(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứ phát hiện và định lượng một số đột biến gen ty thể phổ biến bằng real time PCR

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

Phùng Bảo Khánh

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG
MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ PHỔ BIẾN
BẰNG REAL-TIME PCR

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

Phùng Bảo Khánh

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƢỢNG
MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ PHỔ BIẾN
BẰNG REAL-TIME PCR

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. PHAN TUẤN NGHĨA

Hà Nội, 2017


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS.
Phan Tuấn Nghĩa, ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian trao đổi,
định hƣớng nghiên cứu và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tơi trong suốt q trình
học tập, nghiên cứu khoa học thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ sự cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Thị Hồng Loan, ngƣời
đã giúp đỡ và tƣ vấn cho tơi rất nhiều trong q trình học tập và làm việc.
Tơi xin chân thành cảm ơn đến tồn thể q thầy, cơ trong Bộ mơn Sinh lý
thực vật và Hóa sinh cũng nhƣ quý thầy, cô trong Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học
Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời
gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh học,
Phòng Sau đại học, các thành viên trong nhóm nghiên cứu Phịng Protein tái tổ hợp
thuộc Phịng thí nghiệm trọng điể m Cơng nghê ̣ Enzym và Protein , Trƣờng Đa ̣i ho ̣c
Khoa ho ̣c Tƣ̣ nhiên đã giúp đỡ và ta ̣o điề u kiê ̣n cho tơi hồn thành chƣơng trình h ọc
tập và thực hiện luận văn.
Luận văn đã đƣợc thực hiện với sự tài trợ kinh phí của đề tài KLEPT.16.03 và
bản thân tôi cũng đã đƣợc hỗ trợ kính phí làm thực nghiệm với tƣ cách là học viên
cao học của đề tài.
Cuối cùng, tôi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, ngƣời thân và
bạn bè, những ngƣời đã đô ̣ng viên và tạo điề u kiê ̣n thuâ ̣n lơ ̣i nhất cho tơi có thời gian
học tập, nghiên cứu và hoàn thành luâṇ văn.
Hà Nội, Ngày 20 tháng 11 năm 2017
Học viên cao học

Phùng Bảo Khánh

i


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

APS

Ammonium persulfate

BFQ

Black fluorescence quencher

Chất hấp phụ huỳnh quang

Bp

Base pair

Cặp bazơ

CPEO

Chronic progressiveexternal
ophthalmoplegia

Bệnh liệt mắt cơ ngồi tiến
triển mạn tính

ddH2O

Deionized distilled H2O

Nƣớc cất loại ion, khử trùng

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

KSS

Kearns-Sayre syndrome

LB

Luria Bertani

LHON

Leber’s hereditary optic neuropathy Bệnh liệt thần kinh thị giác di
truyền theo Leber

LNA

Locked nucleic acid

Nucleotide dạng khóa

MELAS

Mitochondrial encephalopathy,
lactic acidosis, stroke-like episodes

Bệnh não giật cơ, tăng acid
lactic máu và giả tai biến mạch

MERRF

Myoclonic epilepsy with raggedred fibres

Bệnh động kinh giật cơ với các
sợi đỏ xé rách

MGB

Minor groove binder

Mẫu dò gắn khe nhỏ

MRI

Magnetic resonance image

Hình ảnh chụp cộng hƣởng từ

mtDNA

Mitochondrial DNA

DNA ty thể

NARP

Neuropathy, ataxia and retinitis
pigmentos

Hội chứng gây liệt, mất sự
điều hòa và viêm võng mạc

OD

Optical density

Mật độ quang học

Axit ethylene diamine
tetraacetic

Hội chứng Kearn-Sayre

ii

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase

RFLP

Restriction fragment length
polymorphism

Sự đa hình các đoạn phân cắt
giới hạn

ROS

Reactive oxygen species

Dạng chứa oxy phản ứng

TAE

Tris -Acetate-EDTA

Đệm Tris -acetate chứa EDTA

TE

Tris-EDTA

Đệm Tris-HCl chứa EDTA

TEMED

N, N, N’, N’- TetramethylEthylenediamine

Tm

Melting temperature

UNG

Uracil-DNA glycosylase

Nhiệt độ tách chuỗi

iii


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. Giới thiệu chung về ty thể ....................................................................................3
1.1.1.Cấu trúc và chức năng của ty thể .......................................................................3
1.1.2.Hệ gen ty thể ......................................................................................................7
1.2. Đột biến gen ty thể và các bệnh hoặc hội chứng liên quan ................................11
1.2.1.Đột biến gen ty thể ...........................................................................................11
1.2.2. Một số bệnh và hội chứng do đột biến gen ty thể ...........................................12

1.3. Các phƣơng pháp phát hiện đột biến gen ty thể .................................................21
1.3.1. PCR-RFLP ......................................................................................................22
1.3.2.Giải trình tự gen ...............................................................................................23
1.3.3.Real-time PCR .................................................................................................23
1.3.4.Các phƣơng pháp khác .....................................................................................24
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .............................................27
2.1. Nguyên liệu ........................................................................................................27
2.1.1. Mẫu bệnh phẩm ...............................................................................................27
2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác .......................................................................27
2.1.3. Máy móc và trang thiết bị ...............................................................................27
2.2. Phƣơng pháp ......................................................................................................28
2.2.1. Biến nạp và nuôi cấy tế bào E. coli chứa plasmid mang đoạn gen có và khơng
có đột biến gen ty thể ................................................................................................28
2.2.2.Tách chiết và định lƣợng DNA ........................................................................28
2.2.3.Kỹ thuật đa hình phân cắt các đoạn giới hạn kết hợp với PCR (PCR-RFLP) .30

iv


2.2.4.Điện di trên gel agarose và gel polyacylamide ................................................31
2.2.5.Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dị huỳnh quang dạng khóa cầu acid
nucleic (LNA) ...........................................................................................................32
2.2.6. Phƣơng pháp thống kê....................................................................................34
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................36
3.1. Tạo các mẫu đối chứng cho real-time PCR phát hiện và định lƣợng 6 đột biến
gen ty thể phổ biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A. ....36
3.1.1. Định lƣợng và kiểm tra độ tinh sạch của plasmid bằng quang phổ kế và điện
di trên gel agarose. ....................................................................................................36
3.1.2. Kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen chèn trong plasmid tái tổ hợp bằng PCRRFLP..........................................................................................................................37
3.2. Tạo hỗn hợp phản ứng master mix cho real-time PCR ......................................39

