(Luận văn thạc sĩ) sử dụng kỹ thuật fish để kểm tra sự hội nhập của gen IL 6 phân lập từ người trong tế bào gốc phôi gà chuyển gen

ĐẠI
ĐẠIHỌC
HỌCQUỐC
QUỐCGIA
GIAHÀ
HÀNỘI
NỘI

BÌA

TRƯỜNG
TRƯỜNGĐẠI
ĐẠIHỌC
HỌCKHOA
KHOAHỌC
HỌCTỰ
TỰNHIÊN
NHIÊN
-----------------------------------------

Nguyễn
NguyễnTiến
TiếnLung
Lung

SỬ
SỬDỤNG
DỤNGKỸ
KỸTHUẬT
THUẬTFISH
FISHĐỂ

ĐỂKIỂM
KIỂMTRA
TRA
SỰ
SỰHỘI
HỘINHẬP
NHẬPCỦA
CỦAGEN
GENIL–6
IL–6PHÂN
PHÂNLẬP
LẬPTỪ
TỪNGƯỜI
NGƯỜI
TRONG
TRONGTẾ
TẾBÀO
BÀOGỐC
GỐCPHƠI
PHƠIGÀ
GÀCHUYỂN
CHUYỂNGEN
GEN

LUẬN
LUẬNVĂN
VĂNTHẠC
THẠCSĨSĨKHOA
KHOAHỌC
HỌC

Hà
HàNội
Nội– –2013
2013


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Tiến Lung

SỬ DỤNG KỸ THUẬT FISH ĐỂ KIỂM TRA
SỰ HỘI NHẬP CỦA GEN IL–6 PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI
TRONG TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
Mã số: 60.42.0114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Lai Thành

Hà Nội – 2013


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cố GS.TS.
Nguyễn Mộng Hùng, ngun Trưởng phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Trung

tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, người đã sáng lập nên phịng thí nghiệm nơi tơi
học tập và làm việc hơn năm năm qua. Trong những ngày tháng ít ỏi được làm việc
cùng thầy, tôi đã học hỏi được rất nhiều điều, không chỉ kiến thức, thao tác thực
hiện thí nghiệm mà cả sự kiên trì, tìm tịi, chịu khó. Thầy đã truyền cho tơi niềm
đam mê nghiên cứu về công nghệ tế bào động vật, đặc biệt là trong lĩnh vực công
nghệ tế bào gốc.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Lai Thành, người thầy đã hướng dẫn
tơi thực hiện cả khóa luận tốt nghiệp Đại học và luận văn cao học. Thầy đã rất tận
tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm làm việc giúp tơi hồn
thành những nghiên cứu này. Trong q trình làm việc, tơi ln nhận được những
lời nhận xét, góp ý quý báu từ thầy để có thể thực hiện tốt nghiên cứu của mình.
Khơng những vậy, trong cuộc sống, tôi cũng luôn nhận được sự giúp đỡ của thầy.
Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, học viên và sinh viên phịng Cơng nghệ Tế
bào Động vật, đặc biệt là CN. Đinh Duy Thành đã chỉ dẫn, giúp đỡ trong thời gian
tôi thực hiện nghiên cứu này.
Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn tới các thầy cơ công tác tại bộ môn Sinh học Tế
bào cũng như các thầy cô trong Khoa Sinh học đã truyền đạt cho tơi những kiến
thức cơ sở để tơi có thể thực hiện được luận văn cũng như vận dụng trong cơng việc
sau này.
Tơi xin chân thành cảm ơn tới Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ
Enzyme và Protein – trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Viện Công nghệ Sinh học –
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Nghiên cứu Gia cầm
Thụy Phương – Viện Chăn nuôi Quốc gia đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành
luận văn này.


Tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân đã quan tâm, động
viên tinh thần trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Cuối cùng, nghiên cứu của tôi được thực hiện dựa trên kinh phí hỗ trợ từ đề
tài thuộc Trung tâm Nghiên cứu Châu Á, Đại học Quốc gia Hà Nội “Sử dụng kỹ

thuật FISH để kiểm tra sự hội nhập của gen IL–6 phân lập từ người trong tế bào gốc
phôi gà chuyển gen” do TS. Nguyễn Lai Thành làm Chủ nhiệm đề tài. Tôi xin chân
thành cảm ơn Trung tâm cũng như Chủ nhiệm đề tài.
Hà Nội, tháng 12 năm 2013

Nguyễn Tiến Lung


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Mục lục
MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
Chương 1 – TỔNG QUAN ...................................................................................... 3
1.1. CHUYỂN GEN Ở GÀ................................................................................ 3
1.1.1. Các phương thức chuyển gen vào tế bào........................................... 3
1.1.2. Các phương pháp tạo gà chuyển gen ................................................ 5
1.1.3. Những ứng dụng của gà chuyển gen ................................................10
1.2. KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH) ............................12
1.2.1. Nguyên lý........................................................................................12
1.2.2. Đầu dò cho phản ứng lai..................................................................13
1.2.3. Ưu điểm của kỹ thuật FISH .............................................................18
1.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật FISH ...........................................................19
1.3. INTERLEUKIN 6 Ở NGƯỜI ....................................................................22
1.3.1. Giới thiệu ........................................................................................22
1.3.2. Chức năng .......................................................................................23
1.3.3. Những ứng dụng lâm sàng...............................................................24
1.3.4. Gen mã hóa IL–6 ở người................................................................25
Chương 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................26

2.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT .............................................26
2.1.1. Đối tượng – vật liệu nghiên cứu ......................................................26
2.1.2. Dụng cụ và vật tư tiêu hao ...............................................................29
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu .........................................................................29
2.1.4. Hoá chất sử dụng.............................................................................30
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................................................32
2.2.1. Tổng hợp đầu dò gắn huỳnh quang cho phản ứng lai FISH..............32
2.2.2. Thu nhận tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người.......................34
2.2.3. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) ..................................38
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................40

Nguyễn Tiến Lung

i

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Mục lục

3.1. TỔNG HỢP ĐẦU DÒ HUỲNH QUANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP
PCR ........................................................................................................40
3.1.1. Thiết kế cặp mồi nhân đoạn gen IL – 6 ............................................40
3.1.2. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR ................................................46
3.1.3. Kết quả tổng hợp đầu dò bằng phản ứng PCR .................................49
3.2. THU NHẬN TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN IL–6 NGƯỜI .....50
3.2.1. Phân lập và nhân nuôi tế bào gốc phôi gà ........................................50
3.2.2. Thu nhận và duy trì tế bào gốc phơi gà chuyển gen .........................52

