(Luận văn thạc sĩ) ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa gen RASSF1A, GSTP1 ở bệnh nhân ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

Đoàn Thị Hồng Vân

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI ĐIỂM ĐỂ PHÁT HIỆN METHYL HÓA
GEN RASSF1A, GSTP1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ VÀ UNG THƢ
TUYẾN TIỀN LIỆT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội-2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

Đoàn Thị Hồng Vân

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI ĐIỂM ĐỂ PHÁT HIỆN METHYL HÓA
GEN RASSF1A, GSTP1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ VÚ VÀ UNG THƢ
TUYẾN TIỀN LIỆT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Võ Thị Thƣơng Lan

Hà Nội-2017


LỜI CẢM ƠN
Trong những năm tháng theo học và làm việc tại Phịng Thí nghiệm Sinh Y, tơi
có cơ hội học hỏi kiến thức mới, có điều kiện thực hành cũng nhƣ tiếp xúc với tác
phong khoa học nề nếp. Tơi đƣợc thử sức mình với những khó khăn, thử thách của
thực nghiệm mang lại. Vì thế, lời cảm ơn đầu tiên, tôi xin đƣợc gửi tới PGS. TS. Võ
Thị Thƣơng Lan – ngƣời đã bên cạnh tôi suốt những năm tháng đó. Cơ là ngƣời
hƣớng dẫn đặc biệt, tâm huyết và vô cùng kiên nhẫn sửa đổi khuyết điểm của tôi.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Tạ Bích Thuận. Mặc dù, cơ khơng
hƣớng dẫn trực tiếp nhƣng những lời động viên của cô làm cho tơi suy nghĩ tích cực
hơn trong lúc gặp trắc trở. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Phạm Anh Thùy
Dƣơng và NCS. Ngô Thị Hà – hai ngƣời chị luôn chia sẻ kinh nghiệm và lắng nghe
những khúc mắc của tơi. Tơi gửi lịng u mến của mình tới các bạn đồng khóa cùng
tồn thể sinh viên và học viên cao học trong Phịng Thí nghiệm Sinh Y.
Để có đƣợc kết quả trong luận văn này, tơi xin cảm ơn Khoa Giải phẫu, Bệnh
viện K, các thầy cô Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc
Gia Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ trong q trình học tập và thực hành.
Tơi gửi lòng biết ơn cũng nhƣ lời cảm ơn này tới các thành viên trong gia đình
đã ủng hộ mọi quyết định của tôi.
Hà Nội, ngày 27 tháng 7 năm 2017
Học viên cao học

Đoàn Thị Hồng Vân


MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1

CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 2
1.1. METHYL HÓA DNA VÀ UNG THƢ ................................................................ 2
1.1.1. Methyl hóa DNA .......................................................................................... 2
1.1.2. Methyl hóa DNA và ung thƣ ........................................................................ 5
1.1.3. Methyl hóa gen GSTP1 ................................................................................ 7
1.1.4. Methyl hóa gen RASSF1A ............................................................................ 8
1.2. MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SỰ METHYL HĨA DNA ...................... 10
1.2.1. Các kỹ thuật phân tích phổ biến ................................................................. 10
1.2.2. Kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu methyl MSP (Methylation-Specific PCR) .. 12
1.3. KỸ THUẬT LAI ĐIỂM .................................................................................... 15
1.3.1. Nguyên tắc chung kỹ thuật lai axit nucleic ................................................ 15
1.3.2. Phƣơng pháp đánh dấu đầu dò ................................................................... 17
CHƢƠNG 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................. 26
2.1. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM ........................................................ 26
2.2. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .................................................. 26
2.2.1. Nguyên liệu ................................................................................................ 26
2.2.2. Hóa chất ...................................................................................................... 27
2.2.3. Thiết bị........................................................................................................ 30
2.3. PHƢƠNG PHÁP ............................................................................................... 30


2.3.1. Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú ........................................ 30
2.3.2. Xử lý DNA với sodium bisulfite ................................................................ 30
2.3.3. Phƣơng pháp PCR ...................................................................................... 30
2.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR............................................................................ 34
2.3.5. Tách plasmid .............................................................................................. 35
2.3.6. Phƣơng pháp xác định nồng độ DNA bằng quang phổ hấp thụ ................. 35
2.3.7. Điện di ........................................................................................................ 35
2.3.8. Phƣơng pháp lai điểm ................................................................................. 35
2.3.9. Phƣơng pháp phân tích thống kê sinh học.................................................. 36

CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 38
3.1. ĐIỀU KIỆN LAI ĐIỂM TỐI ƢU CỦA ĐẦU DÒ G200 VÀ R200 PHÂN BIỆT
TRÌNH TỰ BỊ METHYL HĨA VÀ TRÌNH TỰ KHƠNG BỊ METHYL HÓA ... 38
3.1.1. Kết quả tinh sạch các trình tự nucleotide bị methyl hóa và trình tự
nucleotide khơng bị methyl hóa ................................................................. 38
3.1.2. Kết quả tổng hợp đầu dị............................................................................. 39
3.1.3. Điều kiện lai điểm phân biệt trình tự GSTP1 bị methyl hóa (MeG) và trình
tự GSTP1 khơng bị methyl hóa (UnG) với đầu dị G200 ........................... 40
3.1.4. Điều kiện lai điểm phân biệt trình tự RASSF1A bị methyl hóa (MeR) và
trình tự RASSF1A khơng bị methyl hóa (UnR) với đầu dị R200 .............. 42
3.2. PHÂN TÍCH SỰ METHYL HÓA PROMOTER GEN GSTP1 VÀ RASSF1A
BẰNG KỸ THUẬT MSP ...................................................................................... 47
3.2.1. Tách chiết DNA .......................................................................................... 47


3.2.2. Xử lý DNA với sodium bisulfite ................................................................ 49
3.2.3. Xác định sự methyl hóa promoter của hai gen GSTP1 và RASSF1A trên các
mẫu bệnh phẩm........................................................................................... 50
3.2.4. Mối liên hệ giữa sự methyl hóa và các thơng số sinh học .......................... 55
3.2.5. Kết quả lai điểm trên một số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm .............. 57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 60
PHỤ LỤC ..........................................................................................................................


