sự biến đổi các chỉ huyết học của cá tra (pangasianodon hypophthalmus) giống gây cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn edwardsiella ictaluri có độc lực khác nhau

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN







DƯƠNG VĂN NHÍ








SỰ BIẾN ĐỔI CÁC CHỈ HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG GÂY
CẢM NHIỄM VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri CÓ ĐỘC LỰC KHÁC NHAU

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN











2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN






DƯƠNG VĂN NHÍ

SỰ BIẾN ĐỔI CÁC CHỈ HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG GÂY
CẢM NHIỄM VỚI CÁC CHỦNG VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri CÓ ĐỘC LỰC KHÁC NHAU







LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN






CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. PHẠM THANH LIÊM







2009

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
i
LỜI CẢM TẠ
Xin gởi lời cảm tạ sâu sắc đến thầy Phạm Thanh Liêm đã tạo điều kiện
cho tôi được thực nghiệm và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực
hiện đề tài.
Xin gởi lời cảm ơn quý báo đến cô Đặng Thị Mai Thy, cô Nguyễn Thị
Thu Hằng cùng với tất cả các quý thầy cô, các anh chị cán bộ trong khoa Thủy
Sản nói riêng và trường Đại học Cần Thơ nói chung đã truyền đạt những kinh
nghiệm và kiến thức nền tảng quý báo trong suốt thời gian học tập ở trường và
làm luận văn tốt nghiệp.
Cảm ơn cha mẹ và các anh chị tôi đã động viên và tạo điều kiện cho tôi
được hoàn thành tốt việc học tập trong suốt 4 năm theo học ở trường.
Tôi xin cảm ơn bạn Nguyễn Thị Chúng, bạn Lê Thượng Khởi đã cùng
thực hiện đề tài với tôi và cuối cùng là tất cả các bạn cùng lớp Bệnh học Thủy
sản khóa 31 đã nhiệt tình động viên và hỗ trợ tôi trong thời gian học tập ở
trường.

Xin chân thành cảm ơn!

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
ii
TÓM TẮT
Đề tài “Sự biến đổi các chỉ tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) giống gây cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri có độc lực

khác nhau” nhằm xách sự biến động các chỉ tiêu huyết học
của cá tra giống khi cảm nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
có LD
50
khác nhau. Đề tài được thực hiện trên ba chủng chủng T8, KSL 103,
CAF 258 với hai đối chứng (một đối chứng tiêm nước muối sinh lý và một đối
chứng không tiêm). Nồng độ vi khuẩn gây cảm nhiễm là liều gây chết 50%
tương ứng với từng chủng vi khuẩn, thời điểm thu mẫu được được định là thu
trước khi thí nghiệm,; thu lần 1 sau khi gây cảm nhiễm và lần 2 được thu sau
12 ngày cảm nhiễm. Hồng cầu được phân tích theo phương pháp của Natt and
Herrick, (1952), bạch cầu được phân tích theo phương pháp của Humason,
(1979), số liệu thống kê được sử lý bằng trương trình SPSS 16.0 (sử dụng
phép thử phép thử Ducan và phép thử LSD). Sau khi phân tích nhậ thấy: sự
biến động về số lượng tế bào hồng cầu giữa 3 chủng T8, KSL 103, CAF 258 là
giống nhau; Chủng T8 có tỷ lệ giảm số lượng TBC, lympho, tiểu cầu ít hơn,

BCĐN thì cao hơn chủng KSL 103 và CAF 258; Khả năng phục hồi TBC ở
chủng T8 nhanh hơn, còn BCTT và BCĐN thì chủng CAF 258 nhanh hơn.













PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iii
MỤC LỤC
Trang
Phần 1:ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi thâm canh cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu
Long 3
2.2 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh mủ gan trên cá tra 3
2.2.1 Sơ lược về lịch sử bệnh do E.ictaluri gây ra trên cá trơn 3
2.2.2 Đặc điểm về hình thái, sinh lý và sinh hóa 4
2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý 4
2.3 Các chỉ tiêu huyết học 5
2.3.1 Hồng cầu 6
2.3.2 Tế bào lympho 6

