(Luận văn thạc sĩ) ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang ( FISH) nhằm xác định nhanh một số loại tảo độc hại biển việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lưu Xuân Hòa

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ LAI HUỲNH QUANG (FISH)
NHẰM XÁC ĐỊNH NHANH MỘT SỐ LOÀI TẢO ĐỘC HẠI
BIỂN VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2011


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Lưu Xuân Hòa

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ LAI HUỲNH QUANG (FISH)
NHẰM XÁC ĐỊNH NHANH MỘT SỐ LOÀI TẢO ĐỘC HẠI
BIỂN VIỆT NAM

Chuyên ngành:

Di truyền học

Mã số:

60 42 70
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. ĐINH ĐOÀN LONG

Hà Nội – Năm 2011


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .................................................................... 2
1.1. Khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) ............................................. 2
1.1.1.

Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật FISH ................................................ 2

1.1.2.

Trình tự đích và đầu dị trong phép lai huỳnh quang tại chỗ......................... 6

1.1.3.

Các loại tín hiệu đánh dấu huỳnh quang ...................................................... 9

1.1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH trong vi tảo biển độc hại..... 13
1.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam................................. 17
1.3. Các bước cơ bản của quy trình lai huỳnh quang tại chỗ - FISH ............................. 18
1.4. Đặc điểm sinh thái của một số loài vi tảo biển độc hại nghiên cứu ........................ 19
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................... 21
2.1.

Địa điểm thu mẫu và đối tượng nghiên cứu ................................................ 21

2.2.

Phương pháp thu và lưu giữ mẫu ................................................................ 21

2.3.

Phương pháp phân loại hình thái ................................................................ 23

2.4.

Phương pháp kiểm tra phân loại bằng ADN và thiết kế đầu dò ................... 23

2.4.1.

Phương pháp chuẩn bị ADN khuôn ........................................................... 23

2.4.2.

Phương pháp Singel cell PCR ................................................................... 23

2.4.3.

Phương pháp kiểm tra phân loại bằng ADN ............................................... 24

2.4.4.

Phương pháp thiết kế đầu dò đặc hiệu........................................................ 25

2.5.
Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ ........................................................ 25
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN......................................... 27
3.1.

Kết quả phân lập và phân loại các chủng vi tảo độc hại bằng hình thái ....... 27

3.1.1.

Loài Alexandrium affine............................................................................. 27

3.1.2.

Loài A. pseudogonyaulax ........................................................................... 28

3.2.

Ảnh hưởng của độ mặn tới nuôi sinh khối vi tảo tạo nguyên liệu ................ 29

3.3.

Kết quả giải trình tự và phân loại bằng ADN các mẫu nghiên cứu .............. 31

3.4.

Thiết kế đầu dò lai huỳnh quang tại chỗ ..................................................... 35

3.5.
Tối ưu nhiệt độ lai và thử nghiệm đầu dò.................................................... 37

KẾT LUẬN..................................................................................................................... 43
KIẾN NGHỊ .................................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 45
PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 54

iii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
TT

Chữ viết tắt

Nội dung tiếng Anh

Nội dung tiếng Việt

1.

ADN

Deoxyribonucleic acid

Axít deoxyribonucleic

2.

ARN

Ribonucleic acid

Axít ribonucleic

3.

Bp

Base pair

Cặp bazơ

4.

FISH

Fluorescent in situ hybridization

Phép lai huỳnh quang tại chỗ

5.

FITC

Fluorescein isothiocyanate

Chất phát tín hiệu huỳnh quang

6.

ISH

In situ hybridization

Phép lai tại chỗ

7.

ITS

Internal transcribed spacer

Vùng đệm phiên mã

8.

LSU

Large subunit

Tiểu phần lớn

9.

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

10.

PSP

Paralytic shellfish poisoning

Chất độc gây liệt cơ

rADN

Ribosomal deoxyribonucleic

Trình tự ADN mã hóa

acid

ribosome

11.
12.

rARN

Ribosomal ribonucleic acid

ARN ribosome

13.

SSU

Small subunit

Tiểu phần nhỏ

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1: Một số chất huỳnh quang được dùng phổ biến trong kỹ

10

thuật FISH
Bảng 1.2: Trình tự đầu dị cho một số lồi Alexandrium

16

Bảng 3.1: Một số điều kiện thích hợp cho nhân ni sinh khối tảo A.

31

affine và A. pseudogonyaulax trong phịng thí nghiệm

v


DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Các cách gắn nhãn tín hiệu vào đầu dị

12

Hình 1.2. Các bước cơ bản của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH

19

Hình 2.1. Sơ đồ phản ứng PCR nhân vùng D1-D2 của rADN

23

Hình 3.1. Một số đặc điểm hình thái của A. affine

27

Hình 3.2. Một số đặc điểm hình thái của A. pseudogonyaulax

28

Hình 3.3. Ảnh hưởng của độ mặn tới sự sinh trưởng của tảo A. affine

30

Hình 3.4.

Ảnh hưởng của độ mặn tới sự sinh trưởng của tảo A.

30

pseudogonyaulax
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 2

32

Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại của một số lồi thuộc chi Alexandrium

34

Hình 3.7. So sánh sự khác biệt trình tự nucleotit của A. affine với các lồi

36

Alexandrium
Hình 3.8. So sánh sự khác biệt trình tự nucleotit của A. pseudogonyaulax

37

với các lồi Alexandrium
Hình 3.9. Tế bào A. affine dưới ánh sáng thường (trái) và phát huỳnh

38

quang dưới ánh sáng kích thích (phải) với điều kiện lai 43°C
Hình 3.10. Tế bào A. pseudogonyaulax dưới ánh sáng thường (trái) và

38

phát huỳnh quang dưới ánh sáng kích thích (phải) với điều kiện lai 43°C

Hình 3.11. Lai đầu dị A. affine với mẫu tự nhiên

40

Hình 3.12. Lai đầu dị A. pseudogonyaulax với mẫu tự nhiên

40

vi


MỞ ĐẦU
Trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du biển nói chung và vi tảo biển độc
hại nói riêng, nhiều nhóm lồi sinh vật rất khó hoặc hồn tồn khơng thể phân loại
đến lồi nếu chỉ bằng phương pháp so sánh hình thái. Sự giống nhau về nhiều đặc
điểm hình thái bên ngồi và khó nhận biết những đặc điểm khác nhau của chúng rất
dễ dẫn đến nhầm lẫn trong nghiên cứu phân loại. Cùng với số lượng loài rất lớn có
nhiều đặc điểm hình thái giống nhau, cơng tác nghiên cứu phân loại vi tảo biển
trong nhiều trường hợp gặp nhiều khó khăn, tốn thời gian. Những điều này đã gây
cản trở đối với công tác nghiên cứu hệ sinh thái biển, đánh giá và quản lý nguồn lợi
sinh vật biển nói chung và các nghiên cứu chuyên sâu về các nhóm lồi nói riêng.
Kế thừa các đặc tính ưu việt của các kỹ thuật di lai các axit nucleic và trên nền
tảng của kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH), kỹ thuật lai huỳnh quang
tại chỗ (fluorescence in situ hydridization - FISH) đã được phát triển. Kể từ khi ra
đời, nó đã trở thành một công cụ mạnh trong nhiều nghiên cứu sinh học, không chỉ
các lĩnh vực sinh học phân tử và tế bào, mà cả trong các nghiên cứu về sinh thái
học, mơi trường, trong chẩn đốn và nghiên cứu phát sinh loài. Kỹ thuật FISH ra
đời đã khắc phục được nhiều trở ngại trong nghiên cứu phân loại sinh vật. Các trở
ngại, như các vấn đề khó khăn do phân loại bằng hình thái, nhược điểm về thời gian
phân tích kéo dài, các yêu cầu đòi hỏi về lượng mẫu lớn hay các yêu cầu về môi