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng cho kỹ thuật lai điểm .................................................. 27
Bảng 2.2. Thành phần các dung dịch dùng trong quá trình lai điểm ............................. 28
Bảng 2.3. Trình tự mồi sử dụng cho nghiên cứu và kích thƣớc sản phẩm PCR tƣơng
ứng ................................................................................................................ 29

Bảng 2.4. Thành phần và điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự
GSTP1 bị methyl hóa .................................................................................... 31
Bảng 2.5. Thành phần và điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự
GSTP1 khơng bị methyl hóa ......................................................................... 32
Bảng 2.6. Thành phần và điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự
RASSF1A bị methyl hóa................................................................................ 33
Bảng 2.7. Thành phần và điều kiện phản ứng MSP với cặp mồi khuếch đại trình tự
RASSF1A khơng bị methyl hóa .................................................................... 33
Bảng 2.8. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tổng hợp đầu dị có và khơng có
biotin ............................................................................................................. 34
Bảng 3.1. Điều kiện lai điểm phân biệt sản phẩm tinh sạch mang trình tự GSTP1 bị
methyl hóa (MeG) và trình tự GSTP1 khơng bị methyl hóa (UnG) sử dụng
đầu dò G200 .................................................................................................. 40
Bảng 3.2. Điều kiện lai điểm phân biệt sản phẩm tinh sạch mang trình tự RASSF1A bị
methyl hóa (MeR) và trình tự RASSF1A khơng bị methyl hóa (UnR) sử dụng
đầu dị R200 .................................................................................................. 45
Bảng 3.3. Nồng độ và độ sạch của một số mẫu DNA tách chiết từ mẫu mô ................ 48
Bảng 3.4. Nồng độ và độ sạch của một số mẫu DNA sau xử lý với sodium bisulfite .. 49


Bảng 3.5. Tỷ lệ methyl hóa hai gen GSTP1 và RASSF1A trong ung thƣ vú ................. 55
Bảng 3.6. Mối liên hệ giữa sự methyl hóa promoter hai gen GSTP1 và RASSF1A với
các thông số sinh học của bệnh nhân ung thƣ vú ......................................... 56


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Sự methyl hóa DNA trong genome động vật có vú ........................................ 4
Hình 1.2. Cấu trúc gen GSTP1, mRNA, protein và các yếu tố điều hòa phiên mã......... 7
Hình 1.3. Cấu trúc gen RASSF1A .................................................................................... 9
Hình 1.4. Phƣơng pháp biến đổi DNA nhờ sodium bisulfite ........................................ 12

Hình 1.5. Các cặp mồi của kỹ thuật MSP ..................................................................... 13
Hình 1.6. Kỹ thuật MethyLight ..................................................................................... 14
Hình 1.7. Phƣơng pháp đánh dấu thông qua phản ứng tổng hợp DNA in vitro............ 18
Hình 1.8. Hệ thống đánh dấu gián tiếp .......................................................................... 20
Hình 1.9. Mức độ tƣơng đồng giữa trinh tự bị methyl hóa và trình tự khơng bị methyl
hóa với đầu dị đặc hiệu. ............................................................................... 23
Hình 3.1. (A) Kết quả tách plasmid mang các trình tự bị methyl hóa và khơng bị
methyl hóa. (B) Kết quả điện di 4 ng tinh sạch sản phẩm PCR các trình tự
nucleotide GSTP1 và RASSF1A bị methyl hóa (MeG, MeR) và trình tự
nucleotide khơng bị methyl hóa (UnR, UnG)............................................... 39
Hình 3.2. Kết quả tổng hợp đầu dị G200, R200 có và khơng có biotin ....................... 39
Hình 3.3. Kết quả lai điểm với đầu dị G200 tại các nồng độ muối SSC khác nhau .... 41
Hình 3.4. Kết quả lai điểm với đầu dò R200 trên các sản phẩm tinh sạch mang trình tự
RASSF1A bị methyl hóa (MeR) và trình tự RASSF1A khơng bị methyl hóa
(UnR) ............................................................................................................ 43
Hình 3.5. Kết quả lai điểm với đầu dị R200 tại nhiệt độ 400C, 450C và 490C trong
dung dịch đệm lai có bổ sung 50% formamide ............................................ 45


Hình 3.6. Kết quả lai điểm và điện di của sản phẩm PCR tinh sạch mang trình tự bị
methyl hóa (MeG, MeR) và trình tự khơng bị methyl hóa (UnG, UnR) ...... 46
Hình 3.7. Kết quả điện di minh họa một số DNA tách chiết từ 49 cặp mẫu bệnh phẩm
mô ung thƣ vú-VU và mô liền kề-VL (A) và từ 10 mẫu đúc mô ung thƣ
tuyến tiền liệt T1-T10 (B) ............................................................................. 47
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm MSP phát hiện sự methyl hóa promoter GSTP1 sử
dụng các mẫu bệnh phẩm ung thƣ tuyến tiền liệt (T1-T10) ......................... 51
Hình 3.9. Kết quả điện di minh họa sản phẩm MSP phát hiện sự methyl hóa promoter
gen GSTP1 sử dụng các mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú ................................... 52
Hình 3.10. Kết quả điện di minh họa sản phẩm MSP phát hiện sự methyl hóa promoter
RASSF1A sử dụng các mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú...................................... 54

Hình 3.11. Kết quả lai điểm trên một số sản phẩm MSP từ mẫu bệnh phẩm ung thƣ vú
(A) và ung thƣ tuyến tiền liệt (B) ................................................................. 57


KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT
APS

Amonium persulfate

ATP

Adenine triphosphate

bp

Base pair

C

Cytosine

cs.