2.3.3 Tiểu cầu 6
2.3.4 Bạch cầu đơn nhân 6
2.3.5. Bạch cầu trung tính 6
2.3.6 Một số nghiên cứu về huyết học trên cá 8
2.4 Một số kết quả gây cảm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong phòng
thí nghiệm 9
PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
3.1 Thời gian và địa điểm 11
3.2 Vật liệu nghiên cứu 12
3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 12
3.2.2 Dụng cụ và thiết bị 12
3.2.3 Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn 12
3.3 Phương pháp nghiên cứu 12
3.3.1 Chuẩn bị hệ thống bể 12
3.3.2 Cách chuẩn bị dung dịch vi khuẩn 12
3.3.3 Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cá 13
3.3.4 Bố trí thí nghiệm gây cảm nhiễm 14
3.3.5 Thời gian thu mẫu 14
3.4 Phương pháp phân tích mẫu 14
3.4.1 Phương pháp đếm hồng cầu (Natt and Herrick, 1952) 15
3.4.2 Định lượng và định loại các tế bào bạch cầu (Humason, 1979) 16
3.5 Tái phân lập và tái định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri theo phương
pháp truyền thống 17
3.6 Xử lý số liệu 17
PHẦN 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 18
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

iv
4.1 Đặc điểm cá thí nghiệm 18
4.1.2 Đặc điểm bên ngoài 18

4.1.3 Đặc điểm bên trong 18
4.2 Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn E. ictaluri 19
4.3 Kết quả phân tích huyết học 21
4.3.1 Hồng cầu 22
4.3.1.1 Hình tái hồng cầu 22
4.3.1.2 Số lượng hồng cầu 23
4.3.2 Bạch cầu 25
4.3.2.1 Tổng bạch cầu 25
4.3.2.2 Các loại tế bào bạch cầu 28
4.4 Mức độ biến động về huyết học giữa các chủng vi khuẩn 31
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33
5.1 Kết luận 33
5.2 Đề xuất 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO 34
Phụ lục 35

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
v

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.3 5. Tế bào máu 8
Hình 3.1: Sơ đồ chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm 14
Hình 3.4 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu 16
Hình 3.4.1 Buồng đếm hồng cầu 17
Hình 4.1 Hệ thống các bể bố trí thí nghiệm 18
Hình 4.1.3 Nội tạng cá tra bị nhiễm E. Ictaluri 19
Hình 4.2.1 Gram vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 19
Hình 4.2.2 Kết quả test sinh hóa vi khuẩn E. Ictaluri 20
Hình 4.3.1.1a Hồng cầu cá khỏe 23
Hình 4.3.1.1bHồng cầu cá bệnh 23
Hình 4.3.1.2 Sự biến động số lượng hồng cầu qua các lần thu mẫu trong từng
chủng E.ictaluri 25
Hình 4.3.2.1 Sự biến động số lượng TBC qua các lần thu mẫu trong từng
chủng E.ictaluri 28

Hình 4.3.2.2 Hình thái các tế bào bạch cầu 31

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 3.2.1 Các chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm 11
Bảng 4.2 Kết quả tái định danh vi khuẩn sau khi gây cảm nhiễm 21
Bảng 4.3.1.2 Sự biến động số lượng hồng cầu (tế bào x 10
5
/mm
3
) qua các lần
thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri 23
Bảng 4.3.2.1 Sự biến động số lượng TBC (tế bào x 10
4
/mm
3
) qua các lần thu
mẫu trong từng chủng E.ictaluri 26
Bảng 4.3.2.2a Sự biến động số lượng lympho (tế bào x 10
3
/mm
3
) qua các lần
thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri 29
Bảng 4.3.2.2b Sự biến động số lượng tiểu cầu (tế bào x 10
3
/mm
3
) qua các lần
thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri 29

Bảng 4.3.2.2c Sự biến động số lượng bạch cầu trung tính (tế bào x 10
3
/mm
3
)
qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluri 30
Bảng 4.3.2.2d Sự biến động số lượng bạch cầu đơn nhân (tế bào x 10
3
/mm
3
)
qua các lần thu mẫu trong từng chủng E.ictaluric 30
Bảng 4.4a Sự biến động (%) của các tế bào hồng cầu và bạch cầu giữa các
chủng vi khuẩn E.ictaluri ở đợt thu mẫu lần 1 31
Bảng 4.4a Sự biến động (%) của các tế bào hồng cầu và bạch cầu giữa các
chủng vi khuẩn E.ictaluri ở đợt thu mẫu lần 2 32
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

vi
TỪ VIẾT TẮT
ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long
TGTM: Trắng gan, trắng mang
Tb: tế bào
BCTT: Bạch cầu trung tính
BCĐN: Bạch cầu đơn nhân
TBC: Tổng bạch cầu

