(Luận văn thạc sĩ) phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất lanostan triterpen từ phân đoạn dicloromethan của nấm cổ cò ganoderma flexipes pat , họ ganodermataceae thu hái tại tây nguyên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

an

dP
ha
rm

ac
y,

VN
U

KHOA Y DƯỢC

ed
ic

ine

ĐẶNG THỊ QUỲNH

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ
HỢP CHẤT LANOSTAN TRITERPEN TỪ
PHÂN ĐOẠN DICLOROMETHAN CỦA NẤM CỔ CÒ
- GANODERMA FLEXIPES PAT.,
HỌ GANODERMATACEAE THU HÁI
TẠI TÂY NGUYÊN

Co

py

rig

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ac
y,

dP
ha

rm

ĐẶNG THỊ QUỲNH

VN
U

KHOA Y DƯỢC

M

ed
ic

ine

an

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT
LANOSTAN TRITERPEN TỪ PHÂN ĐOẠN DICLOROMETHAN
CỦA NẤM CỔ CÒ - GANODERMA FLEXIPES PAT., HỌ
GANODERMATACEAE THU HÁI TẠI TÂY NGUYÊN

Sc

ho
ol

of

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

2. TS. Nguyễn Hữu Tùng

Co

py

rig

ht

@

Khóa
: QH.2014.Y
Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Thị Duyên

Hà Nội - 2019


Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

dP
ha
rm

ac
y,

VN
U

LỜI CẢM ƠN
Đề tài “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất lanostan triterpen
từ phân đoạn diclomethan của Nấm cổ cò - Ganoderma flexipes Pat., họ

Ganodermataceae thu hái tại Tây Nguyên” là kết quả cho qúa trình học tập, rèn
luyện của em tại Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên
cứu, thực tập tại Khoa Hóa Thực vật, Viện Dược liệu. Trong thời gian thực hiện
khóa luận tốt nghiệp này, em đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của quý thầy cơ,
gia đình và bạn bè.
Qua đây em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
TS. Nguyễn Thị Duyên - Khoa Hóa Thực Vật - Viện Dược liệu, TS.
Nguyễn Hữu Tùng - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã trực tiếp chỉ
bảo, hướng dẫn em hoàn thành đề tài khóa luận này.
Lãnh đạo, thầy cơ cơng tác tại Khoa Y - Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
đã giúp đỡ, hướng dẫn, tạo điều kiện để em được học tập, nghiên cứu tại Khoa
trong suốt 5 năm học qua.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Dược liệu, đặc biệt là các
cán bộ, nhân viên tại khoa Hóa Thực vật đã giúp đỡ em trong quá trình thực
hiện đề tài.
Gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm, giúp đỡ, động viên, tạo
điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu vừa qua.
Dù đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ từ nhiều nguồn nhưng vì kiến
thức cũng như thời gian cịn hạn chế nên bài báo cáo khơng thể tránh khỏi
những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự thơng cảm và những ý kiến đóng
góp của q thầy cơ, bạn bè để khóa luận của em được hồn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2019
Sinh viên
Đặng Thị Quỳnh


VN
U

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
Các phương pháp sắc ký

1

H-NMR

13

Sắc ký cột thường
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ac
y,

Column Chromatography
High Performance Liquid
Chromatography
TLC
Thin Layer Chromatography
Các phương pháp phổ

Sắc ký bản mỏng

dP
ha
rm

CC
HPLC

Proton Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscop
Carbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy
Distortionless Enhancement
by Polarisation Transfer
Electron Spray Ionization
Mass Spectrometry

C-NMR

an

DEPT

ine

ESI-MS

Heteronuclear Multiple Bond
Correlation
Heteronuclear Single
Quantum Coherence
Mass Spectroscopy
Ultra Violet - Visible

ed
ic

HMBC

M

HSQC

Phổ DEPT

Phổ khối ion hóa phun mù
điện tử
Phổ tương tác dị hạt nhân
qua nhiều liên kết
Phổ tương tác dị hạt nhân
qua nhiều liên kết
Phổ khối
Phổ tử ngoại

of

MS
UV-Vis

Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân proton
Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân carbon 13

Sc

Diclomethan

Dược liệu/Dung mơi
Phân đoạn diclomethan của nấm Cổ cị
Phân đoạn etyl acetat của nấm Cổ cò
Etyl acetat
Methanol
Phân đoạn nước của nấm Cổ cị

rig

ht

@

DCM
DL/DM
DNCC
ENCC
EtOAc
MeOH
WNCC

ho
ol

Các loại dung mơi, phân đoạn dịch chiết

Co

py

Các ký hiệu sinh học
AChE
AD
AIDS

Acetylcholinesterase
Alzheimer
Acquired Immuno Deficiency
Syndrom

Hội chứng mất trí nhớ
Hội chứng suy giảm miễn
dịch mắc phải


Enzyme Catalase
Deoxyribonucleic acid
Effective dose 50%

m/z
Mp
STT
TLTK
v/v
VKH&CNVN

Khối lượng/điện tích
Melting Point
Điểm nóng chảy
Số thứ tự

Tài liệu tham khảo
Thể tích/ Thể tích
Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam

VN
U

CAT
DNA
ED50

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

dP
ha
rm

ac
y,

Liều có hiệu quả ở 50%
động vật thí nghiệm
ERK
Extracellular signal - regulated Kinase điều hịa tín hiệu
kinases
ngoại bào
FGFR
Fibroblast growth factor
Yếu tố tăng trưởng nguyên
receptor
bào sợi
GPx
Enzyme Glutathione Peroxidase
HBV
Hepatitis B virus
HIV

Human immunodeficiency virus
HSV
Virus herpes simplex
IC50
Half maximal inhibitory
Nồng độ ức chế 50%
concentration
NPC
Neural progenitor cell
Tế bào tiền thân thần kinh
Nrf2
Nuclear factor (erythroidYếu tố hạt nhân có nguồn
gốc từ erythroid 2
derived 2)-like 2
RNA
Ribonucleic acid
ROS
Reactive oxygen species
Gốc tự do oxy hóa
SOD
Superoxide dismutase
Enzyme xúc tác quá trình
phân hủy superoxide
Các ký hiệu viết tắt khác


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

Trang

Bảng 1.1.