Cộng sự

Da

Dalton

d(A, C, G)TP

Hỗn hợp gồm deoxyadenine triphosphate, deoxycytosine triphosphate
và deoxyguanine triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic Acid

DNMTs

DNA methyltransferases

dNTPs

Deoxyribonucleotide triphosphates

dTTP

Deoxythymidine triphosphate

dUTP

Deoxyuridine triphosphate

ELISA

Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

ER

Estrogen Receptor

GSTs

Glutathione S-transferases

GSTP1

Glutathione S-transferases Pi 1

HER-2

Human Epidermal growth factor Receptor 2

ICR

Imprinting Control Region

JNK

c-Jun N-terminalkinase

kb

Kilobase=1000 bp

LB

Luria-Bertani

mRNA

Messenger Acid Ribonucleic

MSP

Methylation-Specific PCR


PCR

Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)

PR

Progesterone Receptor

PSA

Prostate specific antigen (kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt)

RASSF1A

Ras association domain family 1A

RNA

Ribonucleic Acid

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

SNP

Single Nucleotide Polymorphism (đa hình đơn nucleotide)

SSC

Saline Sodium Citrate

T

Thymine

TBE

Tris-Borate-EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid)

TEMED

N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine

TRAF2

Tumor necrosis factor receptor-associated factor 2

U

Uracil

LỜI MỞ ĐẦU
Methyl hóa DNA là một trong những cơ chế chính của di truyền ngoại gen, có
vai trị quan trọng trong nhiều quá trình sinh học nhƣ: phát triển phơi, điều hịa phiên
mã, cấu trúc nhiễm sắc thể, bất hoạt nhiễm sắc thể X, in dấu gen và ổn định hệ gen. Do
những vai trị quan trọng đó nên hiện tƣợng methyl hóa DNA có mối liên hệ với nhiều
bệnh ở ngƣời. Đối với bệnh ung thƣ, hiện tƣợng methyl hóa DNA bất thƣờng đƣợc
quan sát ở các tế bào bắt đầu bị tổn thƣơng cho tới các tế bào ở các giai đoạn khác
nhau. Bởi vậy, methyl hóa DNA có thể trở thành dấu chuẩn tiềm năng hỗ trợ chẩn đốn
sớm, tiên lƣợng và điều trị đích ung thƣ.
Các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA ngày càng phát triển và hồn thiện
khơng chỉ để đáp ứng độ nhạy và độ đặc hiệu cao mà cịn có khả năng ứng dụng thực
tiễn. Hiện nay, kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu methyl MSP (Methylation-Specific PCR)
đƣợc sử dụng phổ biến trong nhiều phịng thí nghiệm, bởi có độ nhạy cao và không yêu
cầu thiết bị đặc biệt. Mặc dù vậy, nhƣợc điểm của MSP là khơng định lƣợng, có hiện
tƣợng dƣơng tính giả và cần thời gian chuẩn bị gel để phân tích kết quả. Do vậy, nhiều
nghiên cứu đã cải tiến kỹ thuật MSP cũng nhƣ kết hợp với các kỹ thuật khác nhằm mục
đích tăng độ nhạy, độ đặc hiệu, khả năng ứng dụng trong thực tế và giảm chi phí. Tiếp
nối các nghiên cứu phân tích sự methyl hóa các gen ức chế khối u cũng nhƣ kết hợp kỹ
thuật MSP và kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl hóa DNA của Phịng Thí nghiệm
Sinh Y, chúng tôi thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật lai điểm để phát hiện methyl
hóa gen RASSF1A, GSTP1 ở bệnh nhân ung thƣ vú và ung thƣ tuyến tiền liệt”.

1


Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

METHYL HÓA DNA VÀ UNG THƢ

1.1.1. Methyl hóa DNA
Di truyền ngoại gen là những thay đổi sự biểu hiện hoặc kiểu hình có khả năng
di truyền qua các thế hệ nhƣng không do biến đổi về trình tự DNA [44]. Methyl hóa
DNA là một trong những cơ chế chính của di truyền ngoại gen liên quan trực tiếp tới
sự biến đổi hóa học DNA. Đây là hiện tƣợng thêm một gốc methyl (-CH3) vào vị trí
carbon số 5 của cytosine thành dạng 5-methylcytosine [44]. Hiện tƣợng này xảy ra ở
prokaryote và eukaryote [24]. Ở vi khuẩn, methyl hóa DNA phân biệt DNA genome vi
khuẩn với DNA của thực khuẩn thể, nhờ đó DNA của thực khuẩn thể bị cắt bởi các
enzyme vật chủ. Đối với thực vật, sự methyl hóa xảy ra ở các cấu trúc CG, CHG và
CHH (trong đó H có thể là A, C hoặc T). Nhƣng ở động vật có vú, sự methyl hóa xảy
ra ở cytosine trong dinucleotide CpG [24].
Ở động vật có vú, sự methyl hóa DNA đƣợc xúc tác bởi họ enzyme DNA
methyltransferases (DNMTs) chuyển một gốc methyl từ S-adenyl methionine (SAM)
vào carbon số 5 của gốc cytosine thành dạng 5-methylcytosine [24, 44]. DNMT3A và
DNMT3B có thể thiết lập sự methyl mới trên sợi DNA không đƣợc biến đổi. Mặt khác,
chức năng DNMT1 trong quá trình tái bản DNA để sao chép sự methyl hóa của sợi
DNA bố mẹ tới sợi mới. Cả ba enzyme này đều liên quan tới q trình phát triển của
phơi nhƣng giảm biểu hiện vào cuối giai đoạn biệt hóa [44].
Sự methyl hóa DNA có liên quan và đóng vai trị quan trọng trong bất hoạt
nhiễm sắc thể X, in dấu gen, ổn định hệ gen và điều hòa biểu hiện gen [12, 61]:
Bất hoạt nhiễm sắc thể X: Ở giới tính cái của động vật có vú (kiểu gen XX),
một trong hai nhiễm sắc thể X bị bất hoạt để bù lại sự mất cân bằng các gen liên kết
với nhiễm sắc thể X so với giới tính đực (kiểu gen XY). Quá trình này xảy ra trong giai

