Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp chất ức chế ezyme a glucosidase và a amylase​

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
-----



-----

PHÙNG THỊ HUỆ

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH
VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT ỨC CHẾ
EZYME α-GLUCOSIDASE VÀ α-AMYLASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
-----



-----

PHÙNG THỊ HUỆ

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI SINH
VẬT CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT ỨC CHẾ

EZYME α-GLUCOSIDASE VÀ α-AMYLASE
Chuyên ngành: Động vật học
Mã số: 8 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ NHƢ HẰNG

Hà Nội - 2018


i

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã
nhận đƣợc nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, anh chị và gia đình.
Với tất cả tấm lòng chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.
Trần Thị Nhƣ Hằng ngƣời đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi thực
hiện nghiên cứu, góp ý và sửa chữa để tôi hoàn thiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo của Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật, Trƣờng Đại Học Thái Nguyên đã tận tình truyền đạt cho tôi
kiến thức trong suốt 2 năm học tập, là nền tảng cho tôi trong quá trình nghiên
cứu luận văn và cũng là hành trang quý báu theo tôi trong suốt cuộc đời.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ths. Hoàng Kim Chi, Ths. Nguyễn
Đình Tuấn và tập thể cán bộ công tác tại phòng Sinh học thực nghiệm - Viện
Hoá học các Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn
thành luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình thân yêu của tôi,
những ngƣời đã luôn ở bên tôi, ủng hộ động viên và là chỗ dựa vững chắc để
tôi yên tâm học tập và hoàn thành khóa học này.
Cuối cùng tôi xin kính chúc quý thầy, cô, anh, chị và gia đình dồi dào

sức khỏe, thành công trong sự nghiệp!
Tôi xin chân thành cảm ơn!


ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là hoàn toàn trung thực, chƣa đƣợc sử dụng cho bảo vệ một học vị nào.
Mọi sự giúp đỡ cho hoàn thành luận văn đều đã đƣợc cảm ơn. Các thông
tin, tài liệu trình bày trong luận văn này đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả luận văn

Phùng Thị Huệ

Chữ viết tắt
DMSO
EtOAc
EtOH
IC50
OD
pNPG
VSV
TĐ
v.v.
PDA

HVA
LB


iv

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Một số loại thuốc điều trị bệnh tiểu đƣờng và cơ chế tác dụng [17] 6
Hình 1.2. Hình minh họa chất ức chế tác động lên enzyme..............................9
Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng với sự tham gia của các gốc amino acid trong
trung tâm hoạt động của enzyme α-amylase (Ogawa và cs. 2014).................11
Hình 2.1: Quy trình thu nhận cặn chiết EtOAc từ dịch lên men của các
chủng VSV......................................................................................................25
Hình 3.1. Khuẩn lạc hình thành trên đĩa thạch LB từ các bộ phận khác nhau
của mẫu thực vật............................................................................................. 30
Hình 3. 2. (a) Chủng NĐR1 sinh trƣởng trên môi trƣờng HVA; (b) Chủng HCRt1 sinh trƣởng trên môi trƣờng LB; (c) Chủng HVA DL-NA 6 sinh trƣởng trên
môi trƣơng ISP4; (d) DTC-L-N5 sinh trƣởng trên môi trƣờng PDA............38

Hình 3. 3. Các thử nghiệm ức chế α-amylase và α-glucosidase.....................39
Hình 3. 4. Các thử nghiệm đo nồng độ ức chế IC50 với enzyme α-amylase
(A) và α-glucosidase (B).................................................................................41
Hình 3. 5. Nồng độ ức chế IC50 của dịch chiết các chủng (HVA)DL-NA6
lên enzyme α-amylase và DTC-Rt-N1.2 lên enzyme α-glucosidase so sánh
với Acarbose....................................................................................................42
Hình 3. 6. Sơ đồ phân loại của chủng DTC-Rt-N1.2 dựa trên đoạn trình tự
ITS………………………………………………………………………….47


v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Dịch chiết/hoạt chất chiết xuất từ thực vật có hoạt tính ức chế αglucosidase [6]................................................................................................ 13
Bảng 3.1. Danh sách các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc và một số đặc
điểm hình thái..................................................................................................31
Bảng 3. 2. Phần trăm ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase.................40


vi

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Ảnh hƣởng của các nguồn cacbon khác nhau đến hoạt tính ức
chế enzyme α-amylase của chủng (HVA)DL-NA6.........................................44
Biểu đồ 3.2: Ảnh hƣởng của các nguồn cacbon khác nhau đến hoạt tính ức
chế enzyme α-glucosidase của chủng DTC-Rt-N1.2......................................44


vii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN...................................................................................................i
CHƢƠNG

TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................3

1.1. Bệnh tiểu đƣờng...................................................................................3
Th c tr ng

ệnh tiểu đƣờng tr n thế giới v

t i Việt N m...............4

1.1.1. Trên thế giới.................................................................................... 4
1.1.2. Tại Việt Nam................................................................................... 5
1.2. Một số phƣơng pháp điều trị

ệnh tiểu đƣờng...............................6

1.2.1. Điều trị bằng chế độ ăn uống...........................................................7
1.2.2. Điều trị bằng thảo dƣợc.................................................................. 7
1.2.3. Sử dụng thuốc có hoạt tính chữa bệnh tiểu đƣờng.........................7
1.3. Chất ức chế enzyme α- myl se v

α-glucosidase............................8

1.3.1. Khái niệm chất ức chế enzyme........................................................8
1.3.2. Các loại chất ức chế: có 2 loại.........................................................8
1.3.3. Cấu tạo và phản ứng xúc tác của enzyme α-amylase và αglucosidase.............................................................................................. 10
1.3.3.1.α-Amylase................................................................................... 10
1.3.3.2.Enzyme α-glucosidase.................................................................12
1.3.4. Vai trò của α-glucosidase và α-amylase đối với người bệnh tiểu
đường.......................................................................................................12
1.3.5. Chất ức chế hoạt động của α-glucosidase và α-amylase..............13
1.4. Tình hình nghi n cứu tìm kiếm hợp chất có ho t tính chống tiểu
đƣờng tr n thế giới v

t i Việt N m.........................................................15

1.4.1. Trên thế giới.................................................................................. 16

viii
1.4.2. Tại Việt Nam..................................................................................18
1.5. Hợp chất thi n nhi n có ho t tính chống tiểu đƣờng từ vi sinh
vật...............................................................................................................21
CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.......................................22
2.1. Vật liệu v

đối tƣợng nghi n cứu....................................................22

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................22
2.1.2. Môi trường phân lập và nuôi cấy vi sinh vật.................................22
2.1.3. Hóa chất và thiết bị....................................................................... 22
2.2. Phƣơng pháp nghi n cứu...................................................................23
2.2.1. Phân lập các chủng vi sinh vật từ các mẫu thực vật.....................23
2.2.2. Lựa chọn và lưu giữ giống............................................................ 23
2.2.3. Phương pháp tách chiết dịch nuôi cấy..........................................23
2.2.4. Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme........................................25
2.2.4.1. Thử nghiệm ức chế enzyme α-amylase......................................25
2.2.4.2. Sàng lọc hoạt tính ức chế α-Glucosidase................................... 26
2.2.5. Phƣơng pháp xác định ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến sinh
trƣởng và tổng hợp chất ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase 28
2.2.6. Định danh các chủng nấm bằng sinh học phân tử.........................28
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................. 30
3.1. Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật từ các mẫu th c vật.........30
3.2. Ho t tính ức chế enzyme α- myl se v
3.3. Ảnh hƣởng củ

α-glucosidase.................38

nguồn c c on đến sinh trƣởng v

ức chế enzyme α- myl se v

tổng hợp chất

α-glucosidase...........................................43

3.4. Định d nh các chủng nấm

ằng sinh học phân tử........................45


ix
3.4.1. Chủng DTC-Rt-N1.2.....................................................................45
CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................50
4

Kết luận...............................................................................................50

4 2 Kiến nghị.............................................................................................50
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................51


1
MỞ ĐẦU
Từ những năm 90 của thế kỷ 20, các chuyên gia y tế đã dự báo “Thế kỷ 21
là thế kỷ của các bệnh rối loạn chuyển hoá”. Tiểu đƣờng (TĐ) là bệnh do sự rối
loạn chuyển hoá carbohydrate khi hormone insulin của tuyến tu bị thiếu hay
giảm tác động trong cơ thể, và biểu hiện ở lƣợng glucose trong máu cao. Theo