3.2.3. Kiểm tra sự có mặt gen chuyển trong tế bào bằng phản ứng PCR ....54
3.3. KẾT QUẢ LAI FISH PHÁT HIỆN GEN IL–6 TRONG cESCs ................55
3.4. THẢO LUẬN ...........................................................................................57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................62
PHỤ LỤC................................................................................................................ A

Nguyễn Tiến Lung

ii

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Danh mục hình minh họa

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA
Hình 1. Chu trình tái bản của retrovirus và cách thức sản xuất vector retrovirus ...... 4
Hình 2. Mơ hình chuyển gen thơng qua trung gian tế bào ở gà ................................ 8
Hình 3. Quy trình của kỹ thuật FISH ..................................................................... 12
Hình 4. Cấu trúc một số chất đánh dấu huỳnh quang thường được sử dụng ........... 14
Hình 5. Vị trí của các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào ở kỳ trung gian .................. 19
Hình 6. Kiểu nhân phổ của nhiễm sắc thể tủy xương bệnh nhân đa u tủy ............... 21
Hình 7. Một số ảnh hưởng của IL–6 trong cơ thể................................................... 23
Hình 8. Cấu trúc vector pLenti6/V5–DEST Gateway (ViraPower) của
Invitrogen ............................................................................................... 27
Hình 9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ............................................................................. 32
Hình 10. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi với cADN của gen IL–6 ......... 42

Hình 11. Kết quả xác định vị trí tương đồng giữa cADN và mARN gen IL–6 ....... 43
Hình 12. Kết quả kiểm tra vị trí chèn của gen IL–6 trên vector .............................. 44
Hình 13. Kết quả kiểm tra vị trí bắt cặp của đầu dị trên vector .............................. 45
Hình 14. Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp giữa đầu dò với hệ gen gà bằng
BLASTn ................................................................................................. 46
Hình 15. Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi và nồng độ ion Mg2+ tới hiệu
suất phản ứng PCR.................................................................................. 47
Hình 16. Kết quả giải trình tự nucleotide các sản phẩm PCR và so sánh với
trình tự đầu dị theo lý thuyết................................................................... 48
Hình 17. Kết quả điện di sản phẩm PCR tổng hợp đầu dị ...................................... 49
Hình 18. cESCs 24 giờ nuôi cấy in vitro sau khi phân lập...................................... 51
Hình 19. cESCs ni cấy trên lớp tế bào ni ........................................................ 52
Hình 20. Đánh giá ảnh hưởng của lentivirus tới sự sinh trưởng của cESCs ............ 53
Hình 21. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào chuyển gen ................................. 54
Hình 22. Kết quả phân tích PCR các mẫu tế bào qua các lần cấy chuyển ............... 55
Hình 23. Kết quả lai FISH trên tế bào gốc phôi gà chuyển gen IL–6 người............ 56

Nguyễn Tiến Lung

iii

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Danh mục bảng

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Một số chất đánh dấu huỳnh quang và thuốc nhuộm sử dụng trong

FISH ....................................................................................................... 15
Bảng 2. Vai trò của một số yếu tố chính của vector pLenti6/V5–DEST Gateway .. 28
Bảng 3. Dụng cụ và vật tư tiêu hao được sử dụng trong đề tài ............................... 29
Bảng 4. Các thiết bị nghiên cứu được sử dụng trong đề tài .................................... 29
Bảng 5. Các hóa chất được sử dụng trong đề tài .................................................... 30
Bảng 6. Thành phần phản ứng PCR tối ưu hóa điều kiện tổng hợp của mồi IL–6... 33
Bảng 7. Thành phần môi trường nuôi cấy cESCs ................................................... 35
Bảng 8. Thành phẩn phản ứng PCR phát hiện gen chuyển trong tế bào.................. 37
Bảng 9. Kết quả thiết kế cặp mồi sử dụng chương trình Primer3 ........................... 41

Nguyễn Tiến Lung

K20 Sinh học thực nghiệm
iv


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Bảng ký hiệu và chữ viết tắt

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Viết đầy đủ

ADN

Acid deoxyribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

BSA

Bovine serum albumin

cESCs

Chicken Embryonic Stem Cells

cADN

Complementary ADN

CMV

Cytomegalovirus

DAPI

4',6–diamidino–2–phenylindole

DIG

Digoxigenin

DNase

Deoxyribonuclease

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

FBS

Fetal Bovine Serum

FISH

Fluorescence in situ hybridization

HIV

Human Immunodeficiency Virus

IL–6

Interleukin – 6

LTR

Long Terminal Repeats

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PBS

Phosphate Buffered Saline

PCR

Polymerase Chain Reaction

PGCs

Primordial germ cells

RNase

Ribonuclease

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SSC

Saline – sodium citrate buffer

SSCs

Spermatogonial Stem Cells

Ta

Annealing template

Tm

Melting temperature

Nguyễn Tiến Lung

v

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Mở đầu
MỞ ĐẦU

Sử dụng động vật chuyển gen để sản xuất các loại protein dược phẩm là
hướng đi đã được quan tâm từ lâu. Trong lĩnh vực này, gia cầm chuyển gen đang
được chú ý đến với một số lợi thế vượt trội so với động vật có vú như thời gian tạo
dịng ngắn, trứng có mơi trường vơ trùng tự nhiên, thành phần protein lòng trắng
trứng đơn giản nên dễ tách sản phẩm chuyển gen,…. Tính đến nay, nhiều protein
dược phẩm tái tổ hợp ở người đã được nghiên cứu tạo ra từ gà chuyển gen, trong đó
một số sản phẩm đã bước vào giai đoạn thử nghiệm như kháng thể đơn dòng miR24
điều trị khối u ác tính, interferon β–1a chữa trị đa xơ cứng và interferon α–2a có
trong thuốc Roferon A chữa viêm gan C, ung thư máu. Những nghiên cứu về gà

