Tăng cường tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng công nghệ sinh học thực vật

Viiện khoa học

Bộ khoa học

và công nghệ việt nam

và công nghệ

Viện Công nghệ Sinh học
V.CNSH

V.KHCNVN

V.CNSH

V.KHCNVN

18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
V.KHCNVN
V.CNSH

Báo cáo tổng kết Đề tài
Hợp tác Nghiên cứu KH&CN với nớc ngoài

Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Lê Trần Bình

6288
25/01/2007

Hà Nội, 2006

Viiện khoa học
và công nghệ việt nam

Bộ khoa học
và công nghệ

Viện Công nghệ Sinh học
V.KHCNVN
V.CNSH

V.KHCNVN
V.CNSH

---------------------------------V.KHCNVN
V.CNSH

Báo cáo tổng kết Đề tài
Hợp tác Nghiên cứu KH&CN với nớc ngoài

Tăng cờng tính chống chịu
và cải tiến chất lợng giống lúa bằng
công nghệ sinh học thực vật

Chủ nhiệm Đề tài:

PGS. TS. Lê Trần Bình

Cơ quan chủ trì:

Viện Công nghệ sinh học

Cơ quan chủ quản:

Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Thời gian thực hiện:

2002 - 2005

Hµ Néi, 2006


LLờ
ờii ccảảm
mơ
ơnn

Trong khuôn khổ hợp tác song phương về khoa học và cơng nghệ giữa
CHLB Đức và Việt Nam thì lĩnh vực công nghệ sinh học được chú trọng
như một lĩnh vực ưu tiên. Tuy nhiên, hầu hết các nội dung hợp tác giữa
các đối tác Việt Nam và đối tác Đức nổi bật vẫn là những nội dung nặng về
chuyển giao công nghệ và đào tạo nguồn nhân lực.
Lần đầu tiên trong lĩnh vực cơng nghệ sinh học có một đề tài mà cả hai bên
đối tác đều muốn tập trung khai thác những thành tựu mới nhất của thế
giới về Giải mã genom cây lúa nước. Đó cũng là lý do vì sao một quốc gia
như Đức, khơng trồng một cây lúa nước nào ở ngoài đồng ruộng tự nhiên
mà lại quan tâm đến những nghiên cứu rất cơ bản về cây lúa nước.
Vì thế việc xây dựng một đề tài đối ứng với một Viện đầu ngành về sinh
học phân tử thực vật như Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử,

Golm là một cơ hội lớn cho Viện Công nghệ sinh học nhằm học hỏi cách
thức tiếp cận tiến hành nghiên cứu khoa học tân tiến.
Chủ nhiệm đề tài xin trân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Bộ Liên bang về Đào tạo và nghiên
cứu, CHLB Đức đã hỗ trợ sự hợp tác này.

CƠ QUAN CHỦ TRÌ
VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
PHĨ VIỆN TRƯỜNG

CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

PGS.TS. Trương Nam Hải

PGS. TS. Lê Trần Bình

Đề tài hợp tác Việt - Đức

i


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
ABA

Abscisic axít

ADC

Arginindecarboxylase

APS

Ammonium persulfate

RNAse

RNA polymerase

ATP

Adenosine triphosphate

BSA

Bovine serum albumin

Bc

Bacillus cereus

bp

base pair

Bt

Bacillus thuringiensis

CaMV35S- P

Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotor

cDNA

Complementary DNA

CHLB

Cộng Hoà Liên Bang

CGS

Cystathionin gamma-Synthase

cry

Crystal gene = Gen mã hoá protein tinh thể độc tố diệt côn trùng của vi khuẩn
Bacillus thuringiensis

DNA

Deoxyribonucleic axít

DAO

Diaminoxidase

DNAse

DNA polymerase

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

Et-Br

Ethidium Bromide

FRET

Fluorescence Resonance Energy Transfer

GC-MS

Gas Chromatography-Mass Spectrometry

GC-TOF-MS

Gas Chromatograph/time-of-flight mass spectrometers

GCN

Guanidium thiocyanate

GUS

β-Glucuronidase gene = gen mã hoá β-Glucuronidase

HSK

Homoserine kinase

HPLC

High Performance Liquid Chromatography = sắc ký lỏng cao áp

IRRI

International Rice Research Institute = Viện nghiên cứu lúa Quốc tế

IPTG

Isopropylthio-o-D-galactoside

Kb

Kilobase

KDa

Kilo dalton

KN&CN

Khoa học và Công nghệ

Km

Kanamycine

KO

Knock out

LB

Luria và Bertani

mRNA

Messenger RNA

MPI

Viện Sinh lý Phân tử thực vật Max - Planck

Đề tài hợp tác Việt - Đức

ii


MS

Môi trường nuôi cấy theo Murashige & Skoog

MST

Mass Spectral Target = Chất mục tiêu

NCS

Nghiên cứu sinh

NhaA

Na+/H+ antiporter

NOS-P

Nopaline Synthase Promotor

nptII

Neomycine
phosphotransferase
phosphotransferase II

OAT

Ornithine Aminotransferase

OD

Optical density

PA

Polyamin

PAM

Chlorophyll Fluorometers to measuring systems of plant Gas Exchange = Hệ
thống đo huỳnh quang diệp lục

PAO

Polyaminoxidase

PCR

Polymerase Chain Reaction

PGS.TS

Phó Giáo sư. Tiến sĩ

QA, QB

Quinon A, Quinon B

RNA

Ribonucleic axít

RT-RT-PCR

Real Time-Reverse Trascription-Polymerase Chain Reaction = PCR định lượng

SAMDC

S-Adenosylmethionin-decarboxylase

II

gene=Gen

mã

hoá

neomycine

SAT

Serine acetyltransferase

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis = Điện di biến tính
trên gel polyacrylamide

SPD

Spermidinsynthase

T-DNA

Transfer-DNA = DNA chuyển

TF

Transcription factor = Yếu tố điều khiển phiên mã

Ti-plasmit

Tumor inducing plasmid = Plasmit gây khối u thực vật

Vip

Vegetative insecticidal protein = protein sinh dưỡng diệt côn trùng

Vir

Virulence Region = Vùng gây độc có khả năng tạo khối u

X-gal

5-bromo-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase

X-gluc

5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

Đề tài hợp tác Việt - Đức

iii


MỤC LỤC

BÀI TÓM TẮT ..........................................................................................................................

1

LỜI MỞ ĐẦU ………………………………………………………………………………………….

4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC ………...

5

1.1. Tình hình nghiên cứu ở ngồi nước ……………………………………………………….

5

1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước ……………………………………………………….

6

1.3. Mục tiêu của đề tài ..........................................................................................................

