(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu IN VITRO của cao giàu saponin sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem) và tam thất hoang (panax stipuleanatus h t tsai et k m feng)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ac
y,

VN
U

KHOA Y – DƯỢC

dP

ha

rm

LÊ THỊ THANH HOA

dic

ine

an

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG
CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU IN VITRO
CỦA CAO GIÀU SAPONIN SÂM VŨ DIỆP
(Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG

Sc

ho

ol

of

Me

(Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)

Co
p

yri

gh

t©

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2018


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, ĐHQGHN, Bộ

VN
U

môn Dược lý – Dược lâm sàng, Bộ môn Y Dược học cơ sở, các thầy cô giáo trong
khoa đã tạo điều kiện học tập, nghiên cứu cho em trong thời gian qua, giúp em hồn
thành chương trình học.

ac
y,

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Vũ Thị Thơm, PGS.TS.
Dương Thị Ly Hương, hai giảng viên mẫu mực dẫn dắt em từ những ngày đầu tiên

rm

của đề tài, truyền cho em nhiều động lực và kiến thức quý báu giúp em hoàn thành

ha

khoa luận một cách tốt nhất.

dP

Em cũng xin cảm ơn đề tài thuộc chương trình Tây Bắc: “Ứng dụng các giải
pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai

ine

an

loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panaxbipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax
stipuleanatus H.Tsaiet K.M. Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-18 đã
tài trợ kinh phí giúp em hồn thành nội dung nghiên cứu này. Cảm ơn Khoa xét

nghiệm Huyết Học, Bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện cho em thực hiện thí nghiệm.

dic

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè, đặc biệt là

Me

mẹ em đã ln quan tâm, hỗ trợ, động viên giúp em hồn thành khóa luận này.

of

Lần đầu viết khóa luận, mặc dù rất cố gắng nhưng khó tránh được sai sót.
Em rất mong nhận được sự góp ý của thầy cơ để khóa luận được hồn thiện hơn.

Co
p

yri

gh

t©

Sc

ho

ol

Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Lê Thị Thanh Hoa


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Giải nghĩa
Acid arachidonic
Adenosin diphosphat
Adenosin monophosphat
Adenosin triphotphat

CADP
CEPI

Collagen Adenosin diphotphat (Collagen+ADP)
Collagen Epinephrin

COX-1
CT

Cyclooxygenase 1
Thời gian lấp kín (Closure time)

EtOH
GP
IC 50

Alcol etylic
Glycoprotein
Liều ức chế 50 % đối tượng thử (Inhibitory concentration

LC 50
MDA

50%)
Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%)
Malondialdehyde

MPA

Độ ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet

Co
p

yri

gh

ac
y,

rm

ha

dP

an

ine

dic

Me

ol

ho
Sc

t©

TXA2
vWF
AUC
HMWK
PDGF
CTAP

aggregation)
Phần trăm ngưng tập tiểu cầu điểm cuối (Final platelet
aggregation)
Ngưng tập tiểu cầu
Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet Poor Plasma)
Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma)
Sâm vũ diệp

Tam thất hoang

of

FPA
NTTC
PPP
PRP
SVD
TTH

VN
U

Kí hiệu
AA
ADP
AMP
ATP

Thromboxan A2
Von-Willerbrand
Diện tích dưới đường cong
Kininogen cao phân tử (High molecular weight kininogen)
Yếu tố phát triển (platelet derived growth factor)
Peptid hoạt hóa tổ chức liên kết (connective tissue
activating peptid)


DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên Bảng

Trang

Bảng 3.1

Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) của cao giàu saponin

Bảng 3.2

của Sâm vũ diệp
Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa của cao giàu saponin
Sâm vũ diệp

ac
y,

VN
U

STT

26
27

Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) của cao giàu saponin
Sâm vũ diệp

27

Bảng 3.4

Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) của cao giàu saponin
Tam thất hoang

29

Bảng 3.5

Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa của cao giàu saponin

Bảng 3.6

Tam thất hoang
Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) của cao giàu saponin

an

dP

ha

rm

Bảng 3.3

Co
p

yri

gh

t©

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

Tam thất hoang

30
30


DANH MỤC CÁC HÌNH

STT

Tên Hình

Trang

Sâm vũ diệp
Tam thất hoang

Hình 1.3
Hình 1.4
Hình 1.5

Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng
Cấu trúc của tiểu cầu
Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu của ADP

7
9
11

Hình 1.6

Quá trình ngưng tập tiểu cầu

12

Hình 1.7
Hình 2.1
Hình 2.2
Hình 2.3

Ngun lí của xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu

Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Sâm vũ diệp
Sơ đồ qui trình chiết cao giàu saponin Tam thất hoang
Qui trình đo độ ngưng tập tiểu cầu

15
19
20
22

Hình 2.4.
Hình 2.5
Hình 2.6

Đồ thị ngưng tập tiểu cầu trên in vitro với chất kết tập ADP
Chỉ số Slope
Chỉ số diện tích dưới đường cong – AUC

23
24
25

Hình 3.1

Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Sâm vũ diệp

28

Hình 3.2

Đồ thị ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Tam thất hoang

rm

ha

dP

an

ine

dic

Me
of
ol
ho
Sc
t©
gh
yri
Co
p

ac
y,

VN
U

Hình 1.1
Hình 1.2

3
3

31


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1

VN
U

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .....................................................................................3
1.1. Tổng quan về Tam thất hoang và Sâm vũ diệp ...............................................3

ac
y,

1.1.1. Đặc điểm thực vật .............................................................................................3
1.1.2. Thực trạng và phân bố ......................................................................................4

rm

1.1.3. Công dụng và tác dụng dược lý của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang .............4

ha

1.1.4. Thành phần hóa học ..........................................................................................5

dP

1.2. Sinh lý học tiểu cầu ............................................................................................6
1.2.1. Cấu trúc tiểu cầu................................................................................................7

an

1.2.2. Chức năng tiểu cầu ............................................................................................9

ine

1.3. Các xét nghiệm đánh giá chức năng tiểu cầu ................................................13
1.3.1. Thời gian máu chảy .........................................................................................13

dic

1.3.2. Đo sức bền mao mạch .....................................................................................13

Me

1.3.3. Đếm số lượng tiểu cầu ....................................................................................14

of

1.3.4. Quan sát hình thái và độ tập trung của tiểu cầu trên tiêu bản nhuộm Giêmsa ........ 14

ol

1.3.5. Co cục máu đơng .............................................................................................14

ho

1.3.6. Đo độ dính tiểu cầu .........................................................................................15

Sc

1.3.7. Đo độ ngưng tập tiểu cầu ................................................................................15
1.4. Các thuốc kháng tiểu cầu ................................................................................16

t©

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................18

gh

2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu .............................................................18

yri

2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................21

Co
p

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................26
3.1. Kết quả ..............................................................................................................26
3.1.1 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Sâm vũ diệp ......................................26
3.1.2 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Tam thất hoang.................................29

3.2. Bàn luận ............................................................................................................32
3.2.1. Mơ hình nghiên cứu ........................................................................................32

VN
U

3.2.2. Kết quả nghiên cứu .........................................................................................33
3.2.4. Hạn chế của nghiên cứu ..................................................................................35
Kết luận ....................................................................................................................36

ac
y,

Đề xuất......................................................................................................................37

Co
p

yri

gh

t©

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

an

dP

ha

rm

TÀI LIỆU THAM KHẢO


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, huyết khối là một trong ba nhóm bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất
thế giới, là nguyên nhân gây tắc mạch máu, nhồi máu cơ tim, đột quỵ do thiếu máu