2


đoạn phát triển phôi sớm [12]. Sự bất hoạt xảy ra ngẫu nhiên với một trong hai nhiễm

sắc thể và đƣợc duy trì trên cùng nhiễm sắc thể đó trong quá trình nguyên phân của tế
bào cho tới khi phát triển thành mơ trƣởng thành. Cơ chế duy trì nhiễm sắc thể X bị bất
hoạt là sự methyl hóa quá mức đảo CpG vùng promoter các gen phân bố dọc theo
chiều dài của nhiễm sắc thể X bị bất hoạt (Hình 1.1D) [12]. Sự methyl hóa DNA trong
trƣờng hợp này xảy ra khá muộn [61]. Quá trình bất hoạt đƣợc khởi đầu bởi sự hoạt
hóa các RNA khơng mang mã hoạt động kiểu cis (cis-acting noncoding RNA), từ đó
làm kích hoạt sự thay thế các nhân tố phiên mã, thay đổi nhiễm sắc thể và sau cùng,
các CpG bị methyl hóa tại đảo CpG vùng promoter [43]. Sự methyl hóa DNA rất cần
thiết cho việc duy trì ổn định trạng thái không phiên mã của các gen nằm trên nhiễm
sắc thể X bị bất hoạt [12].
In dấu gen: Ở động vật có vú, hệ gen có nguồn gốc từ bố và từ mẹ có chức
năng khơng cân bằng nhau nhƣng đều cần cho sự phát triển bình thƣờng. Tính trạng
của gen đƣợc biểu hiện phụ thuộc vào nguồn gốc di truyền từ bố hay mẹ. Những gen
đƣợc in dấu thƣờng định vị theo cụm và các allen đƣợc đánh dấu khác nhau nhờ sự
methyl hóa DNA, acetyl hóa/khử acetyl hóa histone, methyl hóa histone và thƣờng liên
quan tới các sợi antisene RNA [61]. Các gen trong cụm thƣờng chịu kiểm soát của
vùng điều khiển in dấu ICR (Imprinting Control Region) (Hình 1.1E). Phơi sau khi thụ
tinh, methyl hóa ICR ở dịng tế bào mầm khơng chịu sự tái lập chƣơng trình của
genome nhƣng trong quá trình phát triển của tế bào mầm, sự methyl hóa ICR bị xóa và
đƣợc thiết lập lại. ICR hoạt động khi khơng bị methyl hóa và khơng hoạt động khi bị
methyl hóa. Ở trạng thái hoạt động, ICR sẽ điều khiển các gen bị in dấu biểu hiện [48].
Ổn định hệ gen: Methyl hóa DNA đóng vai trị ổn định hệ gen bằng cách bất
hoạt phiên mã các trình tự DNA lặp lại và các transposon nội sinh [61]. Hoạt động
phiên mã ở các vùng này bị ức chế bởi sự methyl hóa quá mức. Nếu các transposon
khơng bị ức chế bởi sự methyl hóa thì có thể làm đồng hoạt hóa các gen xung quanh
hoặc phiên mã các yếu tố có khả năng di chuyển (Hình 1.1B). Nếu vùng lặp lại ở gần

3

tâm động đƣợc hoạt hóa phiên mã thì gây ra sắp xếp lại các vùng lân cận tâm động, có
khả năng là nguyên nhân dẫn đến các nhiễm sắc thể khơng xếp hàng trong ngun
phân (Hình 1.1C) [43].

Hình 1.1. Sự methyl hóa DNA trong genome động vật có vú [43]. (A) Phân loại promoter của
gen dựa trên mật độ CpG bị methyl hóa. (B) Các transposon bị ức chế bởi sự methyl hóa
DNA. (C) Sự methyl hóa DNA ức chế phiên mã của các trình tự lặp lại vùng tâm động. (D) Sự
methyl hóa DNA duy trì bất hoạt gen trên một nhiễm sắc thể X. (E) In dấu gen điều khiển biểu
hiện gen đặc hiệu allen. Sự methyl hóa DNA tại vùng điều khiển in dấu điều hòa các protein
bám hoặc biểu hiện của các RNA không mang mã hoạt động kiểu cis.