7

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………….......................

8

2.1. Đối tượng và thiết bị nghiên cứu ...................................................................................

8

2.1.1. Các giống lúa ...........................................................................................................

8

2.1.2. Các thiết bị chính .....................................................................................................

9

2.2. Nội dung nghiên cứu …………………………..............................................................…

9

2.2.1. Tìm kiếm và phân lập các gen làm gia tăng hàm lượng polyamin thông qua kỹ
thuật ức chế gen bằng RNA …………………………………………………………….

9

2.2.2. Phát hiện các gen điều khiển tính chịu hạn và muối bằng phổ phiên mã RNA ..............

10

2.2.3. Kỹ thuật sao chép gen ……………………………………………………………………

10

2.2.4. Kỹ thuật phân tích phổ chất bằng sắc ký khí/quang phổ khối ..................................

11

2.2.5. Tối ưu phương pháp chuyển gen vào một số giống lúa Việt Nam ...........................

11

2.3. Phương pháp nghiên cứu …………………………………………………………………….

12

2.3.1. Phương pháp sinh lý học thực vật ………………………………………………………

12

2.3.2. Phươn g pháp sinh học phân tử thực vật ………………………………………………

18

2.3.3. Phương pháp phân tích ………………………………………………………………….

22

2.3.4. Phương pháp biến nạp gen vào cây lúa ……………………………………………….

23

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN …………………………………………………………

31

3.1. Vai trị của Polyamin đối với tính chịu hạn và chịu mặn …………………………….....

31

3.1.1. Đánh giá tính chịu mặn ………………………………………….............................….

31

Đề tài hợp tác Việt - Đức

iv


3.1.2. Đánh giá tính chịu hạn......………………………………………………………………..

32

3.1.3. Phân tích polyamin và biểu hiện gen …………………………………………………...

35

3.2. Xác định gen điều khiển mới kiểm sốt tính chịu mặn và chịu hạn ...........................

39

3.2.1. Thiết lập ……………………………………………………………………………………

39

3.2.2. Xây dựng phương pháp ...........................................................................................

41

3.2.3. Xử lý hạn ..................................................................................................................

41

3.2.4. Xử lý muối ................................................................................................................

41

3.2.5. Xây dựng ngân hàng dữ liệu về Tác nhân phiên mã ở lúa ......................................

47

3.3. Các chất trao đổi trong rễ ở trạng thái ổn định và chuyển trạng thái khi bị xử lý stress .......

47

3.3.1. Xây dựng phương pháp nuôi trồng và chuyển gen lúa ở các giống thuộc loài phụ Indica …

47

3.3.2. Xử lý hạn …………………………………………………………………………………..

47

3.3.3. Xử lý muối …………………………………………………………………………………

48

3.3.4. Thiết lập một ngân hàng các chất trao đổi của lá và rễ lúa khi phân tích phổ ……..

48

3.3.5. Xác định bằng khối phổ các chất chưa biết .............................................................

49

3.3.6. Xác định và phân tích chất chỉ thị khi xử lý mặn ......................................................

50

3.3.7. Phân tích tương quan trong xác định chất chỉ thị ……………………………………..

51

3.3.8. Đề xuất bổ sung .......................................................................................................

55

3.4. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens....................................

55

3.4.1. Chuyển gen tăng cường khả năng chịu hạn và mặn ...............................................

55

3.4.2. Chuyển gen cải thiện thành phần aminoacid trong lúa gạo .....................................

56

3.4.3. Đề xuất bổ sung .......................................................................................................

66

CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC................................

68

41. Kết quả về khoa học .........................................................................................................

68

4.2. Kết quả nổi bất và khả năng áp dụng ............................................................................

70

4.3. Trình độ cơng nghệ .........................................................................................................

72

4.4. Khả năng áp dụng ...........................................................................................................

72

4.5. Đào tạo .............................................................................................................................

74

4.6. Sản phẩm khoa học của đề tài ......................................................................................

75

Đề tài hợp tác Việt - Đức

v


4.7. Hợp tác quốc tế ...............................................................................................................

76

4.8. Tình hình sử dụng kinh phí ............................................................................................

76

4.9. Danh sách các cơng trình cơng bố ................................................................................

77

4.10. Hạn chế của đề tài .........................................................................................................

78

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................

79

5.1. Kết luận ............................................................................................................................

79

5.2. Đề nghị .............................................................................................................................

81

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................

82

PHỤ LỤC ĐỀ TÀI

83

Báo cáo tình hình sử dụng và Quyết tốn kinh phí
Bản thuyết minh đề cương đề tài
Quyết định của Bộ trưởng về việc phê duyệt các nhiệm vụ hợp tác khoa học
Công văn gia hạn sử dụng kinh phí đề tài
Quyết định thành lập và Biên bản đánh giá của Hội đồng nghiệm thu cấp Cơ sở
Các báo cáo khoa học đăng trên tạp chí trong nước
Các báo cáo khoa học đăng trên tạp chí quốc tế
Poster
Danh sách các gen tìm được trong ngân hàng các dịng KO
So sánh trình tự các gen thiết kế với Genbank
Danh sách các giống lúa làm nguyên liệu
Trang web Ngân hàng dữ liệu về tác nhân phiên mã ở lúa
Trang web của Viện IRRI - Phân loại khả năng chống chịu của các giống lúa theo tiêu
chuẩn của IRRI

Đề tài hợp tác Việt - Đức

vi


MỤC LỤC BẢNG
Bảng 2.1:

Các giống lúa được sử dụng trong các nghiên cứu đề tài co nguồn gốc từ
các quốc gia khác nhau, chủ yếu là các giống của Việt Nam ......................

Bảng 2.2:

Thành phần các môi trường nuôi cấy trong chuyển gen thông qua

Agrobacterium tumefaciens ………………………………………………………………….
Bảng 3.1:

8

26

Kết quả đánh giá tính chịu mặn của các giống lúa tham gia thí nghiệm tổng
hợp theo IRRI trong điều kiện sử dụng nồng độ muối là 100mM NaCl (5,8
g/l), thí nghiệm 3 lần với 5 lần nhắc lại ………………………………………………….

Bảng 3.2:

31

Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa. Thí nghiệm với 5
lần nhắc lại. Nhóm được phân theo mức 30% và 70% chênh lệch ……………

33

Bảng 3.3:

Kết quả xử lý hạn nhẹ kéo dài và xử lý hạn khắc nghiệt ………………………….

53

Bảng 3.4:

Kết quả chọn lọc và tái sinh cây lúa chuyển gen nhaA …………………………….