3.2.1. Tạo hỗn hợp phản ứng master mix cho real-time PCR ...................................39
3.2.2. Xác định thành phần thích hợp của master mix ..............................................43
3.2.3. Đánh giá độ đặc hiệu của master mix .............................................................45
3.2.4. Đánh giá độ nhạy của master mix ...................................................................48
3.2.5. Xác định thời gian bảo quản của master mix ..................................................49
3.2. Điều tra và định lƣợng một số đột biến gen ty thể phổ biến bằng real-time PCR ..... 51
3.2.1. Điều tra sự có mặt của đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A,
T8993G, T8993C ở các bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể ............................................51
3.3.2. Phân tích đột biến A3243G ở các thành viên gia đình bệnh nhân MELAS ..53
KẾT LUẬN ...............................................................................................................58
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................58
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................59

v


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình dạng bình thƣờng (trái) và dạng biến đổi (phải) của ty thể................ 3
Hình 1.2. Cấu trúc ty thể. ............................................................................................ 4
Hình 1.3. Cấu trúc màng trong ty thể. ......................................................................... 5
Hình 1.4. Ty thể và quá trình trao đổi năng lƣợng trong tế bào ................................. 6
Hình 1.5. Hệ gen ty thể ............................................................................................... 8
Hình 1.6. Thuyết cổ chai di truyền ........................................................................... 11
Hình 3.1. Kết quả điện di plasmid tinh sạch ............................................................. 37
Hình 3.2. Kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gen ty thể bằng điện di trên agarose 2% .. 38
Hình 3.3. Điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn kiểm tra các đoạn gen đích ......... 39
Hình 3.4. Biểu đồ tƣơng quan tuyến tính giữa chu kì ngƣỡng và số bản sao ban đầu
của các đột biến ......................................................................................................... 42
Hình 3.5. Biểu đồ tƣơng quan tuyến tính giữa chu kì ngƣỡng và số bản sao ban đầu
của các đột biến sau khi đƣợc xác định điều kiện thích hợp. .................................... 44

Hình 3.6. Đƣờng cong khuếch đại phản ứng real time PCR các mẫu bệnh phẩm
không mang các đột biến........................................................................................... 46
Hình 3.7. Đƣờng cong khuếch đại phản ứng real time PCR một trƣờng hợp dƣơng
tính với A3243G và các đoạn gen khác nhau trên hệ gen ty thể............................... 48
Hình 3.8. Biểu đồ đƣờng cong khuếch đại phản ứng realtime PCR khi sử dụng
khn là 1% đột biến................................................................................................. 49
Hình 3.9. Biểu đồ đƣờng cong khuếch đại phản ứng real time PCR của các đột biến
quan tâm sử dụng master mix bảo quản ở 25oC sau 7 ngày. .................................... 50
Hình 3.10. Biểu đồ đƣờng cong khuếch đại phản ứng real time PCR của các đột
biến quan tâm sử dụng master mix bảo quản ở 4oC sau 20 ngày.. ........................... 51
Hình 3.11. Đƣờng cong khuếch đại đột biến A3243G ở các bệnh nhân BN3, BN4,
BN, BN5, BN10, BN11, BN12. ................................................................................ 52
Hình 3.12. Biểu đồ đƣờng cong khuếch đại và biểu đồ thể hiện sự tƣơng quan giữa
chu kì ngƣỡng và số bản sao ban đầu của các thành viên trong gia đình bệnh nhân
MELAS ..................................................................................................................... 55

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Triệu chứng lâm sàng trên các cơ quan của bệnh ty thể ........................... 13
Bảng 2.1. Trình tự mồi chu trình nhiệt và kích thƣớc sản phẩm PCR ............................ 31
Bảng 2.2. Trình tự mồi và mẫu dị cho real-time PCR ............................................. 35
Bảng 3.1. Kết quả định lƣợng plasmid tinh sạch bằng máy đo quang phổ............... 36
Bảng 3.2. Thành phần cắt enzyme giới hạn .............................................................. 38
Bảng 3.3. Hiệu suất PCR và giá trị tƣơng quan tuyến tính của đƣờng chuẩn các đột
biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A ............................. 42
Bảng 3.4. Hiệu suất real-time PCR và giá trị tƣơng quan tuyến tính của đƣờng
chuẩn các đột biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G, G11778A sau
khi đƣợc xác định điều kiện thích hợp ...................................................................... 45