Điều hòa biểu hiện gen: Phân bố CpG đƣợc coi là vùng quan trọng cho sự điều
hòa của di truyền ngoại gen tới biểu hiện gen [41]. CpG phân bố không ngẫu nhiên
trong genome mà tập trung thành vùng đƣợc gọi là đảo CpG [11]. Đảo CpG chiếm 12% genome, dài 200 bp đến vài kb, thành phần G và C ít nhất chiếm 50% với tỉ lệ quan
sát/mong đợi >0,6 [11, 41]. Các nghiên cứu hiện tại bổ sung thêm vào xung quanh đảo
CpG các vùng CpG lân cận. Mặc dù các vùng này có mật độ CpG thấp hơn nhƣng lại
có chức năng quan trọng đối với điều hịa biểu hiện gen. Ví dụ, trong q trình biệt hóa

4


tế bào, sự methyl hóa vùng CpG cách đảo CpG 2 kb diễn ra mạnh hơn sự methyl hóa
tại đảo CpG, chứng tỏ vai trị chính của vùng lân cận này đối với hƣớng biệt hóa của tế
bào [14]. Đảo CpG thƣờng gần với vùng promoter và/hoặc exon của gen [11]. Mật độ
CpG vùng promoter xác định sự methyl hóa sẽ ảnh hƣởng tới biểu hiện gen (Hình
1.1A). Theo nghiên cứu của Lister và cs. (2009), vùng promoter giàu CpG (Highdensity CpG Promoter, HCP) khơng bị methyl hóa ở tất cả các mô ngay cả khi sự phiên
mã của gen liên quan bị bất hoạt. Vùng promoter mật độ CpG thấp (Low-density CpG
Promoter, LCP) hầu nhƣ bị methyl hóa khơng kể tới sự hoạt hóa hay ức chế của gen.
Ngƣợc lại, sự methyl hóa ở vùng promoter có mật độ CpG trung bình (Intermediatedensity CpG Promoter, ICP) có liên quan tới sự bất hoạt gen [40]. Bất hoạt phiên mã
bởi sự methyl hóa DNA chƣa đƣợc hiểu biết đầy đủ mặc dù đã có nhiều cơ chế đƣợc

đƣa ra. Cơ chế thứ nhất, sự methyl hóa tại trình tự DNA điều hịa đặc hiệu và việc thêm
nhóm methyl vào DNA có thể ngăn cản các protein điều hịa bám vào trình tự này [12].
Vì thế, sự methyl hóa DNA theo cơ chế này sẽ trực tiếp ngăn cản các gen hoạt động.
Một cơ chế khác điều hịa gián tiếp thơng qua protein bám DNA. Những protein này có
vùng bám DNA bị methyl hóa nên có thể nhận biết và bám vào một hoặc nhiều CpG bị
methyl hóa. Sau đó, chúng tƣơng tác hoặc tham gia vào phức bất hoạt quá trình phiên
mã nhƣ phức tái cấu trúc nhiễm sắc thể và/hoặc các enzyme biến đổi histone [12].
1.1.2. Methyl hóa DNA và ung thƣ
Methyl hóa DNA có nhiều ƣu điểm để trở thành chỉ thị sinh học trong ung thƣ
và ứng dụng trong lâm sàng. Thứ nhất, các chỉ thị methyl hóa DNA đặc hiệu cho các tế
bào khối u và xảy ra với phần trăm cao hơn so với biến đổi di truyền [30]. Thứ hai,
DNA là phân tử hóa học ổn định, vì thế, có thể khuếch đại và phát hiện dễ dàng. Thứ
ba, các khối u có nhiều vùng bị methyl hóa bất thƣờng, một trong số đó đặc hiệu cho
từng loại khối u trong khi một số khác có mặt ở hầu hết các loại khối u [30]. Do đó,
methyl hóa bất thƣờng DNA có thể đƣợc tìm thấy trong các tế bào biểu mơ có vẻ bình

5


thƣờng [30]. Ƣu điểm này của dấu chuẩn methyl hóa DNA đã đáp ứng yêu cầu phát
hiện sớm và sàng lọc quần thể ngƣời có nguy cơ mắc ung thƣ.
Methyl hóa DNA bất thƣờng đƣợc quan sát ở ung thƣ tự phát và ung thƣ do di
truyền [41]. Có hai hiện tƣợng thay đổi sự methyl hóa DNA thƣờng xảy ra trong tế bào
ung thƣ so với tế bào bình thƣờng đã đƣợc nghiên cứu:
Trong tế bào bình thƣờng, vùng dị nhiễm sắc bị methyl hóa cao. Các vùng trình tự
lặp lại nhƣ LINE, SINE, IAP và Alu bị bất hoạt, nhờ đó đảm bảo genome đƣợc tồn
vẹn và ổn định. Tuy nhiên, trong nhiều loại khối u, cơ chế này bị gián đoạn và xảy ra
hiện tƣợng mất đi sự methyl hóa ở các vùng mà bình thƣờng bị methyl hóa. Đây đƣợc
gọi là sự methyl hóa dƣới mức. Hiện tƣợng này tạo cơ hội cho sự tái tổ hợp không
mong muốn trong nguyên phân. Các yếu tố gen nhảy đƣợc tái hoạt hóa và tích hợp vào

vị trí bất kì trong hệ gen dẫn tới hình thành đột biến và sự bất ổn hệ gen. Điều này có
liên quan tới sự phát triển khối u và các giai đoạn của bệnh [36]. Ví dụ, mất sự methyl
hóa DNA của Sat2 (juxtacentromeric satellite 2) và Satα (centromeric satellite) trong
ung thƣ vú có liên hệ với sự phát triển sớm của khối u trong khi ở ung thƣ buồng trứng
thì chúng góp phần vào sự tiến triển của khối u và đƣợc đề nghị trở thành chỉ thị cho
tiên lƣợng sớm [36].
Ngƣợc lại với hiện tƣợng trên, ở các tế bào ung thƣ, các gen chịu sự bất hoạt do sự
methyl hóa quá mức đảo CpG mà trong tế bào bình thƣờng chúng khơng bị methyl hóa
[36]. Các gen liên quan tới chu trình tế bào, sửa chữa DNA, kháng thuốc và khử độc,
biệt hóa, tự chết theo chu trình, tăng sinh mạch, di căn và xâm nhập đều bị bất hoạt bởi
methyl hóa quá mức [11]. Nghiên cứu của Drexlex và cs. (1998), hai gen liên quan tới
chu trình tế bào là p16INK4a và p15INK4a chịu sự methyl hóa quá mức ở nhiều loại ung
thƣ. Nhiều gen sửa chữa DNA cũng bị methyl hóa trong các khối u nhƣ MGMT,
MLH1. Điển hình, sự methyl hóa gen BRCA1, gen liên quan tới sửa chữa đứt gãy sợi
đôi DNA, đƣợc nghiên cứu nhiều ở ung thƣ vú và ung thƣ buồng trứng [36].