trường nuôi cấy đặc chủng để sàng lọc lồi… có thể được khắc phục bằng kỹ thuật
FISH. Bên cạnh đó, bằng kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu khơng chỉ phân tích định
tính mà cịn có thể định lượng chính xác số lượng tế bào sinh vật, không gian phân
bố hay mối tương quan với môi trường của các vi sinh vật. Kỹ thuật FISH đặc biệt
hữu ích trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du trong mơi trường biển nói chung
và các lồi tảo độc hại nói riêng.
Nhằm từng bước ứng dụng kỹ thuật FISH để giải quyết những khó khăn trong
phân loại các lồi vi tảo độc hại biển, chúng tơi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật
phân tử lai huỳnh quang (FISH) nhằm xác định nhanh một số loài tảo độc hại
biển Việt Nam”. Kết quả mong đợi của đề tài sẽ giúp cho việc nghiên cứu đánh giá,
quan trắc biến động các loài vi tảo độc hại, cảnh báo các hiện tượng ô nhiễm môi
trường biển (như thủy triều đỏ) trở nên thuận tiện, nhanh chóng và hiệu quả hơn.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1.

Khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật FISH
Kỹ thuật FISH được ra đời vào những năm 1980. Tuy nhiên, trước đó, khi
nghiên cứu tế bào, các nhà nghiên cứu thường sử dụng phương pháp nhuộm mơ đơn
giản. Trong đó, các chất màu nhuộm tự nhiên hoặc tổng hợp đã được sử dụng để
nhuộm các cấu trúc hoặc các chất tích lũy trong tế bào. Nhưng, một nhược điểm lớn
là các chất này thường khơng đặc hiệu do chúng có những ái lực với những đặc tính
chung của các phần tử protein, axit nucleic, các lipit, cacbonhydrate. Chính điều này
đã cản trở cho các nghiên cứu chuyên sâu. Sau đó, các thuốc nhuộm đặc hiệu hơn

đối với các thành phần của tế bào hay các phức hợp phân tử lớn như hemosiderin,
amyloid, elastin đã được tìm thấy, phát triển và áp dụng trong việc nhuộm đặc hiệu
một số thành phần cấu trúc ở cấp độ phân tử và dưới tế bào. Dù đã có nhiều cải
thiện về tính đặc hiệu, nhưng các chất nhuộm này cũng không được áp dụng phổ
biến cho tất cả các đại phân tử sinh học được quan tâm. Khả năng phát hiện sự
giống và khác nhau của các đại phân tử đặc biệt ban đầu được dựa trên các phản
ứng kháng nguyên kháng thể. Vào những năm 1940, việc liên kết các kháng thể với
fluorochome nhưng không làm mất đi sự đặc hiệu liên kết thụ thể của chúng đã
được phát hiện. Trên cơ sở này, kỹ thuật sử dụng tín hiệu huỳnh quang phụ thuộc
kháng thể nhằm phát hiện các phân tử axit nucleic lai đã được Rudkin và Stollar
phát triển năm 1977 [58]. Tuy vậy, trước đó, kỹ thuật lai tại chỗ ISH (in situ
hybridization), tiền thân của kỹ thuật FISH, đã ra đời bởi nhóm các nhà khoa học
Pardue, Gall và John [54]. Trong phương pháp này, các thử nghiệm đã được tiến
hành với việc nhận biết được các trình tự ADN đích có trong nỗn bào của chủng vi
khuẩn Xenopus bằng các đoạn đầu dò có bản chất là ADN hoặc ARN-28S đã được
đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ. Sau đó chúng được ghi nhận bằng kỹ thuật phóng
xạ tự ghi. Kỹ thuật ISH này đã giúp các nhà khoa học có thể đưa các đoạn ngắn
ADN xâm nhập vào trong tế bào mà khơng làm chết, làm thay đổi hình thái của tế

2


bào hay tính tồn vẹn của các bộ phận bên trong tế bào. Trên cơ sở đó, một số cải
tiến kỹ thuật đã tiếp nối như việc ứng dụng các chất chỉ thị (reporter) dựa trên cơ sở
các enzym [33] hay sử dụng hệ thống đầu dò bằng vàng quan sát bằng kính hiển vi
điện tử [55]. Sau khi ra đời, ISH không ngừng được cải tiến nhằm nghiên cứu sự
tiến hóa của nhiễm sắc thể, phân tích các nhiễm sắc thể của các khối u, tế bào ung
thư bạch cầu và nghiên cứu di truyền học tế bào ở các loài.
Tuy nhiên, một số nhược điểm dễ nhận thấy của phương pháp ISH cũng đã
bộc lộ. Đầu tiên, rất nhiều vật liệu phóng xạ tự nhiên sử dụng cho đầu dò là kém

bền. Do các đồng vị phân rã theo thời gian nên hoạt động của đầu dò dễ bị thay đổi.
Thứ hai, mặc dù thông thường độ nhạy của phóng xạ tự ghi là cao nhưng mức độ
phân giải lại bị hạn chế. Thứ ba, để tạo ra tín hiệu có thể đo được trên film chụp X
quang thì mẫu cần phải có thời gian phơi nhiễm dài. Điều này làm chậm tiến trình
thí nghiệm, phân tích kết quả, gia tăng nguy cơ phơi nhiễm với người sử dụng.
Ngồi ra, vì kỹ thuật này địi hỏi sử dụng nguyên liệu là các đồng vị phóng xạ nên
các đầu dị phóng xạ có giá thành cao; mặt khác địi hỏi chúng phải được vận
chuyển, thao tác, lưu trữ và loại bỏ theo những quy trình rất nghiêm ngặt, phức tạp.
Vì những lý do đó, dù có nhiều ưu điểm nổi trội nhưng những hạn chế cơ bản trên
đã yêu cầu các nhà nghiên cứu cần phải tìm ra một biện pháp hiệu quả hơn. Có lẽ vì
vậy mà kỹ thuật ISH (với các đầu dị mang đồng vị phóng xạ) sau đó đã nhanh
chóng được thay thế bởi một kỹ thuật mới có nhiều ưu điểm hơn mang tên kỹ thuật
lai tại chỗ sử dụng các đầu dò axit nucleic có gắn tín hiệu huỳnh quang
(Fluorescence in situ hybridization - FISH). Với kỹ thuật FISH, các trở ngại về thời
gian thí nghiệm, độ phân giải và tính an tồn được giải quyết khá triệt để, mở đường
cho sự phát hiện đồng thời nhiều mục tiêu, phân tích định lượng và cho những hình
ảnh tế bào sống động.
Những nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng tín hiệu huỳnh quang đầu tiên trong
phương pháp lai tại chỗ bắt đầu từ những năm 1980. Trong một nghiên cứu, các nhà
khoa học đã tiến hành gắn phân tử ARN trực tiếp với tín hiệu huỳnh quang ở đầu 3’
và thử nghiệm dùng nó là một đầu dị cho trình tự ADN đặc hiệu. Kết quả cho thấy

