Khảo sát, phân lập và lựa chọn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực mạnh và mới nhất

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

KHẢO SÁT, PHÂN LẬP VÀ LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri CÓ ĐỘC LỰC MẠNH VÀ MỚI NHẤT.
Lê Hồng Phước1*, Nguyễn Thị Hiền1, Nguyễn Hồng Lộc1, Võ Hồng Phượng1, Trịnh Quốc Trọng2
TÓM TẮT
Từ 50 mẫu cá có biểu hiện bệnh gan thận mủ thu được ở các tỉnh ĐBSCL từ tháng 03/2010 đến
tháng 05/2013, nhóm nghiên cứu đã phân lập được bốn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri I, II,
III, IV có khả năng gây bệnh thực nghiệm trên cá tra. Qua khảo sát độc lực của bốn chủng vi khuẩn,
chủng Edwardsiella ictaluri I và IV có độc lực cao gấp đơi so với 2 chủng còn lại với LD50 khoảng
2x104 CFU/0,2 ml/cá. Với liều tiêm 106 CFU/cá, cá bắt đầu chết sau 2 ngày tiêm, chủng E. ictaluri I
gây chết sớm nhất và cho tỉ lệ chết cao nhất (99%) so với các chủng vi khuẩn cịn lại. Chủng III có
tỉ lệ chết thấp nhất. Ở liều tiêm 105 CFU/cá, cá chết bắt đầu từ ngày thứ 3 sau khi tiêm và tập trung
nhiều nhất vào các ngày 3, 4 & 5 sau khi tiêm. So với các chủng vi khuẩn khác thì chủng I cho tỷ lệ
chết cao nhất (85%) và sớm nhất. Ở liều tiêm thấp nhất 104 CFU/cá, cá bắt đầu chết vào ngày thứ
4 và chết tập trung từ ngày 4-6 sau khi tiêm. Trong số các chủng vi khuẩn thử nghiệm có chủng IV
cho tỷ lệ chết cao nhất (50%) và chủng I gây chết sớm hơn so với các chủng còn lại. Kết quả này
cho thấy, vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên cá tra gồm nhiều chủng có độc lực cao thấp khác nhau
tuy nhiên sự khác biệt này là khơng đáng kể.
Từ khóa: vi khuẩn, gây nhiễm, tiêm.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, ngồi việc mở
rộng diện tích ni trồng thủy sản thì việc đa
dạng hóa các đối tượng ni cũng được quan
tâm đáng kể. Nhiều đối tượng ni thích ứng với
các vùng địa lý khác nhau đã được nghiên cứu
và phát triển. Trong đó, cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) được xem là đối tượng nuôi
chủ lực của cả nước và tập trung phát triển nuôi
chủ yếu ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.

Với điều kiện thích hợp, một số tỉnh đã và đang
có diện tích và sản lượng cá tra khá lớn như
Đồng Tháp, Tiền Giang, Bến Tre, An Giang,
Cần Thơ, Vĩnh Long và Hậu Giang. Tuy nhiên,

tình hình ni cá tra vẫn gặp nhiều khó khăn do
các vấn đề về dịch bệnh cũng như về giá cả và
thị trường tiêu thụ. Nghiên cứu cho thấy, ở cá
tra thường xuất hiện các loại bệnh như gan thận
mủ, xuất huyết, phù đầu, trắng gan, trắng mang
và ký sinh trùng. Trong đó, bệnh gan thận mủ
được xem là một trong những bệnh thường xuất
hiện và nguy hiểm nhất. Theo báo cáo của Cục
Thú Y, trong năm 2013 các loại dịch bệnh trên
cá tra đã xảy ra tại 71 xã thuộc 21 huyện của
6 tỉnh ni cá tra tập trung ở ĐBSCL với tổng
diện tích ao cá có cá nhiễm bệnh là 732,1 ha
trong đó bệnh gan thận mủ chiếm tỷ lệ cao nhất
(48%). Bệnh gan thận mủ trên cá tra đã được

Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Mơi trường và Phịng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng
Thủy sản 2.
* Email:
2
Trung tâm Quốc gia giống thủy sản nước ngọt khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy sản 2.
1

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015

87

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
xác định là do tác nhân vi khuẩn E. ictaluri
(Crumlish và ctv., 2002) gây ra. Loài vi khuẩn
này thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae. E. Ictaluri, phần lớn được biết đến như
là tác nhân gây bệnh xuất huyết nội tạng (Enteric septicaemia of catfish- ESC) trên cá nheo
(Ictalurus punctatus) ở Mỹ (OIE, 2006). Cho
đến nay, các nghiên cứu liên quan đến tác nhân
này trên cá tra này rất được quan tâm như các
nghiên cứu về đặc tính sinh hóa, di truyền, dịch
tễ và độc lực. Trong khuôn khổ của nghiên cứu
này, chúng tôi tiến hành khảo sát, phân lập và
lựa chọn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
có độc lực mạnh và mới nhất, với mục tiêu là
tìm ra những chủng E. ictaluri có độc lực cao
làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn như sản
xuất vắc-xin hay nghiên cứu chọn giống cá tra
kháng bệnh gan thận mủ.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1 Mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập
E. ictaluri
Mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập vi khuẩn
là gan, thận cá tra bệnh gan thận mủ, cá bệnh
được thu làm nhiều đợt từ tháng 03/2010 đến
05/2013 (Bảng 1)
Bảng 1. Thông tin mẫu bệnh phẩm dùng để
phân lập E. ictaluri

Đợt
thu

Thời gian

Đợt 1

03/2010

Số lượng
mẫu

Cỡ cá

14

20-25 g

16

>40 g

Địa
điểm
An
Giang

Đợt 2

05/2012

6

20-25 g

Bến
Tre

Đợt 3

01/2013

10

20-25 g

Tiền
Giang

Đợt 4

05/2013

4

25-30 g

Tiền
Giang

88

2.1.2 Cá tra thí nghiệm
Cá tra thí nghiệm có trọng lượng từ 20 đến
25 g/con. Cá thí nghiệm khỏe mạnh, không bị
nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. Cá được chuyển về
phịng thí nghiệm ướt thuần dưỡng trong 2-3
tuần. Sau đó, cá được chuyển vào bể kính từ
7-10 ngày, kiểm tra sự hiện diện của E. ictaluri
ở gan, thận, lách cá trên mơi trường thạch máu
trước khi tiến hành thí nghiệm.
2.1.3 Môi trường nuôi cấy, phân lập vi
khuẩn
Môi trường dùng để phân lập vi khuẩn là
môi trường thạch máu cơ bản có bổ sung 5%
máu cừu. Các mơi trường khác dùng để tăng
sinh vi khuẩn bao gồm môi trường Brain Heart
Infusion Broth (BHIB) hoặc Nutrient Broth
(NB). Môi trường thạch được chuẩn bị bằng
cách dùng môi trường lỏng thêm vào 15 g Agar
cho mỗi lít mơi trường.
2.1.4 Hóa chất khác
Cồn 70%, cồn 90%, dung dịch đệm pH 7,
nước muối 0,85% NaCl, thuốc tím, Chlorine,
dung dịch Formaline (Merck) để bất hoạt vi
khuẩn, thuốc gây mê cho cá EGME - C2H10O2
(Merck, Đức),…
2.1.5 Dụng cụ thí nghiệm
Máy trộn mẫu, máy quang phổ đo OD, tủ
ấm, tủ cấy vi sinh, tủ lắc ổn nhiệt, tủ mát 40C, tủ

lạnh âm 20oC, âm 70oC, máy ly tâm lạnh, cân
điện tử, kim tiêm 1ml, kim tiêm tự động, ống
nghiệm, eppendorf, đĩa petri, bể composite 1m3,
bể kính (80 lít).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp thu mẫu
Thu mẫu cá tra có biểu hiện bệnh tích điển
hình của bệnh gan thận mủ (đốm trắng mủ trên
gan - thận). Tiến hành thu mẫu cá bệnh khi dịch
bệnh bùng phát và thu tối thiểu 3-5 mẫu/ao, thu
cá bệnh nặng sắp chết hoặc cá sống nhưng có