chuyển gen gần đây tập trung chủ yếu vào phương pháp thông qua các tế bào gốc
phôi, với ưu điểm là lựa chọn được ngay từ đầu những tế bào mang gen chuyển
mong muốn trước khi tiêm chúng vào phơi nhận, do đó tiết kiệm được thời gian
cũng như chi phí cho q trình sàng lọc cơ thể chuyển gen từ bố mẹ khảm.
Để tạo động vật chuyển gen hiệu quả thì cần phải có các hệ thống vector đủ
mạnh để chuyển được gen mong muốn với hiệu suất cao, duy trì ổn định trong cơ
thể vật chủ. Hệ thống được sử dụng thường xuyên nhất dựa vào retrovirus (virus
ARN) trong đó sử dụng các enzyme của bản thân và bộ máy phiên mã trong tế bào
chủ để sao chép hệ gen của chúng, sau đó tích hợp nó vào nhiễm sắc thể vật chủ
trong quá trình phân bào. Gần đây, một nhóm nhỏ của retrovirus là lentivirus đã
được coi như một công cụ hứa hẹn trong chuyển gen. Chúng mang đầy đủ các ưu
điểm của retrovirus, hơn nữa cịn có khả năng chèn gen vào tế bào khơng phân chia,
loại vector này đặc biệt hiệu quả đối với tế bào gốc phôi do loại tế bào này rất khó
chuyển gen bằng các phương pháp khác.
Trong q trình tạo động vật chuyển gen, các bước sàng lọc tế bào hay cơ thể
mang gen mong muốn đóng vai trị rất quan trọng. Gen chuyển cần được cài vào
ADN trong nhân tế bào để đảm bảo di truyền cho thế hệ sau qua con đường sinh sản
hữu tính, đồng thời phải được duy trì bền vững qua nhiều thế hệ động vật. Ngoài ra,

Nguyễn Tiến Lung

1

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Mở đầu

gen chuyển phải nằm ở vị trí thích hợp: trong vùng ADN hoạt động, không chèn
vào giữa gen cấu trúc hay các vùng ADN giữ chức năng điều hịa,... Vì vậy, các kỹ
thuật nhằm xác định vị trí gen trong bộ nhiễm sắc thể đã được phát triển, trong số
đó ít tốn kém và dễ thực hiện nhất là kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescence
in situ hybridization – FISH). Cơ sở của kỹ thuật FISH dựa trên sự bắt cặp chính
xác giữa giữa ADN đích và đầu dị đánh dấu huỳnh quang có trình tự tương đồng.
Đây là một trong những kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử và
chẩn đoán nhằm phát hiện những bất thường trên nhiễm sắc thể, nghiên cứu cấu
trúc và chức năng tế bào, lập bản đồ kiểu nhân, xây dựng hệ thống phát sinh lồi,...
Có thể nói FISH là cầu nối giữa lĩnh vực di truyền học cổ điển với di truyền học
hiện đại, kết hợp sự chính xác của các kỹ thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực
quan từ kính hiển vi.
Ở Việt Nam, một số bệnh viện lớn như Bệnh viện K, Bệnh viện Trung ương
Quân đội 108, Bệnh viên Nhi Trung ương,... đã sử dụng kỹ thuật này để chẩn đoán
một số bệnh di truyền ở người. Tuy nhiên trong nghiên cứu cơ bản, việc ứng dụng
nó cịn rất hạn chế. Đến nay, chưa có báo cáo nào về việc sử dụng để đánh giá sự
chèn gen ngoại lai vào hệ gen của tế bào động vật. Mặt khác, trong những nghiên
cứu trên, đầu dò sử dụng đều là các sản phẩm thương mại, hoặc được tự thiết kế
nhưng đặt tổng hợp tại các hãng nổi tiếng, chưa tự tổng hợp tại phịng thí nghiệm sử
dụng chúng.
Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá về tiềm năng ứng
dụng vector chuyển gen lentivirus đối với tế bào gốc phôi gà, sử dụng kỹ thuật
FISH để phát hiện vị trí gen chuyển IL–6 trong tế bào gốc phơi gà chuyển gen, từ
đó tạo tiền đề cho việc tạo gà chuyển gen thông qua tế bào gốc. Nghiên cứu này
cũng góp phần phát triển kỹ thuật FISH trong nghiên cứu cơ bản ở Việt Nam.

Nguyễn Tiến Lung

2

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Chương 1 – Tổng quan

Chương 1 – TỔNG QUAN
1.1. CHUYỂN GEN Ở GÀ
1.1.1. Các phương thức chuyển gen vào tế bào
1.1.1.1. Chuyển gen sử dụng vector virus
Các hệ thống chuyển gen hiệu quả nhất hiện nay khai thác tiềm năng của
virus động vật đã tiến hóa hàng triệu năm qua. Những vector virus được tạo ra bằng
cách thay thế một hoặc một số gen của chúng bằng gen mong muốn. Ưu điểm của
hệ thống chuyển gen sử dụng virus là hiệu suất chuyển gen khá cao và ổn định. Tuy
nhiên, chúng có nhược điểm về độ an toàn, cũng như phản ứng miễn dịch của vật
chủ loại bỏ tác nhân virus. Những nhược điểm này đang dần được khắc phục trong
những vector tái bản thiếu thế hệ mới [58].
Đối với gia cầm, chuyển gen bằng retrovirus và lentivirus thu được nhiều
thành công nhất trừ trước đến nay. Retrovirus có vật chất di truyền là ARN, mang
ba gen chính là gag (mã hóa kháng ngun kết hợp nhóm), env (mã hóa protein vỏ)
và pol (mã hóa enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase và enzyme hội nhập
intergrase). Sau khi thâm nhiễm vào tế bào chủ (đang trong giai đoạn phân chia),
ARN phiên mã ngược thành ADN, từ đó hợp nhất với ADN tế bào chủ, trở thành
một bộ phận ổn định và hoạt động như các gen khác trong tế bào, có thể di truyền
lại cho các thế hệ sau. Nhờ tín hiệu đóng gói tương thích (), ARN phiên mã từ hệ
gen virus kết hợp trở lại với các protein virus (đều được tạo ra nhờ bộ máy tổng hợp
của tế bào chủ), tạo nên các hạt virus mới (Hình 1A). Khi thiết kế vector, người ta
chỉ sử dụng tín hiệu  và hai trình tự dài lặp lại ở hai đầu (long terminal repeat –
LTR), gen chuyển được chèn vào giữa hai LTR này. Vector cần có một dịng tế bào

đóng gói chứa retorvirus cải biến, có khả năng tạo ra các protein virus nhưng khơng
có tín hiệu  (Hình 1B). Nhờ vậy, các hạt virus mới được sinh ra chỉ chứa vector
chuyển gen quan tâm, khơng có khả năng tạo nên các virus khác [5, 72, 74]. Gần
đây, một nhóm nhỏ của retrovirus là lentivirus cũng được sử dụng rộng rãi trong

Nguyễn Tiến Lung

3

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Chương 1 – Tổng quan

chuyển gen. Chúng mang đầy đủ các ưu điểm của retrovirus, hơn nữa cịn có khả
năng thâm nhiễm vào tế bào khơng phân chia [58, 74].