Một số triterpen nhóm I phân lập được từ
chi Ganoderma

6

Bảng 1.2.

Một số triterpen nhóm II phân lập được từ
chi Ganoderma

Bảng 1.3.

Một số triterpen nhóm III phân lập được từ
chi Ganoderma

8

Bảng 1.4.

Một số sterol phân lập từ chi Ganoderma

9
17

Dữ liệu phổ của 2 hợp chất NCC03 và NCC06

31

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

Kết quả tra cứu tài liệu tham khảo tính
đến tháng 7/2018

@
ht
rig
py
Co

7

ac
y,

dP
ha
rm

Bảng 1.5.
Bảng 3.

VN
U

Bảng


DANH MỤC CÁC HÌNH
Tên hình

Trang

VN
U

Hình

Hình 1.1. Cấu trúc của Triterpen nhóm I

6

Hình 1.3. Cấu trúc của Triterpen nhóm III

7

ac
y,

Hình 1.2. Cấu trúc của Triterpen nhóm II

Hình 2.

dP
ha
rm

Hình 1.4. Nấm cổ cò – Ganoderma flexipes Pat., thu tại Tây
Nguyên
Nguyên liệu nấm Cổ cị - Ganoderma flexipes Pat.

16
19
24

Hình 3.2. Sắc ký đồ TLC cao tổng và các cao phân đoạn
nấm Cổ cị.

25

Hình 3.3. Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao nấm Cổ cị phân
đoạn DCM

27

Hình 3.4. Kết quả chạy HPLC kiểm tra độ tinh khiết của 2
hợp chất NCC03 và NCC06

28

Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC03

30

Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của hợp chất NCC06

31

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed

ic

ine

an

Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn nấm Cổ cò.

py
Co

8


VN
U

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

ac
y,

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH

dP
ha

rm

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 3
1.1.

Tổng quan về chi Ganoderma .............................................................. 3

1.1.1. Vài nét về thực vật của chi Ganoderma. ........................................... 3

an

1.1.2. Thành phần hóa học .......................................................................... 4

ine

1.1.2.1.Triterpen/ Triterpenoid ................................................................... 4
1.1.2.2.Sterol .............................................................................................. 9

ed
ic

1.1.2.3.Polysaccharit .................................................................................. 9
1.1.3. Tác dụng sinh học............................................................................ 10

M

1.1.3.1.Tác dụng gây độc tế bào và chống ung thư.................................. 10

of

1.1.3.2.Tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ gan ............................................ 12

ho
ol

1.1.3.3.Tác dụng kháng virut.................................................................... 13
1.1.3.4.Tác dụng kháng vi khuẩn, kháng nấm ......................................... 13

Sc

1.1.3.5.Tác dụng trên hệ thần kinh ........................................................... 14

1.2.

@

1.1.3.6.Tác dụng khác .............................................................................. 15
Tổng quan về đối tượng nghiên cứu - Nấm Cổ cò. ............................ 15

ht

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 19
Đối tượng nghiên cứu. ........................................................................ 19

2.2.

Hóa chất, thiết bị................................................................................. 19

Co

py

rig

2.1.

2.2.1. Hóa chất, dung mơi ......................................................................... 19
2.2.2. Thiết bị............................................................................................. 19


VN
U

2.3. Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh
khiết. ............................................................................................................ 20
2.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập ............................................... 20
2.3.2. Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc ................................. 21

ac
y,

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................... 24

dP
ha
rm

3.1. Chiết các phân đoạn nấm Cổ cò và phân lập các hợp chất từ cao phân
đoạn diclomethan. ......................................................................................... 24

3.1.1. Kết quả chiết phân đoạn nấm Cổ cò. ............................................... 24
3.1.2. Kết quả phân lập các hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn
diclomethan của nấm Cổ cò. ...................................................................... 26

Biện luận cấu trúc 2 hợp chất NCC03 và NCC06 .............................. 28

ine

3.2.

an

3.1.3. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết ......................................................... 27

ed
ic

3.2.1. Hợp chất NCC03 ............................................................................. 28
3.2.2. Hợp chất NCC06 ............................................................................. 30
Bàn luận .............................................................................................. 32

M

3.3.

3.3.1. Về chiết xuất ....................................................................................... 32

of

3.3.2. Về phân lập, tinh chế và nhận dạng cấu trúc hợp chất. ................... 33

ho
ol

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 35
Kết luận............................................................................................... 35

2.

Kiến nghị ............................................................................................ 35

Sc

1.