55

Bảng 3.5:

Tiến độ chuyển các gen cải thiện chất lượng amino acid gồm Cystathionin
gamma-Synthase (CGS), Serinacetyltransferase (SAT), Homoserinkinase
(plastid, SSUHSK), Homoserinkinase (cytosolic, HSK) và Glucoronidase
(GUS) của gạo vào cây lúa ……………………………………………………………………

58

Bảng 3.6:

Điều kiện thuỷ phân protein bằng lò vi sóng MAR5 ………………………………….

64

Bảng 4.1:

Báo cáo tóm tắt kết quả thực hiện từ 12/2001 - 12/2005 ………………………..

70

Bảng 4.2:

Khả năng áp dụng của đề tài ………………………………………………………………..

72

Bảng 4.3:

Danh sách các học viên được đào tạo ……………………………………………………

74

Bảng 4.4:

Danh sách các cán bộ được nâng cao trình độ ……………………………………….

74

Bảng 4.5:

Nội dung hợp tác quốc tế ……………………………………………………………………..

76

Bảng 4.6:

Tình hình sử dụng kinh phí …………………………………………………………………..

76

Đề tài hợp tác Việt - Đức

vii


MỤC LỤC HÌNH
Hình 2.1:

Hiện tượng dịch chuyển điện tử quang hợp trong các tâm phản ứng của hệ
quang hóa II …………………………………………..……………………………………………

14

Hình 2.2:

Nguyên lý cường độ phát quang ………………………………………………………………

18

Hình 2.3:

Sản phẩm PCR tăng dần theo chu kỳ phản ứng …………………………………………

19

Hình 2.4:

Mẫu dị lai …………… ……………………………………………………………………………….

20

Hình 2.5:

Mẫu dị thủy phân (TaqMan probe) ………………………………………………………….

20

Hình 2.6:

Định lượng (I), xác định đột biến với hybrydzation probes (II), xác định đột
biến với TaqMan probes (III), Định tính ví dụ xác định gen nào thuộc lồi
nào (IV) …………………………………………………………………………………………………

21

Hình 2.7:

Cấu trúc vector pCAMBIA1300 dùng để thiết kế gen nhaA, OAT

21

Hình 2.8:

Cấu trúc vector pCAMBIA1390/Ubill dùng để thiết kế gen CGS

22

Hình 2.9:

Phân tích protein tổng số ...........................................................................

22

Hình 2.10:

Sơ đồ các bước chuyển gen thơng qua vi khuẩn A.tumefaciens ………..

23

Hình 3.1:

Sơ đồ các bước chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens..

32

Hình 3.2:

Các giống lúa được trồng trong phytotron....................................................

32

Hình 3.3:

Lượng nước mất đi ở mỗi cây/ 1 ngày .........................................................

33

Hình 3.4:

Sự biến động về số nhánh/ cây, chiều dài lá, trọng lượng tươi, khơ của các

34-

giống ........................................................................................................

35

Hình 3.5:

Hàm lượng Putresine ở các giống xử lý mặn.................................................

35

Hình 3.6:

Hàm lượng Spermidine và Spermine ở các giống xử lý mặn...........................

36

Hình 3.7:

Hàm lượng Putresine, Spermidine và Spermine ở các giống xử lý hạn ...........

37

Hình 3.8:

Hàm lượng Putresin đo được trong mẫu lá các giống lúa và sự thay đổi của
chúng khi xử lý sau 14 ngày với các nống độ NaCl tăng dần từ 0 lên 50 và
100 mM ....................................................................................................

Hình 3.9:

Biểu hiện của gen Arginindecarboxylase (ADC) trong 7 giống lúa có mức độ
chịu mặn khác nhau..................... …………………………………………………………….

Hình 3.10:

38

39

Hiệu quả hoạt động của các cắp mồi dùng trong phản ứng RT-PCR khi nhân
những đoạn gen điều khiển bằng RNA tách chiết từ lúa ...............................

Đề tài hợp tác Việt - Đức

39

viii

Hình 3.11:

Độ nhạy của phản ứng RT-RT-PCR với các mẫu RNA thu được từ thân (trái)
và rễ (phải) cây mạ ...................................................................................

Hình 3.12:

40

Đánh giá mức độ biểu hiện của gen điều khiển liên quan đến tính chịu mặn
trong cây lúa bằng kỹ thuật RT-RT-PCR với 6 cặp mồi đặc hiệu thiết kế theo
số liệu thu được từ ngân hàng gen cây lúa ..................................................

Hình 3.13:

40

Kiểm tra đánh giá chất lượng các cặp mồi dùng cho phản ứng mức độ
đặc hiệu và hiệu quả nhân các đoạn gen điều khiển bằng cDNA từ
RNA cây mạ. Biểu đồ phản ứng theo thời gian ......................................

Hình 3.14:

41

Kiểm tra đánh giá chất lượng các cặp mồi dùng cho phản ứng mức độ
đặc hiệu và hiệu quả nhân các đoạn gen điều khiển bằng cDNA từ
RNA cây mạ. Biểu đồ tốc độ phản ứng ..................................................

Hình 3.15:

42

Hiệu quả hoạt động của các cặp mồi chuyên dụng dùng trong phản ứng RTRT-PCR khi đánh giá mức độ biểu hiện của các gen điều khiển bằng RNA
tách chiết từ hai giống lúa khi xử lý mặn .....................................................

Hình 3.16:

43

Tần suất lặp lại của kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của các gen điều
khiển bằng RNA tách chiết từ hai giống lúa khi xử lý nặm bằng phản ứng RTRT-PCR khi đánh giá ..................................................................................

Hình 3.17:

Sự phân bố tần xuất gen „cảm ứng do tiếp xúc“ ở các giống lúa tham gia thí
nghiệm tại điều kiện đối chứng khơng có muối vào thời điểm 30&180 phút ...

Hình 3.18:

43

44

Sự phân bố tần xuất gen chịu tác động „cảm ứng“ và „ức chế“ bởi tác động
của mặn ở các giống lúa tham gia thí nghiệm tại điều kiện có muối (100 mM)
vào thời điểm 30 và 180 phút............................................. ........................

Hình 3.19:

Mức độ biểu hiện của những gen điều khiển hoạt động có tính đặc thù riêng
của giống khi chịu tác động mặn ……………………………………………………………..

Hình 3.20:

46

Tác động của mặn (NaCl) lên độ dẫn điện của dịch bào ở cây mạ hai giống
DR2 và Chàm khi bị xử lý các thời gian khác nhau từ 0 đến 24 h ..................

Hình 3.21:

45

47

Kho dữ liệu các phổ nhân tạo của các chất trao đổi từ cây mạ (lúa nước) xác
định bằng phương pháp GC-TOF-MS làm nguồn so sánh (bên trái) và phổ
GC-TOF-MS của một mẫu đại diện (bên phải) ..............................................