Hình 1. Chu trình tái bản của retrovirus và cách thức sản xuất vector retrovirus
Chu trình tái bản của retrovirus (hình trái): Virus xâm nhập vào tế bào chủ, sử dụng
enzyme phiên mã ngược để tổng hợp ADN từ ARN của mình; ADN này hội nhập vào hệ
gen tế bào, sử dụng bộ máy tổng hợp của tế bào để phiên mã thành ARN và dịch mã tạo
các protein virus; các protein này đóng gói ARN lại tạo thành các hạt virus mới và giải
phóng vào mơi trường. Khi sản xuất vector retrovirus (hình phải), vector đóng gói mang
các gen mã hóa protein virus nhưng khơng có tín hiệu đóng gói (–), nên vector tạo thành
chỉ chứa cấu trúc gen chuyển trong vector retrovirus (chứa tín hiệu đóng gói +) [72].

1.1.1.2. Chuyển gen khơng dùng virus
Việc chuyển gen không sử dụng virus trên tế bào động vật đã được thực hiện

từ cách đây hơn 40 năm, chúng có ưu điểm về độ an tồn, khơng gây miễn dịch và
đơn giản, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn nhiều so với khi sử dụng virus. Những
phương pháp được sử dụng nhiều hiện nay bao gồm các phương pháp vật lý (vi

Nguyễn Tiến Lung

4

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Chương 1 – Tổng quan

tiêm, xung điện, súng bắn gen,...) hoặc sử dụng hóa chất (calcium phosphate,
DEAE–dextran, liposome,...) [77].
Phương pháp vật lý được sử dụng thường xuyên nhất là sử dụng xung điện
(electroporation). Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên đặc điểm màng tế bào hoạt
động như một tụ điện khơng cho dịng điện đi qua. Người ta sử dụng hiệu điện thế
cao gây sốc trong một thời gian ngắn làm tăng tạm thời điện thế màng tế bào lên
xấp xỉ 1V. Kết quả là xảy ra sự tái tổ chức các thành phần trên màng một cách đáng
kể, tạo ra những kênh vận chuyển nước hoặc các lỗ. ADN thẩm thấu vào trong tế
bào qua đó [34, 66]. Phương pháp này có những ưu điểm như chuyển gen hiệu quả,
áp dụng được với đa số các loại tế bào, có thể tiến hành với mơ cịn ngun vẹn
[77]. Tuy nhiên, xung điện ảnh hưởng lớn tới khả năng sống sót và sinh trưởng của
tế bào (sự chuyển nhiễm tối ưu có thể đạt được trong điều kiện gây chết tới 50% số
lượng tế bào) [61, 77].
Các phương pháp hóa học đều có bản chất là sự liên kết giữa phần mang điện
tích dương của hóa chất sử dụng với gốc phosphate âm của bộ khung acid nucleic,

hình thành phức hệ đại phân tử (polyplex). Phức hệ này được đưa vào trong tế bào
chủ yếu bằng con đường thực bào. Vì vậy, phương thức này có ưu điểm là khơng
ảnh hưởng lớn tới tế bào, tuy nhiên thao tác thực hiện tương đối phức tạp, đồng thời
nhiều loại tế bào khó chuyển nhiễm bằng những hóa chất này. Kết tủa calcium
phosphate và DEAE–dextran được sử dụng sớm nhất và hiện nay vẫn còn phổ biến,
ngồi ra cịn nhiều loại hóa chất khác như các phân tử polycationic (dendrimers
polyamidoamine), polypeptide (polylysine, polyornithine, các dạng kết hợp giữa
chúng) và polyethylenimine [77].
1.1.2. Các phương pháp tạo gà chuyển gen
1.1.2.1. Vi tiêm trực tiếp ADN vào đĩa phôi giai đoạn sớm
Vi tiêm ADN ngoại lai vào nhân nguyên của trứng mới thụ tinh là phương
pháp đầu tiên được sử dụng để tạo động vật có vú chuyển gen và hiện nay vẫn rất
phổ biến. Trên gà, phương pháp này cũng thu được thành công nhất định: Love và

Nguyễn Tiến Lung

5

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Chương 1 – Tổng quan

cộng sự vi tiêm trực tiếp ADN vào hợp tử, thu được bảy cá thể gà chuyển gen sống
sót đến khi trưởng thành, trong đó 3,4% gà con thế hệ tiếp theo nhận gen chuyển từ
một cơ thể gà trống thu được [53]. Tuy vậy, phương pháp này bộc lộ rất nhiều
nhược điểm. Trước hết, phương pháp này không thể thao tác với số lượng lớn, do
mỗi ngày chỉ có một quả trứng rụng và việc kích thích siêu bài nỗn ở gà khó hơn