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
1
PHẦN 1

ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Gới thiệu
Hiện nay nuôi trồng thủy sản được xem là một trong những ngành kinh
tế mũi nhọn của cả nước, sản lượng, diện tích ngày càng tăng. Riêng Đồng
Bằng Sông Cửu Long, tính đến năm 2008 đã hơn 1,2 triệu ha diện tích mặt
nước có khả năng nuôi trồng thủy sản, chiếm gần bằng 60% của cả nước,
trong đó diện tích có khả năng nuôi thuỷ sản nước ngọt trên 500.000 ha và
được xác định là có điều kiện rất thuận lợi. Giá trị xuất khẩu cũng rất lớn, năm
2007 tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản ở Đồng Bằng Sông Cửu Long đạt
2,328 tỷ USD, năm 2008 tăng lên 2,5 tỷ USD, chiếm hơn 60% tổng kim ngạch
xuất khẩu thuỷ sản của cả nước.
Trong đó cá tra là một trong những đối tượng thủy sản được xuất khẩu
nhiều nhất, năm 2008 Đồng Bằng Sông Cửu Long có 5.102ha diện tích ao
nuôi (tăng 11% so năm 2007), với sản lượng cá trên 1 triệu tấn, xuất khẩu trên
535 ngàn tấn qua 117 quốc gia ( Để
đảm bảo sản lượng xuất khẩu nên bên cạnh việc tăng diện tích nuôi người dân
còn đẩy mạnh việc nuôi cá với mật độ cao, dẫn đến nhiều yếu tố bất lợi như ô
nhiễm nguồn nước, dịch bệnh thường xuyên xảy ra… gây nhiều tổn thất cho
người nuôi. Vì vậy, nhiều nghiên cứu nhằm tìm hiểu và phòng chống dịch
bệnh trên thủy sản đựơc thực hiện là đều tất yếu. Kết quả điều tra của Lý Thị
Thanh Loan (2008 ) về tình hình dịch bệnh năm 2007 ở đồng bằng sông Cửu
Long thì tần suất xuất hiện bệnh mủ gan là 52,80%; xuất huyết: 42,50%; phù
đầu, phù mắt: 20,70% và vàng da: 21,60%,trong đó bệnh mủ gan gây nhiều
tổn thất nghiêm trọng cho người nuôi. Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá
tra nuôi ở đồng bằng sông Cửu Long vào cuối năm 1998 (Ferguson et al ,
2001). Về tác nhân gây bệnh mủ gan trên cá tra đã được Từ Thanh Dung
(2005) xác định là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, khi cá nhiễm
bệnh, tỷ lệ chết tăng cao 10-90% có thể lên tới 100% tùy thuộc vào cách quản
lý và cỡ cá nuôi. Khi bệnh cá bơi lờ đờ, bỏ ăn, thân, vi và hậu môn bị huyết,
đồng thời trên gan, thận và tụy tạng xuất hiện nhiều đốm trắng đường kính 1-3

mm bên trong chứa dịch màu trắng đục.
Cùng với việc xác định được tác nhân gây bệnh, từ trước đến nay đã có
nhiều chủng vi khuẩn được phân lập từ các ao nuôi cá bị bệnh mủ và gây cảm
nhiễm trở lại trong phòng thí nghiệm nhằm tìm hiểu khả năng gây bệnh, đặc
điểm sinh hóa, tìm hiểu độc lực…Tuy nhiên, vẫn chưa có chủng vi khuẩn nào
đã phân lập, được tìm hiểu về huyết học. Vì vậy đề tài “Sự biến đổi các chỉ
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
2
tiêu huyết học của cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giống gây cảm
nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực

khác nhau”
được thực hiện.
1.2 Mục tiêu
Xác định sự biến động các chỉ tiêu huyết học của cá tra giống khi cảm
nhiễm với các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có LD
50
khác nhau
1.3 Nội dung thưc hiện
• Gây cảm nhiễm cho cá tra giống với các chủng vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri có LD
50
khác nhau.
• Định loại và định lượng các tế bào máu trên cá tra cảm nhiễm.
• Tái phân lập và định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi thâm canh cá tra ở Đồng Bằng Sông
Cửu Long
Với xu hướng thâm canh trong nghề nuôi cá tra thì dịch bệnh tren cá
xảy ra là đều khó có thể tránh khỏi. Bệnh gây tổn thất lớn cho người nuôi, nếu
không có biện pháp phòng và điều trị hiệu quả, bệnh sẽ lây lang và phát triển
thành dịch thì khó mà khống chế được. Cùng với sự thâm canh đó là nguồn
nước ngày càng bị ô nhiễm do việc sử dụng nhiều thuốc và hoá chất phòng trị
bệnh, sự phân hủy thức ăn dư thừa, các sản phẩm bài tiết của cá…từ các ao
nuôi thải ra kinh, rạch không qua sử lý, trong nguồn nước thải đó luôn tồn tại
nhiều mầm bệnh, chúng sẽ bộc phát khi đủ số lượng và điều kiện thuận lợi.
Theo kết quả điều tra của Nguyễn Chính (2005) ở Cần Thơ và An Giang cho
thấy có nhiều bệnh xuất hiện trong nuôi cá tra thâm canh như: mủ gan, đốm
đỏ, phù đầu, lở loét, trắng mang-trắng gan, lồi mắt nổ mắt, nấm thủy mi, xuất
huyết đường ruột, ký sinh trùng. Trong đó, bệnh thường gặp và gây hại lớn là