ƣớc tính của Tổ chức Y tế thế giới WHO và Liên đoàn TĐ quốc tế IDF, số bệnh
nhân TĐ sẽ tăng từ 150 triệu ngƣời vào năm 2009 lên 399 triệu ngƣời vào năm
2025, tăng 214% so với năm 2006. Đáng chú ý, trong khi tốc độ gia tăng tỷ lệ
mắc bệnh ở các nƣớc phát triển chỉ là 42% thì ở các nƣớc đang phát triển trong
đó có Việt Nam là 170%. Bệnh TĐ có thể gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm và
là nguyên nhân hàng đầu gây nhồi máu cơ tim, đột qu , suy thận giai đoạn cuối
và mù lòa, làm tăng tỷ lệ tử vong lên gấp 2-4 lần. Trên thế giới cứ 10 giây đi qua
có thêm 1 ngƣời bị chết do TĐ và các biến chứng [4], [39].

Thực trạng trên đã khiến cho nhu cầu sử dụng thuốc chữa TĐ gia tăng, vì
vậy việc tìm kiếm các nguồn hợp chất có hoạt tính để điều trị bệnh tiểu đƣờng
đang trở nên vô cùng cấp bách. Các giải pháp đƣợc đặt ra cho việc tìm kiếm
nguồn chất điều trị bệnh tiểu đƣờng bao gồm tổng hợp hợp chất hóa học hoặc
bán tổng hợp, và khai thác các hợp chất thiên nhiên từ nguồn tài nguyên sinh
vật. Mặc dù cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu sàng lọc các chất nguồn
gốc thực vật có hoạt tính ức chế hoạt động của các enzyme có vai trò lớn
trong các bệnh nhân tiểu đƣờng là α-amylase và α-glucosidase, nhƣng các
hợp chất sử dụng làm thuốc phổ biến trong lâm sàng để điều trị bệnh tiểu
đƣờng lại có nguồn gốc từ vi sinh vật. Tuy nhiên các thuốc điều trị hiện hành
đều cho thấy hiệu quả ức chế không quá cao, thực tế đó đặt ra vấn đề việc
sàng lọc các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất ức chế αglucosidase và α-amylase ở nồng độ ức chế thấp hơn, là một hƣớng đi tiềm
năng và cần tập trung nghiên cứu.


2
Xuất phát từ những yêu cầu và thực tế trên đây, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài: “Phân lập v tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng
sinh tổng hợp chất ức chế enzyme α-glucosidase và α- myl se”.
Mục đích nghiên cứu của đề tài là: sàng lọc các chủng vi sinh vật, nhằm
tìm kiếm và khai thác các chất có khả năng ức chế enzyme α-amylase và αglucosidase tiềm năng.

3
CHƢƠNG
1.1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Bệnh tiểu đƣờng
Bệnh tiểu đƣờng (TĐ) còn gọi là bệnh đái tháo đƣờng, là một bệnh rối

loạn trao đổi chất mãn tính đƣợc đặc trƣng bởi nồng độ glucose cao trong
máu (tăng đƣờng huyết), giảm tiết insulin hoặc giảm tác dụng của insulin từ
tuyến tụy trong cơ thể của ngƣời bệnh [28]. Insulin là một hormone đƣợc
tổng hợp trong các tế bào beta của tuyến tụy nhằm đáp ứng với các kích thích
khác nhau nhƣ từ glucose, sulphonylurea và arginine tuy nhiên glucose là yếu
tố chính. Tăng nồng độ đƣờng trong máu thời gian dài có thể gây ra các biến
chứng nhƣ bệnh tim, đột qu , mù lòa và bệnh thận, vì thế TĐ đang là một
trong ba bệnh hàng đầu gây tử vong cao trên thế giới chỉ sau ung thƣ và các
bệnh tim mạch [21], [24]. Bệnh TĐ có thể đƣợc phân loại theo nhiều cách
khác nhau, nhƣng theo phân loại của Hiệp hội Tiểu đƣờng Hoa Kỳ, bệnh TĐ
gồm: (1) Bệnh TĐ loại I (Phụ thuộc insulin - IDDM) là do sự phá hủy các tế
bào beta qua trung gian miễn dịch, dẫn đến thiếu insulin; (2) Bệnh TĐ tự phát
là bệnh TĐ loại I nhƣng không có nguyên nhân rõ ràng và có liên quan di
truyền; (3) Bệnh TĐ loại II (Không phụ thuộc insulin - NIDDM) là do khiếm
khuyết trong tiết insulin và kháng insulin; (4) Đái tháo đƣờng thai kỳ là bất
kỳ dạng không dung nạp nào với glucose khi bắt đầu mang thai. Tuy nhiên,
bệnh tiểu đƣờng chủ yếu đƣợc phân loại thành hai loại chính: TĐ loại I
(IDDM) và TĐ loại II (NIDDM), trong đó bệnh TĐ loại II chiếm đến 90% các
ca bệnh TĐ. Nguyên nhân gây bệnh TĐ là do một số cơ chế để duy trì sự điều