VN
U

cục bộ, hoại tử chi, thuyên tắc phổi, tăng huyết áp…[41]. Những nghiên cứu gần
đây cho thấy yếu tố có vai trị quan trọng bậc nhất đối quá trình hình thành huyết

ac
y,

khối là tiểu cầu. Sau khi được kích hoạt, tiểu cầu thực hiện quá trình bám dính, thay
đổi hình dạng, ngưng tập, phóng thích các chất làm tăng đáp ứng ngưng tập, tạo cục
máu đơng, dẫn đến hình thành huyết khối [23]. Trên lâm sàng, các thuốc kháng tiểu

rm

cầu là liệu pháp lý tưởng. Một số thuốc kháng tiểu cầu hiện có như: aspirin,
clopidogrel, prasugrel, và dipyridamol được sử dụng rộng rãi trong dự phịng và

dP

ha

điều trị huyết khối, bên cạnh những lợi ích, thuốc kháng tiểu cầu còn một số tác
dụng phụ như: gây chảy máu, loét dạ dày, giảm tiểu cầu. Những hạn chế trên thúc
đẩy việc nghiên cứu, phát triển thuốc kháng tiểu cầu mới mạnh hơn và ít tác dụng

ine

an

phụ hơn. Bên cạnh các thuốc tổng hợp, các thuốc có nguồn gốc tự nhiên cũng là đối
tượng được quan tâm nghiên cứu [41].
Việt Nam là vùng đất của nhiều loài thảo dược quý, trong đó có những cây

dic

thuốc được dân gian sử dụng từ hàng ngàn năm nay như các loại nhân sâm, tam

t©

Sc

ho

ol

of

Me

thất... Tuy nhiên, các thảo dược này từ bao đời nay vẫn chỉ được sử dụng trực tiếp
hoặc chế biến thành nguyên liệu thô, do vậy chưa phát huy được hết công dụng.
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus
H. T. Tsai et K. M. Feng) được xác định là loài cây quý hiếm và có nguy cơ tuyệt
chủng rất cao ở Việt Nam. Theo y học cổ truyền, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
dùng làm thuốc bổ như các loại Sâm khác, có tác dụng tăng lực, chống mệt mỏi,
giảm cholesterol, tăng cường sinh dục, chống stress [15]. Một số loài thuộc chi
Panax được nghiên cứu khá đầy đủ về dược lý, hóa học và độc tính. Tuy nhiên ở
Việt Nam và trên thế giới, số lượng các nghiên cứu về tác dụng sinh học và thành

Co
p

yri

gh

phần hóa học hai lồi cây này còn hạn chế. Các nghiên cứu về thành phần hóa học
cho thấy trong rễ, lá của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang có chứa saponin (chất có
khả năng chống ngưng tập tiểu cầu) với hàm lượng cao [13, 15, 36]. Giai đoạn trước
của đề tài, đã chứng minh được Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu
(NTTC) trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn
n-butanol, phân đoạn etylacetat có tác dụng ở các mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL, phân
đoạn ete các mức liều 1-2-5 mg/mL. Tam thất hoang có tác dụng ức chế ngưng tập
tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và mức liều: phân đoạn tổng ở mức liều 1-2-5

1


mg/mL, phân đoạn n-butanol ở mức liều 5 mg/mL, phân đoạn n-hexan các mức liều
0,5-1-2-5 mg/mL [19]. Saponin cũng là thành phần chính của phân đoạn n-butanol,
tuy nhiên butanol là một dung mơi hữu cơ, có ít nhiều độc tính nên trong sản xuất

VN
U

công nghiệp, người ta hạn chế dùng butanol để chiết xuất. Để khắc phục hạn chế
này, nhóm nghiên cứu của PGS. Đỗ Thị Hà (Viện Dược liệu) và Nguyễn Hữu Tùng

ac
y,

(Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội) đã đưa ra một quy trình chiết cao giàu
saponin mà không dùng butanol, với hiệu suất chiết cao Tam thất hoang là
20,59±0,27 %, Sâm vũ diệp là 14,44±0,14 % [8, 27]. Liệu cao này có cịn hoạt tính

rm

chống ngưng tập tiểu cầu khơng? Và tác dụng của nó so với phân đoạn n-butanol
như thế nào? Để trả lời những câu hỏi này, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu

dP

ha

tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin của Sâm vũ
diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T.
Tsai et K. M. Feng)”, với mục tiêu:

Co
p

yri

gh

t©

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

an

1. Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Sâm vũ
diệp và Tam thất hoang trên in vitro.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

VN
U

1.1. Tổng quan về Tam thất hoang và Sâm vũ diệp
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Sâm vũ diệp, còn gọi là Trúc tiết nhân Sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ,
Hoàng liên thất, Vũ diệp tam thất. Tên khoa học: Panax bipinnatifidus Seem., thuộc

ac
y,

họ Nhân Sâm - Araliaceae [4, 20].

rm

Sâm vũ diệp là cây thảo sống nhiều năm; rễ dài có nhiều đốt và những vết
sẹo do thân rụng hằng năm để lại. Thân mảnh cao 10–20 cm, tới 50 cm, thường lụi

ha

vào mùa khô. Lá kép chân vịt, mọc vòng ba cái một, mang 3-7 lá chét mỏng, khơng
lơng, mép có răng đơi cạn hay sâu dạng thùy. Hoa màu trắng lục, xếp 20-30 cái

dP

thành tán đơn trên một trục dài 15-20 cm ở ngọn thân, cuống hoa cỡ 1 cm. Qủa
mọng, khi chín màu đỏ, chứa 1-2 hạt [4].

an

Tam thất hoang được gọi với các tên khác là Tam thất rừng, Dã tam thất,

dic

ine

Bình biên tam thất, Thổ tam thất. Tên khoa học: Panax stipuleanatus H. T. Tsai et
K. M. Feng, họ Nhân Sâm (Araliaceae) [4, 20], cây thân thảo cao 25-75 cm; thân rễ
mập, nằm ngang, có nhiều vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm

ol

of

Me

thường có một thân mang lá. Lá kép chân vịt, gần 1-3 cái, mọc vịng ở ngọn; cuống
dài 5-10 cm. Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thn hay mác thn, dài 5-13 cm,
rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm. Hoa màu vàng xanh với
năm lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô. Qủa mọng, gần hình cầu dẹt, đường
kính 0,6-1,2cm, khi chín màu đỏ. Hạt 1 hoặc 2, màu xám trắng [4, 25].

Co
p

yri

gh

t©

Sc

ho

Hai lồi Sâm vũ diệp và Tam thất hoang có hình thái tương đối giống nhau. Điểm
khác biệt nhất là Sâm vũ diệp có lá xẻ thùy, cịn Tam thất hoang thì khơng [20].