@

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Co

py

rig

ht

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ

dP
ha
rm

ac
y,

VN
U

Cùng với sự tiến bộ của khoa học – kỹ thuật, xu hướng quay về với thiên
nhiên, tìm về những phương thuốc truyền thống dân gian ngày càng được quan
tâm, phát triển. Dược thảo thiên nhiên ngày càng đóng vai trị quan trọng trong
phịng, chữa bệnh và nâng cao sức khoẻ. Trong đó, việc tìm ra loại dược liệu
có nguồn gốc thiên nhiên để chữa các bệnh hiểm nghèo trên cơ sở khoa học có
ý nghĩa vơ cùng to lớn [10].

ine

an

Nấm Linh chi là một loại dược liệu quý trong y học cổ truyền. Với thành
phần hóa học có chứa polysaccharit (giàu β-glucan), triterpenoid, steroid,
saponin…, nấm Linh chi được ghi nhận có tác dụng phịng chống ung thư, tăng
cường hệ miễn dịch, giải độc gan, hỗ trợ điều trị tiểu đường, giảm cholesterol
trong máu… Chính vì thế, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi trong phòng ngừa và
điều trị bệnh là rất lớn, không chỉ ở Việt Nam, mà còn ở nhiều nơi trên thế giới
như Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan,…[9].

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

Theo cuốn Nấm linh chi - Tài nguyên dược liệu quý ở Việt Nam của Nhà
xuất bản Khoa học và kỹ thuật, nước ta có khoảng trên 80 lồi nấm Linh chi,
chiếm khoảng 1/3 số lồi trên thế giới với khơng ít loài mới, đặc hữu [7]. Riêng
ở Vườn Quốc gia Kon Ka Kinh thuộc khu vực Tây Ngun, chi Ganoderma có
ít nhất là 25 lồi, trong đó 10 lồi có tác dụng dược liệu như Ganoderma
tornatum, Ganoderma amboinense, Ganoderma gibbosum, Ganoderma
capense, Ganoderma lobatum, Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum,
Ganoderma flexipes, Ganoderma tropicum, Ganoderma cochlear, các lồi cịn
lại chưa biết rõ ý nghĩa [6]. Do đó, nghiên cứu tài nguyên nấm Linh chi ở Việt

Nam sẽ là một cơng trình có ý nghĩa và mang lại hiệu quả to lớn cho người
trồng nấm. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu (cả trong và ngoài nước) về chi
Ganoderma mới chỉ dừng lại trên đối tượng Ganoderma lucidum. Trong khi
cũng được công bố là một trong số 10 lồi có tác dụng dược liệu tại Vườn Quốc
gia Kon Ka Kinh, nấm Cổ cò - Ganoderma flexipes lại chưa được nghiên cứu
về thành phần hóa học cũng như giá trị sử dụng.

Co

Vì vậy, để góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học của Ganoderma
flexipes, em thực hiện đề tài “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất
lanostan triterpen từ phân đoạn dicloromethan của nấm Cổ cò 1


VN
U

Ganoderma flexipes Pat., họ Ganodermataceae thu hái tại Tây Nguyên” với
2 mục tiêu cần đạt được:

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

dP
ha
rm

ac
y,

1. Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn dicloromethan.
2. Xác định và nhận dạng cấu trúc của các chất phân lập được trong phân
đoạn.

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Tổng quan về chi Ganoderma

VN
U

1.1.

1.1.1. Vài nét về thực vật của chi Ganoderma.

ine

an

dP
ha
rm

ac
y,

Chi Ganoderma thuộc họ Ganodermataceae Donk, trong tất cả, có 219
lồi trong họ đã được gán cho chi này [13], phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới
châu Á, châu Đại Dương và châu Mỹ [5]. Ở Việt Nam, theo GS.TSKH Trịnh
Tam Kiệt, có khoảng 80 loài, phân bố rộng, đặc biệt vùng nhiệt đới [3]. Riêng
trong hệ sinh thái của vườn Quốc gia Kon Ka Kinh ở Tây Nguyên nước ta đã
định danh được 25 loài nấm thuộc chi này [6]. Các loài nấm thuộc chi
Ganoderma đa số sinh trưởng và phát triển dưới tán rừng ở sinh cảnh rừng lá
rộng thường xanh là chủ yếu, tiếp theo là một số sinh cảnh khác như rừng lá
rộng bán thường xanh, rừng hỗn giao lá rộng lá kim, rừng hỗ giao tre nứa. Đa

số các loài xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 12 trong năm [6].
Vị trí phân loại của chi Ganoderma Karst.

ed
ic

Theo hệ thống phân loại của P. Karsten (1881) chi Garnoderma Karst.
thuộc:

M

Giới nấm (Fungi).

Ngành nấm đảm (Basidiomycota).

of

Lớp nấm đảm (Agaricomycetes).

ho
ol

Bộ nấm đa tầng (Polyporales).
Họ nấm Lim (Ganodermataceae).

Sc

Chi Ganoderma Karst. [3]

Đặc điểm của chi Ganoderma Karst:

Co

py

rig

ht

@

Quả thể có cuống hoặc khơng cuống, mọc trên gỗ. Mũ nấm bóng láng
thường dạng thận hay quạt có khi trịn. Thịt nấm màu nâu chất gỗ đến chất bì
dai. Ống nấm đa số một tầng, một số ít hai tầng. Bào tử có dạng hình trứng nhụt
một đầu, vỏ bào tử gồm hai lớp, lớp ngoài nhẵn lớp trong có gai nhẹ có màu
vàng gỉ sắt [6]. Tuy nhiên, các đặc điểm hình thái có thể thay đổi do, ví dụ, sự
khác biệt trong canh tác ở các vị trí địa lý khác nhau trong các điều kiện khí
hậu khác nhau và sự phát triển di truyền tự nhiên (đột biến, tái tổ hợp) của từng
loài [13].
3


1.1.2. Thành phần hóa học

1.1.2.1.