Bảng 3.5. Triệu chứng lâm sàng và tỷ lệ đột biến A3243G của bệnh nhân và các
thành viên trong các gia đình bệnh nhân................................................................... 56

vii


viii


MỞ ĐẦU
Ty thể là bào quan có mă ̣t trong h ầu hết các tế bào nhân chu ẩn với chức năng
chính là sản xuất năng lƣợng dƣới dạng ATP cho các hoạt động của tế bào. Hệ gen
ty thể có cấu trúc sợi đơi, DNA mạch vịng với kích thƣớc 16.569 bp, gồm 37 gen
mã hóa cho 13 protein, 22 RNA vận chuyển (tRNA) và 2 RNA ribosome (rRNA).
Gần nhƣ tất cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lƣợng ổn định do ty thể cung
cấp, do đó những sai hỏng trong DNA của ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ
thống, ảnh hƣởng đến nhiều loại tế bào, mô và tổ chức khác nhau chủ yếu tập trung
ở cơ, thần kinh và chức năng chuyển hóa của cơ thể.
Giống nhƣ tất cả DNA ngồi nhân, mtDNA đƣợc di truyền theo mẹ, tƣ́c là
mẹ truyền hệ gen ty thể cho các ngƣời con và chỉ có những ngƣời con gái mới
truyền hệ gen đó cho thế hệ tiếp theo. Đột biến mtDNA đƣợc truyền từ mẹ sang con
nhƣng tỷ lệ số bản sao mang đột biến ở mẹ và con khác nhau, các cá thể mang đột
biến trong một phả hệ gia đình cũng có sự thay đổi về tần suất đột biến vì vậy mức
độ biểu hiện bệnh ở mẹ và các ngƣời con khác nhau có th ể rất khác nhau. Bệnh do
đột biến gen ty thể có tác động lâm sàng phức tạp. Do đó rất khó để phát hiện thơng
qua việc chẩn đốn lâm sàng. Hiện nay phân tích DNA là phƣơng pháp hiện đại
nhất cho phép hiện nhanh chóng và chính xác các đột biến điểm gây bệnh.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về đột biến gen ty thể, cho đến nay trên
250 đột biến điểm đã đƣợc phát hiện liên quan đến các bênh hay hội chức khác
nhau. Ở Việt Nam, nghiên cứu về đột biến gen ty thể chỉ mới đƣợc quan tâm

khoảng 10 năm gần đây, qua đó khoảng 20 loại đột biến khác nhau đã đƣợc nghiên
cứu và điều tra trên các bệnh nhân nhi nghi bị bệnh ty thể. PCR-RFLP và real-time
là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến để sàng lọc các đột biến gen ty thể. PCRRFLP có ƣu điểm giá thành rẻ, dễ sử dụng, tuy nhiên nó có nhƣợc điểm độ nhạy
khơng cao đồng thời khơng định lƣợng chính xác đƣợc tỷ lệ đột biến. Trong khi đó,
real-time PCR là kỹ thuật phát hiện các đột biến gen ty thể có độ nhạy cao đồng
thời có thể định lƣợng chính xác tỷ lệ đột biến gen gây bệnh thơng qua việc sử dụng

1


các mẫu dị khác nhau. Ngồi ra, phƣơng pháp khơng cần thao tác sau PCR dẫn tới
việc rút ngắn thời gian phân tích mẫu.
Do đó trong nghiên cứu này, trên cơ sở kết quả nghiên của GS.TS. Phan
Tuấn Nghĩa và tập thể đã có trƣớc đó, chúng tơi t ập trung hoàn thiện cách thức
phát hiện và định lƣợng cùng một lúc 6 đột biến điểm có tần suất xuất hiện cao
trong các hội chứng bệnh ty thể điển hình bao gồm: A3243G, G3380A (thuô ̣c hô ̣i
chƣ́ng MELAS), G11778A (thuô ̣c hô ̣i chƣ́ng LHON ), A8344G (thuô ̣c hô ̣i chƣ́ng
MERRF), T8993G/C (thuô ̣c hô ̣i chƣ́ng Leigh) bằng real-time PCR nhằm góp
phần vào việc chẩn đốn và hỗ trợ điều trị bệnh ty thể.
Nghiên cứu đƣợc thực hiện với nội dung nhƣ sau
1. Tạo các mẫu đối chứng cho real-time PCR phát hiện và định lƣợng 6 đột
biến gen ty thể phổ biến A3243G, G3380A, A8344G, T8993C, T8993G,
G11778A.
2. Tạo hỗn hợp phản ứng master mix cho real-time PCR
3. Xác định thành phần thích hợp cho master mix
4. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, xác định thời gian bảo quản master mix
5. Điều tra sự có mặt của 6 đột biến A3243G, G3380A, A8344G, G11778A,
T8993G, T8993C ở các bệnh nhân nghi bị bệnh ty thể sử dụng master mix
đƣợc tạo ra.
6. Phân tích các thành viên trong gia đình bệnh nhân dƣơng tính với một hoặc

nhiều đột biến trong 6 đột biến quan tâm.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về ty thể
1.1.1. Cấu trúc và chức năng của ty thể
Ty thể là bào quan có ở hầu hết các tế bào nhân thật, hình dạng đặc trƣng của
ty thể là thon dài với đƣờng kính 0,5-2 µm và chiều dài 7-10 µm. Phụ thuộc vào
trạng thái tế bào hay loại tế bào mà ty thể có hình dạng và kích thƣớc khác nhau
(Hình 1.1).
Ty thể có khả năng thay đổi kích thƣớc, hình dạng, có thể liên kết với nhau
tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành những cấu trúc ngắn hơn. Ngồi
ra, ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng với những thay đổi sinh lý trong tế bào
[15].

Hình 1.1. Hình dạng bình thƣờng (trái) và dạng biến đổi (phải) của ty thể [15].
Ty thể có cấu trúc gồm hai lớp màng lipoprotein, màng ngoài và màng trong,
tƣơng tự nhƣ màng sinh chất. Hai lớp màng này bao lấy chất nền ở phía trong,
khoang giữa hai màng đƣợc gọi là xoang gian màng. Màng trong ty thể ăn sâu vào
chất nền tạo thành các cấu trúc mào răng lƣợc (Hình 1.2).