Hình 3.22:

Glycine N,N-di(trimethylsilyl) -, trimethylsilyl ester được đánh dấu tại vị trí
C1 và C2 với đồng vị nặng

13

C, cũng như tại vị trí C2 với hai ngun tử

Deuteri (D). ..............................................................................................

Hình 3.23:

50

Biến động của hàm lượng Putrescine và Spermidine trong 4 giống lúa đối
chứng...............……………………………………………………………………………………..

Hình 3.24:

49

51

Sự thay đổi về hiệu suất quang hợp của hệ thống quang hoá II trong điều
kiện xử lý hạn nhẹ kéo dài .........................................................................

Đề tài hợp tác Việt - Đức

52

ix


Hình 3.25:

Sự thay đổi về hiệu suất quang hợp của hệ thống quang hoá II trong điều
kiện xử lý hạn khắc nghiệt .........................................................................

Hình 3.26:

Sự thay đổi về hiệu suất quang hợp của hệ thống quang hoá II tại các ngày
0, 4, 5, 6, 7, 8 rút nước để hạn ..................................................................

Hình 3.27:

53

54

Kết quả đo hiệu suất quang hợp (PAM) đối với mảnh lá của các giống lúa có
mức độ chịu muối khác nhau theo thời gian xử lý tăng dần nồng độ NaCl ……

54

Hình 3.28:

Kết quả chọn lọc và tái sinh cây lúa C71 chuyển gen nhaA ...........................

56

Hình 3.29:

Kết quả sàng lọc cây chuyển gen OAT bằng PCR .........................................

56

Hình 3.30:

Sơ đồ vector chuyển gen pCAMBIA1390/Ubiqutin/SAT/HSK/CGS ...................

57

Hình 3.31:

Qui trình chuyển gen vào lúa giống Tapei ....................................................

57

Hình 3.32:

Kết quả sàng lọc cây chuyển gen bằng PCR với mồi đặc hiệu cho gen CGS
được chuyển............ .................................................................................

59

Hình 3.33:

Phổ 23 axit amin chuẩn xác định bằng RP HPLC ..........................................

61

Hình 3.34:

Phổ các hợp chất thiols chuẩn xác định bằng RP HPLC .................................

62

Hình 3.35:

Chu trình trao đổi chất methionine và các gen tham gia ...............................

62

Hình 3.36:

Các mẫu RNA tổng số sau khi xử lý DNAse, không nhận được sự khuyếch đại
nào sau 35 chu kỳ phản ứng ......................................................................

63

Hình 3.37:

Nguyên tắc phân tích axit amin tổng số từ protein .......................................

64

Hình 3.38:

Thành phần amino acid của protein chuẩn BSA và của protein gạo tồn
phần..........................................................................................................

Hình 3.39:

65

Kết quả chiết rút protein gạo bằng các dịch đệm khác nhau và phân tích trên
điện di PAGE (trên) và định lượng bằng Bradford (dưới)................................

Đề tài hợp tác Việt - Đức

66

x


DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN CHÍNH
STT

Họ và tên

Học hàm,
học vị

Cơ quan

1

Lê Trần Bình

PGS.TS

Viện Cơng nghệ sinh học

2

Nơng Văn Hải

PGS.TS

Viện Công nghệ sinh học

3

Trần Phương Liên

TS

Viện Công nghệ sinh học

4

Lê Thị Thu Hiền

TS

Viện Công nghệ sinh học

5

Phan Văn Chi

PGS.TS

Viện Công nghệ sinh học

6

Nguyễn Thu Hà

ThS

Viện Công nghệ sinh học

7

Nguyễn Thị Tỵ

CN

Viện Công nghệ sinh học

9

Lê Xuân Đắc

ThS

Viện Công nghệ sinh học

10

Lê Văn Sơn

TS

Viện Công nghệ sinh học

11

Nguyễn Phương Thảo

ThS

Viện Công nghệ sinh học

12

Nguyễn Thị Hồng Châu

ThS

Viện Công nghệ sinh học

13

Ellen Zuther

TS

Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

14

A. Heyer

TS

Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

15

Bernd Müller-Röber

TS

Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

16

Joachim Kopka

TS

Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

17

L. Willmitzer

GS.TS

Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

18

Rainer Höfgen

TS

Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

19

Nguyễn Hữu Cường

NCS

Viện CNSH tại Viện MP và SLTVPT

20

Đỗ Thị Phúc

NCS

Trường ĐHKHTN tại Viện MP và SLTVPT

DANH SÁCH CÁC CƠ QUAN PHỐI HỢP THỰC HIỆN
STT

Cơ quan phối hợp

Nội dung phối hợp

1

Đại học Tổng hợp Greifswald

Đào tạo NCS

2

Viện Max Planck về Sinh lý thực vật phân tử

Đào tạo NCS, nâng cao trình độ cán bộ
khoa học, trao đổi và phân tích mẫu

Đề tài hợp tác Việt - Đức

xi


BÀI TĨM TẮT

Đề tài “Tăng cường tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng
công nghệ sinh học thực vật” được thực hiện phối hợp giữa Viện Công nghệ sinh
học, Việt Nam với Viện Max Planck về Sinh học Phân tử thực vật, CHLB Đức do sự
chủ trì của PGS.TS. Lê Trần Bình nhằm mục tiêu nâng cao tính chống chịu và cải
tiến chất lượng giống lúa bằng công nghệ sinh học thực vật.
Trong khuôn khổ nghiên cứu, đề tài được thực hiện và thu được những kết quả
chính sau đây:
Các kết quả nghiên cứu khoa học
1. Bộ sưu tập 68 giống lúa chịu hạn và chịu mặn của Việt Nam đang được nhân
và lưu giữ tại Viện Công nghệ sinh học.
2. Tổng số 33 giống lúa trong đó có 29 giống Indica có nguồn gốc từ Việt Nam
và 4 giống Japonica đối chứng được đưa vào nghiên cứu đánh giá khả năng
chịu hạn và chịu mặn thông qua đánh giá các chỉ tiêu sinh lý, xác định hàm
lượng polyamin; mối tương quan giữa hàm lượng polyamin và khả năng
chống chịu hạn, mặn; đánh giá mức độ biểu hiện các gen điều khiển các gen
cảm ứng khi xử lý hạn và mặn, các chất trao đổi trong rễ và trong lá.