Hình 1.1. Sâm vũ diệp

Hình 1.2. Tam thất hoang

3

1.1.2. Thực trạng và phân bố

ac
y,

VN
U

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được Seemann phát hiện lần đầu
tiên tại vùng núi Hymalaya của Ấn Độ và được công bố năm 1868 trên tạp chí J.
Botany. Trên thế giới, Sâm vũ diệp được tìm thấy ở Trung Quốc, bắc Myanma,
đơng bắc Ấn Độ và Nepal. Ở nước ta, Sâm vũ diệp phân bố hẹp ở vùng núi Hoàng
Liên Sơn (thuộc địa phận Sapa, Bát Xát, Lào Cai) và huyện Than Uyên (Lai Châu).
Sapa chính là điểm cực nam của bản đồ phân bố Sâm vũ diệp trên thế giới ( khoảng
23 độ vĩ Bắc) [21, 53].

an

dP

ha

rm

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) được hai nhà
khoa học người Trung Quốc cơng bố năm 1975 trên tạp chí Acta Phytotaxonomica
Sinica. Lồi này được tìm thấy đầu tiên tại khu rừng Mã Quan, Trung Quốc (phía
bắc Việt Nam) ở độ cao 1100-1700 m so với mặt nước biển. Cho đến nay, trên tồn

thế giới, lồi này mới chỉ tìm thấy ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở
Vườn Quốc gia Hoàng Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [20].

of

Me

dic

ine

Tại Việt Nam cho đến nay, các kết quả nghiên cứu cho thấy hai loài Sâm vũ
diệp và Tam thất hoang phân bố tự nhiên ở sườn tây bắc dãy Hoàng Liên Sơn và
một vài nhánh phụ cận kề, thuộc địa phận của 6 xã thuộc huyện Bát Xát và Sa Pa
của tỉnh Lào Cai [10, 20, 21]. Phạm vi phân bố của hai loài này rất hạn chế, các
quẩn thể của chúng được tìm thấy trong tự nhiên với kích thước rất nhỏ. Tuy nhiên
gần đây Sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một
số địa phương ở Hà Giang và Lào Cai [10].

ol

1.1.3. Công dụng và tác dụng dược lý của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang

t©

Sc

ho

Theo Đơng y, Tam thất hoang có vị ngọt, hơi đắng, tính ấm. Có tác dụng tư

bổ cường tráng, tiêu viêm giảm đau, khử ứ sinh tân và cầm máu. Sách đỏ Việt Nam
năm 2007 ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều có thể dùng làm thuốc. Thân rễ
thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress. Lá,
nụ, hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần” [4].

Co
p

yri

gh

Sâm vũ diệp vị đắng, nhạt, tính hàn, có tác dụng tư bổ cường tráng, tiêu
viêm, giảm đau, khư ứ sinh tân và cầm máu. Dược liệu từ Sâm vũ diệp là thân rễ, rễ
củ dùng cầm máu các loại vết thương và xuất huyết. Làm thuốc bổ chữa thiếu máu,
xanh xao gầy còm nhất là đối với phụ nữ sau sinh đẻ; cịn có tác dụng kích thích
sinh dục và được dùng trong điều trị vô sinh. Ở Vân Nam (Trung Quốc), người ta
dùng rễ củ chữa thổ huyết, chảy máu mũi, đòn ngã tổn thương, thương tổn bên
trong gây đau lưng [4].

4


Nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 công bố cao Tam thất hoang và
Sâm vũ diệp có tác dụng phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress, đưa về trạng
thái bình thường ở các liều thử nghiệm 44, 88, 176 mg/kg. Cao saponin toàn phần

VN
U

của Tam thất hoang có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA ở nồng
độ 25, 50, 100 µg/mL [13]. Năm 2009, nghiên cứu của Viện Dược liệu chỉ ra rằng

ac
y,

phân đoạn saponin của Tam thất hoang có hoạt tính chống oxy hóa – lipid
peroxidation, dịch chiết tổng ethanol có tác dụng chống trầm cảm ở liều 44-176
mg/kg trên chuột [14].

rm

Năm 2017, nghiên cứu của Lê Thị Tâm cho thấy Sâm vũ diệp có tác dụng ức
chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn

dP

ha

tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn etylacetat có tác dụng ở các mức liều 0,5-1-25 mg/mL, phân đoạn ete các mức liều 1-2-5 mg/mL. Tam thất hoang có tác dụng ức
chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và mức liều: phân đoạn tổng ở

1.1.4. Thành phần hóa học

dic

1.1.4.1. Sâm vũ diệp

ine

an

mức liều 1-2-5 mg/mL, phân đoạn n-butanol ở mức liều 5 mg/mL, phân đoạn nhexan các mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL) [19].

Co
p

yri

gh

t©

Sc

ho

ol

of

Me

Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá và thân rễ Sâm vũ diệp cho thấy có
nhiều saponin khung dammaran và oleanan. Năm 1989, Trung Quốc đã phân lập 13
saponin khung dammaran. Hai saponin mới đã được phân lập là bipinnatifidusoside
F1 và F2, cùng với 11 saponin đã biết từ lá khô của Sâm vũ diệp thu thập ở dãy núi
Qinling Trung Quốc. Saponin đã biết được xác định là ginsenosid F1, F2, F3, Rg2,
Re, Rd, Rb1, Rb3, 24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid và majorosid F1 [44].
Năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam- Hàn Quốc phân lập và xác định cấu trúc 10

saponin khung oleanan từ thân rễ Sâm vũ diệp, được thu hái ở Hồng Liên Sơn, Việt
Nam, trong đó có 3 chất mới là bifinosid A-C (1-3) và 7 hợp chất đã biết, bao gồm:
narcissiflorine methyl ester (4), chikusetsusaponin IVa (5), pseudoginsenoside RP1
methyl ester (6), stipuleanoside R1 (7), pseudoginsenoside RT1 methyl ester (8),
momordinIIe (9), và stipuleanoside R2 methyl ester (10) [40]. Năm 2015, nhóm tác giả
Viện Dược liệu bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học của Sâm vũ diệp, kết quả là đã
phân lập được một hỗn hợp saponin (11) bao gồm: stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid
(11A) và β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (11B), glycosphingolipid: 1-O-(β-Dglucopyranosyl)-N-(1,3,4-trihydroxytridec-8-en-2-yl) heptacosanamid (12), dichaccarid:
saccharose (13), saponin: 28-desglucosylchikusetsusapnin IV (14) từ phân đoạn chiết
ethyl acetat thân rễ Sâm vũ diệp. Đây là lần đầu tiên một số hợp chất trên được công

5


ac
y,

VN
U

bố phân lập từ cây này [9]. Năm 2017, rễ Sâm vũ diệp thu hái ở Sa Pa, Lào Cai đã
được nhóm nghiên cứu Khoa Y Dược xác định được 3 cấu trúc hóa học trên cơ sở
phân tích quang phổ và so sánh với chất tham khảo, bao gồm: Stigmast-5-en-3-ol
hay còn gọi là β-sitosterol (1), acid oleanolic (2) và daucosterol (3) từ phân đoạn
cao chiết etyl acetate của cao chiết tổng ethanol Sâm vũ diệp [11]. Trong ba chất
phân lập được thì oleanolic acid là sapogenin của các saponin khung olean có ý
nghĩa trong đánh giá hàm lượng tổng saponin có trong Sâm vũ diệp [10].
1.1.4.2. Tam thất hoang