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
dấu hiệu lâm sàng điển hình. Thu các mẫu cơ
quan nội tạng cá, cho vào eppendorf trong điều
kiện vô trùng và bảo quản lạnh (4oC). Mẫu thu
chuyển đến phịng thí nghiệm càng sớm càng tốt
để tiến hành phân lập và định danh.
2.2.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và
định danh vi khuẩn
Dùng các môi trường: Blood agar, BrainHeart Infusion Agar để phân lập vi khuẩn. Sử
dụng test kit API 20E để test sinh hóa và định
danh vi khuẩn theo khóa phân loại Bergey
(1996). Ngồi ra cịn xác định E. ictaluri bằng
phương pháp PCR. Sử dụng cặp mồi EiFd-1 (5’GTAGCAGGGAGAAAGCTTGC-3’), EiRs-1
(5’- GAACGCTATTAACGCTCACACC-3’)
để khuếch đại đoạn trình tự dài 407 bp thuộc

gen 16S rRNA, đặc hiệu cho loài vi khuẩn E.
ictaluri (Panangala và ctv., 2007).
2.2.3 Phương pháp tách nucleic acid của
vi khuẩn
Lấy khuẩn lạc vi khuẩn cho vào 1ml nước
cất vơ trùng, hịa đều, ly tâm 10 phút với tốc độ
13.000 g, bỏ dịch nổi. Cặn được huyền phù với
500 µl dịch đệm ly trích DNA (50 mM Tris, pH
8; 1 mM EDTA, pH 8; 500 mM NaCl; 1% SDS
và 10 µg/ml Proteinase K), ủ ở 100°C trong 10
phút, để nguội sau đó ly tâm 13.000 g trong 5
phút. Tủa dịch nổi bằng 2 thể tích cồn tuyệt
đối, ly tâm ở 13.000 g trong 10 phút thu tủa
DNA. Loại bỏ dịch nổi và để tủa DNA khơ tự
nhiên, hịa tan tủa DNA bằng nước cất vơ trùng
và giữ ở -20°C.
2.2.4 Phương pháp xác định LD50
Xác định mật độ vi khuẩn tương đối của canh
trùng gốc thông qua giá trị OD550nm và đếm khuẩn
lạc trên đĩa thạch. Tiến hành pha loãng canh trùng
gốc này để được dãy mật độ vi khuẩn sao cho khi
tiêm vào cá với các liều 104, 105, 106 CFU/0,2
ml/cá. Mỗi nồng độ tiêm cho 20 cá. Theo dõi tỷ

lệ sống chết trong mỗi nồng độ pha lỗng rồi tính
liều LD50 theo Reed-Muench (1938).
2.2.5 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm
Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn E.ictaluri được
lấy từ ống giữ giống (âm 70°C) và cấy trên môi
trường thạch máu (BA) ủ ở nhiệt độ 28°C trong