bệnh mủ gan với tỷ lệ chết lên đến 80-90%, kế đến là những bệnh phù đầu, lồi
mắt, nổ mắt với tỷ lệ chết từ 60% đến 70%. Còn theo Từ Thanh Dung (2005)
thì tần xuất hiện bệnh trên động vật thủy sản với vi khuẩn (50,9%), virut
(24,6%), kí sinh trùng (21,1%), nấm (3,4%).
Theo Nguyễn Tấn Duy Phong (2008), bệnh xuất hiện quanh năm nhưng
chủ yếu tập trung vào tháng 5 đến tháng 9, đỉnh điểm là từ tháng 9 đến tháng
11 hàng năm. Một số bệnh xuất hiện với tần số cao như gan thận mủ (93,8%),
xuất huyết (75%), trắng gan trắng mang (68,8%).
2.2 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh mủ gan trên cá tra
2.2.1 Sơ lược về lịch sử bệnh do E.ictaluri gây ra trên cá trơn
Vi khuẩn E.ictaluri được Hawke (1979) phân lập đầu tiên trên cá nheo
Mỹ. Đến năm 1981, Hawke và ctv. xác định vi khuẩn E.ictaluri là nguyên
nhân gây bệnh ESC (Enteric septiceamia catfish).
Vi khuẩn E.ictaluri có khả năng gây bệnh trên một số nhóm cá như
Blue catfish (Ictalurus furcatus), white catfish (Ictalurusrcatus) (Hawke,
1981), cá trê trắng (Clarias batrachus) (Plumb,1987).
Ở Việt Nam, bệnh do vi khuẩn E.ictaluri gây ra trên cá tra được gọi là
bệnh BNP (Bacillary necrosis of Pangasius)-mủ gan. Bệnh được ghi nhận đầu
tiên ở ĐBSCL cuối năm 1998 ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
4
An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ (Ferguson et al., 2001). Bệnh gây hao hụt
rất lớn ở cá giống nhưng thiệt hại kinh tế lớn nhất ở giai đoạn vào khoảng 300-
500 g (Từ Thanh Dung và ctv, 2005), những mô tả về mô bệnh học đầu tiên
của bệnh này được thực hiện bởi Ferguson et al., (2001). Đến năm 2002,
Crumish et al. (2002), khẳng định rằng E.ictaluri là tác nhân chính gây bệnh
mủ gan trên cá tra nuôi ở ĐBSCL, thiệt hại do bệnh mủ gan gây lên đến 90% (
Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003), hơn nữa mầm bệnh diễn biến ngày càng
phức tạp và có chiều hướng gia tăng, theo Phạm Thanh Tuấn (2004) tần số
xuất hiện của bệnh là 43,3% sang năm 2005 là 82% (Nguyễn Chính, 2005)

đến năm 2008 là 96,8% (Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008).
2.2.2 Đặc điểm về hình thái, sinh lý và sinh hóa
Vi khuẩn E.ictaluri được mô tả đầu tiên bởi Hawke et al. (1981) là vi
khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae , vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, kích
thước khoảng 0,75 x 1,5-2,5 nm, di động ở 25-30
0
C và di động yếu hoặc
không di động ở nhiệt độ cao hơn 30
0
C, không có khả năng chịu được ở độ
mặn cao hơn 1,5%, phát triển trên môi trường thạch rất chậm, trên môi trường
TSA sau 48 giờ ở 28- 30
0
C hình thành khuẩn lạc nhỏ, tròn và trắng đục. Môi
trường đặc trưng là EIA (Edwardsiella ictaluri agar) và EMB ( Eosin
Methylen Blue).
Theo Từ thanh Dung và ctv (2003) vi khuẩn E.ictaluri phân lập từ cá
tra Việt Nam có một số đặc điểm khác so với mô tả của Plumb (1999) như có
dạng hình que và có kích thước biến đổi, phát triển tốt ở 28
0
C và phát triển
yếu ở 37
0
C. Điều này lý giải tại sao E.ictaluri cho tới nay chỉ phát hiện trên cá
mà chưa tìm thấy trên các động vật máu nóng khác. Theo Lương Trần Thục
Đoan (2006), khi kiểm tra đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn E.ictaluri 224 phân
lập trên cá tra ở Việt Nam thì chỉ tiêu citrate cho kết quả dương tính, đây là
điểm khác biệt so với vi khuẩn E.ictaluri phân lập trên cá nheo.
2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý
Cá bệnh mủ gan không có những biểu hiện bất thường bên ngoài. Ở

giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi nhưng giảm ăn, một số trường
hợp cá có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ da nhợt nhạt, có biểu hiện xuất huyết trên
da và hậu môn. Dấu hiệu bệnh lý đặc thù nhất là bên trong nội quan các cơ
quan gan, thận,và tỳ tạng xuất hiện những đốm trắng, đường kính 1- 3mm, các
cơ quan này sưng to và có biểu hiện nhũng thận (Ferguson et al., 2001).
Trên cá tra, E.ictaluri tấn công vào các cơ quan như thận, gan, tỳ tạng
(Ferguson, Từ Thanh Dung và ctv., 2001). Theo Lương Trần Thục Đoan
(2006), thì thận và tỳ tạng là 2 hai cơ quan mà vi khuẩn tấn công đầu tiên chứ
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5
không phải ở gan. Ngoài ra, khi thu mẫu ngoài thực tế cũng tìm thấy vi khuẩn
tại các cơ quan khác như: máu, não, cơ,mang, tim, bóng hơi. Trong đó, thận,
tỳ tạng, bóng hơi là những cơ quan bị nhiễm E.ictaluri cao.
Kết quả kiểm tra bằng phương pháp mô bệnh học quan sát thấy trên gan
xuất hiện nhiều vùng xung huyết động mạch và tĩnh mạch gan, mô gan bị hoại
tử và mất cấu trúc, từng cụm vi khuẩn xuất hiện ở rìa các vết thương ở gan cá
tra bị bệnh. Tương tự, ở thận cũng xung huyết và hoại tử, tỳ tạng xuất hiện
nhiều vùng ngoại tử trên các vết thương (Nguyễn Quốc Thịnh, 2002; Trần Thị
Ngọc Hân, 2006), trong khi những biến đổi mô học nghiêm trọng được ghi
nhận trên cá nheo bệnh ESC là ở cơ quan thận và tỳ tạng, cả 2 cơ quan này
đều hoại tử, gan chỉ bị sưng (Areechon et al., 1983; trích dẫn từ Plumb, 1999).
2.3 Các chỉ tiêu huyết học
Máu cá là thành phần quan trọng trong hệ tuần hoàn của tất cả cơ thể
sống, là môi trường sinh lý của cơ thể. Chính vì vậy, các chỉ tiêu huyết học
của cá được nghiên cứu ngày càng nhiều và có liên quan đến vấn đề sức khỏe
của cá (Bhasker and Rao, 1995 trích dẫn bởi Yazlak, 2003). Máu cá gồm
những tế bào máu được lưu thông trong môi trường lỏng là huyết tương hay
dịch bạch huyết đối với động vật không xương sống. Máu có chức năng vận
chuyển oxi, cung cấp vật chất dinh dưỡng, bài tiết những sản phẩm từ mô và
các cơ quan ra ngoài cơ thể. Ngoài ra, máu có vai trò tạo ra sức hô hấp cho cá,

máu được tuần hoàn trong cơ thể là nhờ sự họat động của hệ thống mao mạch
hoặc cơ quan đặc biệt là tim (Aqualex Multimedia Consortium Ltd Ireland,
1988).
Trong thành phần của máu cá, huyết tương có khoảng 90% là nước và
10% là những vật chất vô cơ gồm những chất như globulin miễn dịch,
globulin α, globulin β, kháng thể, và hữu cơ hòa tan. Huyết thanh là chất lỏng
có màu vàng, là phần còn lại sau hiện tượng máu đông lại, thành phần của
huyết thanh tương tự như huyết tương nhưng không có các thành phần máu
vón lại (Aqualex Multimedia Consortium Ltd Ireland, 1988). Máu cá bị tác
động bởi nhiều yếu tố: điều kiện môi trường (Casillas and Smith, 1977), giống
loài ( Siddiquire and Nasim, 1979), kích cở cá (Garcia, 1992), mùa vụ (Cech
and Wohlschlag,1981) trích bởi Yazlak, 2003.
Tế bào máu của cá được chia làm hai nhóm chính: Hồng cầu
(erythrocyte) và bạch cầu (gồm có 4 loại tế bào chính là bạch cầu có hạt
(granulocyte), bạch cầu đơn nhân (monocyte), tế bào lympho (lymphocyte) và
tiểu cầu (thrombocyte). Trong đó, bạch cầu có hạt (granulocyte) gồm bạch cầu
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
6
trung tính (neutrophil), bạch cầu kiềm tính (basophil) và bạch cầu toan tính
(eosinophil).
2.3.1 Hồng cầu
Hồng cầu trưởng thành ở cá có hình tròn hoặc hình oval với nhân bắt
màu đậm và kích thước từ 10x11–12x13 µm, đường kính 4-5 µm. Hồng cầu
phổ biến trong máu ngoại vi của cá chủ yếu lá hồng cầu trưởng thành, hồng
cầu chưa trưởng vẫn tìm thấy nhưng rất ít và kích thước giống hồng cầu
trưởng thành nhưng nhân lớn hơn. Hồng cầu có tế bào chất bắt màu xanh nhạt
hoặc xám bởi thuốc nhuộm Wright và Giemsa (Chinabut et al., 1991).
2.3.2 Tế bào lympho
Tế bào lympho ở cá da trơn nhỏ hơn hồng cầu, kích thước biến động 6 -
11 µm. Tế bào có hình tròn, nhân chiếm toàn bộ tế bào bắt màu tím đậm khi