3


Hình 1.2. Cấu trúc ty thể [16].
Màng ngồi ty thể có độ dày 6 nm, trong đó protein chiếm khoảng 60% và
lipid chiếm khoảng 40%. Màng có nhiều protein lỗ cho phép các chất, các ion di
chuyển tự do từ ngoài nguyên sinh chất vào xoang gian màng và ngƣợc lại. Màng

ngồi ty thể cịn chứa nhiều enzyme quan trọng nhƣ các transferase, kinase,
cytochrome-reductase, acyl CoA synthetase.
Màng trong của ty thể cũng là màng lipoprotein, protein chiếm 80%, lipid
chiếm 20%, và một lƣợng nhỏ cholesterol. Màng trong ăn sâu vào chất nền tạo nên
các cấu trúc mào răng lƣợc. Cấu trúc “mào” làm tăng diện tích bề mặt của màng
trong so với màng ngoài và điều này liên quan đến chức năng của nó là tăng cƣờng
vận chuyển điện tử và tổng hợp ATP. Màng trong chứa nhiều protein vận chuyển
chủ động ATP, ADP, acid béo và các protein kênh vận chuyển các ion Na+, K+,
Ca2+ và H+. Màng trong là nơi bám của 5 phức hợp thuộc chuỗi hô hấp bao gồm
chuỗi vận chuyển điện tử: phức hợp I (NADH ubiquinone reductase), phức hệ II
(Succinate dehydrogenase), phức hệ III (Ubiquinol-cytochrome c reductase), phức
hệ IV (Cytochrome c oxidase), phức hệ 5 (ATP synthase còn gọi là F1F0-ATPase)
và adenine nucleotide translocase (ANT) (Hình 1.3).

4


Hình 1.3. Cấu trúc màng trong ty thể [13].
I, II, III, IV, V phức hệ trong chuỗi vận chuyển điện tử

Xoang gian màng (khoang hẹp giữa màng ngoài và màng trong ty thể) là nơi
trung chuyển các chất giữa hai màng. Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ từ chất
nền đi ra do hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử.
Chất nền (matrix) của ty thể chứa các enzyme của chu trình Krebs, các
enzyme của q trình oxy hóa acid béo, acid amin và vật chất di truyền riêng của ty
thể. Nhƣ vậy, ở tế bào động vật, thực vật và ngƣời ngồi hệ gen nhân, cịn có hệ gen
tế bào chất nằm trong ty thể.
Ty thể thực hiện các chức năng sinh hóa cần thiết cho nội cân bằng tế bào
cũng nhƣ nhân tố quan trọng quyết định sự sống còn của tế bào. Ở sinh vật nhân
chuẩn, ty thể sản xuất ra năng lƣợng dƣới dạng ATP thông qua q trình oxi hóa

các chất hữu cơ bao gồm carbohydrate, chất béo và protein đƣợc lấy từ thức ăn,
trong đó chủ yếu là carbohydrate thơng qua hai bƣớc chính: 1) oxy hóa NADH hoặc
FADH2 đƣợc sinh ra trong quá trình đƣờng phân, chu trình Krebs hoặc β- oxy hóa
các axit béo và 2) phosphoryl hóa oxy hóa tạo ra ATP. Tất cả các q trình này
đƣợc kiểm sốt bởi các hệ nhân tố phiên mã trong ty thể [9].
Chuỗi vận chuyển điện tử bao gồm 5 đơn vị phức hợp enzyme: I, II, III, IV
và V nằm trên màng trong của ty thể, hai phân tử vận chuyển điện tử giữa các phức
hệ là coenzyme ubiquinone (CoQ) và Cyt c. Các Coenzyme, NADH và FADH2

5


trong chu trình Krebs là nguồn cung cấp electron. Các electron đƣợc chuyển sang
các thành phần của chuỗi vận chuyển ở phức hệ I (NADH ubiquinone reductase)
hoặc phức hệ II (Succinate dehydrogenase), Phức hệ I và II xúc tác cho sự nhận
điện tử của CoQ từ NADH và succinate. Phức hệ III (Ubiquinol-cytochrome c
reductase) xúc tác cho quá trình chuyển điện tử từ CoQ đến Cyt c. Cuối cùng phức
hệ IV (Cytochrome c oxidase) xúc tác sự vận chuyển điện tử từ Cyt c tới chất nhận
cuối cùng là oxy phân tử [3]. Ở mỗi bƣớc, điện tử đi qua các phức hệ, năng lƣợng
đƣợc giải phóng ra kèm theo việc bơm các proton (H+) từ chất nền qua màng trong
ra xoang gian màng và làm xuất hiện điện thế màng và gradient proton. Nhờ thế, hệ
thống ATP synthase hoạt động và tổng hợp ATP từ ADP và phosphate vô cơ (Pi)
(Hình 1.4).

Hình 1.4. Ty thể và quá trình trao đổi năng lƣợng trong tế bào [19].
Ty thể hoạt động liên tục để chuyển hóa oxy và tạo ra gốc tự do chứa oxy
phản ứng (ROS). Tuy nhiên, dù là ngẫu nhiên hay vì một ngun nhân nào đó, q
trình vận chuyển điện tử vẫn cịn sai sót, dẫn tới việc sản xuất các gốc tự do chứa