thời gian 24 giờ sau đó tiếp tục đưa vi khuẩn này
vào môi trường BHIB (pH 7, nhiệt độ 28°C ni
lắc 200 vịng/phút) với mật độ 103 CFU/ml tăng
sinh trong thời gian 24 giờ và sau đó đo mật độ
OD550nm xác định mật độ tế bào trước khi công
vào cá tra với liều 0,2 ml dịch vi khuẩn/cá.
Gây bệnh thực nghiệm bằng phương
pháp tiêm: Gây mê cá thí nghiệm bằng EGME
(Ethylene Glycol Monophenyl Ether, Merck)
0,2 ppt (1 ml EGME trong 5 lít nước) trong 3-5
phút. Sử dụng kim tiêm bán tự động (Socorex)
với chiều dài mũi kim tiêm 4 mm được dùng cho
cá 10-40 g để đảm bảo an tồn cho cá thí nghiệm.
Mũi kim tiêm đi vào xoang bụng cá ở vị trí giữa
hai vây bụng cá tra và chếch một góc 45°.
2.2.6 Phương pháp xác định mật độ vi
khuẩn
Tại các thời điểm thu mẫu kiểm tra OD550nm,
canh khuẩn cũng được pha loãng theo hệ số 10 và
tiến hành cấy trên đĩa thạch để xác định mật độ
vi khuẩn. Sau khi pha loãng dùng micropipette
hút 0,1 ml cho vào đĩa thạch NA. Tương ứng với
mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa. Dùng que cấy chang
đều canh khuẩn trên mặt thạch sau đó cho vào
tủ ấm 28ºC và tiến hành đếm số lượng khuẩn
lạc sau 36h ni cấy, tính mật độ vi khuẩn theo
công thức:
A (tế bào/ml) = (a + b)/2 x 10 x D
Trong đó: A là mật độ vi khuẩn (tế bào/ml)
a, b là số khuẩn lạc mọc trên đĩa 1 và đĩa 2

ứng với độ pha lỗng đã được xác định.
D = độ pha lỗng

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015

89


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 2
2.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát độc lực
của vi khuẩn
Mục đích của thí nghiệm này là để so sánh
độc lực của các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân
lập được . Thí nghiệm được bố trí trên bể kính.
Mỗi bể kính chứa 20 cá có trọng lượng trung
bình là 20 g. Cá thí nghiệm được tiêm canh
khuẩn với liều 104, 105 và 106 CFU/0,2 ml/cá.
Cá đối chứng được tiêm với nước muối sinh lý.
Mỗi nghiệm thức thí nghiệm được lập lai 3 lần.
Sau khi tiêm, cá được bố trí vào các bể kính và
cho nhịn đói trong vịng 6 giờ. Sau đó, cá được
cho ăn bình thường. Theo dõi cá chết hàng ngày
sau khi tiêm và kết thúc thí nghiệm sau 2 tuần.

Thu mẫu cá chết ở mỗi bể vào các ngày cá chết
tập trung, thu ngẫu nhiên mỗi cá/bể cho phân
tích vi khuẩn kiểm tra tác nhân gây bệnh.
III. KẾT QUẢ
3.1. Kết quả phân lập, định danh vi
khuẩn từ mẫu cá tra bệnh

Kết quả phân lập E. ictaluri qua 4 đợt thu
mẫu thu được 04 chủng E. ictaluri I, II, III và IV.
Kết quả kiểm tra sinh hóa từ 4 chủng vi khuẩn
này được trình bày ở bảng 2. Các chủng E.
ictaluri này đều gây tan huyết trên môi trường
thạch máu, khuẩn lạc nhìn rõ sau 36-48 giờ cấy
trên đĩa thạch (Hình 1) và khi nhuộm Gram cho
thấy vi khuẩn có dạng trực khuẩn Gram âm.

Bảng 2. Kết quả kiểm tra sinh hóa của các chủng vi khuẩn E. ictaluri
Phản ứng

Chủng vi khuẩn
E. ictaluri I

E. ictaluri II

E. ictaluri III

E. ictaluri IV

ONPG

+

+

+

-

ADH

-

-

-

-

LDC

-

+

+

+

ODC

-

-

-

-

CIT

+

+

+

d

H2S

-

-

-

-

URE

-

-

-

-

TDA

-

-

-

-

VP

+

+

+

d

GEL

+

+

+

-

GLU

+

+

+

+

MAN

-

d

d

-

INO

-

-

-

-

SOR

-

-

-

-

RHA

-

-

-

-

SAC

-

d

d

-

MEL

+

-

-

-

AMY

-

d

d

-

ARA

+

d

d

-

NIT

+

+

+

-

O/F

+/+

+/+

+/+

+/+

LAC

+

+

+

+

NO3

+

+

+

+

+

+

+

-

ESCULIN

Ghi chú: (-): âm tính, (+) dương tính, d: dương tính khơng rõ.
90

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN 2

Hình 1. Các chủng vi khuẩn E. ictaluri I, II, II, IV trên môi trường thạch máu

Kết quả kiểm tra bằng PCR 16S rRNA của
E. ictaluri (Panangala và cvt., 2007) cho thấy cả
4 chủng E. ictaluri cho sản phẩm khuếch đại có
kích thước 407 bp, tương ứng với chủng chuẩn
E. ictaluri LMG7860 (Hình 2).