6


Dấu chuẩn methyl hóa DNA đƣợc tiến hành phân tích thuận tiện và có thể sử
dụng kết hợp với các phƣơng pháp chẩn đốn khác. Methyl hóa DNA khơng chỉ có thể
ứng dụng trong chẩn đốn mà cịn là cơng cụ hỗ trợ xác định và phân loại khối u, có
khả năng dự đốn đáp ứng điều trị và cải thiện tiên lƣợng bệnh [13].
1.1.3. Methyl hóa gen GSTP1
Glutathione S-transferases (GSTs) bao gồm các enzyme có nhiều chức năng.
Các enzyme này có vai trị giải độc cho tế bào, bảo vệ các đại phân tử khỏi các chất oxi
hóa [27]. GST Pi 1 (GSTP1) là một trong ba lớp phổ biến của GSTs [45].
Gen GSTP1 nằm trên vùng 11q13, dài 2.8 kb và bao gồm 7 exon. Khung đọc
mở bắt đầu tại vị trí 3’ của exon đầu tiên và dài 630 bp, mã cho protein gồm 290 axit
amin với khối lƣợng phân tử khoảng 23224 Da (Hình 1.2) [45]. Vùng mã hóa bị điều

khiển bởi đảo CpG thuộc vùng promoter nằm ở phía trƣớc vị trí khởi đầu phiên mã. Cả
khu vực này bị phân cách bởi trình tự dài lặp lại ATAAA. Trình tự lặp lại ATAAA
hoạt động gần nhƣ là một nhân tố để phân chia các trạng thái khác nhau của di truyền
ngoại gen [53]. Ngoài ra, nhiều nhân tố phiên mã khác nhƣ SP1 (Stimulator protein 1),
AP1 (Activator protein 1), yếu tố nhân tăng cƣờng hoạt hóa tế bào B (NF-ĸB) và
GATA1 cũng đóng vai trị quan trọng trong điều hịa biểu hiện GSTP1 (Hình 1.2) [53].

Hình 1.2. Cấu trúc gen GSTP1, mRNA, protein và các yếu tố điều hòa phiên mã [45, 53].

7


Protein GSTP1 liên quan tới điều hòa chết theo chƣơng trình của tế bào. GSTP1
tƣơng tác với tín hiệu gây chết c-Jun NH2-terminal kinase (JNK1) hoặc thụ thể liên
quan với nhân tố hoại tử khối u (TRAF2). GSTP1 có chức năng chuyển hóa và giải độc
nên gen GSTP1 biểu hiện ở hầu hết các tế bào, đặc biệt các tế bào tiếp xúc với mơi
trƣờng bên ngồi nhƣ tế bào của hệ thống tiết niệu, tiêu hóa, hơ hấp [53]. Mức độ biểu
hiện GSTP1 tăng chứng tỏ hoạt động giải độc tăng cƣờng để đáp ứng với các chất oxi
hóa. Thực nghiệm cho thấy, chuột không biểu hiện protein GSTP1 sẽ nhạy cảm với các
độc tố môi trƣờng, thúc đẩy hình thành đột biến và phát triển ung thƣ [53]. Sự methyl
hóa quá mức vùng promoter dẫn tới bất hoạt biểu hiện gen GSTP1 đƣợc nghiên cứu
nhƣ một chỉ thị tiềm năng cho chẩn đoán ung thƣ tuyến tiền liệt [53]. Ngoài tuyến tiền
liệt, protein GSTP1 biểu hiện ở nhiều mơ trong đó có mơ vú [45]. Do đó, sự methyl
hóa bất thƣờng vùng promoter GSTP1 cũng đƣợc phát hiện ở các bệnh nhân ung thƣ vú
[53]. Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự methyl hóa bất thƣờng GSTP1 là
một sự kiện xảy ra sớm trong quá trình phát sinh ung thƣ vú [37], có thể trở thành chỉ
thị sinh học cho sàng lọc sớm và nguy cơ mắc ung thƣ vú [18, 37].
1.1.4. Methyl hóa gen RASSF1A
Gen RASSF1 nằm trên vùng 3p21.3, có kích thƣớc xấp xỉ 11 kb, bao gồm 8
exon [15]. Sự cắt nối luân phiên cùng với việc phiên mã từ 2 promoter khác nhau tạo

thành 8 đồng phân khác nhau RASSF1A-RASSF1H trong đó RASSF1A và RASSF1C là
hai dạng phổ biến [3]. Gen RASSF1 có 2 vùng promoter tƣơng ứng với 2 đảo CpG khác
nhau. Đảo CpG nhỏ có kích thƣớc 737 bp chứa 85 CpG và là promoter của RASSF1A,
RASSF1D, RASSF1E, RASSF1F và RASSF1G. Đảo CpG lớn hơn có kích thƣớc 1365
bp chứa 139 CpG và là promoter của RASSF1B và RASSF1C [3]. RASSF1A bao gồm
các exon 1, 2, 3, 4, 5, 6 mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 340 axit amin có khối
lƣợng phân tử 39 kDa (Hình 1.3) [3, 15].