3. Hồn thiện và tối ưu hóa phương pháp xử lý tính chịu muối và hạn đối với các
giống lúa phù hợp với điều kiện ở Việt Nam. Kết quả xử lý mặn thu được 5
giống chịu mặn tốt (Chăm, Chăm biển, IR57311, Cườm và Nước mặn), 7
giống chịu mặn trung bình (CR203, Nước mặn 1, Đốc đỏ, Nếp mặn, Đốc
phụng, C71 và Cha va) và 6 giống mẫn cảm (C70, DR2, Lúa mặn, Songhua,
Taipei và Nipponbare). Kết quả xử lý hạn thu được 7 giống chịu hạn khá tốt
(CR203, Khẩu chăm, Trà lĩnh, IR57311, C70, LC-93-1 và Nếp mèn), 7 giống
chịu hạn trung bình (LC-93-4, Cườm, C71, Taipei, Lúa mặn, Lốc dâu, K.lúa
nương) và 7 giống mẫn cảm (DR2, LC-93-2, Lốc, Khẩu nón, Khẩu hom,
Songhua, Nipponbare).
4. Kết quả xử lý mặn cho thấy (i) Giữa các nhóm có sự khác biệt rất rõ về hàm
1


lượng polyamin, (ii) Các giống mẫn cảm có hàm lượng Putrescine cao hơn hẳn,
(iii) Hàm lượng Putrescine tỷ lệ thuận với khả năng chịu mặn, (iv) Hàm lượng
Putrescine tăng lên khi xử lý với nồng độ NaCl tăng dần. Hoạt động của enzym
Arginindecarboxylase (ADC) ở những giống mẫn cảm tăng lên rất rõ rệt. Thí
nghiệm chuyển các gen chủ chốt làm thay đổi hàm lượng polyamin đang được
tiến hành.
5. Một ngân hàng dữ liệu về các gen điều khiển phiên mã (TF) với 2512 gen
gồm 2261 loci mã hóa và sắp xếp thành 44 họ gen khác nhau, được hoàn
thành và công bố trên . Thông qua việc thiết
kế hàng trăm cặp mồi đặc hiệu và tiến hành kỹ thuật RT-RT-PCR đã đánh giá
được mức độ biểu hiện của các đoạn gen điều khiển khi cây mạ bị xử lý mặn
tại hai thời điểm. Kết quả cho thấy: với giá trị abs(log2(FoldChange))>3.32 và
hệ số biến đổi đạt khoảng 10 lần hoặc kích thích hoặc ức chế thì ở hai giống
nghiên cứu là Chàm và DR2 có đến 12%, tức là 313 gen trong số 2512 gen
được coi là cảm ứng hoặc ức chế do mặn.
6. Đối với cây mạ, 132 MSTs đã được xác định. Trong đó có 109 chất thuộc các

chất trao đổi sơ cấp, một số chất bị biến đổi thành 2 hoặc nhiều dẫn xuất hóa học
do hóa chất sử dụng trong kỹ thuật GC-MS. Tuy nhiên, 148 MSTs của cây mạ
chưa được xác định. Khẳng định được những chất trao đổi như Spermidine và
Putrescine trong rễ và lá lúa khi bị xử lý hạn và mặn có những thay đổi rất đáng
kể.
7. Hệ thống ni cấy mô tế bào để chuyển gen vào lúa với nguồn vật liệu ban
đầu là hạt lúa chín (thay vì phơi non rất khó chủ động) đã được thiết lập.
Chuyển được gen CGS và các gen khác như Serinacetyltransferase,
Homoserinkinase và Homoserinkinase (cytosolic) nhằm cải thiện thành phần
axít amin trong gạo của các giống lúa Việt Nam đang được thực hiện. Bước
đầu thu được các dòng cây chuyển gen phục vụ cho các phân tích tiếp theo.
8. Để có thể định lượng chính xác thành phần axít amin trong gạo, phương pháp
thủy phân protein tổng số của hạt gạo bằng vi sóng được hoàn thiện kết hợp
với việc tách chiết bằng các hệ dịch đệm khác nhau cho phép hình thành một
hệ thống gồm nghiền chiết protein từ gạo, thủy phân bằng vi sóng, tạo dẫn
xuất và định lượng với HPLC cho phép phân tích được hàm lượng axít amin
trong lượng siêu nhỏ (mg) bột gạo.
2


9. Đã có 13 bài báo khoa học trong đó có 7 bài đăng trên tạp chí trong nước, 4
bài đăng trên tạp chí Quốc tế và 2 poster tham dự Hội nghị Quốc tế.
Kết quả phục vụ thực tế
Những kết quả thu được góp phần định hướng việc chuyển gen nhằm cải tiến tính
chịu hạn và chịu mặn của các giống lúa Việt Nam, đồng thời góp phần xác định cách
thức cải tiến chất lượng dinh dưỡng thông qua hàm lượng và thành phần axít amin
của protein trong gạo Việt Nam.
Qui trình chuyển gen vào cây lúa sẽ được áp dụng đối với các cây trồng khác
đồng thời sẽ được chuyển giao cho các Viện nghiên cứu. Cây lúa chuyển gen sẽ được
trồng và ứng dụng trong điều kiện Việt Nam.

Kết quả đào tạo
Đào tạo Nghiên cứu sinh:
1. Nguyễn Hữu Cường

- NCS tại CHLB Đức

2. Đỗ Thị Phúc

- NCS tại CHLB Đức

3. Lê Xuân Đắc

- NCS tại Viện Công nghệ sinh học

4. Nguyễn Phương Thảo

- NCS về proteomic cây chuyển gen ở Nhật

Đào tạo cao học:
1. Nguyễn Thị Hải Yến - Nghiên cứu hoàn thiện hệ thống chuyển gen ở lúa
Kết quả nâng cao tiềm lực khoa học
Hoàn thiện hệ thống chuyển gen, phân tích và đánh giá cây chuyển gen trong
phịng thí nghiệm, nhà kính trồng cây đồng thời phân tích năng suất và chất lượng cây
lúa chuyển gen.
Có thêm 2 Ngân hàng dữ liệu về gen điều khiển và cấu trúc các chất trao đổi của
lúa gạo phục vụ công tác nghiên cứu.