nhiều so với ở động vật có vú. Thêm vào đó, để thu được mỗi trứng mới thụ tinh,
người ta phải giết một con gà mái, đồng thời trứng sau vi tiêm phải được bao bọc
trong lớp lịng trắng và vỏ đá vơi như tự nhiên để có thể phát triển [18, 51].
Các nhà nghiên cứu đã thay đổi phương pháp này phù hợp với gia cầm bằng
cách tiếp cận hai giai đoạn: đĩa phôi của trứng chưa ấp (giai đoạn X theo hệ thống
phân chia của Eyal–Giladi, Kochav [41]) và phôi sau khoảng 55–72 giờ ấp (giai
đoạn 17–20 theo hệ thống phân chia của Humberger và Hamilton [27]). Kwon và
cộng sự tạo gà chuyển gen mã hóa protein phát huỳnh quang màu xanh lá cây tăng
cường (Enhanced Green Fluorescence Protein – EGFP) bằng cách vi tiêm vector
retrovirus vào đĩa phơi giai đoạn X, trong đó nhiều bộ phận như đầu, chi, mắt và
một số nội tạng đều biểu hiện EGFP [43]. Nhóm nghiên cứu của Kamihira đã chứng
minh gen chuyển có khả năng biểu hiện cao khi được tiêm vào phôi 55–60 giờ ấp.
Họ tiêm vector retrovirus chứa các gen mã hóa chuỗi đơn Fv và Fc của globulin
miễn dịch G1 của người vào phôi gà, tạo được gà chuyển gen biểu hiện protein này
trong huyết thanh và lòng trắng trứng (khoảng 5,6 mg/ml) [36]. Ở Việt Nam, năm
2010, Nguyễn Thị Hồng Hạnh và cộng sự cũng đã báo cáo về việc tạo gà chuyển
gen bằng phương pháp vi tiêm vector vào đĩa phôi giai đoạn X, trong đó gen chuyển
được phát hiện trong máu gà con sinh ra bằng phương pháp PCR [2].
1.1.2.2. Chuyển gen qua tinh trùng
Đây là phương pháp dựa trên khả năng của tinh trùng có thể lưu giữ ADN
ngoại sinh và chuyển nó vào trứng trong q trình thụ tinh. Tinh trùng được ủ trực
tiếp với ADN trần, ngoài ra người ta có thể tăng cường hiệu quả q trình này bằng
cách sử dụng xung điện hay các chất hóa học như liposome, calcium phosphate,

Nguyễn Tiến Lung

6

K20 Sinh học thực nghiệm

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Chương 1 – Tổng quan

DEAE–dextran. Tinh trùng mang ADN được thụ tinh nhân tạo, thụ tinh trong ống
nghiệm hay có thể được tiêm trực tiếp vào trứng. Lợi thế lớn nhất của phương pháp
này là hiệu quả chuyển gen cao, giá thành thấp, dễ thực hiện [39, 47].
Sử dụng phương pháp này, năm 2000, Harel-Markowitz và cộng sự đã tạo
được gà chuyển gen mã hóa EGFP và hormone kích thích nang trứng (follicle
stimulating hormone – FSH) của người, trong đó tinh trùng được ủ với plasmid và
một loại liposome là Lipofectamine®. ADN ngoại lai đã được phát hiện trong mẫu
mô gan, da, tim và bạch huyết bằng kỹ thuật PCR, cũng như được chứng minh biểu
hiện bằng RT–PCR và miễn dịch phóng xạ [28]. Mới nhất, năm 2013, nhóm nghiên
cứu của Samoylov đã tạo gà chuyển gen mã hóa nhân tố kích tích tạo quần lạc bạch
cầu hạt (Granulocyte Colony–Stimulating Factor – gcsf) của người, sử dụng
Lipofectamin® 2000 để tăng hiệu quả hấp thu ADN của tinh trùng. Kết quả có
33,3% gà con sinh ra mang gen chuyển mong muốn, với hàm lượng protein gcsf
trong huyết thanh đạt khoảng 50–220 pg. Sử dụng những gà trống này thụ tinh nhân
tạo với gà mái bình thường đã thu được 37,5% gà con thế hệ tiếp theo mang gen
chuyển [73]. Ở Việt Nam, Lê Thị Tuyết và cộng sự đã công bố nghiên cứu chuyển
gen qua tinh trùng ở gà năm 2010, trong đó phát hiện được gen chuyển ở nhiều mô,
cơ quan khác nhau của gà con thế hệ tiếp theo [10].
1.1.2.3. Chuyển gen thông qua trung gian tế bào
Các phương pháp trên đều có nhược điểm là gen chuyển được tích hợp ngẫu
nhiên vào nhiễm sắc thể của phơi, do đó khơng đánh giá sớm được ảnh hưởng của
vị trí chèn gen đến sức sống của gà con sinh ra. Gần đây, người ta sử dụng các tế
bào nuôi cấy in vitro làm trung gian cho q trình tạo gà chuyển gen, nhờ đó sàng
lọc ngay từ đầu những tế bào mang gen chuyển ở vị trí mong muốn, giảm thời gian
cũng như chi phí đánh giá và chọn lọc kiểu hình cơ thể biến đổi di truyền [6, 88].

Những loại tế bào được quan tâm gồm: tế bào gốc phôi, tế bào sinh dục nguyên
thủy và tế bào gốc tinh nguyên bào (Hình 2).

Nguyễn Tiến Lung

7

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Chương 1 – Tổng quan

Hình 2. Mơ hình chuyển gen thơng qua trung gian tế bào ở gà
Các tế bào gốc phôi (ESCs) hoặc tế bào sinh dục nguyên thủy (PGCs) thu nhận từ phôi
được chuyển nhiễm với vector mang gen mong muốn, những tế bào mang gen chuyển được
sàng lọc và vi tiêm trở lại phơi nhận, từ đó thu được gà khảm. Phương pháp tương tự cũng
được tiến hành với tế bào gốc tinh nguyên bào (SSCs) thu nhận từ tinh hoàn gà trống,
những tế bào mang gen chuyển được tiêm trở lại vào tinh hoàn gà trống đã triệt sản [51].