Hình 2. Điện di sản phẩm PCR. M: DNA
100bp plus (ABM, Canada), chứng âm (-) sử
dụng nước cất, chứng dương (+) DNA vi khuẩn
E. ictaluri LMG7860 (Đại học Ghent, Bỉ)

3.2. Kết quả khảo sát độc lực của các
chủng vi khuẩn E. ictaluri
Ở thí nghiệm này, với liều tiêm 106 CFU/
cá, cá bắt đầu chết sau 2 ngày tiêm. Chủng E.
ictaluri I cho tỷ lệ chết sớm nhất và cao nhất
so với các chủng vi khuẩn còn lại (Đồ thị 1).
Chủng E. ictaluri III cho tỉ lệ chết thấp có ý
nghĩa thống kê (p<0,05) so với các chủng còn
lại (phương pháp Ducan).
Ở liều tiêm 105 CFU/cá cho tỷ lệ chết chậm
hơn, cá chết bắt đầu từ ngày thứ 3 sau khi tiêm
và tập trung nhiều nhất vào các ngày 3, 4 & 5
sau khi tiêm. So với các chủng vi khuẩn khác
thì chủng I cho tỷ lệ chết cao nhất và sớm nhất
so với các chủng còn lại (Đồ thị 2), tuy nhiên
khơng khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) khi sử
dụng phương pháp thống kê Duncan.

Đồ thị 1. Tỷ lệ chết cộng đồn trên cá tra sau khi gây nhiễm với 04 chủng Edwardsiella ictaluri liều 106 CFU/cá

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015

91


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

Đồ thị 2. Tỷ lệ chết cộng đồn trên cá tra sau khi gây nhiễm với 04 chủng Edwardsiella ictaluri
liều 105 CFU/cá
Ở liều gây nhiễm 104 CFU/cá, cá bắt đầu
chết vào ngày thứ 4 và chết tập trung từ ngày
4-6 sau khi tiêm. Trong số các chủng vi khuẩn
thử nghiệm có chủng IV cho tỷ lệ chết cao nhất
(50%) so với các chủng còn lại và chủng I cho
tỷ lệ chết sớm hơn so với các chủng còn lại. Tỉ

lệ chết giữa các chủng E. ictaluri cũng khơng
cho khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) khi dùng so
sánh Duncan (Đồ thị 3).
Kết quả kiểm tra LD50 của các chủng vi
khuẩn thử nghiệm cho thấy độc lực nằm trong
khoảng 1,9-3,8 x104 (CFU/0,2 ml/cá) (Bảng 3).

Đồ thị 3. Tỷ lệ chết cộng đồn trên cá tra sau khi gây nhiễm với 04 chủng Edwardsiella ictaluri
liều 104 CFU/cá
92

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
Bảng 3. Giá trị LD50 của các chủng E. ictaluri
Chủng vi khuẩn

LD50

Edwardsiella ictaluri I

1,9 x104 (CFU/0,2 ml/cá)

Edwardsiella ictaluri II

3,8 x104 (CFU/0,2 ml/cá)

Edwardsiella ictaluri III 3,4 x104 (CFU/0,2 ml/cá)
Edwardsiella ictaluri IV

2 x104 (CFU/0,2 ml/cá)