3

LỜI MỞ ĐẦU
Lúa nước là cây lương thực quan trọng đứng hàng thứ 3 trên thế giới sau lúa
mỳ và ngô. Gạo là nguồn lương thực chủ yếu của hơn một nửa dân số thế giới
(chủ yếu ở châu Á và châu Mỹ La tinh), điều này làm cho nó trở thành loại lương
thực được con người tiêu thụ nhiều nhất.
Trong danh sách các cây ngũ cốc như: lúa mỳ, lúa mạch, ngơ, cao lương, kê.... thì
genome của cây lúa nước được coi là nền tảng cho bộ gen của các cây ngũ cốc khác.
Chính vì vậy mà Chương trình giải mã genom cây lúa (Rice Genome Project) được lựa
chọn để tiến hành và đã hoàn thành vào tháng 3 năm 2004 mở ra khả năng tiến hành
hàng loạt các nghiên cứu hậu genomic, trong đó bao gồm các nghiên cứu về những gen
liên quan đến tính chịu mặn và chịu hạn của cây lúa, cũng như các gen liên quan đến
chất lượng của hạt gạo.
Sử dụng các trang thiết bị phân tích hiện đại như: đo huỳnh quang diệp lục, phân
tích khối phổ GC/MS, sắc ký lỏng cao áp, PCR định lượng (RT-RT-PCR), đồng thời
với việc khai thác triệt để các Ngân hàng dữ liệu về genom của cây lúa nhằm tìm ra
các yếu tố điều khiển, các chất chỉ thị liên quan đến tính chống chịu là một phần nội
dung của đề tài. Phần thứ hai là dùng các phương pháp nuôi cấy tế bào, chuyển gen
vào cây lúa và khai thác các dòng lúa mang bộ gen bị khiếm khuyết do loại thải
(knock-out) nhằm mục tiêu tìm ra cơ chế chống chịu, biện pháp tăng cường tính
chống chịu và chất lượng lúa gạo ở mức độ phân tử.
Nội dung nghiên cứu của đề tài này mang tính nghiên cứu cơ bản có định hướng
sâu sắc và lâu dài, đòi hỏi nhiều thời gian, trang thiết bị tiên tiến, cách tiếp cận hiện
đại và phạm vi hợp tác rộng lớn (Ngân hàng dữ liệu gen các tác nhân TF ở lúa và cây
khác, Ngân hàng phổ GC/MS và cấu trúc phân tử các chất trao đổi, Ngân hàng các
dòng lúa (KO).
Kết quả thu được ban đầu là rất khả quan cho thấy cách đặt vấn đề và hướng tiếp
cận là phù hợp và mang lại hiệu quả. Tuy nhiên, cần nhiều thời gian tiếp tục nghiên
cứu thì mới đi đến được những kết luận chắc chắn, mang tính lý luận và thực tiễn cao.

4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
TRONG VÀ NGỒI NƯỚC
1.1. Tình hình nghiên cứu ở ngồi nước
Vai trị của một số nhóm chất như: proline, glycine betaine, fructant, manitol...
liên quan đến tính chống chịu của thực vật với điều kiện bất lợi của môi trường đặc
biệt là hạn và mặn đã được khẳng định. Hiện nay một số gen liên quan đến chất lượng
thực phẩm như gen làm tăng hàm lượng methionine (CGS), tryptophan, lysine,
cysteine (SAT)... cũng đã được công bố. Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ gen
đối với tính chống chịu và cải biến chất lượng ở lúa ln là những nội dung nghiên
cứu chính ở nhiều Viện nghiên cứu lớn trên thế giới. Có khá nhiều phương pháp để
tìm kiếm các gen liên quan đến tính chống chịu như: (i) Tìm trên mạng trình tự đã
cơng bố, thiết kế primer và nhân dòng bằng DNA của đối tượng quan tâm, sau đó so
sánh trình tự và thiết kế vào vector để sử dụng; (ii) Kỹ thuật sàng lọc cDNA dựa trên
nguyên tắc kích thích cho gen cần tìm hoạt động; (iii) Thơng qua nghiên cứu hệ
proteomics để tìm các protein mới có hoạt tính dưới tác động của điều kiện môi
trường hay nhu cầu của các giai đoạn sinh trưởng phát triển bằng kỹ thuật 2D kết hợp
với các phân tích khối phổ và so sánh với ngân hàng dữ liệu gen mà biết được trình tự
axít amin của protein và trình tự nucleotit của gen đó.
Cho đến nay, nhiều gen liên quan đến tính chống chịu đã được phân lập chủ yếu
bằng các phương pháp trên và đã được ứng dụng để nâng cao tính chống chịu trên đối
tượng cây thuốc lá, lúa mỳ, lúa nước... như: gen nhaA (chịu mặn), gen HAL, gen
codA, betA, nhóm gen RAB, gen P5CS, gen OAT (chịu hạn)... Hiện nay Viện Sinh lý
Phân tử thực vật Max - Planck, CHLB Đức đang có những nghiên cứu sâu và rất
thành cơng về vai trị của một số hợp chất như polyamin, đường tan, axít béo...dưới
điều kiện bất lợi ở lúa thông qua kỹ thuật ức chế gen bằng RNA và các phương pháp
phân tích bằng quang phổ khối. Cơ sở của phương pháp như sau:
Trường hợp phân lập gen, bao gồm các bước:

i)

Tách chiết mRNA từ các giống lúa có tính chống chịu ở các vùng sinh thái
khác nhau dưới điều kiện stress và không stress.

5


ii)

Tạo ngân hàng cDNA bằng enzym sao chép ngược.

iii) Tạo các vi bản trên màng chuẩn (15000).
iv) Lai với cDNA khơng xử lý.
v)

Thu các dịng lai dương tính và nhân bản các dịng lai bằng PCR.

vi) Đọc trình tự và thiết kế gen cho mục đích chuyển gen.
Trường hợp phân tích phổ chất:
i)

Tách chiết các chất từ các giống lúa xử lý và khơng xử lý.

ii)

Phân tích phổ chất bằng kỹ thuật sắc ký khí hoặc quang phổ kế.

iii) So sánh phổ chất giữa giống chống chịu và giống không chống chịu trong
điều kiện bất lợi và điều kiện thường.

1.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước
Hiện nay các kỹ thuật dùng để xác định sự gia tăng một số chất liên quan đến tính
chống chịu ở cây lúa như proline và các đường tan... đang được sử dụng rất hiệu quả
để đánh giá tính chống chịu của cây trồng đối với điều kiện bất lợi ở nhiều phịng thí
nghiệm trên thế giới cũng đã được sử dụng ở Việt Nam.
Ở Việt Nam, kỹ thuật phân lập gen đi từ cDNA cũng đã được triển khai nghiên
cứu tại Viện Công nghệ Sinh học. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu tìm kiếm các
gen cũng mới chỉ được tiến hành nghiên cứu ở cây đu đủ đối với bệnh vi rút đốm
vịng và tính chịu hạn ở đậu tương song chưa được nghiên cứu cho các giống lúa Việt
Nam.
Viện Công nghệ sinh học đang xây dựng một dự án hợp tác với Viện Max Planck
về Sinh học phân tử thực vật, Trường Đại học Tổng hợp Greifswald, CHLB Đức theo
hướng nghiên cứu Tăng cường tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng
công nghệ sinh học thực vật. Dự án được Bộ Đào tạo và Nghiên cứu Đức tài trợ về
kinh phí. Kinh phí này chủ yếu dành để cán bộ của Việt Nam sang học phương pháp
và làm việc ở Đức trên đối tượng là các giống lúa của Việt Nam. Sự hợp tác này là
một điểm thuận lợi để chúng ta có thể nhanh chóng tiếp cận với kỹ thuật hiện đại để
phân lập tìm kiếm các gen cũng như các phương pháp nghiên cứu phân tích xác định
phổ các chất (polyamin, proline, axít béo, ABA...) có liên quan đến tính chịu hạn và
mặn nhằm đưa ra được các phương pháp cải biến tính chống chịu ở lúa. Vì thế, việc
triển khai kỹ thuật này tại Việt Nam là rất cần thiết, giúp cho Việt Nam có thêm một
6