6

oxy nhƣ anion superoxide (•O2-) là một trong các gốc tự do chính. Các anion
superoxide tiếp tục tƣơng tác với nhiều hợp chất khác và tạo ra các gốc tự do thứ
cấp. Trƣớc đó, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng tƣơng tác của gốc tự do hydroxyl
(•OH) với phân tử DNA gây tổn hại đến các bazơ nitơ purine, pyrimidine và khung
xƣơng đƣờng của DNA [34].
Ngoài ra, việc tạo ra quá nhiều gốc tự do sẽ phá hủy các protein/các enzyme,
màng, và DNA của ty thể, làm cho sự hình thành ATP và các chức năng thiết yếu
khác trong ty thể bị gián đoạn. Bên cạnh anion superoxide và các gốc hydroxyl,
chuỗi vận chuyển điện tử cũng tạo ra các phân tử hoạt động khác nhƣ nitơ oxit (NO)
và các loại nitơ phản ứng (RNS). Hầu hết các protein của tế bào và glutathione đều
bị ảnh hƣởng bởi sự nitrat hóa do RNS gây ra. Mặc dầu, các gốc tự do là sản phẩm
không tránh khỏi trong các quá trình hóa sinh cơ bản và liên tục đƣợc sản xuất trong
cơ thể, tuy nhiên, các tế bào có nhiều cách để chống lại những tác dụng của cácgốc
tự do bằng cách trực tiếp làm giảm quá trình tạo ra các gốc tự do hoặc bằng cách
loại bỏ các gốc tự do bởi các chất chống oxy hoá bao gồm cả các cơ chế sử dụng
enzyme và không sử dụng enzyme [34].
1.1.2. Hệ gen ty thể
Ty thể là bào quan hiếm hoi trong tế bào có hệ gen riêng, nhân bản độc lập
với hệ gen nhân. Khác với DNA nhân (nDNA), mtDNA không liên kết với protein
histone, điều này làm cho mtDNA giống DNA của vi khuẩn. DNA ty thể khơng có
intron (ngoại trừ một số nucleotide khơng mã hóa ở giữa một vài gen) và có các gen
nằm gối lên nhau).
mtDNA ngƣời tồn tại ở dạng mạch vòng, sợi đơi có kích thƣớc là 16.569 bp,
chứa 37 gen, mã hóa 13 polypeptide, 2 RNA ribosome và 22 tRNA (Hình 1.5A).
Vùng khơng mã hóa (D-loop) đóng vai trị kiểm sốt mtDNA sao chép và phiên
mã. 2 rRNA và 22 tRNA đóng vai trị trong việc dịch mã để tạo ra 13 polypeptide.
13 polypeptide đƣợc phân bố trong các phức hợp protein I, III, IV và V của phức
hệ photphoryl hóa oxy hóa và giữ vai trị chính trong hoạt động hơ hấp của tế bào.

Gen ND1-ND6 và ND4L mã hóa 7 tiểu đơn vị của phức hệ I (NADH–ubiquinone

7


oxidoreductase), cytochrome b (Cytb) là tiểu đơn vị của phức hệ III chỉ đƣợc mã
hóa bởi mtDNA (ubiquinol cytochrome coxidase reductase), COX1-3 (COI-COIII)
mã hóa cho 3 tiểu đơn vị của phức hệ IV (cytochrome c oxidase-COX), các gen
ATP 6 và ATP 8 mã hóa cho 2 tiểu đơn vị của phức hệ V (Hình 1.5B). Những phức
hợp này cũng bao gồm nhiều tiểu đơn vị đƣợc mã hóa bởi hệ gen nhân. Đặc biệt,
phức hệ II đƣợc mã hố hồn toàn bởi hệ gen nhân. Dầu vậy, tất cả 37 gen của ty
thể đều rất quan trọng đối với quá trình photphoryl hóa oxy hóa. Các protein cịn
lại (> 1.000 Da) trong hệ protein ty thể đƣợc mã hóa bởi hệ gen nhân, đƣợc tổng
hợp trong tế bào chất và sau đó đƣợc vận chuyển qua màng vào trong ty thể [32].

Hình 1.5. Hệ gen ty thể [32]
(A. Sơ đồ hệ gen ty thể, B. Các gen mã cho phức hệ của chuỗi vận chuyển điện tử)

Hệ gen ty thể sao chép độc lập với hệ gen nhân bằng một hệ thống riêng
trong ty thể nhƣng các enzyme cho quá trình tái bản lại do hệ gen nhân mã hóa.
Q trình phiên mã và dịch mã của mtDNA đƣợc điều khiển bởi gen nhân. Hệ gen
ty thể đƣợc phiên mã từ một điểm khởi đầu nằm trên vùng D-loop, bản phiên mã
sau đó đƣợc endonuclease phân cắt để hình thành nên các phân tử tRNA, rRNA
12S và 16S, RNA thông tin (mRNA) tiền thân [2].
Số lƣợng bản sao ty thể ở tế bào khác nhau là khác nhau. Ở tế bào bạch cầu
là 250-350 và lên đến 6000 ở tế bào cơ [44]. Điều này tạo ra đặc trƣng quan trọng