Ngoài ra, khi kiểm tra cá chết sau khi gây
bệnh thực nghiệm bằng cách thu ngẫu nhiên
mỗi bể một con để cấy vi khuẩn từ thận cá lên
môi trường BA, kết quả sau 48 giờ cấy ủ ở 30°C
chỉ có thuần một loại vi khuẩn E. ictaluri với
kiểu tan huyết đặc trưng trên BA.
IV. THẢO LUẬN
Theo mô tả của Austin (2007), E. ictaluri
có thể được phân lập từ thận, gan, lách, não và
các vết thương trên da hay cơ của cá trên môi

trường BHIA, thạch máu hay môi trường chọn
lọc đối với E. ictaluri (EIM). Sau khi ủ ở 26°C
trong 48 giờ, các khuẩn lạc của E. ictaluri có
dạng trịn bóng, đường kính khoảng 2 mm, hơi
cong, vành đầy đặn và khơng có sắc tố. Khi
kiểm tra các đặc tính sinh hóa thì E. Ictaluri
được xác đinh là vi khuẩn Gram âm, hình que,
lên men và di chuyển bằng lơng mao. E. Ictaluri
có khả năng sản xuất các enzyme như catalase, P-galactosidase, lysine và ornithine decarboxylase nhưng không tạo H2S, indole, oxidase hay phenylalanine deaminase (Waltman và
ctv., 1986). Qua phân tích 119 chủng E. ictaluri
thu trong suốt 7 năm ở các bang của Mỹ, cho
thấy các chủng này có độ tương đồng về đặc
tính sinh hóa rất cao. Tất cả các chủng đều có
khả năng phân hủy chondroitin sulfate, là thành
phần chính của sụn, đây có thể là một yếu tố
gây độc quan trọng trong việc hình thành nên
tổn thương lỗ trên đầu đặc trưng của cá bệnh

(Waltman và ctv., 1986; Cooper và ctv., 1996).
Sự khác biệt về kiểu gene của 20 chủng E. ictaluri, 19 chủng thu từ cá nheo Mỹ và 1 chủng
thu từ cá trê (Clarias batrachus) ở Thái Lan có
đặc tính sinh hóa giống nhau, xác định bằng kỹ
thuật arbitrary primed PCR (AP-PCR) kết hợp
với mồi phát hiện vùng bảo tồn nằm trong vùng
lặp lại của vi khuẩn đường ruột (ERIC II) cho
thấy vi khuẩn này gồm 4 nhóm dưới lồi (Bader và ctv., 1998). Trong nghiên cứu này, cả bốn
chủng mà chúng tôi phân lập đươc đều cho phản
ứng dương tính với Citrate và VP. Kết quả này
tương ứng với nghiên cứu của Thy và ctv., 2008
khi phân lập E. ictaluri từ cá tra Việt Nam ở 5

tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long
và Bến Tre nhưng lại khác với mô tả của Hawke
(1979) (Citrate và VP âm tính với E. ictaluri).
Ngồi ra, bốn chủng E. ictaluri phân lập được
cũng cho phản ứng dương tính với Lysine, âm
tính với Arginine giống với các đặc tính của E.
ictaluri mà Hawke (1979) mơ tả. Cũng theo
Hawke các phản ứng đường hầu hết là âm tính.
Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, một vài chủng
cho dương tính nhẹ với amylase, arabinose và
manitol. Sự khác biệt về một vài phản ứng sinh
hóa này có thể là do sự khác biệt về các chủng
vi khuẩn được phân lập từ các vùng địa lý khác
nhau và sự biến chủng của vi khuẩn trong q
trình gây bệnh.
Ngồi ra, nghiên cứu này đã gây bệnh thành
công trên cá tra bằng 04 chủng E. ictaluri I, II,
III, IV đã phân lập được. Cá được gây bệnh có
biểu hiện bệnh lý giống cá bệnh ngồi tự nhiên
như màu sắc cá nhợt nhạt, mắt lồi, đôi khi xuất
huyết bên ngoài cơ thể ở các gốc vây, quanh
mắt, miệng, đi, hậu mơn. Bên trong cơ thể
có vơ số đốm trắng với kích thước khác nhau từ
1-3 mm xuất hiện đầu tiên trên thận, sau đó đến
lách và gan.
Qua khảo sát về độc lực của 4 chủng E.
ictaluri phân lập được có thể thấy rằng vi