Co

p

yri

gh

t©

Sc

ho

ol

of

Me

dic

ine

an

dP

ha

rm

Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của Tam thất
hoang được cơng bố. Một số nghiên cứu tập trung vào phần thân rễ của loài này chỉ
ra rằng phần thân rễ Tam thất hoang chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết
đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số
saponin khung dammaran với hàm lượng thấp. Năm 1985, nhóm các nhà nghiên
cứu ở Trung Quốc phân lập 2 saponin loại dẫn chất acid oleanolic và đặt tên là
stipuleanosid R1 và stipuleanosid R2 từ thân rễ Tam thất hoang [43]. Năm 2002,
trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama
(Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran gồm các
ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ dich chiết ethanol của Tam
thất hoang được thu hái ở Trung Quốc [36]. Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun
Liang đã phân lập được 11 hợp chất saponin từ mẫu Tam thất hoang thu hái ở Việt
Nam trong đó có 1 chất mới là spinasaponin A methyl ester (1) [33]. Năm 2013,
nhóm tiếp tục phân lập được 4 hợp chất saponin nữa đều là các saponin khung
oleanan [38]. Ngồi ra, nhóm nghiên cứu cũng đã phân lập được một số hợp chất
khác từ Tam thất hoang gồm 2 polyacetylen mới (stipudiol và stipuol), 1
polyacetylen đã biết (3R,9R,10R)- panaxytriol và các hợp chất khác: spathulenol
(serquiterpen) và 9- docosenoic acid methyl ester (acid béo) [48]. Ở Việt Nam,
nghiên cứu về thành phần hóa học của Tam thất hoang vẫn cịn mới mẻ. Năm 2002,
Trần Cơng Luận đã phát hiện sự có mặt của hai nhóm chất chính là polyacetylen và
saponin cùng với acid béo, acid amin, tanin bằng phương pháp thử định tính hóa
học và phân tích sơ bộ sắc ký lớp mỏng [14]. Đồng thời bằng cách thủy phân
saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu được acid oleanolic [13].
1.2. Sinh lý học tiểu cầu
Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhất, khơng có nhân, đường kính 3-4 µm, được
sản xuất từ mẫu tiểu cầu, nguyên mẫu tiểu cầu bắt đầu từ tế bào nguồn dòng tủy, do
tế bào gốc sinh máu tạo nên. Mỗi mẫu tiểu cầu có thể tạo được 3000 tiểu cầu. Số

6

lượng tiểu cầu lưu hành ở máu ngoại vi khoảng 150 - 450 × 109/L [18, 29]. Tiểu cầu
có đời sống ngắn, khoảng từ 8-14 ngày. Hiện nay có thể giữ tiểu cầu trong 7 ngày
ngoài cơ thể ở nhiệt độ 20-22 °C, lắc liên tục [18].

VN
U

1.2.1. Cấu trúc tiểu cầu.

Tiểu cầu có một cấu trúc phức tạp gồm 4 khu vực: khu ngoại vi, khu sol-gel,

ac
y,

khu bào quan và khu màng
Khu ngoại vi

rm

Khu ngoại vi gồm lớp màng tiểu cầu kết nối với hệ thống các ống mở. Màng
tiểu cầu gồm hai lớp lipid bao quanh tiểu cầu. Màng tiểu cầu chứa các glycoprotein

dic

ine

an

dP

ha

quan trọng đóng vai trị như các receptor bề mặt liên quan đến q trình đơng máu
[52]. Glycoprotein Ib (GPIb): là protein xuyên màng có nhiệm vụ liên kết với yếu tố
wWF giúp cho tiểu cầu dính bám vào collagen. Đây là bước đầu tiên trong hoạt
động đông cầm máu của tiểu cầu [18, 29]. Glycoprotein IIb/IIIa (GPIIb/IIIa): là
protein màng, hoạt động phụ thuộc vào ion canxi, có nhiệm vụ liên kết với
fibrinogen, giúp cho tiểu cầu ngưng tập tạo thành đinh cầm máu [18, 29]. Ngồi ra,
các phospholipid điện tích âm, đặc biệt phosphatidylserine (PS) có vai trị quan
trọng trong q trình đơng máu, là chất nền ban đầu cho các phản ứng enzym tiểu

of

Me

cầu để tạo ra thromboxan A2 (TXA2), sản phẩm quan trọng trong q trình hoạt
hóa tiểu cầu và là chất chủ vận mạnh gây nên quá trình ngưng tập tiểu cầu. Màng
tiểu cầu cũng có khả năng nhận và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học

Co
p

yri

gh

t©

Sc

ho

ol

bên trong [17, 52].

Hình 1.3. Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng [29]

7


Hệ thống các kênh mở gồm các kênh mở vào trong tiểu cầu như các khơng
bào làm tăng diện tích bề mặt tiểu cầu, các hạt tiểu cầu phóng thích các chất qua hệ
thống kênh này [18]. Hệ thống ống dẫn từ trong bào tương của tiểu cầu ra đến lớp

VN
U

màng ngoài, tạo thành các lỗ nhỏ li ti trên bề mặt tiểu cầu. Hệ thống này đóng vai
trị như một đường dẫn cho các chất từ bên ngồi mơi trường đi vào trong tế bào

ac
y,

chất của tiểu cầu và là nơi đưa các chất được giải phóng từ các hạt ra khỏi tiểu cầu
khi chúng bị hoạt hóa [7].
Khu sol-gel

ha

rm

Khu sol-gel nằm dưới khu ngoại vi gồm các vi ống và vi sợi. Vi ống nằm sát
màng tiểu cầu tạo nên khung đỡ và tham gia vào hoạt động co rút khi tiểu cầu bị

an

dP

kích thích [52]. Vi sợi gồm các sợi actin có liên hệ chặt chẽ với các vi ống và tham
gia vào hoạt động tạo giả túc của tiểu cầu [52]. Ngồi ra khu sol-gel cịn chứa
glycogen [28].
Khu bào quan

dic

ine

Khu bào quan gồm có các loại hạt và thành phần tế bào như các lysosom, ty
thể… Những bào quan này tham gia vào quá trình trao đổi chất, là nơi dự trữ enzym

gh

t©

Sc

ho

ol

of

Me

và một lượng lớn các chất khác có vai trị quan trọng với chức năng tiểu cầu [18,
23]. Hạt đặc chứa một số chất như ADP, ATP, GDP, GTP, serotonin, histamin,
canxi, magie, pyrophosphat, nucleotid khác. Các chất này được giải phóng khi tiểu
cầu bị kích thích [18]. Hạt γ-gamma (Túi lysosome) chứa enzym như galactosidase,
fucosidase, hexosaminidase, glucuronidase. Hạt α chứa nhiều protein dính như
fibrin, fibronectin, vWF, thrombospondin, thromboglobulin, vitronectin; Yếu tố
phát triển (platelet derived growth factor - PDGF); Peptid hoạt hóa tổ chức liên kết
(CTAP: connective tissue activating peptid); Yếu tố 4 tiểu cầu; Yếu tố đông máu:
yếu tố V, kininogen, fibrinogen, yếu tố XI, protein S, chất ức chế yếu tố hoạt hóa
plasminogen. Hạt λ: làm tan cục máu đông trong giai đoạn sau của sự hồi phục
mạch [18, 37].

yri

Khu vực màng

Co
p

Khu vực màng gồm hệ thống ống dày đặc gắn với canxi một cách chọn lọc,
đóng vai trị là nơi dự trữ canxi của tiểu cầu. Đây cũng là nơi tổng hợp men
cyclooxygenase và prostaglandin của tiểu cầu [52].