dP
ha
rm

ac
y,

VN
U

Ngồi gần 90% là nước trong đặc trưng của tất cả các loại nấm, 10%
khối lượng còn lại của chi Ganoderma chủ yếu bao gồm: protein (10 - 40%),
carbohydrate (3 - 28%), chất béo (2 - 28%), chất xơ (3 - 32%), vitamin và
khoáng chất. Người ta đã xác nhận rằng protein có nguồn gốc từ nấm có chứa
tất cả các axit amin thiết yếu và chúng đặc biệt giàu lysine và leucine. Tuy
nhiên, nhóm chất có hoạt tính sinh học chính trong các loại nấm khác nhau của
chi Ganoderma là triterpen và polysaccharit (Boh và cộng sự, 2007) [35].
Triterpen/ Triterpenoid

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

Terpen là một nhóm các hợp chất xuất hiện trong tự nhiên, có bộ xương
carbon bao gồm một hoặc nhiều đơn vị isopren. Terpen bao gồm bốn nhóm: (a)
mono- và sesquiterpen dễ bay hơi (tinh dầu) (C10 và C15), (b) diterpen ít bay
hơi (C20), (c) triterpen và sterol (C30) và (d) ) các sắc tố caroten (C40). Hầu
hết các nghiên cứu về nấm Linh chi liên quan đến các dạng triterpene và sterol
ít bay hơi hơn [13].
Triterpen là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren [13]. Hàng
trăm hợp chất triterpen đã được phân lập từ chiết xuất methanol, ethanol,
acetone và chloroform của bào tử, sợi nấm và cơ thể đậu quả của các loại nấm
Linh chi, đặc biệt là loài G.lucidum [36].
Kubota lần đầu tiên phân lập được axit ganoderic A và axit ganoderic B
từ Ganoderma lucidum (FR.) KARST năm 1982. Kể từ đó, hơn 316 triterpen
đã được phân lập từ cơ thể đậu quả, bào tử, và sợi nấm của nhiều loại nấm Linh
chi trong chi Ganoderma [46].
Cấu trúc hóa học của triterpen dựa trên lanostane, là một chất chuyển
hóa của lanosterol, thơng thường chúng có hai nhóm cụ thể được xác định là
ganoderic (C30) và axit lucidenic (C27). Theo nghiên cứu của Cole R. J. và
Schweikert M. A. đã có hơn 130 hợp chất là dẫn xuất của lannosterol (acid
ganoderic, ganoderiol, ganolucidic, các lucidon, acid lucidenic,...) được phân

lập từ phân đoạn không phân cực chiết xuất từ nấm Linh chi. Các triterpen tồn
tại dưới dạng tự do (khơng có phần đường), có cấu trúc vịng, mang một số
nhóm chức như: -OH; -OAc; -O- (eter); C=O; nối đôi C=C. Cấu trúc hóa học
của nó rất phức tạp và bị oxy hóa cao. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan
4


VN
U

tốt trong eter dầu hỏa, n-hexan, diethyl ether, cloroform), ít tan trong nước
ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid [2].

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

M

ed
ic

ine

an

dP
ha
rm

ac
y,

Các triterpen phân lập từ chi Ganoderma được phân thành từng nhóm
khác nhau theo 3 cấu trúc chính dưới đây.

5


U
N
,V

y
c
a

m
r
a

h
P
d

n
a
e

n
i
ic

Hình 1.1. Cấu trúc của Triterpen nhóm I [1]
Bảng 1.1. Một số triterpen nhóm I phân lập được từ chi Ganoderma

6

STT

Triterpen

R1

R2

1

Ganoderal A

O

H

2

Acid Ganoderic S

α-

h
c
S

fM

lo

oo
α-

R3
H
H

R4

ed

R5

R6

R7

R8

Nguồn gốc

TLTK

H

Δ 24-25

Me

CHO

G. lucidum

[40]

H

Δ 24-25

Me

COOH

G. lucidum

[21]

Me

COOH

G. lucidum

[1]

Me

COOH

G. orbiforme

[25]

OAc OAc

3

Acid lanosta7,9(11),24-trien3β,15α,22βtriacetoxy-26-oic

y
p
Co

h
g
ri

4

t@

Ganorbiformin G

βαβOAc OAc OAc
O

H

OAc

H

H

Δ 24-25


U
N

,V

y
c
a

m
r
a

h
P
d

n
a
e

7

n
i
ic

Hình 1.2. Cấu trúc của Triterpen nhóm II [1]

ed

Bảng 1.2. Một số triterpen nhóm II phân lập được từ chi Ganoderma
STT

Triterpen

1

Acid lucidenic A

2

Acid lucidenic C

3
4

R2

R3

R4

O

β-OH

H

Me

β-OH

β-OH

β-OH

Me

COOH

G. lucidum

Acid 20-hydroxylucidenic N β-OH

β-OH

H

OH

COOH

G. lucidum

H

H

COOMe

G. lucidum

β-OH

COOH

G. sinense

@
t
h

p
o
C

l
o
o

h
c
S

Methyl lucidenat F

O

O

20-hydroxylucidenic acid A

O

OH

g
i
r
y

5

M
f
o
R1

R5

Nguồn gốc TLTK
[1]

[39]


U
N
,V

y
c

a

m
r
a

h
P
d

n
a
e

8

n
i
ic

Hình 1.3. Cấu trúc của Triterpen nhóm III [1]

ed

Bảng 1.3. Một số triterpen nhóm III phân lập được từ chi Ganoderma
STT
1
2

Triterpen

R1

Acid ganoderic α

β-OH

Acid ganoderic H

β-OH

g
i
r
y

@
t
h

Sc

R3

fM

O

O

R2

ho
O

R5

R6

R7

R8

R9

R10

βOAc

β-OH

α-Me

O

H

COOH

Me

O

βOAc

O

α-Me

O

H

COOH

Me

o
l
o

R4

3

Acid ganoderic V

O

α-OH

H

H

α-OAc α-Me

H

Δ24-25

Me

COOH

4

Acid ganoderic W

α-OAc

α-OH

H

H

α-OAc α-Me

H

Δ24-25

Me

COOH

p
o
C

Nguồn
gốc

TLTK

G.
lucidum

[17]

[1]


1.1.2.2.