nhuộm với Giemsa, tế bào chất nhỏ không rõ ràng và thường bắt màu xanh
nhạt (Chinabut et al., 1991). Theo Phuong et al. (2007) chia tế bào lympho
trong máu cá trê lai thành 2 loại: tế bào lympho nhỏ có kích cở 3,92-5,00 µm
và, và tế bào lympho lớn có kích cở khoảng 5,09-8,77 µm và có số lượng lớn
nhất trong số tổng bạch cầu (17,55-108,37x10
3
tb/µL).
2.3.3 Tiểu cầu
Hình dạng thay đổi, có thể là hơi tròn, dài hoặc hơi thoi. Có vành mỏng
của tế bào chất bao quanh nhân. Tế bào chất có màu xanh nhạt khi nhuộm với
dung dịch Wright & Giemsa. Tiểu cầu tham gia vào quá trình đông máu trong
trường hợp bị tổn thương (Chinabut et al., 1991).
2.3.4 Bạch cầu đơn nhân
Bạch cầu đơn nhân là tế bào lớn nhất trong các dạng tế bào máu với
đường kính 10-14 µm, hình dạng không đều, chúng có tâm lệch, trong tế bào
chất tồn tại những không bào có nhiều kích thước khác nhau. Nhân bắt màu
xanh, tế bào chất bắt màu xanh nhạt. (Chinabut et al.,1991). Bạch cầu đơn
nhân chỉ tồn tại vài ngày trong vòng tuần hoàn máu, sau đó di chuyển xuyên
qua màng trong của mao mạch để liên kết với các mô và thực hiện chức năng
thực bào (Gartner & Hiatt, 1997). Chúng thực bào, hủy diệt những vật lạ (vi
khuẩn), những tế bào chết hoặc những tế bào già cỗi (như hồng cầu) và tham
gia vào quá trình trình diện kháng nguyên.
2.3.5. Bạch cầu trung tính
Tế bào lớn và tròn đường kính nhân 9-13 µm với số lượng lớn của
những hạt nhỏ trong tế bào chất màu xanh nhẹ hoặc hơi hồng. Nhân bắt màu
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
7
xanh đậm, chia hai thùy ở tế bào thành thục và dạng tròn thành thục và dạng
tròn lệch tâm ở dạng chưa trưởng thành (Chinabut et al., 1991). Ở động vật có
vú, bạch cầu trung tính là tế bào thực bào chính và xuất hiện nhanh tại vị trí

viêm. Nó có khả năng ăn những tế bào nhỏ nên còn được gọi là tiểu thực bào.
Finn & Nielson (1971) đã báo cáo về sự di chuyển và thực bào bởi bạch cầu
trung tính và các đại thực bào trong quá trình viêm do vi khuẩn ở cá hồi. Khi
bạch cầu trung tính thực hiện chức năng thực bào xong thì nó cũng chết và trở
thành đối tượng thực bào của đại thực bào (Hibiya, 1982), kết quả là xuất hiện
mủ tại chỗ viêm. Chúng chỉ tồn tại trong máu khoảng 10 giờ rồi đi ra khỏi ống
mạch tới mô.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8
Hình 2.3.5 Tế bào máu (Multimedia et al., 1988)
2.3.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến các thông số huyết học trên cá
Nhiều nghiên cứu cho thấy, các chỉ tiêu huyết học của cá chịu ảnh
hưởng bởi nhiều yếu tố: Ảnh hưởng của hàm lượng kẽm, nghiên cứu của Kori-
Siakpere et al. (2008) trên đối tượng Heteroclarias sp, khi cho cá tiếp xúc với
môi trường nước có lượng kẽm 5mg/l trong 15 ngày. Sau đó kiểm tra các chỉ
tiêu huyết học về chỉ tiêu haematocrit, haemoglobin, Trong đó, tổng số tế bào
bạch cầu (8,22 ± 0,09.10
3
tb/mm
3
) và hồng cầu (1,41 ± 0,06. 10
6
tb/mm
3
) điều
giảm nhưng không có ý nghĩa so với đối chứng (8,42 ± 0,06.10
3
tb/mm
3
) và

