM), sau đó siêu âm, phá vỡ tế bào và ly têm
thu dịch nổi cho quá trình tinh sạch. Do kháng thể anti-CD47 tái tổ hợp có 6
2+

Histidine ở đầu C nên có ái lực cao với Ni , vì vậy chúng tôi tinh sạch kháng thể

15

này bằng phƣơng pháp sắc ký ái lực với Ni-NTA resin. Trong quá trình tinh sạch,
Imidazole đƣợc sử dụng nhƣ chất cạnh tranh Ni

2+

2+

trong phức hợp Ni - histidine.

Các protein lẫn trong dịch chiết kháng thể tái tổ hợp đƣợc loại bỏ khỏi kháng thể tái
tổ hợp ở nồng độ Imidazole 50 mM. Sau đó kháng thể tái tổ hợp đƣợc đẩy ra khỏi
cột nhờ buffer đẩy (Native Elution Buffer), chúng tôi thu 2 phân đoạn với thể tích 1
mL/phân đoạn ở nồng độ Imidazol 250 mM
2.3.5. Gắn nối sản phẩm PCR vào vector pET22b+
Thể tích phản ứng gắn nối 10 μL gồm 3 μL sản phẩm PCR, 2 μL vector
o

pET22b+, 1 μL buffer, 1 μL T4 ligase, 3 μL H2O. Ủ phản ứng ở 16 C qua đêm. Sau
đó, sản phẩm ghép nối gen đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
2.3.6. Biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng
phƣơng pháp sốc nhiệt
Chuẩn bị tế bào khả biến
o
 Lấy chủng tế bào đƣợc cất ở - 20 C, cấy vạch tế bào trên đĩa môi trƣờng
 Nhặt một khuẩn lạc nuôi cấy trong 2ml môi trƣờng LB lỏng, nuôi lắc ở
o

37 C qua đêm.
 Cấy chuyển 1% dịch nuôi tế bào qua đêm sang môi trƣờng LB mới. Nuôi

o

lắc ở 37 C đến khi OD600 đạt 0.5-0.7.
 Chuyển dịch tế bào sang ống eppendorf vô trùng, để trên đá 10 phút.
o

 Ly tâm thu tế bào ở 4 C, 4000 v/ph, 5 phút.
 Loại dịch nổi, hòa tan cặn tế bào trong 300 µl CaCl2 0.1M, đặt trong đá
10 phút.
o

 Ly tâm ở 4 C , 4000 v/ph, 5 phút, loại dịch.
 Hòa tan tủa trong 100 µl (CaCl2 0.1 M , glycerol 30%), giữ ở
-80oC. Biến nạp
o
 Lấy tế bào khả biến giữ trong tủ -80 C ra, đặt trên đá khoảng 30 phút.
 Bổ sung dung dịch sau phản ứng gắn vào ống eppendorf chứa bào khả

biến, đặt trong đá 30 phút.

16


o

 Sốc nhiệt ở 42 C trong 90 giây, sau đó đặt ngay ống tế bào vào đá để trong

5 phút.

o

 Bổ sung 100µl môi trƣờng LB, nuôi lắc 200 v/ph ở 37 C trong 1 giờ.
 Cấy trải dịch tế bào trên môi trƣờng LB/agar bổ sung Amp (100µg/ml).
o

 Nuôi ở tủ ấm qua đêm ở 37 C.

2.3.7. Tách plasmid từ vi khuẩn E. coli theo phƣơng pháp mini-prep của
Sambrook
Hóa chất: dung dịch I, dung dịch II và dung dịch III, dung dịch 25:24:1 với
các thành phần đƣợc trình bày cụ thể trong bảng phụ lục 2.
Quy trình
 Nuôi tế bào trong môi trƣờng LB lỏng: lấy một khuẩn lạc từ đĩa petri nuôi
o

trong 2 ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung ampicilin 100µg/ml, nuôi lắc ở 37 C,
200 v/ph.
 Hòa tan tế bào trong 150 µl dung dịch I.
 Bổ sung 150 µl dung dịch II, đảo nhẹ ống nghiệm.
 Bổ sung 150 µl dung dịch III, đảo đều ống nghiệm, để ở trong đá 10 phút.
 Bổ sung 450 µl dung dịch 25:24:1, đảo đều ống nghiêm.
 Ly tâm ở 13000 v/ph trong 15 phút.
 Hút cẩn thận pha trên cho vào ống eppendorf mới.
o

 Bổ sung 500 µl Isopropanol, để ở -20 C khoảng 30 phút.
 Ly tâm ở 13000 v/p, 15 phút để thu tủa.
 Rửa tủa bằng cồn 70%.
o

 Làm khô tủa, hòa tan tủa trong H2O bổ sung RNase, ủ ở 37 C, 30 phút.
 Điện di kiểm tra kết quả trên gel agarose.

2.3.8. Chọn dòng plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp PCR
Chọn ngẫu nhiên một số khuẩn lạc trắng mọc trên đĩa thạch rồi tiến hành tách
plasmid và chọn dòng bằng phản ứng PCR với cặp mồi T7 promoter/T7 terminator
bắt cặp đặc hiệu với trình tự nucleotide trên vector pET22b+ nằm ở hai đầu vùng đa
tách dòng (MCS) là vị trí nhận biết của các enzyme cắt giới hạn. Thành

17