3


rằng so với các đầu dị phóng xạ, đầu dị huỳnh quang sử dụng an tồn hơn, ít gây
hại đối với môi trường và sức khỏe con người, đồng thời kết quả thu được cũng
chính xác hơn [18]. Ở những nghiên cứu khác, các đầu dò gắn biotin và các tín hiệu
streptavidin kết hợp huỳnh quang đã được dùng cho việc phát hiện các trình tự
ADN đích đặc trưng trên nhiễm sắc thể [46] và các trình tự trên mARN [60]. Năm

1989, DeLong cũng đã tiến hành thử nghiệm sử dụng các đầu dò oligonucleotit (17
- 34 nucleotit) được đánh dấu huỳnh quang để dị tìm các vi khuẩn E.coli dựa vào
trình tự đích là đoạn ARN 16s [24]. Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, việc sử
dụng nhiều đầu dò khác nhau cho phép xác định được các loại tế bào khác nhau
trong cùng một nhóm và thậm chí với việc phân tích cường độ huỳnh quang cũng
cho thấy được giai đoạn và tốc độ phát triển của các tế bào vi sinh vật [19, 24].
Với khả năng ứng dụng rộng rãi của kỹ thuật FISH, ngày càng nhiều nghiên
cứu được tiến hành trên các lĩnh vực khoa học. Sự phát triển ngày càng cao của
nhiều kỹ thuật phân tích đã cho thấy rằng số lượng lồi có trong tự nhiên, nhất là
đối với nhóm vi khuẩn, có con số vượt xa so với số lượng các loài đã được phát
hiện và mơ tả trước đó. Do đó, sự đa dạng thành phần loài vi sinh vật trong thời
gian trước đây đã từng bị đánh giá thấp. Các phương pháp cổ điển trước đây hầu
như không thể mô tả được chính xác và đầy đủ rất nhiều lồi vi sinh vật. Rất nhiều
loài sau này được phát hiện mới bằng các phương pháp hiện đại và chính xác hơn,
như phương pháp FISH. FISH có khả năng đưa ra những hình ảnh chi tiết của mơi
trường vi sinh mà khơng cần phải qua những bước làm sạch hay khuếch đại. Chính
vì vậy mà nó đã được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau về
môi trường. Phương pháp này hiện nay được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu
về sự đa dạng sinh học của các quần thể vi sinh vật ở nhiều điều kiện địa lý khác
nhau trong tự nhiên, Llobet (1998) đã sử dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ như
một công cụ để các nghiên cứu về hệ vi sinh vật có trong trầm tích biển. Kết quả
cho thấy, gần 45% số tế bào vi khuẩn có trong đó thuộc nhóm ngành đã biết với
nhóm Cytophaga-Flavobacterium có trong hầu hết các lớp trầm tích [45]. Hay các
nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn bằng kỹ thuật FISH trong đại dương [31], trong

4


các tầng nước khác nhau tại vịnh Mariager Fjord, Đan Mạch [53], những nghiên
cứu hệ vi khuẩn ở trong sông [42], trong thủy vực trên núi cao có băng bao phủ

quanh năm [11], hay các nghiên cứu về Bacillus trong đất [26]…
Bên cạnh đó, kỹ thuật FISH cũng được ứng dụng rộng rãi trong y học.
Gersdorf (1993) đã tiến hành nghiên cứu hỗn hợp vi khuẩn phổ biến trong khoang
miệng người bằng phương pháp FISH qua đó đã tìm thấy có hơn 300 lồi vi khuẩn
khác nhau, trong đó có nhiều lồi rất phức tạp khi tiến hành ni cấy hoặc chưa
từng được nuôi cấy. Các bệnh về răng miệng như viêm răng hay viêm lợi có liên
quan đến các mạng lưới vi khuẩn đặc thù này. Trong khi một số kỹ thuật nuôi cấy
chuyên biệt chỉ thu được rất ít thành phần lồi trong sự đa dạng nhóm vi sinh vật
này. Những lợi ích khi sử dụng kỹ thuật FISH đã được thể hiện rõ trên những vi
khuẩn kị khí gram âm, như Porphyromonas gingivalis, Bacterroides forsythus và
Prevotella intermedia có trong thành phần mảng bám răng của bệnh nhân viêm răng
[28, 29]. Cũng thông qua kỹ thuật FISH, các phân tích sâu hơn đã cho thấy một số
lượng lớn và đa dạng về hình thái của các loại xoắn khuẩn trên các vết bẩn của
mảng bám răng có trong khoang miệng của các bệnh nhân cùng với sự phát triển
nhanh chóng của bệnh viêm răng [21, 52]. Trong một thử nghiệm lâm sàng với các
mẫu đờm và mẫu gạc họng, một tập hợp các đầu dò oligonucleotit được thiết kế để
dị tìm đặc hiệu đối với các mầm bệnh phân lập từ tế bào xơ gan của bệnh nhân
được tiến hành. Kết quả cho thấy, các đầu dò đã phát hiện nhanh chóng và chính
xác các vi khuẩn gây cấp tính ở bệnh nhân xơ nang, bao gồm Pseudomonas
aeruginosa,

Stenotrophomonas

Burkholderia

cepacia,

maltophilia,

Haemophilus

influenzae,

Pseudomonas
Streptococcus

aeruginosa,
pyogenes,

Staphylococcus aureus và Candida albicans. So với các kỹ thuật nuôi cấy thơng
thường, FISH chứng tỏ là cơng cụ chính xác và hiệu quả [33, 34]. Ở một nghiên cứu
y học khác, khả năng ứng dụng của FISH để định danh các vi sinh vật gây bệnh
trong các mẫu máu nhiễm bệnh đã được khảo sát. Các đầu dò oligonucleotit sử
dụng đặc hiệu cho từng mầm bệnh điển hình đã cho thấy hiệu quả khi chúng dị tìm
thấy các nhóm gây bệnh bao gồm Staphylococci, Streptococci, Enterococci,

5


Enterobacteriaceae và nấm trên các bệnh nhân nhiễm bệnh. Các nhà nghiên cứu kết
luận rằng phương pháp FISH có độ nhạy và đặc hiệu tuyệt vời và kết quả thu được
chỉ trong 25 phút cho tới 2,5 giờ. Trong khi đó, việc định danh các lồi bằng
phương pháp ni cấy truyền thống thường mất từ 24 đến 72 giờ mới hồn thành.
Sự phát hiện nhanh chóng các ngun nhân mầm bệnh trong máu bằng phương
pháp FISH cho phép các bác sỹ dễ dàng đưa ra được các phương pháp trị liệu thích
hợp và do đó có thể hồn thiện việc chẩn đoán cho các bệnh nhân bị nhiễm trùng
máu [37, 41].
Cho đến nay, với các ưu thế về độ nhạy, tiết kiệm thời gian, đơn giản… kỹ
thuật FISH đã và đang là một công cụ hữu dụng trong những ứng dụng về nghiên
cứu sinh thái, đa dạng sinh học, y học, di truyền học và nhiều lĩnh vực khác.