Sterol

VN
U

Gần đây, Fa – Huan Ge và cộng sự (2017) lần đầu tiên phân lập được từ
dầu bào tử nấm Linh chi thu được bằng chiết xuất CO2 siêu tới hạn một sterol,
Ganoderin A, được chứng minh là cấu trúc trước đây chưa từng có [19].

ac
y,

Dưới đây là một số sterol đã được phân lập và xác định từ chi
Ganoderma.

dP
ha
rm

Bảng 1.4. Một số sterol phân lập dược từ chi Ganoderma
Sterol

Nguồn gốc

TLTK

1

Ergosterol

G.lucidum

[20, 19]

2

Fungisterol

G.lucidum

[18]

3

5α-ergost-7-en-3β-ol, 5αergosta-7,22-dien-3β-ol

4

5,8-epidioxy-5α,8αergosta-6,22-dien-3β-ol

G.annulare

[43]

5

Stellasterol

G.lucidum

[19]

an

STT

[43]

M

ed
ic

ine

G.annulare

Polysaccharit

of

1.1.2.3.

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

Polysacchrit của linh chi là các polymer thiên nhiên, có cấu trúc đa dạng
và phức tạp [10]. Cho đến nay, hơn 200 polysaccharit đã được phân lập từ bào
tử, sợi nấm và cơ thể đậu quả của chi Ganoderma (Huie và Di, 2004). Nhưng
polysaccharit chỉ gồm 2 loại chính và tỉ lệ các thành phần có trong mỗi loại như
sau: GL – A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Glactan, cịn GL – B có
thành phần chính là Glu, nên gọi là Glucan [35]. Theo các báo cáo trước đây,
các polysacharit của chi Ganoderma chủ yếu bao gồm glucan, galactan và/hoặc
các heteropolysaccharit khác bao gồm một số monosaccharit như glucose,
galactose, mannose và fucose [50]. Hầu hết các GPs hình thành từ 3 chuỗi
monosaccharit, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN.
Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100.000
- 1.000.000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM). Một phần
9


VN
U

polysaccharit phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước
nóng [2].
1.1.3. Tác dụng sinh học

dP
ha
rm

ac
y,

Từ thời xa xưa, trong các tài liệu y học cổ đã ghi nhận nhiều tác dụng
bảo vệ sức khỏe của nấm Linh chi đối với cơ thể. Ngày nay, khi nền khoa học
hiện đại ngày càng phát triển, đặc biệt là lĩnh vực phân tử học và dược lý dược
lâm sàng, hàng trăm những cơng trình nghiên cứu đã cơng bố, một lần nữa
khẳng định tính năng, cơng dụng của lồi thảo dược quý này. Kết quả của các
nghiên cứu khoa học này cho rằng tác dụng sinh học của chi Ganoderma chủ
yếu do triterpen và polysaccharit đem lại.
Tác dụng gây độc tế bào và chống ung thư

an

1.1.3.1.

ed
ic

ine

Tác dụng chống ung thư của các loài nấm Linh chi đã và đang được quan
tâm, nghiên cứu và ứng dụng nhiều. Nhiều cơ sở khoa học về tác dụng này của
nó đã được công bố.

Sc

ho
ol

of

M

Axit ganoderic T (GA-T) gây ra sự giảm sự tăng sinh của một số tế bào
ung thư. Nó có độc tính tế bào cao hơn đối với dịng tế bào ung thư phổi 95-D
so với các dòng tế bào bình thường. Khả năng tồn tại của các tế bào 95-D đã bị
ức chế 70% ở liều 50 μg/mL trong 24 giờ bởi GA-T. GA-T ở nồng độ thấp cũng
có thể ức chế mạnh sự hình thành các khuẩn lạc tế bào 95-D. Chen và cộng sự
chứng minh rằng GA-T ức chế thành công sự xâm lấn tế bào ung thư trong ống
nghiệm và di căn trong thí nghiệm in vivo, do đó GA-T có thể hoạt động như
một loại thuốc tiềm năng để điều trị ung thư [45].

py

rig

ht

@

Gao và cộng sự đã nghiên cứu các tác dụng chống độc in vivo của
ganoderiol F, cho thấy hoạt động mạnh nhất trong xét nghiệm độc tế bào. Nó
được dùng cho chuột mang tế bào ung thư biểu mô tế bào phổi (LLC) của Lewis
với ba liều 5, 10 và 20 mg/kg/ngày. Ganoderiol F ức chế đáng kể sự phát triển
khối u. Trong khi đó, khơng có tác dụng phụ hoặc độc hại rõ ràng nào được
nhận thấy [15].