8


Hình 1.3. Cấu trúc gen RASSF1A. α, β, γ: các exon. C1: vùng bảo thủ 1 (vùng bám của
diacylglycerol). ATM: trình tự xảy ra sự phosphoryl hóa đồng bộ của ATM-kinase. RA
domain: vùng tƣơng tác của Ras [15].

Protein RASSF1A tham gia điều hịa nhiều q trình sinh học của tế bào.
Protein RASSF1A có vai trị trong việc tổng hợp thoi vô sắc và thúc đẩy sự ổn định của
chúng [15]. Bên cạnh đó, RASSF1A có thể gây kìm hãm chu kì tế bào bằng cách tác
động đến protein RB (Restinoblastoma protein). RASSF1A ức chế q trình tích lũy
cyclin D1 điều khiển sự phosphoryl hóa Rb và kiểm sốt chết theo chƣơng trình của tế
bào từ pha G1 [15]. Nhờ vậy, RASSF1A có thể ức chế chu trình tế bào ở điểm chuyển
đổi G1/S. Do đó, RASSF1A biểu hiện quá mức sẽ thúc đẩy quá trình chết theo chƣơng
trình, pha nghỉ chu trình tế bào và giảm tình trạng khối u ở các dòng tế bào ung thƣ
[15]. Ngƣợc lại, thực nghiệm chứng minh rằng nếu protein RASSF1A giảm thì làm chu
trình tế bào mất kiểm sốt, tăng sự bất ổn hệ gen, kháng lại nhân tố cảm ứng quá trình
tự chết TNFα và K-Ras [15]. Sự methyl hóa quá mức promoter RASSF1A có mối liên
hệ với việc giảm biểu hiện của protein RASSF1A. Hiện tƣợng này đƣợc quan sát ở
nhiều loại ung thƣ phổ biến. Tỷ lệ methyl hóa quá mức vùng promoter RASSF1A xảy
ra từ 99% ở các khối u cho tới 0% ở các mơ bình thƣờng ở xung quanh [23]. Tỷ lệ cao
nhất đƣợc báo cáo là 88%, 95% và 99% lần lƣợt ở ung thƣ phổi, ung thƣ vú và ung thƣ

tuyến tiền liệt [15].

9


1.2.

MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SỰ METHYL HĨA DNA

1.2.1. Các kỹ thuật phân tích phổ biến
Các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA có thể đƣợc phân chia theo số lƣợng và
phân bố vị trí CpG thành các nhóm chính sau [41]:
Các kỹ thuật thuộc nhóm đánh giá tồn bộ số lƣợng C bị methyl hóa (Global
5mC quantification approaches). Ban đầu, số lƣợng C bị methyl hóa đƣợc đánh giá
dựa trên kỹ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao và kết hợp với khả năng phóng xạ của gốc
methyl. Sau đó, hƣớng tiếp cận này đƣợc cải tiến thành hóa mơ miễn dịch sử dụng
kháng thể của C bị methyl hóa, phân tích ELISA (methDNA-ELISA)... Hƣớng tiếp cận
này cho phép đánh giá tồn bộ những thay đổi chính về mức độ methyl hóa nhƣng
khơng cung cấp đƣợc thơng tin vị trí bị methyl hóa [55] và khơng phân tích đƣợc sự
methyl hóa DNA đặc hiệu vùng [41].
Các kỹ thuật thuộc nhóm đánh giá sự methyl hóa DNA của tồn bộ genome
(Genome-wide DNA methylation approaches) có thể sử dụng hoặc không sử dụng
microarray. Kỹ thuật quét hệ gen vùng giới hạn (restriction landmark genome
scanning, RLGS) không cần microarray. Kỹ thuật quét vùng hệ gen xác định các gen bị
methyl hóa đặc hiệu mơ trong tế bào bình thƣờng và các gen bị methyl hóa bất thƣờng
trong tế bào ung thƣ [55]. Các kỹ thuật dựa trên microarray sử dụng kháng thể nhận
biết C bị methyl hóa hoặc sử dụng protein bám trình tự bị methyl hóa; hoặc kỹ thuật
giải trình tự thế hệ mới [41, 55].
Các kỹ thuật thuộc nhóm đánh giá sự methyl hóa DNA đặc hiệu từng vùng
(Locus-specific DNA methylation approaches) sẽ xác định tình trạng methyl hóa

DNA từng vùng đƣợc chọn. Vùng gen đƣợc chọn có số vị trí CpG biến đổi. Các kỹ
thuật thuộc nhóm này có chi phí tƣơng đối thấp, đặc biệt hiệu quả khi vùng đích phân
tích chứa các chỉ thị sinh học có giá trị. Hƣớng tiếp cận này dựa trên phƣơng pháp biến