1.1.2. Trình tự đích và đầu dị trong phép lai huỳnh quang tại chỗ
Bản chất của kỹ thuật FISH là sự lai chính xác một đoạn oligonucleotit có
gắn tín hiệu huỳnh quang (đầu dị) với một trình tự ADN đích đặc trưng. Với nhiều
mục đích khác nhau mà người ta có thể sử dụng kỹ thuật FISH nhằm dị tìm hay
phát hiện các trình tự ADN hay ARN đích thuộc các phần khác nhau của hệ gen
quan tâm. Các trình tự này có thể là một trình tự đặc trưng nằm trên nhiễm sắc thể
mã hóa cho một chức năng gen nào đó cần quan tâm. Với các đầu dị đặc hiệu cho
từng locut gen, chúng được tạo ra từ một phần của gen. Do vậy, khi lai, chúng sẽ
kết hợp bổ sung với phần đặc hiệu đó của gen trên nhiễm sắc thể. Từ đó người ta có
thể xác định được chính xác vị trí trên nhiễm sắc thể mà gen đó tồn tại. Đối với các
trình tự đích là những đoạn lặp vùng tâm động hay vùng Alphoid, đầu dò được thiết
kế sẽ cho phép chúng ta tìm thấy vùng tương ứng bổ sung tại tâm động của các
nhiễm sắc thể. Trong nhiều trường hợp, các nhiễm sắc thể được đánh dấu bởi các
màu huỳnh quang khác nhau của đầu dị. Từ đó người ta có thể xác định được cá thể
có mang đúng số lượng các nhiễm sắc thể hay khơng. Đối với phép lai tồn bộ
nhiễm sắc thể, tập hợp những đầu dò nhỏ được sử dụng để lai cho từng đoạn ngắn
trình tự đích dọc trên nhiễm sắc thể. Nhiễm sắc thể phát quang với các màu sắc

6


khác nhau của đầu dị giúp người ta có thể phân biệt được dễ dàng các nhiễm sắc
thể khác nhau thay vì phải căn cứ vào các vạch sáng tối trên nhiễm sắc thể theo các
phương pháp truyền thống. Mặt khác, chúng cũng giúp cho việc nhận biết dễ dàng
những bất thường trong cấu trúc của nhiễm sắc thể.
Trong một nghiên cứu của mình về bệnh bạch cầu (ABL), Michael đã tiến
hành thử nghiệm hệ thống tổ hợp các đầu dị oligonucleotit (COMBO) thơng qua kỹ
thuật FISH nhằm nhận diện vùng ABL (gây bệnh bạch cầu) thuộc nhiễm sắc thể số
9 của người. Kết quả cho thấy hệ thống COMBO hoạt động rất hiệu quả và có thể
coi đây như một cách tiếp cận mới trong việc gắn nhãn đặc hiệu tại những vị trí cần

quan tâm của hệ gen người [48]. Các kết quả nghiên cứu thử nghiệm khác cũng chỉ
ra rằng để quá trình lai bổ sung được hiệu quả thì thơng thường các trình tự này phải
ở giai đoạn chuẩn bị của nhiễm sắc thể trong nguyên phân hoặc trong giai đoạn gian
kỳ của tế bào [18, 19].
Mở rộng nghiên cứu, các nhà khoa học cũng đã sử dụng các tiểu phần ARN
ribosome (5s, 16s, 23s hoặc 28s) như các trình tự đích trong các thí nghiệm sử dụng
kỹ thuật FISH. Năm 1994, Trebesius cùng các đồng nghiệp của mình đã ứng dụng
phát triển kỹ thuật FISH trong việc xác định các tế bào vi khuẩn bằng việc sử dụng
các đầu dị polynucleotit cho các trình tự đích 23s ARN ribosome của vi khuẩn. Các
đầu dị này tỏ ra rất hiệu quả trong việc phát hiện các đối tượng vi khuẩn cần quan
tâm [64]. Trong một nghiên cứu khác, các trình tự thuộc các vùng V2, V4, V8 của
16s ribosome đã được các nhà khoa học sử dụng làm các trình tự đích cho các đầu
dị huỳnh quang trong phép lai tại chỗ nhằm định lượng nhóm vi khuẩn
Bifidobacterium spp. cộng sinh trong đường tiêu hóa của người [44]. Với mỗi mục
tiêu nghiên cứu, các vùng khác nhau của các tiểu phần ribosome ngày càng được
khai thác và sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng kỹ thuật FISH khác nhau [18, 27,
36, 68]. Trong nhiều nghiên cứu về phân loại, các trình tự đích được sử dụng phổ
biến trong FISH là các rRNA 16S vì chúng ổn định về mặt di truyền, số lượng bản
sao nhiều.

7


Nhiều kết quả khác cũng đã cho thấy, việc sử dụng thành phần đích là phân
tử mARN đặc hiệu cũng có thể giúp ích trong nhiều nghiên cứu có liên quan vì
mARN là một mắt xích quan trọng trong chuỗi hoạt động sinh hóa và di truyền của
tế bào và của cơ thể [18, 25, 65].
Cùng với việc khai thác có hiệu quả và đa dạng các trình tự đích, các loại đầu
dò phục vụ trong kỹ thuật FISH cũng được nghiên cứu chế tạo và cải tiến tùy theo
từng mục tiêu. Một số nghiên cứu đã sử dụng các đầu dò là các đoạn polynucleotit.

Đây là những đoạn polynucleotit có kích thước lớn từ 200 – 300 nucleotit. Trong
một số nghiên cứu, người ta đã sử dụng chúng cho việc dị tìm các trình tự đích là
vùng siêu biến III thuộc 23s ARN ribosome của các vi khuẩn. Những đầu dị
polynucleotit này đã thể hiện tính hữu dụng trong việc phát hiện Pseudomonas
putida, Acinetobacter spp. [64] và nhóm vi khuẩn và vi khuẩn cổ phù du trong
nước biển [25]. Trong một nghiên cứu khác, bảy đầu dò polynucleotit đã xây dựng,
thiết kế nhằm nhận biết các loài Acinetobacte baumannii, A. calcoaceticus, A.
haemolyticus, A. junii, A. radioresistens, A. lwoffii, A. johnsonii cũng dễ dàng được
ứng dụng thông qua kỹ thuật FISH [39].
Bên cạnh đó, các đoạn oligonucleotit với kích thước chỉ khoảng 15 - 30
nucleotit có gắn các nhãn tín hiệu khác nhau cũng được nghiên cứu thiết kế và sử
dụng làm đầu dị tìm các thành phần đích là phân tử mARN, rARN đặc hiệu trong
nhiều nghiên cứu [25, 65]. Xét về tính hiệu quả, trong kỹ thuật lai huỳnh quang tại
chỗ nguyên vẹn tế bào, các đầu dò oligonucleotit với trình tự ngắn lại có hiệu quả
tốt hơn trong khả năng xâm nhập vào tế bào và lai đặc hiệu với trình tự đích. Đối
với các trình tự đích thuộc các tiểu phần ribosome 5s, 16s, 23s hoặc 28s của vi
khuẩn, các lồi thơng thường được nhận diện bằng các đầu dị oligonucleotit. Chính
vì vậy mà các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH với đầu dò oligonucleotit cho các
mục đích xác định vi khuẩn, phân tích cấu trúc nhóm vi khuẩn, xem xét các mối
quan hệ tương tác về không gian và thời gian của các quần thể vi sinh vật trong môi
trường sống của chúng đã được nhiều nhà khoa học quan tâm trong thời gian qua.
Trên thế giới, kỹ thuật FISH cũng đã được các nhà khoa học áp dụng trên các đối