Co

Su và cộng sự (2000) đã kiểm tra hoạt động gây độc tế bào của lanostan
từ G. tsugae và tìm thấy hoạt động chống lại ba dòng tế bào ung thư. Lanostan
và một steroid từ G. tsugae đã gây chết tế bào do apoptosis và cho rằng đó là
10


ac
y,

VN
U

sterol sở hữu hoạt động ức chế chu kỳ tế bào (Gan và cộng sự, 1998a). Gonzalez
và cộng sự (2002) cũng đã quan sát thấy apoptosis trong các tế bào ung thư
bạch cầu ở người tiếp xúc với ba lanostanoid phân lập từ G.concinna. Ngược
lại, ba triterpen từ G. concinna đã ức chế DNA polymerase của bê và chuột có
liên quan đến sửa chữa DNA, tái tổ hợp và sao chép DNA (Mizushina và cộng
sự, 1999) [38].

dP
ha
rm

Triterpen được coi là tác nhân chống ung thư tiềm năng do hoạt động
chống lại các khối u đang phát triển (Lin và cộng sự, 2003): chúng gây độc tế
bào trực tiếp chống lại các tế bào khối u (Gonzalez và cộng sự, 2002) [38].

ed
ic

ine

an

Polysacharit phân lập từ chi Ganoderma làm tăng phản ứng miễn dịch
chống khối u bằng cách thúc đẩy hoạt động của các tế bào diệt tự nhiên và tế
bào lympho T gây độc tế bào [37]. Ngồi ra, các nó cũng được công nhận để
cải thiện sự biểu hiện của phức hợp tương hợp mơ, chủ yếu trong dịng tế bào
u ác tính, giúp cải thiện q trình trình diện kháng ngun và do đó kích thích
kháng virut và ung thư [44]. Polysaccharit thường không tác động trực tiếp gây
đến độc tế bào trong các tế bào khối u, nhưng tác động đến các hoạt động chống
khối u thông qua việc tăng cường miễn dịch qua trung gian của vật chủ [15].

of

M

Theo các nghiên cứu mới nhất của Wiater và cộng sự, các α- D -glucan
được phân lập từ G. lucidum thể hiện hành động gây độc tế bào liên quan đến
các tế bào ung thư HeLa biểu mô ở người [42].

@

Sc

ho
ol

Một số nghiên cứu in vivo đã chứng minh rằng polysaccharit (β- D glucan, heteropolysaccharit và glycoprotein) được phân lập từ Ganoderma có
hoạt tính chống khối u sarcoma 180 ở chuột. Sự kích thích của hệ thống miễn

dịch, được trung gian bởi các polysaccharit, có thể là cơ chế chính giải thích
cho khả năng chống khối u của nấm Linh chi. Trong số rất nhiều polysaccharit,
β- D -glucan chịu trách nhiệm chính cho các hiệu ứng chống độc [48].

Co

py

rig

ht

Isocitrate dehydrogenase (IDH) là một trong những enzyme quan trọng
trong chu trình acid tricarboxylic, và đột biến IDH có liên quan đến nhiều bệnh
ung thư. Bằng phương pháp sàng lọc phối tử ảo, phát hiện rằng sterol có tiềm
năng ức chế IDH1. Như vậy, phát hiện của Zheng M và cộng sự nhấn mạnh
rằng hợp chất sterol từ Ganoderma sinense có thể có tiềm năng lâm sàng trong
các liệu pháp khối u như một chất ức chế hiệu quả của IDH1 đột biến [51].
11


dP
ha
rm

ac
y,

VN
U

Hexokinase 2 (HK2), một enzyme giới hạn tốc độ trong bước đầu tiên
của con đường glycolysis. HK2 cung cấp một mục tiêu mới cho điều trị ung
thư do vai trò then chốt của nó trong q trình khối u và di căn khối u. Việc
sàng lọc phối tử ảo dựa trên cấu trúc trong một cơ sở dữ liệu nhỏ các sản phẩm
tự nhiên đã dự đoán rằng một steroid mới, (22E, 24R) -6β-methoxyergosta-7,9
(11), 22-triene-3β, 5α-diol từ Ganoderma sinense có ái lực liên kết cao với
HK2. Kết quả nghiên cứu in vitro của Bao F và cộng sự đã khẳng định rằng
sterol này là chất ức chế HK2 tự nhiên đầu tiên, nó có thể được coi là một ứng
cử viên thuốc tiềm năng nhắm mục tiêu tại HK2 để điều trị ung thư [12].

an

Ngai và cộng sự đã phân lập được một lectin từ G. capense thể hiện hoạt
động giảm thiểu mạnh đối với tế bào lách chuột và hoạt động chống tăng sinh
đối với các tế bào ung thư bạch cầu và tế bào gan trong ống nghiệm [36].
1.1.3.2.

Tác dụng chống oxi hóa, bảo vệ gan

of

M

ed
ic

ine

Trong số các thành phần hóa đã được phân lập và xác định của chi

Ganoderma thì terpen được chứng minh là phần có hoạt tính chống oxy hóa
cao nhất [15]. Sự gia tăng các enzym chống oxy hóa chủ yếu được đóng góp
bởi axit ganoderic. Nó có thể kích hoạt yếu tố hạt nhân erythroid 2 liên quan
đến yếu tố 2 (Nrf2), từ đó khởi đầu sự biểu hiện của các gen chống oxy hóa
(SOD, CAT và GPx) và do đó tăng cường nồng độ enzyme chống oxy hóa (Ko
và cộng sự 2008) [29].

ht

@

Sc

ho
ol

Trong một thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, Chu cùng cộng sự (2012)
suy ra rằng do sự hiện diện của lanostan triterpen có thể góp phần vào việc hạ
lipid máu. Kết quả đánh dấu gan và siêu âm bụng cho thấy lanostan triterpen
có thể cải thiện chức năng gan (bảo vệ gan) bằng cách giảm căng thẳng oxy
hóa (ROS), lắng đọng lipid và do đó làm giảm tổn thương gan cũng như bình
thường hóa các tình trạng bất thường khác nhau như gan nhiễm mỡ và polyp
túi mật [14].

py

rig

Các nghiên cứu này đã chứng minh tính chống oxy hóa, chống lão hóa
và bảo vệ gan của triterpen bằng cách kiềm chế stress oxy hóa một cách hiệu

quả.