8

VN
U
ac
y,
rm
ha

dP

Hình 1.4. Cấu trúc của tiểu cầu [29]
1.2.2. Chức năng tiểu cầu

ine

an

Chức năng chính của tiểu cầu là làm vững bền mạch máu, tạo nút cầm máu
ban đầu và tham gia vào q trình đơng máu huyết tương [17, 29].

dic

1.2.2.1. Vai trị của tiểu cầu trong q trình cầm máu
Trong trạng thái sinh lý bình thường, tiểu cầu khơng dính vào nội mơ mạch

ho

ol

of

Me

máu cịn ngun vẹn, khi khi tế bào nội mô thành mạch bị tổn thương tiểu cầu
nhanh chóng trải qua các q trình thơng qua một loạt các phản ứng phối hợp tinh
xảo, mà kết quả cuối cùng là hình thành một nút tiểu cầu tại nơi mơ tổn thương.
Q trình chuyển đổi tiểu cầu bất hoạt thành tiểu cầu hoạt hóa xảy ra theo một chiều
dọc liên tục nhưng có thể được chia thành các bước: bám dính, kết tập, phóng thích
các chất [7, 18, 23, 35].

Sc

Giai đoạn bám dính

t©

Tiểu cầu dính vào các bề mặt lạ những tổ chức dưới nội mạc bộc lộ khi mạch

Co
p

yri

gh

máu bị tổn thương (in vivo) hoặc bề mặt ống nghiệm thủy tinh, lam kính (in vitro) [17].
Trong thành mạch khỏe mạnh, tiểu cầu được duy trì ở trạng thái không hoạt động
bởi oxid nitric và prostacyclin từ tế bào nội mơ các mạch máu. Tế bào nội mơ cịn
chứa ADPase (adenosin diphosphatase) có tác dụng kìm hãm q trình kích hoạt

ADP. Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị mất đi và bộc lộ lớp dưới
nội mơ, lớp này có bản chất là các protein dính như: collagen, yếu tố von
Willebrand, fibronectin, lamilin…[7, 41, 52]. Yếu tố vWF tạo điều kiện cho sự bám
dính ban đầu, thơng qua liên kết với phức hợp GPIb/IX/V đóng vai trò thụ thể trên

9


màng tiểu cầu, vWF đóng vai trị quan trọng trong bám dính của tiểu cầu khi tốc độ
dịng máu cao. Trong điều kiện tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh, bám dính ban đầu
của tiểu cầu chủ yếu thơng qua liên kết collagen với GPIa/IIa. Những tương tác này

VN
U

cho phép tiểu cầu lưu thơng chậm lại đủ để có sự tương tác, ràng buộc hơn nữa của
các cặp thụ thể - phối tử dẫn đến sự bám dính tĩnh [7, 35]. Đặc biệt sự tương tác ban

ac
y,

đầu giữa collagen và GPVI gây ra sự kích hoạt GPIIb/IIIa và GPIa/IIa. vWF và
collagen hình thành liên kết mạnh mẽ tương ứng với GPIIb/IIIa và GPIa/IIa, fibrinogen
liên kết với GPIIb/IIIa giữ tiểu cầu tại chỗ [7, 12].

rm

Giai đoạn ngưng tập

ha

Là hiện tượng tiểu cầu tập trung thành nút qua hiện tượng dính. Hiện tượng

an

dP

dính đã hoạt hóa tiểu cầu, tạo điều kiện cho tiểu cầu ngưng tập [18]. Ngưng tập tiểu
cầu được đặc trưng bởi sự tích tụ tiểu cầu vào một nút cầm máu. Các thụ thể tiểu
cầu trung tâm trong quá trình này là GPIIb/IIIa, liên kết các tiểu cầu kích hoạt thơng

ine

qua cầu fibrinogen. Một tiểu cầu khơng hoạt hóa có khoảng 4.000-5.000 phức hợp
GPIIb/IIIa trên bề mặt của nó. Trong trạng thái không hoạt động, thụ thể này không
thể gắn với fibrinogen, vWF, TSP, fibronectin, vitronectin. Chỉ khi tiểu cầu được

dic

hoạt hóa, phức hợp GPIIb/IIIa mới được hoạt hóa, hoạt động như một thụ thể dành

of

Me

cho fibrinogen, chất này lại gắn với thụ thể trên các tiểu cầu khác tạo nên một cầu
nối làm cho các tiểu cầu ngưng tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa. Hai giai đoạn
ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau diễn ra liên tục cho đến
khi tạo thành nút tiểu cầu [7, 29, 35].

yri

gh

t©

Sc

ho

ol

Một số chất có khả năng gây ngưng tập tiểu cầu là: ADP, thrombin, adrenalin,
serotonin, acid arachidonic, thromboxan A2, collagen, ristocetin..., trong đó ADP
đóng vai trị quan trọng nhất vì chất này gây ngưng tập tiểu cầu một cách độc lập
không phụ thuộc các tác nhân khác và giúp cho phản ứng ngưng tập do các tác nhân
khác xảy ra đầy đủ hơn. Ngồi ra, ADP cịn có nguồn gốc từ hồng cầu. Những hồng
cầu tại vị trí thành mạch bị tổn thương sẽ bài tiết ADP và nhờ vậy làm tăng nhanh
nồng độ ADP khu trú tại chỗ tổn thương, góp phần làm tăng q trình ngưng tập tiểu
cầu, nhanh chóng tạo nút cầm máu ban đầu, làm ngừng chảy máu [17, 29].

Co
p

Sự ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP: Bình thường các tiểu cầu khơng
ngưng tập vì có năng lượng được tạo ra do sự thối hóa ATP thành ADP. Trong
trường hợp nồng độ ADP cao thì phản ứng này bị ức chế dẫn đến tiểu cầu bị ngưng
tập [23].

10

VN
U
ac
y,

rm

Hình 1.5. Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu của ADP [23]

ha

Acid arachidonic hoạt hóa ngưng tập tiểu cầu làm hoạt hóa phospholipid,

dic

ine

an

dP

giải phóng acid arachidonic. Acid arachidonic hoạt hóa men cyclooxygenase (có
trong hệ thống dày đặc) tạo prostaglandin và thromboxan A2 (thromboxan A2 có
tác dụng kích thích ngưng tập tiểu cầu). Thrombin gây ngưng tập tiểu cầu qua cơ
chế tác động lên yếu tố V có trên bề mặt tiểu cầu. Bởi vậy khi dùng men trypsin để
thủy phân yếu tố V thì tiểu cầu khơng cịn ngưng tập được nữa [23]. Adrenalin và
noradrenalin gây ngưng tập tiểu cầu theo cơ chế gián tiếp thơng qua việc phóng

ho

ol

of

Me

thích ADP và trực tiếp kích thích sự ngưng tập qua vai trò của acid arachidonic
[23]. Sự ngưng tập do ristocetin xảy ra do sự kích thích yếu tố von-Willebrand gắn
với tiểu cầu tại vị trí của receptor GPIb. Vì vậy, nếu thiếu một trong hai yếu tố này
thì tiểu cầu khơng ngưng tập [18, 23]. Serotonin liên kết với thụ thể 5HT2A
khuếch đại cùng với ADP cho phản ứng của tiểu cầu, ngồi ra serotonin có thể
đóng vai trị gây đơng máu, làm tăng việc lưu giữ protein đông máu như
fibrinogen, thrombospondin trên bề mặt tiểu cầu [7].

t©

Sc

Sự ngưng tập tiểu cầu là một hiện tượng có thể phục hồi được tự nhiên. Qúa
trình phục hồi này là do sự có mặt của một hệ thống men ở trong huyết tương và
trong tiểu cầu; trong đó adenylat kinase đóng vai trị quan trọng nhất [23].

gh

Giai đoạn phóng thích các chất của tiểu cầu [23]