8


tượng là những sinh vật phù du nước ngọt cũng như các loài phù du sống ven biển,
ngoài khơi và cả những lồi thu được từ trầm tích đáy biển. Kỹ thuật FISH đã cho
thấy được ưu thế trong khả năng xác định nhanh chóng và chính xác số lượng rất
nhỏ các tế bào vi khuẩn cũng như có khả năng phát hiện được sự đa dạng phong

phú của các quần thể sinh vật này [11, 18, 31, 46].
1.1.3. Các loại tín hiệu đánh dấu huỳnh quang
Trong lịch sử phát triển kỹ thuật FISH, nhiều biến thể của tín hiệu (thuốc
nhuộm) gắn trực tiếp hoặc gián tiếp đã được đưa ra. Điều này cho phép các nhà
nghiên cứu có thể lựa chọn, tùy theo độ đặc hiệu, độ nhạy, độ phân giải, màu sắc
phát quang của đầu dò để thiết kế các đầu dò phù hợp với các điều kiện thí nghiệm
khác nhau. Đồng thời, việc đa dạng hóa các loại tín hiệu đánh dấu (đa dạng màu
sắc) sẽ làm cho hình ảnh của một kết quả lai huỳnh quang trở nên sinh động. Hình
ảnh thu được có thể minh họa rõ ràng cho việc phân tích sự tổ hợp của hệ gen về
mặt không gian hay dễ dàng trong việc phát hiện nhiễm sắc thể và sự sai lệch của
chúng trong chu trình tế bào. Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang thường được gắn
với đầu dò bằng các liên kết cộng hóa trị. Chúng thường có các mức năng lượng
kích thích và phát xạ tối đa khác nhau, vì vậy cho phép phát hiện đồng thời hai hoặc
nhiều vi sinh vật bằng một lần tiến hành lai phân tử duy nhất đồng thời cho ra
những hình ảnh màu sắc sinh động. Các chất nhuộm thường sử dụng cho FISH
trong phân loại vi sinh vật là các dẫn xuất của fluorescein (như FluoresceinIsothiocyanate (FITC), 5(6)carboxyfluorescein-N-hydroxysuccimide-ester (FluoX))
hoặc dẫn xuất của rhodamine (như Tetramethyl-Rhodamine-Isothiocyanate
(TRITC), Texas Red), ngồi ra cịn có các loại thuốc nhuộm cyanine khác như là
Cy3 và Cy5… [12, 39].

9


Bảng 1.1. Một số chất huỳnh quang được dùng phổ biến trong kỹ thuật FISH
[18]
Bước sóng
Chất
Màu
Kích thích cực đại
Phát xạ

Huỳnh quang
(nm)
(nm)
Alexa488

Xanh lá cây

493

517

AMCA

Xanh da trời

399

446

CY3

Đỏ

552

565

CY5

Đỏ

649

670

CY7

Tím

743

767

DAPI

Xanh da trời

350

456

Fluoresscein

Xanh lá cây

494

523

Rodamine

Đỏ

555

580

TAMRA

Đỏ

543

575

Texas Red

Đỏ

590

615

Đỏ-cam

550

580

TRITC

Trong kỹ thuật FISH người ta có nhiều cách để đánh dấu đầu dò. Tuy vậy,
việc đánh dấu trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang lên đầu dị là cách thơng dụng,
nhanh và rẻ nhất. Đồng thời, đầu dò được chuẩn bị theo cách này dễ dàng được phát
hiện vì khơng cần phải tiến hành các bước dị tìm sau q trình lai. Trong đánh dấu
đầu dò, một hoặc nhiều phân tử thuốc nhuộm huỳnh quang được liên kết trực tiếp
với chuỗi polynucleotit/oligonucleotit trong suốt q trình tổng hợp thơng qua liên
kết amino ở đầu 5’ của đầu dò. Một cách khác, người ta cũng có thể sử dụng enzym
Terminal transferase để gắn các nucleotit đã được đánh dấu huỳnh quang vào đầu 3’
của đầu dị [52]. Ngồi ra, một số thuốc nhuộm như Flourescein-Isothiocyanate
(FITC) nếu được gắn vào đầu dò theo một dải thì có thể làm tăng cường độ tín hiệu
so với các đầu dò được đánh dấu trực tiếp [23]. Sự tăng lên về tín hiệu huỳnh
quang cũng được biểu hiện trên những đầu dò được gắn chất huỳnh quang trên cả
hai đầu 3’ và 5’ [62]. Trong nghiên cứu của mình, Trebesius cùng các đồng nghiệp
(1994) đã sử dụng các đầu dị polynucleotit cho các trình tự đích 23s ARN ribosome

10


của vi khuẩn. Các đầu dị này khơng gắn tín hiệu phóng xạ mà được thay bằng dẫn
xuất phát huỳnh quang của UTP (fluorescein-12-UTP, digoxigenin-11-UTP, 7amino-4-methyl-coumarin- 3-acetyl-6-UTP, hoặc tetramethylrhodamine-6-UTP).
Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, với đầu dò dạng này thì hiệu quả mang tín
hiệu huỳnh quang tăng gấp khoảng 26 lần so với đầu dò ngắn oligonucleotit [64].
Tuy vậy, ở một một số trường hợp, việc dị tìm theo cách gián tiếp tỏ ra có
hiệu quả hơn. Sự tăng độ nhạy của thí nghiệm FISH bằng cách kết hợp các đầu dò
với những chất chỉ thị như Digoxygenin (DIG) đã được thực hiện và sau đó phức
hợp này sẽ được dị tìm thơng qua một chất phản huỳnh quang [69]. Ngồi ra,
người ta có thể tăng độ nhạy của FISH bằng việc sử dụng enzym nhằm khuếch đại
tín hiệu của đầu dò trong nhiều nghiên cứu định danh vi khuẩn. Ban đầu, mỗi
oligonucleotit vẫn sẽ được đánh dấu bằng digoxygenin như trên, sau đó được dị