chỉnh giữa độ nhạy của các mô với insulin bị phá vỡ dẫn đến sự tiết insulin
bởi các tế bào beta tuyến tụy bị suy yếu và tác dụng insulin bị suy giảm do
hiện tƣợng kháng insulin
[16].

Bệnh TĐ loại II này liên quan chặt chẽ đến nhiều khiếm khuyết về di

truyền, và một số yếu tố môi trƣờng đặc biệt là béo phì từ đó gây ra các sai
lệch trong tế bào beta và kháng insulin ngoại mô [29].


4
1.1.

Th c tr ng

ệnh tiểu đƣờng tr n thế giới v

t i Việt N m

1.1.1. Tr n thế giới
Theo một thông báo vào năm 1998 của các chuyên gia thuộc Tổ chức TĐ
quốc tế, tỷ lệ ngƣời mắc bệnh TĐ trên toàn thế giới là: 110 triệu ngƣời vào
năm 1994, 135 triệu ngƣời vào năm 1995, dự kiến năm 2000 là 151 triệu
ngƣời. Tuy nhiên con số thống kê thực tế cho thấy số bệnh nhân TĐ trên toàn
thế giới trong năm 2000 là 171 triệu ngƣời (chiếm 2,8% dân số thế giới), tức
là vƣợt 13% so với dự đoán của năm 1998. Ƣớc tính hiện có 366 triệu ngƣời
trên thế giới bị bệnh TĐ, số lƣợng ca bệnh TĐ trên toàn cầu tăng gấp đôi
trong ba thập kỷ qua. Trong các trƣờng hợp mắc bệnh TĐ, TĐ type 2 chiếm
đa số. Tỷ lệ mắc bệnh tăng nhanh ở các nƣớc đang phát triển là do sự thay đổi

về lối sống, thói quen ăn uống, đặc biệt là lối sống ít vận động thể lực. TĐ
type 2 tiến triển một cách âm thầm và liên tục, nếu không đƣợc theo dõi và
quản lý, điều trị tốt sẽ gây nhiều biến chứng nguy hiểm để lại di chứng nặng
nề và đe dọa tính mạng ngƣời bệnh và là một trong những nguyên nhân tử
vong chính của bệnh TĐ [12]. Theo khuyến cáo của Tổ chức IDF, trên thế
giới mỗi năm có khoảng 3,2 triệu ngƣời chết vì bệnh TĐ, nhƣ vậy một ngày
có 8700 ngƣời và mỗi phút có 6 ngƣời chết do TĐ. Trong số 17 triệu ngƣời
chết vì đột qu tim mạch thì có 50-70% là do nguyên nhân của bệnh TĐ, nhất
là TĐ type 2 thƣờng do phát hiện bệnh muộn. Có 30-90% TĐ type 2 không
đƣợc chẩn đoán và 50% bệnh nhân đã có một hoặc nhiều biến chứng vào thời
điểm phát hiện bệnh. Nhiều bệnh nhân khi phát hiện bệnh lại không đƣợc
quản lý, theo dõi và điều trị đúng chuyên khoa dẫn đến biến chứng sớm và
nặng nề ảnh hƣởng đến đời sống của ngƣời bệnh, đồng thời tốn kém kinh tế
của gia đình và ngân sách xã hội [39].
Các khu vực đặc biệt bị ảnh hƣởng bởi căn bệnh TĐ này là Trung Quốc
và Ấn Độ, nơi tỷ lệ mắc bệnh TĐ loại II đã tăng lên đột ngột mặc dù