công cụ hiện đại về Sinh học phân tử để cải biến tính chống chịu của các giống lúa
Việt Nam với các điều kiện bất lợi môi trường. Trên cơ sở của những phương pháp
này, những nghiên cứu tương tự sẽ được triển khai trên một số đối tượng cây trồng
khác như ngô và đậu tương.
1.3. Mục tiêu của đề tài
Tìm kiếm, đánh giá, phân lập và sử dụng các gen nhằm nâng cao khả năng chống

chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa và chất lượng tinh bột của hạt gạo
thông qua các kỹ thuật phân tử và biến nạp gen.
Các mục tiêu cụ thể
i)

Nghiên cứu vai trò của polyamin đối với khả năng chống chịu điều kiện
ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa thông qua các kỹ thuật ức chế gen bằng RNA.

ii)

Nghiên cứu phát hiện các gen điều khiển tính chịu hạn và chịu muối bằng
phổ phiên mã RNA từ những giống lúa chống chịu.

iii) Phân tích phổ trao đổi chất ở rễ của các giống lúa (chống chịu và không
chống chịu với hạn và muối) trong điều kiện stress bằng kỹ thuật sắc ký
khí/quang phổ khối.
iv) Chuyển gen tăng cường tính chịu hạn và mặn, tăng cường hàm lượng axít
amin vào cây lúa.
Trong nội dung hợp tác của dự án với Đức có phần nghiên cứu thực hiện tại Việt
Nam từ 2002 đến 2005. Các nội dung của đề tài được thực hiện tốt nhờ sự hỗ trợ kinh
phí của Bộ dành cho việc đón tiếp chuyên gia bạn sang làm việc và gửi cán bộ sang
Đức làm việc để thực hiện các nội dung nghiên cứu tại Việt Nam.

7


CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu

Các giống lúa: Tổng số có 33 giống lúa được sử dụng trong các thí nghiệm (Bảng
2.1), các giống thí nghiệm được gieo trồng tại nhà lưới Viện Công nghệ sinh học, Hà
Nội, Việt Nam và tại nhà kính tại Viện MPI, Golm, CHLB Đức. Các giống lúa C71,
DR2 và Taipei được dùng để chuyển gen.
Vector: Vector dùng để chuyển gen quan tâm là pCAMBIA1390/Ubill và
pCAMBIA1300.
Chủng vi khuẩn LBA4404 mang vector chuyển gen quan tâm.
Bảng 2.1: Các giống lúa được sử dụng trong các nghiên cứu của đề tài
Giống số

Giống

Khả năng chịu
hạn*

Khả năng chịu
mặn*

Nguồn gốc

1

CR203

x

x

Việt Nam

2

DR2

x

x

Việt Nam

3

Lốc

x

4

C70

x

5

C71

x

6

Pokkali

7

Đốc đỏ

x

Việt Nam

8

Đốc phụng

x

Việt Nam

9

Sabita

x

IRRI

10

NSG19

13

K. Lúa Nương

x

14

Cườm

x

15

Khẩu chăm

x

Việt Nam

16

Khẩu hom

x

Việt Nam

17

Khẩu nón

x

Việt Nam

18

Trà lĩnh

x

Việt Nam

19

Nếp mèn

x

Việt Nam

20

Lốc dâu

x

Việt Nam

Việt Nam
x

Việt Nam

x

Việt Nam

x

IRRI

x

IRRI
Việt Nam

x

Việt Nam

8


21

Nước mặn

x

Việt Nam

22

Lúa mặn

x

Việt Nam

23

Nếp mặn

x

Việt Nam

24

Nước mặn 2

x

Việt Nam

25

Nước mặn 1

x

Việt Nam

26

Chăm

x

Việt Nam

27

Chăm biển

x

Việt Nam

28

Cha va

x

Việt Nam

29

LC-93-1

x

Việt Nam

30

LC-93-2

x

Việt Nam

31

LC-93-4

x

Việt Nam

50

Nipponbare

x

x

Nhật

51

Taipei

x

x

Đài Loan

52

IR57311

x

x

IRRI

53

Songhua

x

x

Trung Quốc

x

Ghi chú: * Tính chống chịu hạn và mặn theo mô tả trong lý lịch giống

2.1.2. Các thiết bị chính
Các thiết bị chính phục vụ nghiên cứu bao gồm:
i)

Thiết bị nuôi trồng và xử lý mô, cây: Phytotron, bàn cấy vơ trùng, buồng
ni cấy mơ, nhà kính trồng cây.

ii)

Thiết bị phân tích: Khối phổ, máy PCR, máy lai và đọc DNA array, máy đọc
trình tự gen.

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Tìm kiếm và phân lập các gen làm gia tăng hàm lượng polyamin thông qua
kỹ thuật ức chế gen bằng RNA
Phía Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam
i)

Đánh giá khả năng chịu hạn và chịu muối NaCl của ít nhất 20 giống lúa
Indica của Việt Nam có khả năng chống chịu khác nhau thông qua phép thử
chịu hạn và chịu muối .

ii)

Xác định hàm lượng PA (Putrescine, Spermidine, Spermine ...) và mối
tương quan của chúng đến tính chống chịu ở 20 giống lúa trên theo phương
pháp của viện MPI.

9


Phía Viện MPI MPP, CHLB Đức
i)

Thiết kế các gen ức chế từ RNA tách chiết được từ các giống có tính chống
chịu cao.