tìm bằng một thể kháng digoxygenin, kháng thể này tiếp tục được liên kết với
enzym phosphatase kiềm. Enzym này chuyển hóa HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic
acid-2’-phenylanilide phosphate) thành dạng Dephosphoryl, chất này tạo ra màu
huỳnh quang đỏ sáng khi kết hợp với Fast Red TR. Tín hiệu huỳnh quang thu được
theo cách này có cường độ mạnh hơn 8 lần so với tín hiệu của các oligonucleotit chỉ
gắn nhãn huỳnh quang duy nhất [40, 67].
Sau này, phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng enzym ngày càng được cải
tiến tốt hơn nhờ vào một kỹ thuật được gọi là “hệ thống khuếch đại tín hiệu
Tyramide” (TSA). Hệ thống này làm tăng cường độ tín hiệu lên khoảng 10 – 20 lần
so với ban đầu. Tuy nhiên các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, do quá trình xâm nhập
của các chất cao phân tử vào trong tế bào vi khuẩn bị hạn chế hơn những chất
nhuộm thông thường nên số lượng các tế bào được lai thành công đã giảm đi một
cách rõ ràng so với việc sử dụng đầu dị thơng thường được đánh dấu duy nhất một
chất huỳnh quang. Mặc dù enzym lysozyme đã giúp cải thiện tính thấm của các đầu
dị vào trong tế bào, dẫn tới cường độ tín hiệu được nâng cao, nhưng phương pháp
này dường như không áp dụng được với một số loài vi khuẩn Gram dương. Trong
một số trường hợp, việc kết hợp sử dụng các đầu dò polyribonucleotit, được đánh

11


dấu với digoxygenin, song song với việc sử dụng hệ thống TSA là một giải pháp
tốt. Sự kết hợp này đã được ứng dụng thành cơng khi dị tìm và phát hiện trực quan
các loài Listeria gây độc [65]. Về khía cạnh khác, các đầu dị oligonucleotit với
trình tự ngắn lại có hiệu quả tốt hơn trong khả năng xâm nhập vào tế bào và lai đặc
hiệu với trình tự đích so với các đầu dị polynucleotit.
Để tăng độ nhạy của đầu dị trong kỹ thuật FISH, việc tính tốn đến số lượng
bản sao của trình tự đích cũng là một giải pháp được tính đến nhằm khuếch đại tín
hiệu để có được hình ảnh rõ nét hơn. Trong nhiều trường hợp, các trình tự đích là
các rARN hay các mARN (thường có nhiều trong tế bào) được lựa chọn để sử dụng

với các đầu dị oligonucleotit mang được ít tín hiệu đánh dấu [18].
Gắn nhãn vào đầu 5’ (a)
Gắn nhãn vào đầu 3’ (b)

Sử dụng chất chỉ thị (c)

Sử dụng enzym (d)

Đầu dị dạng polynucleotit (e)

Hình 1.1. Các cách gắn nhãn tín hiệu vào đầu dị [18].
Gắn nhãn trực tiếp (a, b) và gián tiếp (c–e) của đầu dò sử dụng 1 phân tử chỉ
thị như digoxygenin (DIG) mà nó sau đó được phát hiện bởi kháng thể huỳnh
quang, horseradish peroxidase (HRP) sử dụng phức hợp fluorescein–tyramide như
một cơ chất cho sự khuếch đại tín hiệu bằng enzym theo hệ thống TSA, hoặc sự kết
hợp sử dụng các đầu dò polyribonucleotit với hệ thống TSA.
Như vậy, bằng kỹ thuật FISH, các nhà nghiên cứu khơng chỉ có thể phân biệt
được các vi sinh vật quen thuộc mà còn xác định được các vi sinh vật mới, chưa biết

12


rõ về điều kiện và môi trường nuôi cấy. Đồng thời, kỹ thuật FISH có thể giúp chúng
ta phân tích được sự phân bố không gian của chúng và biết rõ về hệ thống phức tạp
của các quần thể vi sinh vật. Việc xác định số lượng, cường độ các tín hiệu phát ra
bằng các oligonucleotit của rARN đích cho phép ước tính được tỷ lệ tăng trưởng
của các tế bào riêng lẻ [38]. Cho đến nay, độ nhạy và tốc độ thực hiện là những đặc
điểm nổi bật giúp kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ - FISH trở thành công cụ rất hữu
hiệu cho nhiều nghiên cứu về di truyền, sinh thái, mơi trường. Qua q trình phát
triển và cải tiến, cho đến nay chúng được xem là một trong những công cụ di truyền

phân tử ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu về sinh thái học, môi trường học, chẩn
đốn bệnh và phát sinh lồi.
1.1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH trong vi tảo biển độc hại
Vi tảo biển (Microalgae) là bộ phận sinh vật có thành phần rất phong phú
trong hệ sinh thái thủy sinh của biển. Trong chuỗi thức ăn, vi tảo biển là sinh vật
sản xuất sơ cấp, là một mắt xích thức ăn, nguồn cung cấp dinh dưỡng của nhiều loài
động vật phù du, ấu trùng giáp xác và nhiều loài động vật khác [7]. Bên cạnh chức
năng quan trọng đó, việc bùng phát hoặc tiết các chất gây độc của một số lồi vi tảo
biển lại có thể gây nguy hại cho các lồi thủy sinh, thậm chí gây nguy hiểm đến tính
mạng con người và gây ơ nhiễm mơi trường, phá hủy cân bằng sinh thái. Điển hình
cho những tác hại này chính là hiện tượng thủy triều đỏ hay tảo độc nở hoa, đã được
ghi nhận ở nhiều vùng biển khác nhau trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Đây
cũng là nguyên nhân làm chết nhiều lồi sinh vật biển trong tự nhiên và ni trồng
thủy sản.
Một số chi tảo điển hình cho hiện tượng thủy triều đỏ là Alexandrium và
Pseudo-nitzschia. Đây là những chi tảo biển có phân bố rộng, có thể bắt gặp ở nhiều
vùng biển khác nhau ở Việt Nam và trên thế giới. Chúng có khả năng sản sinh các
độc tố gây liệt cơ (PSP) và có thể gây chết người [45]. Mặt khác, rất nhiều lồi vi
tảo có cấu tạo phức tạp và rất giống nhau về hình thái ngồi, do vậy thường dẫn đến
sự lẫn lộn về danh pháp giữa các loài trong cùng một chi. Điều này dẫn đến những