5
tỷ lệ béo phì tƣơng đối thấp. Với cùng một chỉ số khối cơ thể (BMI), ngƣời
châu Á có xu hƣớng có tỷ lệ mỡ trên cơ thể cao hơn ngƣời châu Âu do
thƣờng béo phì bụng hơn và khối lƣợng cơ ít hơn, điều này có thể là nguyên
nhân gia tăng TĐ loại II ở châu Á. Ngoài ra, dinh dƣỡng ké m giai đoạn mang
thai và đầu đời, kết hợp với suy dinh dƣỡng cũng góp phần vào sự gia tăng
của bệnh TĐ loại II, đặc biệt là ở những ngƣời thay đổi thói quen ăn uống đột
ngột và ít hoạt động thể chất. Tỷ lệ bệnh TĐ loại II ở nam giới cũng cao hơn
một chút so với ở nữ giới [17].
1.1.2. T i Việt N m
Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh TĐ của các khu vực đã đƣợc điều chỉnh
phân chia theo cấu trúc tuổi của quần thể là: tỷ lệ mắc bệnh TĐ toàn quốc là

2,7%, tỷ lệ mắc TĐ ở nữ là 3,7%, tỷ lệ tƣơng ứng ở nam là 3,3%. Tỷ lệ mắc
TĐ ở vùng núi cao là 2,1%, vùng trung du là 2,2%, vùng đồng bằng ven biển
là 2,7%, vùng đô thị và công nghiệp là 4,4%. Đặc biệt tỷ lệ mắc bệnh TĐ ở
nhóm đối tƣợng có yếu tố nguy cơ, tuổi từ 30 đến 64 chiếm tỷ lệ 10,5%, tỷ lệ
rối loạn dung nạp glucose là 13,8%. Theo phân loại của Hiệp hội Tiểu đƣờng
quốc tế và Tổ chức Y tế Thế giới, tỷ lệ mắc bệnh TĐ
ở

Việt Nam nằm trong khu vực hai (tỷ lệ 2% - 4,99%) giống của các nƣớc

khác trong khu vực nhƣ Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia và thấp hơn các
nƣớc thuộc khu vực ba (tỷ lệ 5-7,99%) bao gồm Nhật Bản, Hàn Quốc,
Malaysia, Singapore, Australia… [6].
Tỷ lệ mắc TĐ ở Việt Nam tăng tỷ lệ thuận theo tuổi (p < 0,0005). Ở lứa
tuổi dƣới 40 tỷ lệ mắc bệnh TĐ vẫn thấp khoảng dƣới 1%, tỷ lệ bệ nh TĐ
đƣờng tăng nhanh ở hai mốc tuổi là 45 (4,6%) và 60 tuổi (10,1%). Tỷ lệ rối
loạn dung nạp glucose cũng có diễn biến gần giống nhƣ tỷ lệ mắc bệnh TĐ là
tăng tỷ lệ thuận theo tuổi (p < 0,0005) nhƣng không có mốc tăng đột ngột
nhƣ tỷ lệ bệnh TĐ. Tuổi trung bình của các đối tƣợng mắc


6
bệnh TĐ là 52,4 tuổi. Hầu hết ngƣời bị bệnh TĐ đã đƣợc chẩn đoán từ trƣớc
đều đang đƣợc điều trị đều đặn (85,8%), số ngƣời bệnh không đƣợc điều trị
chỉ có 14,2% [4], [9].
1.2.

Một số phƣơng pháp điều trị

ệnh tiểu đƣờng

Bệnh tiểu đƣờng loại 2 là một căn bệnh khó điều trị và không có một
công thức điều trị cụ thể nào phù hợp cho tất cả bệnh nhân mà đều phải dựa
vào dấu hiệu lâm sàng của từng ca bệnh. Hình 1.1 minh họa một số loại thuốc
phổ biến trong phƣơng pháp điều trị bệnh tiểu đƣờng đang đƣợc lƣu hành
hiện nay.