2.2.2. Phát hiện các gen điều khiển tính chịu hạn và muối bằng phổ phiên mã RNA
Phía Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam
i)

Chọn 4 giống lúa có tính chịu hạn (CR203; DR2, DR3, Lốc) và 5 giống lúa
có tính chịu muối (Cườm; CR203, NN8; SR26; SR59) từ các giống lúa
Indica của Việt Nam.

ii) Thiết lập thư viện cDNA từ rễ, lá, phơi hạt... của các giống lúa có tính chống
chịu hạn và muối cao (xử lý stress và không xử lý).
iii) Thu nhận, nhân dịng, đọc trình tự và so sánh các dịng lai cDNA.
Phía Viện MPI MPP, CHLB Đức
i)

Tạo các vi bản của 10 000-15 000 dòng cDNA từ mỗi thư viện cDNA trên.

ii)

Nhân bản 10 000-15 000 dòng cDNA bằng phản ứng PCR.

iii) Tạo các bản màng chuẩn mang 15 000 cDNA.
iv) Chuyển RNA lên màng chuẩn.
v)

Tiến hành lai 15 000 cDNA (không xử lý) với cDNA (đã xử lý) trên bản
màng chuẩn để phát hiện các dòng lai cDNA.

2.2.3. Kỹ thuật sao chép gen
Phía Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam
i)

Thiết kế mồi để nhân các đoạn gen từ DNA hoặc cDNA (rễ, lá, cây con).

ii)

Nhân dòng bằng kit TA.

iii) Tạo các vi bản trên màng chuẩn và lai với cDNA tách từ các giống chống
chịu hạn và mặn trong điều kiện stress.
iv) Thu nhận các dịng lai dương tính để đọc trình tự gen.
v)

Thiết kế đoạn gen phân lập được vào vector thích hợp bao gồm gen chỉ thị,
gen chọn lọc, đoạn promoter và đoạn terminator cần thiết cho chuyển gen
vào thực vật.

10


Phía Viện MPI MPP, CHLB Đức
i)

Tạo 17 000 dịng cDNA bằng enzym sao chép ngược từ mRNA tổng số tách
từ giống lúa chịu hạn và chịu mặn.

2.2.4. Kỹ thuật phân tích phổ chất bằng sắc ký khí / quang phổ khối
Phía Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học & Cơng nghệ Việt Nam
i)
ii)

Tối ưu phương pháp xử lý tính chịu muối và hạn đối với các giống lúa.
Tìm mối tương quan của các nhóm chất giữa điều kiện mơi trường và các
giai đoạn phát triển (đẻ nhánh, trỗ bông).

iii) Xử lý với proline để nghiên cứu tính chống chịu.
iv)

Xác định hàm lượng ABA ở rễ của các giống lúa trên trong điều kiện stress
và không stress.

v)

Đưa ra được protocol đánh giá kiểu hình tính chịu hạn ở lúa.

Phía Viện MPI MPP, CHLB Đức
i)

Phân tích phổ trao đổi chất của rễ ở 4-5 giống lúa (2-3 giống chống chịu và
2-3 giống khơng chống chịu) trong điều kiện bình thường và xử lý dưới điều
kiện khơng có stress (thay đổi thời gian và chế độ xử lý).

ii)

Xác định khoảng 300 chất từ các giống lúa đã đánh giá được tính chống chịu
hạn hoặc muối (nhóm đường đơn, đường đơi, axít amin, axít béo, proline,
K+, Na+, đường tan...). Phát hiện các chất tương tự có trong cây lúa (khoảng
50 chất).

2.2.5. Tối ưu phương pháp chuyển gen vào một số giống lúa Việt Nam
Phía Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học & Cơng nghệ Việt Nam
i)

Tối ưu hóa điều kiện ni cấy mô tế bào và tái sinh cây trên các đối tượng
giống nghiên cứu.

ii)

Thử nghiệm chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens trên một số
giống lúa bao gồm các bước chính sau: Nhiễm mẫu nuôi với vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens, diệt khuẩn, chọn dịng mơ sẹo và tái sinh cây.

iii) Tối ưu hóa điều kiện chuyển gen và tái sinh cây để thu được hiệu quả tái
sinh và chuyển gen cao.

11

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp sinh lý học thực vật
i)

Xử lý hạn và mặn; Thu thập và đánh giá khả năng chịu hạn và muối các
giống lúa (33 giống).

Xử lý hạn: Cây mạ được nuôi 10 ngày trong các chậu có đường kính 10cm (1
cây/1 chậu) chứa cát thạch anh trộn với phân bón hỗn hợp gồm 0,4g Fetrilon và 8g
Levatit HD5. Cây mạ được xử lý hạn bằng cách để khô các chậu trồng cây trong 4
ngày khơng tưới. Sau đó các chậu trồng cây được tưới bổ sung thêm một lượng nước
hạn chế (khoảng 13.68ml/1 cây/1 ngày) trong khoảng 14 ngày. Thí nghiệm được thực
hiện trong phytotron với chu kỳ chiếu sáng 12 giờ ngày/ 12 giờ đêm), cường độ ánh
sáng ngày đạt khoảng 2500lux, nhiệt độ 22-26oC, độ ẩm 70-75%.
Xử lý muối: Hạt lúa được cho nảy mầm trong 10 ngày sau đó cây mạ được nuôi
trong dung dịch (Yang et al., 1994) trong phytotron ở điều kiện chiếu sáng 14 giờ,
cường độ ánh sáng ngày đạt khoảng 2500lux, nhiệt độ 26oC, độ ẩm 70%. Nhiệt độ
22oC và độ ẩm 70% vào ban đêm. Sau 14 ngày cho cây phát triển bình thường, dung
dịch ni cây được thay mới và bổ sung muối NaCl với các nồng độ 0; 50; 100 mM.
Thời gian xử lý muối được thực hiện trong 14 ngày.
ii) Trồng, nhân giống và theo dõi các đặc điểm nông sinh học của các giống thí
nghiệm được thực hiện theo yêu cầu cụ thể của từng thí nghiệm.
iii) Phân loại khả năng chống chịu của các giống lúa theo tiêu chuẩn của IRRI.
Các chỉ tiêu theo dõi như số nhánh, chiều dài lá, sự thay đổi huỳnh quang diệp
lục, trọng lượng tươi và khô của lá, thân, rễ được sử dụng để đánh giá khả năng chịu
hạn của các giống theo 3 mức: Chống chịu, chống chịu trung bình và mẫn cảm theo
phương pháp tính tốn của IRRI ( />Phân loại khả năng chịu muối của các giống được thực hiện dựa theo thang điểm
đánh giá lá bị hại như sau:
1

Đầu lá hơi bị héo hoặc lá gần như bình thường

3

< ¼ tổng số lá bị héo hoặc mất màu xanh

5

1/4 - 1/2 tổng số lá bị héo hoặc mất màu xanh

7

Hơn 2/3 tổng số lá bị héo hoặc mất màu xanh

9

Hầu hết các lá bị héo

12