1,63 ± 0,12.10
6
tb/mm
3
), riêng tế bào lympho lại tăng. Ngoài ra, dưới điều
kiện stress do sự thay đổi giá trị của pH làm cho lượng bạch cầu giảm, tăng
A: Hồng cầu (erythrocyte) B: Bạch cầu đa nhân (granulocyte)
C: Bạch cầu đơn nhân (monocyte) D: Tiểu cầu (thrombocyte)
E: Lympho (lymphocyte) F: Lympho chưa trưởng thành
D
B A
E
C
F
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
9
lượng đường trong máu và tạo ra nhiều tế bào hồng cầu chưa trưởng thành ở 3
loài cá chép ấn độ (Jera et al., 2006).
Năm 2003, Harikrishnan et al. nghiên cứu huyết học của cá chép
(Cyprinus carpio) gây cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila, kết quả
cho thấy tế bào hồng cầu giảm, bạch cầu tăng so với đối chứng với giá trị lần
lượt là: 1,68 ± 0,12.10
6
tb/mm
3
, 3,6 ± 0,2.10
4
tb/mm
3
và 2.31 ± 0,16.10

3

tb/mm
3
, 3,15 ± 0,14.10
3
tb/mm
3
. Bên cạnh đó, cá rô phi (Nile tilapia) được gây
cảm vi khuẩn Enterococus sp. Sau 24 giờ kiểm tra chỉ tiêu huyết học cho kết
quả tương tự, số lượng hồng cầu giảm đi, còn số lượng bạch cầu tăng lên.
Trong đó, số lượng bạch cầu đơn nhân (monocyte) lại giảm so với đối chứng
(Martins et al., 2008).
Theo Dương Thành Long, 2008 đã nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học
trên cá tra với trọng lượng khác nhau. Cá nhỏ có trọng lượng trung bình 38,24
g/con mật độ hồng cầu 1,86.10
6
tb/mm
3
, tổng bạch cầu 7,39. 10
6
tb/mm
3
.
Trong khi đó, cá lớn có trọng lượng 1060g/con thì mật độ hồng cầu 1,32.10
6

tb/mm
3
, tổng bạch cầu 8,07. 10

6
tb/mm
3
. Kết quả cho thấy mật độ hồng cầu, tế
bào lympho và bạch cầu trung tính của cá nhỏ cao hơn cá lớn. Ngược lại, tổng
bạch cầu, tế bào monocyte và tiểu cầu thì thấp hơn cá lớn.
Ngoài ra, kết quả kiểm tra các chỉ tiêu huyết học của cá tra bị trắng gan
trắng mang (TGTM) cho thấy hồng cầu ở cá bị TGTM nhẹ (4,25.10
5
tế
bào/mm
3
) hay nặng (1,04.10
5
tế bào/mm
3
) đều giảm hơn so với cá khỏe
(2,27.10
6
tế bào/mm
3
), mật độ bạch cầu ở cá không có biểu hiện TGTM tăng
hơn so với cá khỏe. Trong khi đó, mật độ bạch cầu của cá bị TGTM nhẹ
(3,27.10
4
tế bào/mm
3
), TGTM nặng (0,99.10
4
tế bào/mm

3
) thì giảm hơn cá
khỏe (10,12.10
4
tế bào/mm
3
). Mật độ tiểu cầu, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu
trung tính giảm ở cá bị trắng gan trắng mang điều giảm, trừ tế bào lympho
tăng ở cá bị TGTM nhẹ (Phạm Thị Phương Tiến, 2008).
2.4 Một số kết quả gây cảm nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trong
phòng thí nghiệm
Thí nghiệm cảm nhiễm là việc làm rất quan trọng và không thể thiếu
trong nghiêu cứu bệnh học thủy sản vì “tác nhân gây bệnh phải có khả năng
gây bệnh khi gây nhiễm vào con vật mẫn cảm”. Tùy vào mục đích nghiên cứu
mà lựa chon phương pháp gây cảm nhiễm khác nhau, riêng đối với vi khuẩn
nói chung và vi khuẩn E. Ictaluri nói riêng thì thường dùng phương pháp tiêm
và phương pháp ngâm để gây cảm nhiễm cho cá.
Lương Trần Thục Đoan (2006) gây cảm nhiễm khảo sát sự xâm nhập
của vi khuẩn gây bệnh mủ gan trên các cơ quan khác nhau của cá tra theo 2
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
10
phương pháp ngâm và tiêm cho thấy ở phương pháp ngâm do mật độ vi khuẩn
thấp nên tỉ lệ cá chết thấp (8,3%), còn phương pháp tiêm cá chết với tỷ lệ
33,3%, 66,7% và 100% tương ứng với 3 mật độ 10
4
, 10
5
, 10
6
.