10


đổi DNA nhờ sodium bisulfite hoặc phƣơng pháp sử dụng các enzyme giới hạn nhạy
cảm nhóm methyl (Methylation-sensitive restriction enzymes, MSREs).
Phƣơng pháp sử dụng enzyme giới hạn nhạy cảm nhóm methyl dựa trên cơ sở
nhận biết và cắt trình tự tại CpG khơng bị methyl hóa [41]. Phƣơng pháp sử dụng
enzyme này có thể kết hợp cùng PCR để làm giàu đoạn trình tự bị methyl hóa hoặc
khơng bị methyl hóa. Phƣơng pháp này tƣơng đối đơn giản và yêu cầu ít lƣợng DNA.
Tuy nhiên, chỉ các CpG trong vị trí enzyme đƣợc phân tích và nếu cắt khơng hồn tồn
có thể dẫn tới kết quả dƣơng tính giả [55].
Phần lớn phân tích methyl hóa DNA đƣợc phát triển dựa trên phƣơng pháp biến
đổi DNA nhờ sodium bisulfite [55]. Sodium bisulfite đƣợc sử dụng để chuyển gốc C
không bị methyl hóa thành U, trong khi C bị methyl hóa đƣợc giữ nguyên. Phản ứng
này xảy ra trong điều kiện pH thấp và nhiệt độ cao với DNA ở dạng sợi đơn và không
thể xảy ra khi DNA ở dạng sợi đơi [9, 34]. Q trình biến đổi nhờ sodium bisulfite
gồm 3 bƣớc cơ bản: phản ứng sodium bisulfite với liên kết đôi ở carbon số 5 và 6 của
cytosine thành dẫn xuất cytosine sulphonate (bƣớc 1); thủy phân loại gốc amine tạo
thành uracil sulphonate (bƣớc 2); loại bỏ gốc sulphonate bằng xử lý kiềm tạo thành gốc
uracil (bƣớc 3) (Hình 1.4A) [9]. Khi xử lý DNA với sodium bisulfite trong điều kiện
thích hợp, tỷ lệ biến đổi C khơng bị methyl hóa thành U mong đợi khoảng 99% [45].
Tuy nhiên, một số vùng nhỏ DNA nhiều bản copy có tỷ lệ C khơng bị methyl hóa đƣợc
biến đổi thấp [34]. Tỷ lệ biến đổi này cũng phụ thuộc vào chất lƣợng DNA [34]. DNA
lẫn protein có tỷ lệ biến đổi bởi sodium bisulfite thấp hơn DNA sạch. Protein lẫn trong
mẫu sẽ làm cho quá trình xử lý với sodium bisulfite xảy ra khơng hồn tồn. Các vị trí
khơng đƣợc biến đổi sẽ xuất hiện một cách ngẫu nhiên trên từng vùng hoặc từng vị trí

đơn lẻ [63].

11


Hình 1.4. Phƣơng pháp biến đổi DNA nhờ sodium bisulfite. (A) Quá trình biến đổi DNA nhờ
sodium bisulfite. Bƣớc 1: sự sulphonate hóa. Bƣớc 2: sự thủy phân loại gốc amine. Bƣớc 3:
loại gốc sulphonate. (B) Kết quả PCR với khuôn là DNA đã xử lý sodium bisulfite [66].

Việc biến đổi DNA nhờ sodium bisulfite chuyển gốc C không bị methyl hóa
thành U nhƣng gốc C bị methyl hóa đƣợc giữ ngun, do đó tạo các sợi khơng bổ sung
[9]. Điều này cho phép phân biệt đƣợc DNA bị methyl hóa và khơng bị methyl hóa
thơng qua phản ứng PCR [55]. Trong phản ứng PCR, uracil đƣợc khuếch đại nhƣ
thymine và các C bị methyl hóa vẫn khuếch đại nhƣ cytosine (Hình 1.4B) [9].
1.2.2. Kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu methyl MSP (Methylation-Specific PCR)
Kỹ thuật MSP đƣợc Herman và cs. mơ tả năm 1996, cho tới nay, nó trở thành
một trong những kỹ thuật phổ biến. Kỹ thuật phân tích này đƣợc phát triển dựa trên
phƣơng pháp biến đổi DNA nhờ sodium bisulfite [28]. Mồi MSP đƣợc thiết kế để
khuếch đại DNA bị methyl hóa. Sự đặc hiệu này đƣợc quyết định bởi nhiều vị trí CpG
trong trình tự mồi, thƣờng ở gần hoặc tại vị trí đầu 3’. Trong điều kiện của phản ứng
PCR, chỉ có sự khuếch đại DNA bị methyl hóa xảy ra. Kỹ thuật MSP thƣờng thiết kế

12


thêm cặp mồi thứ 2 để khuếch đại DNA không bị methyl hóa, vì thế khẳng định đƣợc
sự có mặt của khn đã đƣợc xử lý với sodium bisulfite (Hình 1.5) [34, 35]. Cặp mồi
đặc hiệu thiết kế cho DNA bị methyl hóa và cặp mồi đặc hiệu thiết kế cho DNA khơng
bị methyl hóa nên có cùng vị trí CpG trong trình tự [5]. Cả hai bộ mồi này thƣờng có
giá trị Tm tƣơng tự nhau, sai khác khơng q 50C (Hình 1.5). Kích thƣớc sản phẩm

MSP đƣợc khuếch đại khơng q 500 bp vì sự thối hóa DNA xảy ra sau quá trình xử
lý với sodium bisulfite [5]. Kỹ thuật điện di đƣợc sử dụng để phát hiện sản phẩm MSP,
so sánh độ sáng của băng điện di cho phép đánh giá tƣơng đối mức độ methyl hóa [34].

Hình 1.5. Các cặp mồi của kỹ thuật MSP [35].

Kỹ thuật MSP rất nhạy để sàng lọc các gen bị methyl hóa với khả năng phát
hiện 1 allen bị methyl hóa trong 1000 allen khơng bị methyl hóa [28]. Kỹ thuật này áp
dụng đƣợc trên các mẫu DNA bị giới hạn về số lƣợng và chất lƣợng ví dụ nhƣ DNA từ
mẫu đúc [28, 55]. Ngoài ra, kỹ thuật MSP khơng u cầu thiết bị đặc biệt, dễ sử dụng,
có thể áp dụng ở bất kỳ phịng thí nghiệm nào và đƣợc dùng rộng rãi cho việc phân tích
sự methyl hóa DNA tại nhiều vùng đặc hiệu [34]. Hiện nay, một số hãng cung cấp các
dung dịch cho phản ứng MSP nhƣ EpiTect MSP kit (Qiagen), CpG® Wizard BRCA1
Methylation (Millipore)…

13