8

của di truyền gen ty thể đó là tính đồng nhất (homoplasmy) và tính khơng đồng
nhất (heteroplasmy) của các mtDNA. Tính đồng nhất là khi tất cả các bản mtDNA
giống nhau trong khi tính khơng đồng nhất là khi có một hỗn hợp của hai hoặc
nhiều loại mtDNA khác nhau [51].
Xác định tính đồng nhất hay khơng đồng nhất của hệ gen ty thể có giá trị
trong việc nghiên cứu các bệnh/hội chứng do đột biến gen ty thể. Một số đột biến
gen ty thể tồn tại ở tất cả các bản sao ty thể của tế bào đƣợc gọi là đột biến ở dạng
đồng nhất. Trong khi đó một số đột biến khác chỉ tồn tại ở một số bản sao nhất
định đƣợc gọi là đột biến ở dạng không đồng nhất. Khi đột biến ở dạng không
đồng nhất, chỉ khi đột biến đạt đến một ngƣỡng nhất định thì mới dẫn sự khiếm
khuyết trong chuyển hóa năng lƣợng và biểu hiện thành bệnh [51].
Các tế bào có khả năng “chịu đựng” tỷ lệ mtDNA đột biến cao (60-90%)
trƣớc khi chuỗi hô hấp tổn thƣơng và đƣợc gọi là ngƣỡng biểu hiện của đột biến
[39]. Tỷ lệ ty thể đột biến phải đạt đến ngƣỡng thì mới gây ra các biểu hiện lâm
sàng. Ngƣỡng biểu hiện của đột biến thay đổi tùy thuộc từng loại đột biến và từng
loại mô, ở các mô không phân chia nhƣ mô cơ và thần kinh chứa tỷ lệ mtDNA đột
biến cao trong khi đó ở các mơ phân chia nhanh nhƣ bạch cầu máu chứa tỷ lệ
mtDNA đột biến thấp. Tuy nhiên, tỷ lệ mtDNA đột biến cao cũng đƣợc phát hiện ở
biểu mô đƣờng tiết niệu, đây là loại mô tăng sinh rất nhanh. Các mô cần nhiều năng
lƣợng nhƣ cơ, tim, não có ngƣỡng biểu hiện của đột biến thấp và dễ bị tổn thƣơng
khi có đột biến mtDNA [10].
Sự di truyền của các gen trên mtDNA là sự di truyền qua tế bào chất. Đối với
các gen nằm trong nhân của tế bào sinh vật nhân chuẩn, chúng tuân theo các quy
luật hoạt động của nhiễm sắc thể trong các cơ chế phân bào. Nhƣng hệ gen ty thể lại
khơng tn theo những quy luật đó mà các tính trạng do chúng xác định có những
kiểu di truyền riêng đặc trƣng cho chúng. Giống nhƣ tất cả DNA ngoài nhân,
mtDNA đƣợc di truyền theo mẹ. Ngƣời mẹ truyền hệ gen ty thể cho các ngƣời con
và chỉ có những ngƣời con gái mới truyền hệ gen đó cho thế hệ tiếp theo.

9

Trong q trình trƣởng thành của nỗn bào, số lƣợng bản sao ty thể tăng
nhanh chóng. Trong kì sau của giảm phân II, số lƣợng bản sao mtDNA lớn hơn
100000 để chuẩn bị cho nhu cầu chuyển hóa năng lƣợng trong q trình thụ tinh và
phát triển của phơi [32]. Trong khi đó, tinh trùng chỉ chứa khoảng 100-1500 bản
sao, tập trung ở đuôi tinh trùng. Khi thụ tinh, nhân tinh trùng đi vào trứng cịn đi
tinh trùng rụng ra, tế bào tinh trùng chỉ đóng góp hệ gen nhân cho tế bào trứng chứ
khơng đóng góp hệ gen ty thể. Do đó, gần nhƣ khơng có ty thể của tinh trùng đi vào
trong trứng, nhƣng nếu có thì tế bào trứng có cơ chế tiêu diệt các ty thể này.
Phân tích sự di truyền của mtDNA cho thấy một bà mẹ có đột biến gen ty thể
ở dạng khơng đồng nhất có thể truyền tỉ lệ đột biến mtDNA khác nhau đáng kể cho
những ngƣời con. Trong một số trƣờng hợp, tỷ lệ đột biến của ngƣời mẹ thấp nhƣng
những ngƣời con có một tỉ lệ đột biến cao (Hình 1.6).
Hiện tƣợng này đƣợc giải thích bởi một giả thuyết về nút cổ chai di truyền
mtDNAtrong suốt quá trình sinh nỗn và tạo trứng và chỉ có một phần nhỏ mtDNA
đƣợc biểu hiện trong trứng của ngƣời trƣởng thành [51].
Thực tế, trứng của ngƣời phụ nữ đƣợc hình thành ở giai đoạn rất sớm trong
quá trình phát triển. Tế bào tiền thân phân chia thành nhiều trứng, vì thế ty thể từ tế
bào đó đƣợc phân phối ngẫu nhiên thơng qua các trứng này và chỉ có một lƣợng nhỏ
phân tử mtDNA từ ngƣời mẹ đƣợc truyền cho thế hệ sau. Các trứng khác nhau có
thể chứa một lƣợng mtDNA đột biến khác nhau, điều này quyết định lƣợng nguyên
liệu di truyền đột biến đƣợc truyền cho thế hệ sau. Sự khác nhau này có thể giải
thích sự khác nhau về mức độ nghiêm trọng của bệnh giữa các ngƣời con [38].

10


Hình 1.6. Thuyết cổ chai di truyền [51].
Tế bào mầm nguyên thủy của ngƣời phụ nữ chứa mtDNA đột biến đƣợc phân chia ngẫu

nhiên trong q trình phát triển nỗn bào sơ cấp và phát triển lên noãn bào trƣởng thành.
Do đó, mỗi trứng sẽ mang một tỷ lệ đột biến mtDNA khác nhau. Trứng đƣợc thụ tinh với
tinh trùng và phát triển thành hợp tử cho ra các cá thể con với tỷ lệ đột biến khác nhau.