Nguyễn Tiến Lung

8

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Chương 1 – Tổng quan

Tế bào gốc phôi (Embryonic Stem Cell – ESCs) là những tế bào đa tiềm
năng chưa biệt hoá, trong điều kiện thích hợp có khả năng biệt hóa thành tất cả các
loại tế bào có nguồn gốc từ ba lá phơi. Bên cạnh đó, ESCs có khả năng tự duy trì và
nhân lên trong thời gian dài. Vì vậy chúng trở thành công cụ hữu hiệu trong việc tạo
động vật chuyển gen [4, 46]. Năm 1990, Petitte đã lần đầu tiên tạo được gà khảm
bằng phương pháp vi tiêm các tế bào đĩa phôi vào phôi giai đoạn X [68]. Đến năm
2006, Wang đã chuyển gen thành công vào ESCs bằng liposome và vector virus. Sử
dụng các tế bào này tiêm vào phơi nhận, nhóm nghiên cứu đã thu được gà con mang
gen chuyển ở hầu hết các mô cơ thể với một bản sao duy nhất. Tuy nhiên, sự đóng
góp của các tế bào biến đổi di truyền vào dịng tinh là khơng thể hoặc hiệu suất rất
thấp [92]. Đến nay, chưa có báo cáo nào về việc ESCs sau khi ni cấy q một
tuần có thể đóng góp vào dịng sinh dục của gà khảm, có thể việc nuôi cấy in vitro
đã làm ESCs mất dần khả năng này [51]. Ở Việt Nam, năm 2012, Nguyễn Lai
Thành và cộng sự cũng đã chuyển gen vào ESCs sử dụng vector lentivirus, sau khi
tiêm chúng vào phôi nhận đã thu được gà con mang gen ở mô ruột. Tuy vậy các
phôi được vi tiêm thường chết ở giai đoạn sớm của q trình phát triển, chỉ có 10%
trong số đó nở thành gà con, có thể do gen chuyển chèn vào những vị trí gen hoạt
động, ảnh hưởng tới sức sống của phôi [6].
Một cách tiếp cận khác là hướng đến các tế bào sinh dục nguyên thủy
(Primordial Germ Cells – PGCs). Đây là những tế bào đầu dòng của trứng và tinh
trùng, có thể tìm thấy trong liềm mầm phơi giai đoạn 7–10 (sau 23–38 giờ ấp), sau
đó chúng lưu thơng trong mạch máu phơi, đến các vị trí sau này hình thành tuyến
sinh dục trưởng thành [62]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng PGCs sau khi
nuôi cấy in vitro vẫn có thể hội nhập được vào phơi nhận, đóng góp vào q trình
tạo trứng và tinh trùng. Van de Lavoir và cộng sự đã phân lập PGCs từ mạch máu
phôi, chuyển gen và nuôi cấy trong thời gian dài (lên tới 209 ngày) vẫn có thể đóng
góp vào sự hình thành các tế bào sinh dục khi được tiêm vào phôi giai đoạn X [87].
Tuy nhiên, việc thu nhận PGCs từ máu của phôi gà gặp nhiều khó khăn do chúng

chiếm tỷ lệ rất thấp (0,05% tổng số tế bào máu) [65]. Một số nhóm nghiên cứu khác

Nguyễn Tiến Lung

9

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Chương 1 – Tổng quan

đã tìm cách phân lập loại tế bào này từ các tuyến sinh dục phôi. Shiue và cộng sự đã
thu nhận PGCs từ phôi 5,5 ngày ấp (giai đoạn 28). Những tế bào này trải qua 281
ngày nuôi cấy vẫn duy trì các đặc điểm đặc trưng, và khi được tiêm vào động mạch
chủ lưng của phôi 2,5 ngày ấp (giai đoạn 17) vẫn có khả năng tạo thành gà khảm
dòng sinh dục [81]. Motono và cộng sự cũng đã hoàn thiện phương pháp tạo gà
chuyển gen bằng PGCs thu nhận từ phơi 2,5 và 5,5 ngày ấp, trong đó chứng minh
rằng khả năng truyền lại gen chuyển của gà mái khảm tốt hơn so với gà trống [60].
Ngoài ra, một số phịng thí nghiệm đã hướng đến sử dụng tế bào gốc tinh
nguyên bào (Spermatogonial Stem Cells – SSCs) làm trung gian cho quá trình
chuyển gen. SSCs mang những đặc điểm đặc trưng của tế bào gốc đa tiềm năng,
chiếm khoảng 0,33–0,44% số lượng tế bào trong tinh hoàn gà con 4 tuần tuổi,
0,029–0,072% ở gà trưởng thành 24 tuần tuổi [35]. Sử dụng những tế bào này tiêm
vào ống sinh tinh của gà nhận, người ta đã thu được gà trống khảm trong tinh hoàn
với hiệu suất lên tới 50% [67]. Sự phát triển của phương pháp này giúp giảm thiểu
đáng kể thời gian tạo gà chuyển gen, minh chứng là thời gian từ khi chuyển nhiễm
vector vào tế bào cho đến khi gà khảm thế hệ tiếp theo được nở ra chỉ khoảng 38–
45 ngày (tiêm vào gà trưởng thành) cho đến 137–188 ngày (tiêm vào gà con) [49].

1.1.3. Những ứng dụng của gà chuyển gen
1.1.3.1. Tạo mơ hình nghiên cứu y – sinh học
Gà được coi là hệ thống thử nghiệm quan trọng trong các lĩnh vực sinh học
phát triển, miễn dịch học, vi sinh vật học. Nhiều khám phá có ý nghĩa sinh học
mang tính lịch sử (ví dụ như virus có khả năng gây nên khối u, hay các tế bào B là
một nhóm nhỏ của tế bào lympho) được phát hiện lần đầu tiên ở gà [16]. Các dịng
gà chuyển gen có thể sử dụng để khám phá chức năng của nhiều gen trong q trình
phát triển phơi thai của động vật có vú nói chung. Năm 2006, nhóm nghiên cứu
thuộc Đại học Sheffield (Anh) đã đánh giá khả năng bất hoạt gen của các ARN can
thiệp (iARN) trên mơ hình phơi gà. Kết quả, các iARN có khả năng làm im lặng
một số gen trong khu vực đặc hiệu của hệ thống thần kinh phôi, với hiệu suất đạt

Nguyễn Tiến Lung

10

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Chương 1 – Tổng quan

trên 90% [20]. Năm 2010, McGrew và cộng sự đã chứng minh một trong những yếu
tố kiểm soát biểu hiện gen ở chuột nằm trên locus chuỗi nhẹ myosin 1/3 (myosin
light chain 1/3 – MLC1/3) có khả năng hoạt động ở phơi gà. Yếu tố này có thể điều
khiển sự biểu hiện của gen lacZ trong sợi cơ xương tương tự như ở chuột. Đây là
một minh chứng cho thấy các yếu tố kiểm soát biểu hiện của một số gen trong q
trình phát triển có thể tương đồng giữa các lồi, chúng có thể hoạt động trong mơ
hình phát triển tương đương [56].