Co
p

yri

Dưới tác dụng của các yếu tố gây ngưng tập (ADP, thrombin), tiểu cầu sẽ bị
ngưng tập, tiếp theo sẽ xảy ra một loạt các biến đổi, đó là q trình thay đổi hình
dạng và phóng thích của tiểu cầu. Đây là một hiện tượng rất phức tạp, bao gồm sự
biến đổi về hình thái và sinh hóa của tiểu cầu. Cụ thể là những thay đổi về hình thái:
tiểu cầu phồng to lên, trải rộng ra, kết dính, ngưng tập, hình thành chân giả, mất hạt,
co lại. Sau đó tiểu cầu co rút, giải phóng ra một loạt thành phần như ADP,

11


serotonin, adrenalin, histamin, yếu tố III tiểu cầu, 5-hydroxy tryptamin, nucleotid và
một số men khác. Các hiện tượng sinh hóa xảy ra như: kích thích chuyển hóa tiêu
đường, thối hóa và tái tổng hợp từng phần ATP, ADP thành AMP, hoạt hóa

VN
U

thrombosterin. Hiện tượng này xảy ra có sự tham gia của thrombin, collagen và có
tiêu tốn năng lượng của tiểu cầu. Đây là hiện tượng vô cùng ý nghĩa trong việc bảo
vệ mạch máu khi mạch máu bị tổn thương.

ac
y,

Trong thực tế, các khả năng kết dính, ngưng tập, phóng thích của tiểu cầu có
sự gắn bó rất chặt chẽ với nhau, khả năng này thúc đẩy, tạo điều kiện, mở rộng cho

rm

khả năng khác xảy ra để đạt mục đích cuối cùng là thực hiện tốt các chức năng của

ho

ol

of

Me

dic

ine

an

dP

ha

tiểu cầu.

Sc

Hình 1.6. Quá trình ngưng tập tiểu cầu [35]

Hiện tượng dính hoạt hóa tiểu cầu, thay đổi hình dạng từ hình đĩa thành dạng

Co
p

yri

gh

t©

quả cầu nhỏ gọn, với phần mở rộng đuôi gai dài tạo điều kiện thuận lợi cho độ bám
dính. Tiểu cầu ngưng tập, cùng lúc với quá trình này, bên trong tế bào chất của tiểu
cầu xảy ra hiện tượng giải phóng hạt, các chất chứa bên trong hạt sẽ được giải
phóng ra mơi trường bên ngoài qua hệ thống kênh mở và thực hiện vai trò sinh học
của chúng [7, 18, 23].
1.2.2.2. Vai trò của tiểu cầu trong q trình đơng máu huyết tương
Ngay khi hiện tượng bám dính bắt đầu, tiểu cầu thay đổi hình dạng và chế
tiết chất tham gia quá trình khởi động đông máu HMWK, yếu tố này cùng với

12


kallikrein hoạt hóa yếu tố XII bước đầu của quá trình đơng máu. Một lượng nhỏ
thrombin được hình thành trên bề mặt của một số tế bào mang TF (tissue factor)
như: nguyên bào sợi, bạch cầu đơn nhân hoạt hóa hoặc tế bào nội mơ, lượng

VN
U

thrombin này khơng có khả năng để tạo ra một cục máu đông fibrin ổn định, nhưng
đủ để hoạt hóa tiểu cầu. Sau đó, tiểu cầu hoạt hóa liên kết các yếu tố đơng máu bởi

ac
y,

các thụ thể chuyên biệt. Tiểu cầu liên kết với các yếu tố V và VIII chống lại sự phân
cắt bởi hoạt tính protein C. Yếu tố XIa liên kết với thụ thể GPIb trên bề mặt tiểu cầu
và hoạt hóa yếu tố IX. Yếu tố Xa dễ dàng bị ức chế bởi TF. Sự phối hợp của các

rm

yếu tố đơng máu trên bề mặt tiểu cầu dẫn đến hình thành thrombin, vì vậy một cục
máu đơng ổn định fibrin được hình thành. Ngồi ra tiểu cầu cịn cung cấp khoảng

dP

1.3. Các xét nghiệm đánh giá chức năng tiểu cầu

ha

20 % yếu tố V và các yếu tố đông máu khác như fibrinogen, yếu tố IX, XIII [7].

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp đánh giá chức năng tiểu cầu như: đo thời

ine

an

gian máu chảy, đo sức bền mao mạch, đếm số lượng tiểu cầu, co cục máu đông, đo
độ dính tiểu cầu, đo độ ngưng tập tiểu cầu...

dic

1.3.1. Thời gian máu chảy

ol

of

Me

Nguyên lý là khi mạch máu bị tổn thương, máu sẽ thốt ra ngồi, đồng thời
hệ thống cầm máu bắt đầu hoạt động. Hoạt động cầm máu gồm vai trò của thành
mạch và của tiểu cầu. Chất lượng của hoạt động này không tốt sẽ làm cho thời gian
để cầm được máu dài hơn. Xét nghiệm thời gian máu chảy là tạo ra tổn thương
mạch máu và đo thời gian từ lúc máu chảy đến khi máu ngừng chảy [16].

Sc

ho

Nguyên lý của phương pháp Duke là dùng kim chủng tạo một vết thương
nằm ngang ở vùng giữa dái tai và đo thời gian máu chảy [12]. Trị số bình thường từ
2 – 4 phút [12, 23].

gh

t©

Ngun lý của phương pháp Ivy là đo thời gian máu chảy của các vết thương ở
mặt duỗi cẳng tay, dưới 1 áp suất đã định [12]. Trị số bình thường: 4-8 phút [12, 23].

yri

Phương pháp Borchgrevink có trị số bình thường từ 7-10 phút [23]

Co
p

1.3.2. Đo sức bền mao mạch
Có 2 phương pháp, nhưng phương pháp giảm áp ít dùng hơn phương pháp
tăng áp: dùng huyết áp kế, duy trì lực bằng trung bình cộng giữa huyết áp tối đa và
tối thiểu trong vịng 10 phút sau đó tháo hơi nhanh. Đếm số nốt xuất huyết ngay
dưới vùng dưới da nếp khuỷu. Nếu trên 7 nốt xuất huyết là dương tính. Sức bền

13


mao mạch giảm gặp trong một số bệnh lý: Giảm tiểu cầu, viêm thành mạch dị ứng,
viêm thành mạch do độc tố. Trong bệnh von-Willebrand, bệnh rối loạn chức năng
tiểu cầu. Ngồi ra cịn có thể gặp ở người già, thiếu vitamin C, do thể tạng hoặc có

VN
U

tính gia đình [16, 23].
1.3.3. Đếm số lượng tiểu cầu

ac
y,

Có rất nhiều phương pháp đếm tiểu cầu, nhưng phổ biến nhất hiện nay ở các
bệnh viện là đếm tiểu cầu bằng máy dựa trên nguyên lý trở kháng hoặc laser. Trị số
bình thường của tiểu cầu là 150.000 - 300.000/mm3. Số lượng tiểu cầu giảm gặp

ha

rm

trong: xuất huyết do giảm tiểu cầu có nguyên nhân miễn dịch, suy tuỷ xương,
leucemie cấp, sốt xuất huyết. Số lượng tiểu cầu tăng gặp trong: tăng tiểu cầu tiên

dP

phát, leucemie kinh dòng hạt, đa hồng cầu tiên phát [16, 23].

an

1.3.4. Quan sát hình thái và độ tập trung của tiểu cầu trên tiêu bản nhuộm
Giêmsa

dic

ine

Rất cần thiết phải làm đặc biệt ở các trường hợp nghi ngờ bệnh lý tiểu cầu.
Bình thường tiểu cầu bắt màu đỏ tím, khơng có nhân nhưng có các hạt màu đỏ và
đứng thành cụm nếu máu chưa qua chống đông. Độ tập trung tiểu cầu tăng trong:

of

1.3.5. Co cục máu đông

Me

tăng tiểu cầu tiên phát, leucemie kinh dòng hạt, đa hồng cầu tiên phát. Độ tập trung
tiểu cầu giảm gặp trong: Suy tuỷ xương, leucemie cấp [16, 23].