Hình 1.1. Một số loại thuốc điều trị bệnh tiểu đƣờng và cơ chế tác dụng [17]


7
Trong đó các phƣơng án điều trị bệnh TĐ tƣơng đối đa dạng và chủ yếu
tập trung vào các hƣớng điều trị với đơn thuốc đơn thuần (70,9%), thuốc kết
hợp với chế độ ăn (29,1%), chế độ ăn và luyện tập đơn thuần chỉ có 2,9%.
Các phƣơng pháp khác nhau tuy nhiên đều hƣớng đến một mục tiêu chung là
hạ chỉ số đƣờng huyết HbA1c xuống mức tiêu chuẩn. Trong đó sử dụng các
chất ức chế các enzyme có vai trò trong việc dung nạp glucose (nhƣ αamylase và α-glucosidase) cũng là một giải pháp. Một số phƣơng pháp điều
trị có thể kể đến nhƣ sau:
1.2.1. Điều trị ằng chế độ ăn uống
Một trong số những liệu pháp hiệu quả cho các bệnh nhân TĐ type 2 là
điều chỉnh lƣợng đƣờng huyết thông qua chế độ dinh dƣỡng. Ngƣời bệnh
cần đảm bảo chế độ ăn đầy đủ chất đạm, béo, bột đƣờng, vitamin, muối
khoáng với số lƣợng hợp lý. Tuân thủ nguyên tắc thức ăn đa dạng, nhiều
thành phần, ăn đủ để có trọng lƣợng vừa phải, hạn chế ăn chất béo, đặc biệt là
mỡ động vật, ăn lƣợng vừa phải chất xơ, hạn chế ăn mặn, tránh rƣợu bia và
thức uống có cồn [24].
1.2.2. Điều trị ằng thảo dƣợc
Một số loại thảo dƣợc rất tốt cho ngƣời bệnh TĐ, điển hình nhƣ mƣớp
đắng, ổi, nha đam, cây cà ri, cây húng quế, lá xoài… Ngƣời bệnh có thể kết
hợp bổ sung các thảo đƣợc này trong chế độ ăn uống sẽ tốt cho quá trình điều

trị.
1.2.3. Sử dụng thuốc có ho t tính chữ

ệnh tiểu đƣờng

Đối với một số nhóm đối tƣợng bị TĐ cụ thể, việc điều trị bằng insulin
là giải pháp bắt buộc và chƣa có giải pháp thay thế. Tuy nhiên, sử dụng các
nhóm thuốc có thể bắt buộc và chƣa đƣợc coi là phƣơng án điều trị nhanh và
hiệu quả nhất. Song chế độ ăn uống phù hợp sẽ tốt cho quá trình điều chỉnh
lƣợng carbonhydrate trong cơ thể.


8
1.3.

Chất ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase

1.3.1. Khái niệm chất ức chế enzyme
Là phân tử nhỏ bám vào enzyme và làm giảm hoạt tính enzyme, chúng
phải có một số đặc tính sau:
Đặc thù với mỗi enzyme và hoạt động ở nồng độ thấp, và thƣờng không
phá hủy enzyme.

-

Bởi vì sự giảm hoạt tính của enzyme có thể làm chết tác nhân gây
bệnh hay sửa chữa sự mất cân bằng chuyển hóa, nên chất ức chế đƣợc sử
dụng làm thuốc bảo vệ thực vật (nông nghiệp diệt côn trùng, vi sinh vật gây
bệnh) hoặc làm thuốc chữa bệnh v.v.
Chất ức chế có thể bám vào trung tâm hoạt động enzyme hoặc vị trí khác

làm giảm phản ứng.
Sự bám của chất cảm ứng vào Enzyme có thể là (i) thuận nghịch hay (ii)
không thuận nghịch.
+

Bám không thuận nghịch thƣờng là chất ức chế phản ứng (gắn chặt) với

enzyme theo kiểu liên kết hóa trị, làm thay đổi các axit amin tại hoạt
động (ví dụ khí độc thần kinh (Ops kết hợp serin của enzyme acetylcholine
esterase).
+