1.2. Đột biến gen ty thể và các bệnh hoặc hội chứng liên quan
1.2.1. Đột biến gen ty thể
Hệ gen ty thể có tỷ lệ đột biến rất cao, cao hơn từ 10 đến 20 lần so với đột
biến DNA trong nhân. Mặc dầu cơ thể có hệ thống sửa chữa mtDNA nhƣng cũng
khơng đủ để ngăn chặn q trình oxy hóa bởi hệ gen ty thể luôn phải tiếp tiếp xúc
với các gốc tự do chứa oxy do phức hệ chuỗi hô hấp tế bào tạo ra. Mặt khác DNA
của ty thể còn thiếu các phân tử histon bảo vệ.
Hầu hết những thay đổi trên DNA ty thể chỉ là đa hình và có vai trị quan
trọng trong việc tạo nên sự đa dạng của quần thể. Những đột biến mtDNA gây bệnh
đầu tiên đã đƣợc xác định vào năm 1988 [55]. Kể từ đó, hơn 250 đột biến mtDNA
gây bệnh đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu, bao gồm hai loại đột biến chính là đột
biến điểm và đột biến cấu trúc mtDNA [1].
Đột biến điểm mtDNA là đột biến thay thế, mất hoặc thêm một nucleotide
trên hệ gen ty thể. Các đột biến này là nguyên nhân chính gây bệnh ở ngƣời với tỷ

11


lệ 1:200 trong dân số [12]. Triệu chứng lâm sàng do các đột biến điểm có thể biểu
hiện ở trẻ em hoặc ngƣời trƣởng thành. Đột biến điểm trên các gen mã hóa cho
tRNA của ty thể là nguyên nhân phổ biến nhất của bệnh ty thể. Đặc biệt, nhiều đột
biến đã đƣợc báo cáo ở gen mã hóa cho tRNALeu, điều này đã chỉ ra rằng vùng này
là điểm nóng xảy ra đột biến [42] với khoảng 75% trƣờng hợp đột biến do di truyền
từ mẹ và 25% trƣờng hợp do phát sinh ở mức độ cá thể [41].
Đột biến cấu trúc bao gồm các đột biến do mất đoạn, đạo đoạn, lặp đoạn
mtDNA và có tần suất 1,5/100000 trong dân số [18] với ba hội chứng/bệnh chính:

bệnh liệt cơ mắt tiến triển (PEO) (khoảng 65% trƣờng hợp), hội chứng KearnsSayre (KSS) (~ 30% trƣờng hợp) và hội chứng Pearson (<5% trƣờng hợp). Trong
đó, hội chứng Pearson là hội chứng nghiêm trọng nhất, liên quan đến mất đoạn
mtDNA lớn, với các triệu chứng thiếu máu và rối loạn chức năng tụy và thƣờng gây
tử vong ở trẻ sơ sinh [30].
1.2.2. Một số bệnh và hội chứng do đột biến gen ty thể
mtDNA mã hóa các protein trong chuỗi hơ hấp, cũng nhƣ tRNA và rRNA
cần thiết cho quá trình dịch mã. Do đó đột biến trong hệ gen ty thể gây ra những
khiếm khuyết trong q trình photphoryl hóa oxy hóa dẫn tới nhiều bệnh khác nhau,
chủ yếu là bệnh thần kinh - cơ. Những hội chứng và bệnh ty thể rất đa dạng về kiểu
hình lâm sàng và thƣờng tập trung ở các mô cần nhiều năng lƣợng, cơ xƣơng, cơ
tim, thần kinh và não, là những mô bị ảnh hƣởng nhiều nhất [10].
Ảnh hƣởng của bệnh do đột biến gen ty thể khoảng 1:5000 trong dân số và
có sự khơng đồng nhất của triệu chứng lâm sàng giữa các bệnh nhân khác nhau do
tác động của một hay nhiều cơ quan (bảng 1.1). Ngoài ra độ tuổi, giới tính và mơi
trƣờng sống cũng góp phần thay đổi kiểu hình của bệnh [14].

12


Bảng 1.1. Triệu chứng lâm sàng trên các cơ quan của bệnh ty thể [14].
Biểu hiện lâm sàng
Cơ quan
Hệ thần kinh
trung ƣơng
Hệ thần kinh
ngoại vi
Mắt

Tuyến nội tiết
Tụy

Gan
Ruột
Cơ
Máu

Thận
Tim mạch

Da

Đột quỵ, động kinh
Thối hóa thần kinh
Đặc điểm bất thƣờng khi chụp rơngen thần kinh.
Viêm màng não, viêm não
Bệnh lý thần kinh ngoại biên.
Hoại tử
Đau mắt
Chứng giật cầu mắt
Rối loạn thị giác
Viêm võng mạc
Giảm hormone tăng trƣởng
Rối loạn tuyến giáp hoặc tuyến cận giáp
Thiếu hụt nhiều loại hormon
Đái tháo đƣờng
Thiếu máu ngoại sinh
Suy gan (men gan cao)
Đau tắc ruột
Rối loạn chức năng ruột
Đau cơ
Sợi cơ đỏ xé rách

Thiếu máu cục bộ
Hoại tủy
Acid lactic lớn hơn 2,4 mmol /l
Rối loạn chức năng ống thận
Suy thận cấp tiến
Hội chứng thận kháng steroid (do thiếu coenzyme Q10)
Các khiếm khuyết dẫn truyền
Bệnh cơ tim
Rậm lông
Bệnh về lông tóc (khiếm khuyết ở phức hệ III)
Xuất huyết dƣới da

Sự khởi phát các triệu chứng lâm sàng, sự biến đổi kiểu hình và mức biểu hiện
của bệnh ty thể chịu ảnh hƣởng của một số yếu tố khác nhau bao gồm: ngƣỡng chịu
đựng của tế bào, sự phân chia tế bào chất trong phân bào, sự nhân bản đơn dòng, và