Sc

ho

ol

Có nhiều phương pháp khác nhau, tuy nhiên trong lâm sàng thường dùng kỹ
thuật của Budtz-Olzen. Đây là xét nghiệm đơn giản nhưng khá đặc hiệu. Đánh giá
sự co cục máu bằng cách quan sát cục máu đông sau 2 giờ. Nguyên lý của phương
pháp: máu ra khỏi thành mạch sẽ bị đông, máu đơng là máu chuyển thành dạng rắn
nhờ hình thành các sợi fibrin. Mạng lưới sợi fibrin ôm lấy các thành phần hữu hình

Co
p

yri

gh

t©

rồi co rút lại tạo nên cục máu đông tách rời khỏi phần huyết thanh. Cục máu đông
co được là nhờ vai trò của tiểu cầu và của fibrin [16, 23]. Cục máu co hồn tồn:

phản ảnh tình trạng bình thường của fibrrinogen và tiểu cầu (cả số lượng và chất
lượng). Cục máu không co (không tạo thành cục máu tách riêng rõ ràng với huyết
thanh) hay cục máu co khơng hồn tồn (phần huyết thanh tách ra ít dưới 30% máu)
hoặc co cục máu nhưng còn nhiều hồng cầu tự do trong huyết thanh) là thể hiện bất
thường của tiểu cầu (số lượng hoặc chất lượng) và/hoặc các fibrrinogen. Mức độ bất
thường càng nặng thì cục máu càng không co.

14


Xét nghiệm co cục máu phụ thuộc vào số lượng và chất lượng tiểu cầu,
lượng fibrinogen, yếu tố VIII và hematocrit [16, 23].

VN
U

1.3.6. Đo độ dính tiểu cầu
Trên in vivo sử dụng phương pháp Borchrevink. Nguyên lý là đo độ dính tiểu
cầu qua việc lấy máu để đếm tiểu cầu trực tiếp tại vết thương vào các thời điểm

ac
y,

cách đều nhau. Trị số bình thường: 20-40 %. Trên in vitro có 3 phương pháp
(phương pháp Salzman, Bowie, Hellem). Nguyên lý là đo độ dính tiểu cầu sau khi
cho máu hoặc huyết tương qua cột bi thủy tinh [23]. Độ dính tiểu cầu giảm trong:

ha

rm

bệnh Von – Willebrand, trong một số bệnh lý rối loạn chức năng tiểu cầu, dùng một
số thuốc giảm đau, sau truyền Dextran. Độ dính tiểu cầu tăng trong: bệnh lý huyết

dP

khối, tiểu đường, hút thuốc lá, cũng có thể gặp trong những trường hợp sau mỗ, sau
sinh, sau một sang chấn nào đó (đặc biệt sau cắt lách, …) [23].

an

1.3.7. Đo độ ngưng tập tiểu cầu

dic

ine

Có rất nhiều kỹ thuật để đo độ ngưng tập tiểu cầu nhưng chủ yếu dựa trên
nguyên lý sau: Mật độ quang của huyết tương giàu tiểu cầu tỷ lệ thuận với nồng độ
của tiểu cầu có trong huyết tương đó. Bởi vậy khi cho thêm một chất gây ngưng tập

Co
p

yri

gh

t©

Sc

ho

ol

of

Me

tiểu cầu nào đó (ADP, adrenalin) vào dung dịch huyết tương giàu tiểu cầu, hiện
tượng ngưng tập tiểu cầu sẽ xãy ra. Nồng độ tiểu cầu dưới dạng những phân tử
riêng biệt sẽ giảm dẫn đến mật độ quang học tăng. Ghi nhận một số hình ảnh của
quá trình thay đổi của mật độ quang sẽ biết được đặc điểm của quá trình ngưng tập
tiểu cầu [2, 3, 23, 50].

Hình 1.7. Nguyên lí của xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu
(PPP: huyết tương nghèo tiểu cầu, PRP: huyết tương giàu tiểu cầu)

15


dP

ha

rm

ac
y,

VN
U

Nguyên lý của phương pháp đo quang: thiết bị đo độ ngưng tập tiểu cầu bằng
phương pháp quang học là một quang phổ kế có bước sóng thích hợp cố định. Một
chùm tia ánh sáng đỏ chiếu qua một ống chứa huyết tương giàu tiểu cầu và một
chùm tia khác chiếu qua một ống chứa huyết tương nghèo tiểu cầu. Khi đo, sử dụng
một mẫu huyết tương giàu tiểu cầu của mẫu máu cần đo để thiết lập điểm chuẩn ở
đó ánh sáng bị cản hồn tồn và độ dẫn truyền ánh sáng là 0 %. Đồng thời sử dụng
huyết tương nghèo tiểu cầu của cùng mẫu máu để thiết lập điểm chuẩn ở đó ánh
sáng đi qua hồn tồn và độ dẫn truyền ánh sáng là 100 %. Khi cho chất kết tập như
ADP, collagen, thrombin, epinephrin, acid arachidonic, ristocetin...vào huyết tương
giầu tiểu cầu sẽ xẩy ra hiện tượng các tiểu cầu ngưng tập với nhau tạo thành đám vì
vậy độ dẫn truyền ánh sáng sẽ tăng lên. Độ dẫn truyền ánh sáng phản ánh mức độ
ngưng tập tiểu cầu. Kết quả được thể hiện bằng % độ dẫn truyền ánh sáng của huyết
tương giàu tiểu cầu trong đó tiểu cầu đã ngưng tập tối đa [24, 37, 50, 51].

an

1.4. Các thuốc kháng tiểu cầu

ho

ol

of

Me

dic

ine

Tiểu cầu có vai trị quan trọng trong cơ chế bệnh sinh huyết khối. Trong
nhiều bệnh lý, sự hoạt hóa tiểu cầu bao gồm: hiện tượng dính, ngưng tập, phóng
thích ra các yếu tố/thành phần nội tiểu cầu… đó là những cơ sở sinh lý, sinh hóa và
cơ học quyết định cho sự hình thành huyết khối. Bởi vậy, hiện nay liệu pháp kháng
tiểu cầu ngày càng được quan tâm đúng mức hơn trong việc điều trị dự phịng và
chống sự hình thành huyết khối [23]. Thuốc kháng tiểu cầu là thuốc ức chế quá
trình kết dính, hoạt hóa, ngưng tập, nhằm ngăn ngừa, hạn chế tắc mạch [18]. Điều
trị chống ngưng tập tiểu cầu có thể tấn cơng lên các mục tiêu trên con đường của
quá trình ngưng tập tiểu cầu [26]. Hiện nay có nhiều thuốc kháng tiểu cầu với cơ
chế khác nhau được sử dụng như: Aspirin, Ticlopidin, Clopidogrel, Prasugrel…