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015

93


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2
khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên cá tra gồm
nhiều chủng có độc lực cao thấp khác nhau, tuy
nhiên sự khác biệt này là khơng đáng kể. Nếu
xét về thời gian thì chủng E. ictaluri I gây chết
cá sớm hơn các chủng còn lại (cá bắt đầu chết
từ ngày thứ 2 sau khi tiêm vi khuẩn) và nếu
xét về LD50 thì chủng này cũng có giá trị thấp
nhất mặc dù sự khác biệt với các chủng khác
khơng có ý nghĩa thống kê (1,9 x104 CFU/0,2
ml/cá). Theo giá trị LD50, hai chủng E. ictaluri
I và IV có độc lực tương đương nhau khoảng
2x104 CFU/0.2 ml/cá và cao hơn gần hai lần so
với hai chủng E. ictaluri còn lại. Kết quả này
khá tương đồng với các nghiên cứu khác ở Việt
Nam. Như nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng
Oanh và ctv., (2009) khi kiểm tra độc lực của
9 chủng vi khuẩn E. ictaluri cũng cho thấy các
chủng có độc lực cao thấp khác nhau. Kết quả
nghiên cứu của Nguyễn Quốc Bình và ctv.,
(2010) cho thấy E. iclaturi có LD50 khoảng từ

104-105 CFU/cá. Nguyễn Hữu Thịnh và ctv.,
(2009) nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm bằng
phương pháp tiêm với liều tiêm từ dãy nồng độ
5,5 x103 đến 5,5 x 106 (mỗi nồng độ pha loãng
10 lần) cho tỷ lệ chết từ 93-99,3% và đối với

gây bệnh bằng phương pháp ngâm cho tỷ lệ
chết 66% ở liều 5,5 x 106 CFU/ml.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc,
Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thị Mai Thy, 2004.
Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra
(Pangasius hypophthalmus). Tạp chí khoa học
Đại học Cần Thơ 2004, tr. 137 – 142.

Tài liệu tiếng Việt

V. KẾT LUẬN
Trong năm 2012 và 2013 nhóm nghiên cứu
đã cập nhật được 04 chủng vi khuẩn E. ictaluri
I, II, III, IV từ cá tra bệnh gan thận mủ thu tại
các tỉnh thuộc Đồng bằng sơng Cửu long. Các
chủng vi khuẩn này có khả năng gây bệnh trên
cá tra với biểu hiện bệnh lý giống cá bệnh ngồi
tự nhiên. Đồng thời, nhóm cũng đã xác định
được độc lực của các chủng E. ictaluri này.
Trong đó, chủng E. ictaluri I và IV có độc lực
cao hơn gần hai lần so với hai chủng E. ictaluri
II và III.

Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2009.
Độc lực của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân
lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)
bệnh mủ gan, Hội thảo nghiên cứu tác nhân gây

bệnh gan thận mủ ở cá tra 11/08/2009.

Tài liệu tiếng Anh

Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Trọng Bình, Vũ thị Thanh
Hương, Dương Vân Anh, Trần Hạnh Triết, Trần
Thị Thanh Xuân, Đinh Thị Cao Khánh, Võ Hy Lan
Anh, Văn Xuân Thành, Trần Thị Thanh Thanh,
2010. Các hướng nghiên cứu về vaccine phòng
bệnh gan thận mủ cho cá Tra đang được triển khai
tại Trung tâm Cơng Nghệ Sinh Học Thành phố
Hồ Chí Minh. Hội nghị Cơng Nghệ Sinh Học tồn
quốc, Tp.HCM ngày 02/12/2010.

Bader, J.A., Shoemaker, C.A., Klesius, P.H., Connolly,
M.A., and Barbaree, J.M., 1998. Genomic
subtyping of Edwardsiella ictaluri isolated from
diseased channel catfish by arbitrary primed
polymerase chain reaction. Journal of Aquatic
Animal Health 10, 22-21.