13


sự di truyền “nút cổ chai”. Nhiều đột biến gen gây bệnh ty thể ở trạng thái không
đồng nhất, trong trƣờng hợp này thì triệu chứng lâm sàng của bệnh thƣờng phụ
thuộc tỷ lệ gen đột biến. Tỷ lệ gen đột biến nhỏ nhất cần thiết có thể gây nên những
biến đổi sinh hóa và chức năng của tế bào dẫn đến biểu hiện lâm sàng của bệnh
đƣợc gọi là ngƣỡng biểu hiện của đột biến. Giá trị ngƣỡng này khác nhau đối với
từng loại đột biến và giữa các mô, cơ quan trong cơ thể. Thông thƣờng các giá trị
ngƣỡng trong khoảng 60-90% gen đột biến mtDNA [39]. Trong quá trình phân bào,
ty thể đƣợc phân chia ngẫu nhiên. Do đó, tỷ lệ đột biến mtDNA của tế bào con sẽ
thay đổi, sự thay đổi này đôi khi thấp hơn hoặc cao hơn ngƣỡng biểu hiện của bệnh.
Mặt khác, mỗi tế bào nhân bản ngẫu nhiên hàng vạn bản sao mtDNA dẫn đến sự
thay đổi tỷ lệ mtDNA đột biến trong tế bào và mơ. Ngồi ra, cơ chế di truyền “nút

cổ chai” cũng quyết định sự biểu hiện bệnh ty thể ở các con sinh ra từ trứng của
ngƣời mẹ mang đột biến gen ty thể ở dạng không đồng nhất, bởi sự di truyền ngẫu
nhiên lƣợng mtDNA đột biến vào tế bào trứng của mẹ tạo nên tỷ lệ không đồng
nhất ở tế bào hợp tử cao hơn hay thấp hơn ngƣỡng biểu hiện của bệnh.
Hiện nay, đã có hơn 250 đột biến mtDNA gây bệnh đƣợc xác định, tập trung
vào một số bệnh và hội chứng sau đây.
1.2.2.1. Hội chứng MELAS
Hội chứng MELAS (mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and
stroke-like episodes) là hội chứng giật thần kinh-cơ, tăng acid lactic máu và giả tai
biến mạch và là một trong những hội chứng bệnh có tần suất xuất hiện cao nhất do
đột biến gen ty thể, đƣợc mô tả lần đầu tiên vào năm 1984 [37].
Các biểu hiện điển hình của hội chứng MELAS bao gồm đột quỵ, co giật
từng cơn, sa sút trí nhớ, đau cơ do do tích tụ axit lactic, các sợi cơ đỏ bị xé rách,
phát triển tâm thần vận động khơng bình thƣờng, đau đầu và nôn mửa tái phát [8,
22].
Nguyên nhân của hội chứng MELAS là do đột biến A3243G, T3271C,
T3291C, A3252G, A3260G, C3256T trên gen MTTL1 mã hóa cho tRNALeu(UUR)
trong đó đột biến A3243G đƣợc tìm thấy ở 80% trƣờng hợp mắc hội chứng

14


MELAS. Các đột biến ở các gen ty thể khác cũng đƣợc công bố là nguyên nhân gây
ra hội chứng MELAS, tuy nhiên với tỷ lệ rất thấp bao gồm các gen MT-TL2 mã hoá
cho tRNALeu (CUN), MT-TK mã hoá cho tRNALys, MT-TH mã hóa cho tRNAHis, MTTQ mã hóa cho tRNAGln, MT-TF mã hóa cho tRNAPhe, MT-TV mã hố cho
TRNAVal, các gen MT-ND1, MT-ND4, MT-ND5 và MT-ND6 mã hóa cho các tiểu
đợn vị phức hệ I chuỗi hô hấp, gen MT-CO2 và MT-CO3 mã hóa cho tiểu phần của
phức hệ IV và gen MT-CYB mã hóa cho một tiểu đơn vị của phức hệ III. Ngoài ra,
các đột biến trong gen nhân POLG mã hóa DNA ty thể DNA polymerase gamma đã
đƣợc liên kết với một kiểu hình giống MELAS [59].

Các đột biến trên tRNALeu vẫn là nguyên nhân chính gây ra MELAS. Trong
số đó, đột biến A3243G đƣợc báo cáo đầu tiên trên gen mã hóa cho tRNA Leu là đột
biến phổ biến nhất ở tất cả chủng tộc. Vì vậy, đột biến A3243G đƣợc là một nguyên
nhân quan trọng để chẩn đốn hội chứng MELAS ngồi các chẩn đoán lâm sàng.
Đột biến A3243G gây ra rối loạn thể ty thể. Ở mức độ phân tử, đột biến làm
thay đổi cấu trúc, rối loạn chức năng của tRNALeu(UUR) gây ra giảm sút quá trình
tổng hợp protein, làm hỏng sự kết thúc phiên mã và biến đổi bộ ba đối mã. Ở mức
độ tế bào, đột biến tồn tại dạng khơng đồng nhất và các bằng chứng về hình thái học
điển hình nhƣ sợi cơ đỏ xé rách. Ở mức độ cơ quan, đột biến gây ra bệnh cơ, bệnh
não, tăng acid lactic máu và dịch não tủy, ngoài ra cịn có các kiểu hình khác.
Nghiên cứu về chức năng của tRNA trong ty thể ở in vitro chứng tỏ rằng đột biến
A3243G đã làm giảm khả năng liên kết giữa tRNA với acid amin từ 12-25 lần so
với gen khơng đột biến [36]. Do đó, q trình tổng hợp các protein cần thiết cho
tiểu đơn vị cấu tạo nên các phức hệ trong chuỗi vận chuyển điện tử bị suy giảm. Kết
quả là việc tạo ra năng lƣợng (ATP) để đáp ứng nhu cầu cần thiết cho tế bào ở các
cơ quan khác nhau bị khiếm khuyết, dẫn tới sự rối loạn chức năng đa cơ quan trong
hội chứng MELAS.
Đột biến A3243G đã đƣợc nghiên cứu phát hiện và định lƣợng bằng realtime PCR với mẫu dò các allen đặc hiệu (ARMS-qPCR) và so sánh hiệu quả của
phƣơng pháp này với PCR-RFLP. Kết quả là ở các tỷ lệ % đột biến nhỏ (< 5%)

15