Sc

1.4.1. Nhóm ức chế men Cyclo-oxygenase: Aspirin

Co
p

yri

gh

t©

Aspirin được coi là thuốc kháng tiểu cầu hàng đầu và được sử dụng rộng rãi.
Cơ chế tác dụng: Aspirin ức chế men cyclooxygenase 1 (COX-1) dẫn đến ngăn cản sự

tạo thành Thromboxan A2 (TXA2), nhờ đó mà ức chế ngưng tập tiểu cầu. Sự ức chế
này là rất mạnh và tồn tại suốt đời sống tiểu cầu đó, vì tiểu cầu khơng thể tổng hợp
thêm men mới được nữa. Bên cạnh đó, Aspirin cũng ức chế sự tổng hợp chất
prostaglandin kháng đông, là PGI2 của tế bào nội mạc mạc thông qua việc ức chế men
prostacyclin synthetase, do đó gián tiếp kích thích NTTC. Tuy nhiên tác dụng này
không mạnh bằng tác dụng ức chế men cyclooxygenase và tác dụng này cũng khơng
kéo dài vì tế bào nội mạc có thể tổng hợp ra men mới [22, 23]. Aspirin có thể ức
chế ngưng tập tiểu cầu với các chất kết tập như collagen, ADP, epinephrin.

16


1.4.2. Nhóm ức chế ADP Receptor (nhóm Thienopyridin)

ac
y,

VN
U

Ticlopidin: cơ chế tác dụng ức chế NTTC của Ticlopidin là do Ticlopidin
tưong tác với glycoprtein IIb/IIIa receptor của fibrinogen làm ức chế sự gắn
fibrinogen vào tiểu cầu hoạt hóa, ngăn cản sự kết dính tiểu cầu. Ngồi ra, thuốc cịn
làm tăng prostaglandin D2 và E2 góp phần chống đơng vón tiểu cầu và tăng thời
gian chảy máu [1, 22]. Ngày nay Ticlopidine ít sử dụng hơn vì có một số tác du ̣ng
phu ̣ quan trọng như giảm ba ̣ch cầ u ha ̣t (có thể gây tử vong), suy tủy và tắ c mâ ̣t.

dP

ha

rm

Clopidogrel: bản thân Clopidogrel là tiền thuốc không có hoa ̣t tin
́ h kháng
tiể u cầ u. Sau khi đươ ̣c hấ p thu ở ruô ̣t, khoảng 85 % lươ ̣ng thuố c hấ p thu đươ ̣c
chuyể n hóa bởi các enzym esterase thành những chấ t không có hoa ̣t tin
́ h và 15%
đươ ̣c chuyể n hóa bởi hê ̣ enzym cytochrome P-450 (hai bước) ở gan thành chấ t có
hoa ̣t tính ức chế thu ̣ thể P2Y12 trên bề mă ̣t tiể u cầ u, làm ADP không gắ n đươ ̣c vào
thu ̣ thể của nó dẫn tới không hoa ̣t hoá đươ ̣c tiể u [1, 22, 39].

Me

dic

ine

an

Prasugrel: là thuố c mới nhấ t thuô ̣c nhóm Thienopyridin. Sau khi vào ố ng
tiêu hóa, prasugrel bi ̣ thủy phân nhanh chóng bởi esterase trong ruô ̣t và máu thành
chấ t chuyể n hóa trung gian. Chấ t này la ̣i đươ ̣c biế n thành chấ t chuyể n hóa có hoa ̣t
tính bởi enzym cytochrome P450 (mô ̣t bước), chấ t chuyể n hóa có hoa ̣t tính của
prasugrel ức chế không hồ i phu ̣c thu ̣ thể P2Y12 của tiể u cầ u. Như vậy Prasugrel
khắc phục được nhược điểm của Clopidogrel nên Prasugrel có tác du ̣ng ức chế kế t
tâ ̣p tiể u cầ u ma ̣nh hơn, nhanh hơn và ổ n đinh
̣ hơn so với clopidogrel [1].

of

Thuố c ức chế P2Y12 không thuô ̣c nhóm thienopyridin

Sc

ho

ol

Ức chế trực tiế p có hồ i phu ̣c thu ̣ thể P2Y12 của tiể u cầ u. Đây là thuốc đầy
triển vọng qua nghiên cứu PLATO (Study of Platelet Inhibition and Patient
Outcomes) [1].
1.4.3. Các thuố c ức chế thụ thể Glycoprotein IIb/IIIa của tiể u cầ u

gh

t©

Abciximab, Eptifibati và Tirofiban. Các th́ c này ức chế glycoprotein
IIb/IIIa sẽ ức chế những liên kế t chéo bằ ng fibrin giữa các tiể u cầ u do đó ức chế
hin
̀ h thành huyế t khố i [1, 22].

yri

1.4.4. Thuốc làm tăng AMP vòng tiểu cầu

Co
p

Dipyridamol: Ức chế sự vỡ ra của AMP vịng do phosphodiesterase do đó là
tăng nồng độ APM vòng, ngăn cản sự ngưng tập, phóng xuất và kết dính tiểu cầu[1,
22]. Thuốc có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu nhưng không làm kéo dài thời
gian chảy máu [23].

17


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu

VN
U

Đối tượng
Mẫu Sâm vũ diệp toàn cây tươi thu hái ở Sa Pa – Lào Cai vào tháng 3 năm
2016 được giám định tên khoa học là Sâm vũ diệp - Panax bipinnatifidus Seem. bởi

rm

ac
y,

chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Phần dưới
mặt đất được rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 40-50 °C đạt độ ẩm dưới 10 %, xay
nhỏ và bảo quản trong túi nilon. Mẫu được giám định tên khoa học là Sâm vũ diệp

ha

sau khi được sơ chế, làm khô, xay nhỏ được chiết bằng EtOH 50 % với tỷ lệ dung

môi : dược liệu là 7:1, ở nhiệt độ 90 °C. Chiết 2h/lần, 3 lần/mẻ. Dịch chiết cồn 50 %

dP

thu được cô dưới áp suất giảm đến khi tạo thành cao lỏng (1:1).

an

Cao chiết tồn phần của Sâm vũ diệp cịn nhiều tạp chất bao gồm các hợp
chất ít phân cực, dầu béo và các thành phần saccarid tan trong nước. Loại bỏ các tạp

dic

ine

chất ít phân cực, thân dầu: dùng phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng với n-hexan
theo tỷ lệ 1:1 qua 3 lần. Cất loại thu hồi dung môi n-hexan để tái sử dụng. Lớp nước
sau chiết lỏng-lỏng chứa toàn lượng saponin đã được loại dầu béo và tạp chất thân

Me

dầu. Loại bỏ các thành phần saccarid tan trong nước: sử dụng sắc ký hấp phụ bằng
resin diaion HP-20, rửa giải bằng EtOH 96 %.

Co
p

yri

gh

t©

Sc

ho

ol

of

Dịch sau loại tạp được cất thu hồi dung môi dưới áp xuất giảm đến cao đặc,
đem sấy chân không tại 55-60 °C trong 24 giờ, sử dụng máy xay dược liệu, nghiền
cao thành dạng bột, rây qua rây 355, thu được cao khô định chuẩn giàu saponin của
Sâm vũ diệp, bảo quản trong túi nilon kín tại nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Các
phân đoạn chiết cao khô định chuẩn giàu saponin của Sâm vũ diệp được tiến hành
tại bộ mơn Hóa Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, do TS. Nguyễn Hữu
Tùng cung cấp (Hình 2.1) [27].

18