Bám thuận nghịch, chất ức chế bám không có liên kết hóa trị (liên kết

hydro, k nƣớc, ions) với enzyme, và dễ bị loại bỏ bằng pha loãng hoặc
thẩm tích)
Một số kiểu ức chế khác: bám vào phức hợp enzyme/cơ chất, hoặc ức chế
kiểu tự sát (biến đổi chất ức chế)
1.3.2. Các lo i chất ức chế: có 2 loại
-

Loại 1: ức chế cạnh tranh

Chất ức chế và cơ chất không thể bám vào enzyme cùng một thời điểm.
Thông thƣờng, chất ức chế rất giống cơ chất về cấu tạo, chúng cạnh tranh
nhau với vùng hoạt động của enzyme
-

Loại 2: ức chế không cạnh tranh

9
+

Chất ức chế bám vào phức enzyme/cơ chất (hiếm gặp)

+

Chất ức chế bám vào enzyme tại vị trí khác với vị trí của cơ chất, làm
thay đổi cấu trúc tại vị trí hoạt động của enzyme. Thƣờng chúng hoạt
động không phụ thuộc nồng độ cơ chất.

Hình 1.2. Hình minh họa chất ức chế tác động lên enzyme.


10
1.3.3. Cấu t o và phản ứng xúc tác của enzyme α-amylase và αglucosidase
1.3.3.1.


α-Amylase

Cấu t o
Enzyme α-amylase là protein có phân tử lƣợng thấp, thƣờng nằm trong

khoảng 50.000 đến 60.000 Dal. Một số trƣờng hợp đặc biệt nhƣ α-amylase từ
loài vi khuẩn Bacilus macerans có phân tử lƣợng lên đến 130.000 Dal. Đến
nay ngƣời ta đã biết rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-amylase nhƣng chỉ
có 2 loại α-amylase là taka-amylase từ Apergillus orysee và α-amylase của tụy
lợn đƣợc nghiên cứu kĩ về hình thể không gian cấu trúc bậc 3. Mới đây các

nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về vùng kị nƣớc
cho thấy các chuỗi mạch amino acid của tất cả các enzyme α-amylase đều có
cấu trúc bậc 3 tƣơng tự nhau


Phản ứng xúc tác củ α-amylase
Mặc dù có thể đƣợc thu từ các nguồn khác nhau, α-amylase (EC

3.2.1.1) đều tham gia xúc tác một phản ứng giống nhau. Alpha amylase giúp
phân cắt các liên kết α-1,4-glucosidae ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh
bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào. Enzyme
α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột
nguyên song với tốc độ rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn:
+

Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị

thủy phân tạo thành một lƣợng lớn dextrin phân tử thấp ( -dextrin), độ nhớt
của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa
nhanh) [40].
+

Giai đoạn 2 (giai đoạn đƣờng hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành

bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine.


11
Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và

monosaccharide. Dƣới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá
nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose [15].
+

Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch

polyglucosecolagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose,
maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thuỷ phân
của amylose chƣa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của αAmylase lên amylopectin cũng xảy ra tƣơng tự nhƣng vì không phân cắt
đƣợc liên kết α-1,6-glucoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin
nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đƣờng nói trên
còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8% [26]

Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng với sự tham gia của các gốc amino acid trong
trung tâm hoạt động của enzyme α-amylase (Ogawa và cs. 2014).


12
1.3.3.2.


Enzyme α-glucosidase

Cấu t o
α-glucosidase

glucosidoinvertase,

có

nhiều

tên

gọi

khác

nitrophenyl-α-D-glucosidase,

nhƣ:

glucoinvertase,

maltase

glucoamylase,

glusosidosucrase, transglucosidase, glucosidoinvertase, α-D-glucosidase, αglucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, maltase. α-Glucosidase có trên
màng ruột non và chiếm khoảng 2% tổng số protein. Enzym này phân bố trên
toàn bộ chiều dài ruột non với hoạt tính tăng chậm dần và đạt đỉnh ở hồi
tràng. Ngoài ra, α-glucosidase còn đƣợc tìm thấy ở biểu mô thận [26].
Enzym alpha glucosidase có 2 tiểu phần: tiểu phần N tận và tiểu phần C
tận. Cả 2 tiểu đơn vị này đều có trọng lƣợng phân tử ~100 kDa và thuộc gia
đình GH31 phân nhóm 1 do có chuỗi WiDMNE trong trung tâm xúc tác [37].