1.1.3.2. Sản xuất protein tái tổ hợp
Việc sử dụng động vật có vú (bị, cừu, dê,…) chuyển gen làm “lò phản ứng
sinh học” đã sản xuất được nhiều protein dược liệu từ sữa, như –1 antitrypsin,
calcitonin, interleukin–2, erithropoeietin,… Sản lượng sản phẩm thu được từ động
vật có vú rất ấn tượng, đối với bò là khoảng 8.000 lít sữa, với lượng protein tái tổ
hợp có thể lên tới 40 kilogam mỗi năm [33].
Gần đây, gà chuyển gen được quan tâm hơn với nhiều lợi thế. Thứ nhất,
chúng có thời gian tạo dịng ngắn, chi phí chăn ni cũng thấp hơn so với các động
vật có vú khác. Thứ hai, trứng gà rất giàu protein, trong đó hơn một nửa (54%)
được tạo bởi sự biểu hiện của gen duy nhất ovalbumin, do đó dễ dàng sản xuất
lượng lớn protein tái tổ hợp với độ tinh khiết cao. Thứ ba, trứng gà chứa nhiều chất
ức chế protease tự nhiên và môi trường vô trùng tạo điều kiện lý tưởng cho việc ổn
định hoạt tính sinh học của protein tái tổ hợp. Ngồi ra, mơ hình glycosyl hóa nhiều
protein ở người giống với gà hơn động vật có vú, đồng thời một số protein gây độc
cho động vật có vú có thể được tạo ra ở gà [18, 52].
Tính đến nay, nhiều protein dược phẩm tái tổ hợp ở người đã được nghiên
cứu tạo ra từ mơ hình này, như chuỗi đơn Fv và Fc của globulin miễn dịch G1 [36],
hormone kích thích nang trứng (FSH) [28], nhân tố kích tích tạo quần lạc bạch cầu
hạt (gcsf) [73],... Một số sản phẩm đã bước vào giai đoạn thử nghiệm như kháng thể
đơn dịng miR24 điều trị khối u ác tính, interferon β–1a chữa trị đa xơ cứng và
interferon α–2a có trong thuốc Roferon A chữa viêm gan C, ung thư máu [52].

Nguyễn Tiến Lung

11

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Chương 1 – Tổng quan

1.2. KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH)
1.2.1. Nguyên lý
Cũng như các kỹ thuật lai acid nucleic khác, kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ
(Fluorescence In Situ Hybryzation – FISH) dựa trên đặc tính biến tính và hồn
ngun của acid nucleic [85]. Trong phản ứng lai, sự tương đồng trình tự giữa đầu
dị và ADN đích cho phép chúng kết hợp chính xác với nhau tạo thành phức hệ lai.
Tín hiệu huỳnh quang gắn trên đầu dị được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh
quang, cho phép phát hiện và xác định vị trí của gen đích trên mẫu nghiên cứu
(Hình 3) [94].

Hình 3. Quy trình của kỹ thuật FISH

Nguyễn Tiến Lung

12

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Chương 1 – Tổng quan

Mẫu phân tích (máu ngoại vi, tế bào ni cấy, tiêu bản cố định mơ,...) được
biến tính ADN và ủ với đầu dị đánh dấu có trình tự đặc hiệu. ADN cạnh tranh
(thường sử dụng ADN tinh trùng cá hồi) và thêm vào hỗn hợp lai nhằm giảm liên
kết không đặc hiệu giữa đầu dị và ADN đích. Sau khi lai và rửa nguyên liệu thừa,

mẫu được phát hiện trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua kháng thể thứ cấp đặc hiệu
gắn huỳnh quang [15, 94].
1.2.2. Đầu dò cho phản ứng lai
1.2.2.1. Đầu dò đánh dấu trực tiếp và gián tiếp
Những nghiên cứu đầu tiên về kỹ thuật lai tại chỗ được công bố vào cuối
những năm 1960, đều sử dụng đầu dị đánh dấu phóng xạ (32P, 35S, 3H), tuy nhiên
các chất phóng xạ có nhiều nhược điểm về độ an tồn, thời gian và chi phí tiến
hành. Từ những năm 1980, sau thí nghiệm lai sử dụng đầu dò ADN gắn biotin và
kháng thể đánh dấu huỳnh quang của Langer và Safer, các chất đánh dấu huỳnh
quang đã dần thay thế các chất phóng xạ. Đầu dị huỳnh quang thể hiện một số ưu
điểm nổi bật hơn hẳn so với loại đầu dị phóng xạ: độ bền và độ an tồn cao, ít gây
hại với mơi trường và con người, kết quả lai thu được chính xác, đánh dấu được với
nhiều loại thuốc nhuộm phát xạ tại những bước sóng khác nhau cho phép phát hiện
nhiều trình tự đích chỉ với một lần lai. Đặc biệt, sử dụng chất đánh dấu huỳnh quang
thu được tín hiệu ở chính xác vị trí bắt cặp, trong khi các đầu dị phóng xạ có thể chỉ
cho phép quan sát được tín hiệu trong ảnh chụp nhiễu xạ cách vị trí bắt cặp một
khoảng nhất định. Có hai loại đầu dị huỳnh quang theo phương pháp phát hiện vị
trí lai: trực tiếp và gián tiếp [59].
Trong phương pháp gián tiếp, các phân tử đánh dấu (như biotin, digoxigenin
– DIG, dinitrophenol) được gắn vào đầu dị, sau đó mẫu lai được phát hiện bằng
kháng thể thứ cấp đánh dấu huỳnh quang tương ứng. Hệ thống phổ biến nhất hiện
nay sử dụng biotin (Hình 4), được phát triển bởi David Ward và cộng sự từ năm
1981 [44]. Đầu dò gắn biotin sau phản ứng lai được phát hiện bởi nhiều thuốc thử
khác nhau, thường sử dụng nhất là streptavidin và avidin do chúng có khả năng liên

Nguyễn Tiến Lung

13

K20 Sinh học thực nghiệm

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Chương 1 – Tổng quan

kết với biotin tốt nhất (trong đó streptavidin được ưa thích hơn do điểm đẳng điện
gần như trung tính giúp giảm liên kết khơng đặc hiệu [59]. Ngồi hệ thống sử dụng
biotin, các đầu dị gắn DIG (Hình 4) cũng thường xuyên được sử dụng. DIG là
steroid có nguồn gốc duy nhất từ hoa và lá của một số thực vật chi Digitalis (như D.
purpureaand, D. lanata), do đó kháng thể kháng DIG hầu như không gắn kết với
các vật liệu sinh học khác. Trong lai FISH, các kháng thể kháng DIG có thể được
kết hợp với alkaline phosphatase, peroxydase, Rhodamine,… [31]. Phương pháp sử
dụng đầu dị gián tiếp có ưu điểm là tạo ra các tín hiệu huỳnh quang cường độ cao,
nhưng chúng gặp bất lợi khi cần thêm bước ủ để liên kết phức hệ lai và kháng thể
thứ cấp gắn huỳnh quang [59].