13


khó khăn rất lớn cho việc quan trắc, cảnh báo nguy cơ bùng phát và hạn chế những
tác hại của chúng trong tự nhiên. Tuy nhiên, kỹ thuật FISH ra đời và ngày càng
hoàn thiện đã phần nào giúp các nhà khoa học dễ dàng hơn trong việc rà soát và
phát hiện nhanh tảo độc hại và quan trắc, cảnh báo môi trường một cách hiệu quả
hơn. Phương pháp này thường được sử dụng trong các nghiên cứu quan trắc mơi
trường biển cho các lồi vi tảo độc hại, đặc biệt khi có những biến động bất thường

về mơi trường và sự nở hoa vi tảo biển [59].
Một trong những thử nghiệm đầu tiên sử dụng các đầu dò phân tử như một
cơng cụ để phân loại các lồi tảo độc hại được tiến hành bởi Anderson (1995). Kết
quả nghiên cứu này cho thấy độ nhạy của đầu dò lai huỳnh quang trong việc phát
hiện Pseudonitszchia pungens là rất tốt. Sự kết hợp giữa 2 loại đầu dò huỳnh quang
và đầu dò kháng thể làm tăng đáng kể hiệu quả hình ảnh thu được [15]. Năm 1996,
Adachi và đồng nghiệp đã sử dụng các kỹ thuật phân tử để phân loại hai loài A.
tamarense và A. catenella thuộc chi Alexandrium. Đầu dị ADN được thiết kế đối
với trình tự của ADN mã hóa ribosome (rADN) tại vùng ITS. Nhóm đối tượng được
tiến hành thử nghiệm bao gồm A. affine, A. insuetum, A. pseudogonyaulax, A.
lusitanicum, A. fraterculus, Gymnodinium mikimotoi, Prorocentrum

micans,

Amphidinium carterae, Heterocapsa triyuetra, Heterosigma akashiwo, Chattonella
antiyua và Skeletonema costatum. Kết quả cho thấy, hai đầu dò cCAT-F1 và
cTAM-F1 chỉ bắt cặp tương ứng với các chủng khác nhau thuộc hai loài
Alexandrium catenella và A. tamarense. Ngồi ra, chúng khơng hề có phản ứng với
các chủng tảo độc khác hoặc xảy ra phản ứng chéo trong cùng điều kiện lai. Kết quả
này chứng tỏ, cCAT-F1 và cTAM-F1 có tính đặc hiệu cao với các lồi Alexandrium
catenella, A. tamarense và có thể dùng làm đầu dị đặc hiệu để nhận dạng hai lồi
vi tảo biển này [10].
Một số cơng bố sau đó cũng cho thấy phương pháp FISH có khả năng áp
dụng tốt trong việc phân loại các loài đặc hiệu ngay cả trong mẫu ni cấy và mẫu
ngồi tự nhiên [10, 59]. Cùng thời gian này, Miller và Scholin đã ứng dụng FISH
với việc sử dụng đầu dò huỳnh quang đặc hiệu rARN để phân loại chi Pseudo-

14

nitzschia. Tám đầu dò phân tử đặc hiệu (auD1, puD1, muD1, muD2, heD2-2, frD1,
deD1, và amD1) được thiết kế và sử dụng để phân loại một cách dễ dàng tám lồi
khác nhau, đó là: P. australis, P. pungens, P. multiseries, P. heimii, P. fraudulenta,
P. delicatisima, P. pseudodelicatisima và P. americana. Kết quả cũng cho thấy tính
tiện dụng, chuẩn xác và tiết kiệm thời gian của phương pháp phân loại bằng các đầu
dò huỳnh quang hơn nhiều so với các phương pháp truyền thống [50, 51]. Ở một
nghiên cứu khác, kỹ thuật FISH cũng được ứng dụng thử nghiệm để nhận dạng 10
chủng tảo độc thuộc một số loài Pseudo-nitzschia được thu thập ở nhiều vùng khác
nhau trên thế giới (Nhật Bản, Mĩ và Canada) với trình tự đích là ARN. Kết quả cho
thấy, đầu dị có tín hiệu rất mạnh đối với các chủng Pseudo-nitzschia multiseries và
P. pungens, thu thập từ Mĩ và Canada. Phép lai phân tử cũng cho thấy tín hiệu
huỳnh quang giảm nhẹ khi tế bào ni cấy ở giai đoạn muộn chứng tỏ lượng ARN
đã giảm trong tế bào. Việc định lượng tế bào Pseudo-nitzschia bằng sử dụng kết
hợp kỹ thuật FISH cũng trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn [59]. Khả năng ứng
dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ đối với các mẫu Pseudo-nitzschia đã được cố
định bằng hóa chất bảo quản cũng đã được thử nghiệm. Các mẫu vi tảo cố đã được
cố định bằng êtanol cũng đã có phản ứng dương tính đối với thí nghiệm lai. Tuy
nhiên, độ nhạy của tín hiệu huỳnh quang thu được tùy thuộc vào thời gian cố định
và một số điều kiện bảo quản của mẫu trước khi thí nghiệm. Đối với các mẫu sau
khi lai với đầu dò huỳnh quang được lưu giữ ở 4oC sẽ duy trì được sự phát quang
trong thời gian dưới 1 tuần [49]. Trong những nghiên cứu khác, các các tiểu đơn vị
của ribosome cũng đã được lấy làm các trình tự đích cho việc quan trắc Pseudonitzschia thu thập từ vịnh Chinhae Bay (Hàn Quốc). Kỹ thuật FISH với các đầu dò
đặc hiệu đã được sử dụng gồm muD1, puD1, auD1, heD2-2, frD1, deD1, amD1.
Nghiên cứu này cũng cho thấy, một số đầu dị cho tín hiệu huỳnh quang yếu hơn
các đầu dò khác. Điều này được giải thích là liên quan đến trạng thái sinh lí của tế
bào [20].
Sau này, việc sử dụng các đầu dò phân tử phát huỳnh quang trong kỹ thuật
FISH để nhận dạng và phát hiện các loài tảo độc hại ngày càng phổ biến hơn. Đầu

15

dị được thiết kế dựa trên trình tự đích thuộc vùng D1- D2 của tiểu đơn vị lớn LSU
rADN của các loài vi tảo đã được thử nghiệm trong phép lai FISH đặc hiệu trên tế
bào nguyên vẹn. Các đầu dị ADN đặc hiệu cho 6 lồi Alexandrium: A. tamarense,
A. catenella, A. affine, A. fraterculus, A. insuetum và A. pseudogonyaulax đã cho kết
quả tốt và không biểu hiện ở các phản ứng lai với các loài Alexandrium khác [43].
Cũng nghiên cứu về một số loài thuộc chi Alexandrium, một số nhà khoa học khác
cũng đã thành công trong việc phát triển phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ với
các đầu dị được thiết lập từ các trình tự đích thuộc rARN có trong tế bào A.
tamarense và A. catenella với cả mẫu ni cấy và mẫu tảo thu ngồi tự nhiên [63].
Một số thử nghiệm lai tại chỗ trên Heterosigma akashiwo (Raphidophyceae) với các
đầu dị thiết kế các trình tự ARN và ADN đích đã cho thấy: đối với đầu dò rARN,
kết quả là các ARN trong tế bào chất được lai với đầu dị và làm cho tồn bộ tế bào
bắt màu xanh; còn với đầu dò ADN, đầu dị lai với ADN trong nhân nên chỉ có
nhân tế bào là bắt màu xanh [21].
Khai thác trình tự vùng D1-D2 ADN mã hóa cho tiểu phần lớn của ribosome
(LSU), một số nhà khoa học đã thiết kế các đầu dò và phát triển phép lai huỳnh
quang tại chỗ với tín hiệu FITC nhằm định loại nhanh cho nhiều lồi tảo độc hại
trong nhiều thủy vực [22].
Bảng 1.2. Trình tự đầu dị cho một số lồi Alexandrium [22].
Tên lồi