Phản ứng xúc tác
Alpha glucosidase (EC.3.2.1.20) có vai trò xúc tác cho phản ứng

chuyển oligosacarid thành các phân tử đƣờng nhỏ hơn để đƣợc hấp thu vào
máu. Cơ chế của nó là cắt đứt liên kết α-D-1,4 glucose đầu không khử. Cụ
thể, khi thức ăn là các carbohydrate đƣợc đƣa vào cơ thể, dƣới tác dụng của
các enzym trong hệ tiêu hóa là α-amylase tuyến nƣớc bọt và tuyến tụy,
carbohydrat đƣợc thủy phân thành các phân tử đƣờng nhỏ hơn nhƣ dextrin,
maltotriose, maltose. Hỗn hợp này sau đó đƣợc thủy phân bởi các enzym
alpha-glucosidase ở màng ruột non (EC.3.2.1.20), enzym alpha
glucosidase trong lysosym (EC.3.2.1.3) và sucrase-isomaltase (EC.3.2.1.48,
EC.3.2.10) thành glucose và đƣợc hấp thu vào máu [27], [40].
1.3.4. Vai trò của α-glucosidase và α-amylase đối với người bệnh tiểu đường

Biểu hiện bệnh của TĐ là lƣợng glucose trong máu cao hơn bình
thƣờng. Do đó, việc kiểm soát lƣợng glucose là một mục tiêu quan trọng để
làm giảm nguy cơ biến chứng sức kho lâu dài của bệnh TĐ. Carbohydrate


13
là nguồn cung ứng lớn glucose trong cơ thể. Phân tử carbohydrate bị thuỷ
phân thành các oligosaccharide bởi enzyme α-amylase (tu tạng), tiếp theo
ở

ruột non, enzyme α-glucosidase thuỷ phân oligosaccharide thành glucose và

sau đó thẩm thấu vào máu. Do đó, nếu ức chế đƣợc 2 enzyme này thì lƣợng
glucose trong máu sẽ giảm, việc điều trị TĐ sẽ dễ dàng hơn.
Bằng cách ức chế hoạt động của enzyme alpha glucosidase có thể làm
giảm sự thủy phân carbohydrate và làm chậm quá trình hấp thu glucose vào
máu do đó giúp kiểm soát lƣợng glucose máu sau ăn [34].
1.3.5. Chất ức chế hoạt động của α-glucosidase và α-amylase
Hiện nay TĐ đƣợc kiểm soát bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ

sử dụng thuốc duy trì lƣợng glucose trong máu ổn định (Sulfonylurea), chất
ức chế tiêu hoá và hấp thụ tinh bột (Glucobay), thuốc cảm ứng độ nhạy của
insulin [3]. Các thuốc điều trị TĐ thƣờng hiếm và có giá thành cao. Vì vậy,
làm thế nào để tổng hợp đƣợc một số lƣợng lớn các chất có khả năng ức chế
enzym 2 α-glucosidase (EC 3.2.1.20) và α-amylase (EC 3.2.1.1) để mang lại
những loại thuốc với giá thành thấp hơn và đến đƣợc với tay của mọi ngƣời
dân là rất quan trọng. Bảng 1.1 liệt kê một số hợp chất có hoạt tính ức chế
enzyme α-glucosidase có nguồn gốc từ thực vật đã đƣợc nghiên cứu và xác
định giá trị ức chế IC50.
Bảng 1.1. Dịch chiết/ho t chất chiết xuất từ th c vật có ho t tính
ức chế α- glucosidase [6]
Th c vật

Acosmium
panamense
(Onychiuroidea)–
Balsamo


amarillo
Adhatoda
Nees
(Acanthaceae)
Cang mai
Alstonia
scholaris
(Apocynaceae)–
Mò cua
Bergenia
(Saxifragaceae) –

Pakhanbhed
Cassia
auriculata
Avartaki
Cecropia
obtusifolia
(Cecropiaceae)
Guarumo
Asphodelaceae
Lô hội
Quốc
Cleistocalyx
operculatus
(Myrtaceae)
Vối
Curcuma longa Nghệ
Derris scandens
(Fabaceae)–Dây
tử quy