Co

Ngồi ra, tác dụng chống oxi hóa của các lồi nấm Linh chi cịn được
chứng minh qua hoạt tính sinh học của polysaccharit. Một nghiên cứu chéo
12


dP
ha
rm

ac
y,

VN
U

ngẫu nhiên, mù đôi đã được thực hiện giữa viên nang là dịch chiết nấm Linh
chi được làm giàu polysaccharit (GL) và viên nang giả dược với 90% là tinh
bột được thực hiện bởi Hui Fang Chiu và cộng sự. Kết quả nghiên cứu thu được
ở các đối tượng được điều trị GL cho thấy sự giảm đáng kể mức độ của các dấu
hiệu stress oxy hóa khác nhau. Hơn nữa, các tổn thương gan đã được bình
thường hóa khi điều trị bằng GL. Do đó, nhóm tác giả đã kết luận rằng GL được
làm giàu với polysaccharit có thể ảnh hưởng đến hiệu quả chống oxy hóa, chống
lão hóa và bảo vệ gan thông qua việc làm giảm quá mức các gốc tự do và do
đó bảo vệ tế bào khỏi bị hư hại [14].

ine

an

Năm 2011 Kao cùng các cộng sự báo cáo rằng β-1,3-glucan (một glucan
trọng lượng phân tử thấp) được phân lập từ G. lucidum có thể tăng đáng kể
(40% - 80%) khả năng sống sót của dòng tế bào đại thực bào bạch cầu đơn nhân
chuột (RAW 264,7) với stress oxy hóa do H2O2 gây ra, và giảm sự hình thành
các loại gốc tự do oxy hóa (ROS) [27].
Tác dụng kháng virut

ed
ic

1.1.3.3.

@

Sc

ho
ol

of

M

HIV là virut gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS).
Phương pháp điều trị hiện tại cho HIV là hoãn sự phát triển của AIDS. Một số
triterpen của các loài nấm Linh chi (ganoderic acid beta, lucidumol B,
ganodermanondiol, ganodermanontriol và ganolucidic acid A) đã được chứng

minh là có hoạt tính chống suy giảm miễn dịch ở người, với giá trị IC50 là 2090 microM [32]. Hai terpen: axit lucidenic O và lucidenic lactone, đã ức chế
men sao chép ngược loại 1 của HIV [36]. Nhiều nghiên cứu vẫn cần được thực
hiện để tạo cơ sở cho việc khẳng định các loài nấm Linh chi là tác nhân chống
HIV, tuy nhiên triterpen dường như vẫn là nhóm hợp chất chính có tác dụng
chống HIV [15].

rig

ht

Một số nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng polysacharit của Ganoderma
lucidum hòa tan trong nước đã ức chế đáng kể virut herpes simplex HSV-1 và
HSV-2 [28].

py

1.1.3.4.

Tác dụng kháng vi khuẩn, kháng nấm

Co

Heleno và cộng sự báo cáo rằng chiết xuất methanol của nấm Linh chi
cho thấy hoạt động chống lại Staphylococcus aureus và Bacillus cereus cao hơn
13


ac
y,

VN
U

so với kháng sinh ampicillin và streptomycin, trong khi Staphylococcus aureus
và Bacillus cereus là những vi khuẩn nhạy cảm nhất. Nồng độ ức chế tối thiểu
nằm trong khoảng 0,0125-0,75 mg/mL và nồng độ diệt khuẩn là 0,035-1,5
mg/mL [22]. Như vây, polysaccharit cho thấy hoạt động kháng khuẩn, ức chế
sự phát triển của vi khuẩn hoặc gây ra cái chết của vi khuẩn gây bệnh. Tuy
nhiên, các cơ chế hoạt động chống vi khuẩn của nấm Linh chi vẫn chưa được
xác định rõ ràng [15].

dP
ha
rm

Các hợp chất sterol của G.applanatum, được tìm thấy có hoạt tính phổ
kháng khuẩn rộng và tác dụng diệt khuẩn [15]. Ganomycins A và B từ
G.pfeifferi thể hiện hoạt động chống lại vi khuẩn Gram âm và Gram dương
[34].

an

Ngoài ra, Wang và cộng sự đã phân lập được protein kháng nấm 15 kDa,
được xác định là ganodermin, từ G.lucidum [45].
Tác dụng trên hệ thần kinh

ine

1.1.3.5.

ho
ol

of

M

ed
ic

Stress oxy hóa là một lý do cho sự tiến triển của nhiều bệnh thối hóa
thần kinh như bệnh Parkinson, bệnh Huntington, bệnh xơ cứng teo cơ và bệnh
Alzheimer (AD). Một trong những cách tiếp cận để điều trị AD là kiểm soát
chức năng của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine trong não thông qua việc
ức chế acetylcholinesterase (AChE). Zhang và cộng sự đã báo cáo rằng hỗn
hợp các hợp chất triterpen trong G.lucidum thúc đẩy sự tồn tại của tế bào thần
kinh và giảm mệt mỏi. Và người ta đã chứng minh rằng việc tiếp tục uống
G.lucidum có thể cắt giảm sự tiến triển của bệnh Alzheimer [49].

rig

ht

@

Sc

Bên cạnh đó, nghiên cứu của Huang và cộng sự cho thấy rằng
polysaccharit của nấm Linh chi cũng đại diện cho một sản phẩm tự nhiên có
tiềm năng lớn trong việc ngăn ngừa và điều trị sớm AD. Phát hiện của nhóm

tác giả cho thấy polysaccharit có thể phục vụ như một tác nhân trị liệu tái tạo
để điều trị suy giảm nhận thức liên quan đến các bệnh thối hóa thần kinh [23].