Hình 4. Cấu trúc một số chất đánh dấu huỳnh quang thường được sử dụng

Đối với phương pháp trực tiếp, các phân tử báo cáo được gắn trực tiếp vào
đầu dị và từ đó có thể quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ngay sau phản ứng
lai mà không cần thêm bước ủ kháng thể thứ cấp. Những chất huỳnh quang thường
được sử dụng trong trường hợp này là các hợp chất thuộc các nhóm coumarin,
fluorescein, rhodamine và cyanine (Bảng 1). Ưu điểm của phương pháp này là thao
tác đơn giản hơn phương pháp gián tiếp, hiện tượng nhiễu nền thấp. Tuy nhiên, tín

Nguyễn Tiến Lung

14

K20 Sinh học thực nghiệm


Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Chương 1 – Tổng quan

hiệu thu được có cường độ yếu hơn. Người ta có thể cái tiến bằng cách sử dụng
thêm kháng thể thứ cấp gắn chất phát huỳnh quang mạnh, khi đó nó khơng khác
phương pháp phát hiện gián tiếp như đã trình bày ở trên [59].
Bảng 1. Một số chất đánh dấu huỳnh quang và thuốc nhuộm sử dụng trong FISH

Huỳnh quang

Ex (nm) Em (nm)

Các chất đánh dấu
7–Amino–4–methylcoumarin–3–acetic acid, NHS (AMCA)

354

411

7–Diethylaminocoumarin–3–carboxylic acid, NHS

432

472

Pacific Blue™ , NHS

416

451

Fluorescein–5/6–isothiocyanate (FITC)

494

519

Tetramethylrhodamine–5/6–isothiocyanate (TRITC)

544

572

Oregon Green® 488 isothiocyanate

493

520

Rhodamine Green™ carboxylic acid, NHS

504

532

Alexa Fluor® 488

494

519

Alexa Fluor® 568

577

602

Alexa Fluor® 594

590

615

Texas Red® sulfonyl chloride

587

602

Cy3™

550

570

Cy5™

649

670

4',6–Diamidino–2–phenylindole (DAPI)

367

452

Propidium iodide (PI)

543

614

Các thuốc nhuộm ADN

Ex: đỉnh hấp thụ; Em: đỉnh phát quang; NHS: N–Hydroxysuccinimidyl Ester
Gần đây, người ta có thể sử dụng kết hợp nhiều đầu dị gắn các chất huỳnh
quang khác nhau, từ đó thu được nhiều tín hiệu khác nhau trên cùng một mẫu lai.
Phương pháp này được ứng dụng hiệu quả khi phân tích kiểu nhân sinh vật [59].

Nguyễn Tiến Lung

15

K20 Sinh học thực nghiệm

Luận văn thạc sĩ khoa học 2013

Chương 1 – Tổng quan

1.2.2.2. Các phương pháp đánh dấu đầu dò
Ba phương pháp thơng dụng được sử dụng để đánh dấu đầu dị là dịch
chuyển điểm đứt (nick translation), kéo dài mồi ngẫu nhiên (random primed) và
PCR. Cả ba phương pháp này đều sử dụng hoạt tính enzyme để gắn deoxyribo–
nucleotide triphosphate đánh dấu lên phân tử đầu dò.
Phương pháp dịch chuyển điểm đứt
Phương pháp dịch chuyển điểm đứt sử dụng đồng thời hoạt tính của hai loại
enzyme là ADN polymerase và DNase. Đầu tiên, DNase I tạo ra một điểm đứt trên
phân tử ADN làm bộc lộ đầu 3’–OH. Điểm đứt được dịch chuyển dần nhờ hoạt tính
5’ – 3’ exonuclease của enzyme ADN polymerase I. Trong khi đó, enzyme ADN
polymerase I bám vào đầu 3’–OH và tổng hợp kéo dài chuỗi nhờ hoạt tính 5’ – 3’
polymerase Klenow của nó. Trong suốt quá trình tổng hợp, nucleotide đánh dấu
được bổ sung vào hỗn hợp phản ứng sẽ thay thế một trong số các phân tử dNTP và
được cài nhập vào sợi ADN đang được tổng hợp, kết quả là tạo thành phân tử đầu
dò được đánh dấu. Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong đánh dấu đầu
dò cho FISH, với ưu điểm là tạo ra được đầu dò có kích thước tối ưu bằng cách điều
chỉnh nồng độ DNase. Phản ứng đánh dấu thực hiện tối ưu trong 60–90 phút, với
kích thước đầu dị khoảng 200–500 bp [21, 22, 59].
Phương pháp tổng hợp kéo dài mồi ngẫu nhiên
Phương pháp tổng hợp kéo dài mồi ngẫu nhiên (còn được gọi là đánh dấu
oligo) dựa trên phản ứng lai của hexanucleotide với sợi ADN khn nhờ hoạt tính
kéo dài chuỗi của tiểu đơn vị Klenow thuộc enzyme ADN polymerase I. Bước đầu
tiên của phương pháp là gây biến tính ADN tạo ra sợi đơn, sau đó cho các đoạn
hexanucleotide bắt cặp ngẫu nhiên với ADN khuôn, các đoạn này được dùng như
mồi cho đoạn Klenow của ADN polymerase I tổng hợp kéo dài ADN, với nguyên

liệu là các nucleotide đánh dấu [22, 93]. Đầu dị thu được có kích thước tối ưu trong
khoảng 200–1000 bp, với lượng từ 30–70 ng (với 10 ng mẫu ban đầu, ủ trong 1 giờ)
đến 2,10–2,65 mg (3 mg mẫu ban đầu, ủ 20 giờ). Nhược điểm lớn của phương pháp

Nguyễn Tiến Lung

16

K20 Sinh học thực nghiệm