Tạp chí Thương Mại Thủy sản, số 131. Tháng 02/2013,
ISSN 1859-1175

94

Austin, B., and Austin, D.A., 2007. Bacterial Fish
Pathogens: Diseases of Farmed and Wild Fish, 4th.
Springer and Praxis Publishing, Chichester, UK.

Cooper, R.K., Shotts, E.B. and Nolan, L.K., 1996.
Use of a mini-transposon to study chondroitinase
activity associated with Edwardsiella ictaluri.
Journal of Aquatic Animal Health 8:319-324.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

Crumlish, Dung, M., Turnbull, T.J., Ngoc, N., and
Ferguson, H., 2002. Identification of E. ictaruli
from the diseased freshwater catfish Pangasius
hypophthalmus Sauvage, cultured in the Mekong
Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases 25: 733736.
Hawke, J. P., McWhorter, A. C., Steigerwalt, A. G.,
and Brenner, D. J., 1981. Edwardsiella ictaluri
sp. Nov., the causative agent of enteric septicemia
of catfish. International Journal of Systematic
Bacteriology 31 (4): 396-400.
Panangala, V. S., Craig, A.S., Vicky, L.V., Kevin,
D., and Phillip, H.K., 2007. Multiplex-PCR
for Simultaneous Detection of 3 Bacterial
Fish Pathogens, Flavobacterium Columnare,
Edwardsiella Ictaluri and Aeromonas hydrophila.
Diseases of aquatic organisms 74(3):199–208.

Reed, M.J., and Muench, M., 1938. A simple method
for estimating fifty percent endpoints. American
Journal of hygiene 27: 493-497.

Thinh, N.H., Kuob, T.Y., Hung, L.T., Loc, T.H.,
Chen, S.C., Evensen, O., Schuurman, H.J.,
2009. Combined immersion and oral vaccination
of
Vietnamese
catfish
(Pangasianodon
hypophthalmus) confers protection against
mortality caused by Edwardsiella ictaluri. Fish &
Shellfish Immunology 27: 773-776.
Waltman, W.D., Shotts, E.B., and Hsu, T.C., 1986.
Biochemical characteristics of Edwardsiella
ictaluri. Applied and Environmental Microbiology
51:101-4.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015

95


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

INVESTIGATION, ISOLATION AND SELECTION OF THE MOST UPDATED
AND VIRULENT STRAINS OF Edwardsiella ictaluri
Le Hong Phuoc1*, Nguyen Thi Hien1, Nguyen Hong Loc1, Vo Hong Phuong1, Trinh Quoc Trong2
ABSTRACT
In this study, 4 strains of bacteria E. ictaluri, namely I, II, III and IV were isolated and characterized
from 50 diseased fish samples collected from culture farms in Mekong Delta from March, 2010 to
May, 2013. Through the challenge tests using those E. ictaluri strains, the same bacillary necrosis
pathology was reproduced in experimental fish. Among 4 strains of E. ictaluri, strain I and II appear to be the most virulent with the LD50 is approximately 2x104 CFU/0.2 ml/fish which is double

the LD50 of strain II and III. At the dose of 106 CFU/fish, the experimental fish started to die in the
second day post injection with the E. ictaluri I caused more than 99% mortality. In the challenge test
with the dose of 105 CFU/fish, majority of the fish died after 3 days post injection. The E. ictaluri I
caused 85% mortality. At the lowest dose, 104 CFU/fish, after 4 days post injection, the fish started
to die. The E. ictaluri IV induced mortality the most with more than 50% of mortality. Generally,
the virulence of E. ictaluri strains causing bacillary necrosis pathology in trafish might vary but not
significant.
Keywords: bacteria, challenge, injection.

Người phản biện: TS. Đinh Thị Thủy
Ngày nhận bài: 29/5/2015
Ngày thông qua phản biện: 10/6/2015
Ngày duyệt đăng: 15/6/2015

Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2.
* Email:
2
National Breeding Center for Southern Freshwater Aquaculture, Research Institute for Aquaculture No.2
1

96

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015