Trình tự đầu dò

Số hiệu trên
Genbank

A.tamiyavanichii

GTACTTAGACCACACCATA

AB088316

A. catenella

GCAT TTGACAATTGCTCCT

AB088280

A. fraterculus

GCTCTTGTTCATCAACATC

AB088290

A. insuetum

GCACTTGATGATCGATTGC

AB088298

A. tamarense

GCATTTGGCGATCAATTCT

AB088279

A. pseudogonyaulax

GCACTTGATGGTTGTTTGC

AB088302

Trong nhiều nghiên cứu về sau này, một số cải tiến của kỹ thuật FISH đã được
đưa ra nhằm hoàn thiện và tối ưu hơn cho từng mục đích hay đối tượng quan tâm

16


khác nhau [17]. Với những ưu thế về độ chính xác, độ nhạy và tiết kiệm thời gian,
kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ vẫn được xem là một công cụ rất hữu hiệu cho
nhiều nghiên cứu sinh học.
1.2.

Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam
Cho đến nay, tại Việt Nam, kỹ thuật FISH chủ yếu được nghiên cứu ứng dụng

trong lĩnh vực y học. Một số nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đốn trước sinh
bằng kỹ thuật FISH đã được tiến hành. Các nghiên cứu này được dựa trên các trình
tự ADN đích thuộc các nhiễm sắc thể nhằm phát hiện một cách chính xác các bất
thường trên các nhiễm sắc thể (NST) tương ứng với các bệnh di truyền được quan
tâm [4]. Trong một số nghiên cứu khác, ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang
được dùng để chẩn đoán trước sinh hội chứng Đao, hội chứng Tớc-nơ cũng đã cho
kết quả thành công. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, việc sử dụng kỹ thuật lai
huỳnh quang tại chỗ đã cho kết quả rất chính xác khi so sánh với phương pháp phân
tích nhiễm sắc thể của tế bào ối [1, 2]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu ứng dụng kỹ
thuật FISH trong việc phát hiện các lệch bội nhiễm sắc thể số 13, 18, 21, X, Y từ tế
bào dịch ối bằng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ cũng đã thành cơng. Trên cơ sở
phân tích các mẫu thu từ các phụ nữ mang thai giai đoạn 17 - 25 tuần có nguy cơ

cao bị dị tật, kỹ thuật FISH đã giúp phát hiện 1 trường hợp mắc hội chứng Patau
(trisomy 13), 1 trường hợp mắc hội chứng Đao (trisomy 21), 1 trường hợp bất
thường cánh dài của NST 16. Kết quả cũng cho thấy 100% mẫu kết quả FISH phù
hợp với kết quả phân tích về NST liên quan đến các NST số 13, 18, 21, X, Y. Quy
trình chuẩn nhằm chẩn đốn trước sinh bằng chọc ối làm xét nghiệm FISH an toàn
cũng đã được hoàn thiện [6]. Sử dụng kỹ thuật FISH nhằm phát hiện sự khuếch đại
gen NMYC trên các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đã được tiến hành tại các
bệnh viện Nhi trung ương và cho kết quả tốt đẹp. Một số biến đổi di truyền trong u
nguyên bào thần kinh có ý nghĩa quan trọng trong việc lựa chọn phác đồ điều trị và
tiên lượng bệnh, trong đó sự khuếch đại gen NMYC được xem là yếu tố quan trọng
nhất đã được tìm thấy. Kết quả thành cơng này có ý nghĩa quan trọng hỗ trợ các bác

17


sỹ lâm sàng trong việc phân nhóm bệnh nhân và lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp
[5].
Các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH đối với các
loài sinh vật thủy sinh tại Việt Nam gần như rất ít. Trong một nghiên cứu gần đây
tại Viện nghiên cứu hải sản về ứng dụng kỹ thuật FISH cho việc nhận diện nhanh 2
loài tảo giáp độc hại A. tamarense và A. catenella, một số thử nghiệm đã được tiến
hành. Các trình tự đích thuộc vùng D1- D2 trên nhiễm sắc thể mã hóa cho tiều phần
lớn LSU của ribosome của loài được lấy làm cơ sở thiết kế đầu dị. Tín hiệu huỳnh
quang FITC được thiết kế gắn với đầu dò đặc hiệu. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy
các trùng lặp, giống nhau về đặc điểm hình thái của các lồi tảo giáp từng gây khó
khăn trong quan trắc tảo độc hại đã phần nào được giải quyết nhờ kỹ thuật FISH.
Đây cũng là một trong những cơ sở ban đầu cho việc ứng dụng kỹ thuật này trong
quan trắc cảnh báo về sự bùng phát các đối tượng thủy sinh gây thủy triều đỏ tại
Việt Nam [3].
1.3.

Các bước cơ bản của quy trình lai huỳnh quang tại chỗ - FISH
Sự ra đời của kỹ thuật FISH dựa trên các cải tiến của kỹ thuật ISH đã ra đời

và là sự kết hợp chính xác của phép lai một đoạn oligonucleotit (đầu dị) có gắn tín
hiệu huỳnh quang với một trình tự ADN đích đặc trưng. Bằng quan sát trực quan từ
kính hiển vi huỳnh quang, các phân tử huỳnh quang phát sáng với những màu sinh
động cho phép hiển thị các đoạn ADN, nhiễm sắc thể hay tế bào đích. Nhờ đó mà
các nhà nghiên cứu có thể nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào sinh vật trong
mẫu môi trường tự nhiên hay trong các mơ bệnh phẩm...
Quy trình này bao gồm các bước cơ bản sau:
- Bước 1: Chuẩn bị mẫu và đầu dị có trình tự nucleotit bổ sung đặc hiệu với trình
tự đặc hiệu cần nhận biết.
- Bước 2: Cố định mẫu nghiên cứu.
- Bước 3: Lai giữa đầu dị và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào của mẫu.

18


- Bước 4: Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dị khơng được lai (đầu dị tự do).
- Bước 5: Hiển thị, quan sát và phân tích kết quả bằng kính hiển vi huỳnh quang.

Hình 1.2. Các bước cơ bản của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH
1.4.

Đặc điểm sinh thái của một số loài vi tảo biển độc hại nghiên cứu
Alexandrium affine được xác định là một trong số 31 loài tảo độc hại thuộc

phân chi Alexandrium nom. nud của chi Alexandrium (chi tảo Hai roi) trên thế
giới. Chúng được xác định có phân bố phổ biến ở vùng biển Việt Nam. Các kết quả

nghiên cứu trước đây cho thấy rằng chúng phát triển mạnh vào thời gian từ tháng 12
đến tháng 2 hàng năm và bắt gặp nhiều trong các thủy vực Thừa Thiên Huế. Loài
này cũng đã bắt gặp phát triển mạnh tại các vịnh Văn Phong, Cam Ranh (Khánh
Hịa) vào mùa khơ thuộc các tháng 3 và 4. Một kết quả phân tích độc tố của loài này

19