Co

py

Ngồi ra, từ thời cổ đại, G.lucidum được sử dụng như một thuốc giảm
đau và có đặc tính thư giãn [15], Matsuzaki và cộng sự cũng đã báo cáo rằng
chiết xuất nước giàu polysaccharit thể hiện tác dụng chống trầm cảm và giảm
hành vi lo lắng ở chuột [33].
14


1.1.3.6.

Tác dụng khác

VN
U

Sterol phân lập từ nấm Linh chi đã được chứng minh là có tác dụng ức
chế tổng hợp cholesterol trong ống nghiệm [28].

dP
ha
rm

ac
y,

Nucleoside, uridine và uracil từ sợi nấm của một loài nấm Linh chi G.capense đã được tìm thấy có khả năng làm giảm mức độ aldolase trong huyết
thanh của những con chuột bị chứng thiếu máu thực nghiệm. Adenosine cũng
đã được chứng minh là ức chế kết tập tiểu cầu [23, 39].

Tổng quan về đối tượng nghiên cứu - Nấm Cổ cò.

of

1.2.

M

ed
ic

ine

an

Như vậy, từ những bằng chứng nghiên cứu khoa học và kinh nghiệm sử
dụng trong y học cổ truyền từ xa xưa, các loại nấm Linh chi đã được báo cáo
là có một số tác dụng dược lý bao gồm: điều hòa miễn dịch, chống xơ vữa động
mạch, chống viêm, giảm đau, giảm một số tác dụng phụ do hóa trị liệu gây ra,
chống ung thư, thúc đẩy giấc ngủ, kháng khuẩn, kháng virut (HBV, HSV, ...
cho tới HIV), bảo vệ gan, hạ lipid máu, bảo vệ tế bào thần kinh, chống dị ứng,
chống oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do triệt để, chống lão hóa, hạ đường huyết,
hoạt động estrogen và đặc tính chống lt. Điển hình là Ganoderma lucidum
hiện đã được công nhận là một chất bổ trợ thay thế trong điều trị bệnh bạch cầu,
ung thư biểu mô, viêm gan và tiểu đường [13].

rig

ht

@

Sc

ho
ol

Nấm Cổ cị có tên khoa học là Ganoderma flexipes Pat., được cho là có
nguồn gốc từ Việt Nam. Bằng chứng đã được trình bày trong các nghiên cứu
phát sinh gen trước đây rằng đây là một loài độc lập (Cao và cộng sự, 2012;
Wang và cộng sự, 2012), được tìm thấy rộng rãi trên khắp châu Á cận nhiệt đới
và nhiệt đới. Cao và cộng sự (2012) đề xuất rằng Ganoderma atrum,
Ganoderma calidophilum, Ganoderma hhaiense (J.D. Zhao và cộng sự, 1979)
và Ganoderma parviungulatum (J.D. Zhao & X.Q. Zhang, 1986) tất cả được
mô tả từ tỉnh Hải Nam, Trung Quốc của Giáo sư Ji-Ding Zhao và các đồng
nghiệp của ông là từ đồng nghĩa của G.flexipes [52].

Co

py

Vị trí phân loại của Ganoderma flexipes Pat.
Giới

: Mycota hay Fungi

Ngành

: Eumycota

Ngành phu ̣ : Basidiomycotina
15


M

VN
U
ac
y,

ed
ic

ine

an

dP
ha
rm

Lớp
: Hymenomycetes
Lớp phu ̣

: Hymenomycetidae
Bộ
: Ganodermatales
Họ
: Ganodermataceae
Chi
: Ganoderma
Đặc điểm sinh học của Ganoderma flexipes Pat.

Co

py

rig

ht

@

Sc

ho
ol

of

Hình 1.4. Nấm Cổ cị – Ganoderma flexipes Pat., thu tại Tây Nguyên
a. Quả thể b. Bào tử c. Bào tầng
Ghi chú: Thước đo tự nhiên = 2cm, thước đo hiển vi 2µm,
thước đo bào tầng = 0.5 mm

Quả thể có màu nâu đỏ. Mũ nấm khi non có dạng vịi, sau phát triển thành
dạng quạt hay móng nhỏ. Mặt trên mũ nấm có cấu trúc vịng đồng tâm và vân
thớ phóng xạ. Mép mũ tà, ít lượn sóng và khơng chia thùy. Bề mặt mũ nấm gồ
ghề, có màu nâu đỏ. Kích thước quả thể khoảng 1,5-10 x 1,0-7,0 cm; dày 0,51,0 cm.
Thịt nấm chất lie cứng, khi non màu trắng, sau đó chuyển sang màu nâu.
Hệ sợi dimitric gồm sợi không vách ngăn ngang và sợi bện; kích thước
từ 1,5-7,0 µm. Hệ sợi trong nuôi cấy trên môi trường thạch (môi trường thuần
khiết) lúc đầu màu trắng, sau chuyển sang màu vàng nhạt.
Bào tầng dạng ống nhỏ, mỗi milimet có 4-7 ống, miệng ống nấm tròn
đều. Miệng ống nấm khi non màu trắng, khi già chuyển sang màu vàng nhạt.
16