Tuy nhiên, theo Williams & Lawrence (2005) đã sử dụng vi khuẩn E.
ictaluri R4383 WT và R4383 HM với nồng độ lần lượt là 7,0 x 10
7
CFU/ml và
7,2x10
7
CFU/ml ngâm trên cá nheo Mỹ trong thời gian 30 phút, tỉ lệ chết là
90% và 85%. Đồng thời, tác giả cũng sử dụng phương pháp tiêm vi khuẩn E.
ictaluri để so sánh với phương pháp ngâm với mật độ vi khuẩn tăng dần. Đối
với vi khuẩn E. ictaluri R4383 WT tiêm với mật độ 5,2x10
3
CFU/ml, 5,2x10
4

CFU/ml, 5,2x10
5
CFU/ml thì tỉ lệ chết lần lượt là 67,2%, 100%, 100%. Trong
khi đó, tiêm E. ictaluri R4383 HM với mật độ vi khuẩn là 5,2x10
3
CFU/ml,
5,2x10
4
CFU/ml, 5,2x10
5
CFU/ml và 5,2x10
6
CFU/ml gây chết 63,5%, 98,7%,
100%, 100%. Qua kết quả thí nghiệm, họ kết luận rằng không có sự khác nhau
giữa hai phương pháp ngâm và tiêm.
Thí nghiệm của Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) khi tiến hành ngâm vi khuẩn

E. ictaluri ở mật độ 1,5x10
2
và 1,5x10
3
CFU/ml thì tỉ lệ cá chết dao động từ
56,6% đến 96,7%. Bên cạnh đó Tiết Ngọc Trân (2007) cũng ngâm với 2 dòng
vi khuẩn là 18764 và 223 mật độ 0,9x10
8
CFU/ml, sau 1h tỉ lệ xâm nhập của 2
dòng tương đối cao khoảng 10
4
-10
5
CFU/ml sau đó giảm dần, trong các cơ
quan phân tích thì ruột là cơ quan cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn E.
ictaluri cao nhất, kế đến là thận, tỳ tạng, gan.
Lê Minh Đương (2007) cũng tiến hành thí nghiệm trên cá tra bằng
phương pháp ngâm với 2 dòng vi khuẩn EH02 & E223 kết quả cho thấy tỉ lệ
nhiễm của dòng vi khuẩn EHO2 cao nhất là ở tỳ tạng (92,5%), thấp nhất là
não (27,5%). Trong khi đó, lô E223 thì tỉ lệ cảm nhiễm cao nhất là lớp nhớt
trên da (80%) và thấp nhất là mang (2,5%). Nghiên cứu này cũng xác định
được tỉ lệ cá chết dao động từ 2,5-92,5% với mật độ vi khuẩn là 10
8
CFU/ml.
Trong thí nghiệm xác định LD
50
của các chủng A1, CAF 258, T8, KSL
103, Lê Thượng Khởi (2009) xác định được LD
50
của 3 chủng CAF258, T8,

KSL103 với giá trị LD
50
lần lượt là 4,7x10
2
CFU/ml; 1,3x10
4
CFU/ml và
2,1x10
4
CFU/ml, còn chủng A1 không xác định được LD
50
do ở nồng độ thấp
(10
3
) đã gây chết 100% số cá thí nghiệm. Qua đó cho thấy độc chủng CAF
258 khá mạnh, còn LD
50
chủng A1 dưới 10
3
.


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11
PHẦN 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
- Thời gian: tháng 01/2009 đến 06/2009.
- Địa điểm: Phòng cảm nhiễm, phòng thí nghiệm của Bộ môn sinh học
và Bệnh Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ.

3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Đối tượng thí nghiệm
Cá tra giống có trọng lượng trung bình khoảng 20g/con, được mua từ
các trại giống thuộc khu vực Cần Thơ.
Nguồn vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được phân lập từ mẫu cá tra bị
bệnh gan thận mủ và được trữ trong tủ - 80
0
C của bộ môn sinh học và bệnh
thủy sản, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ và đã được xác định LD
50

(Lê Thượng Khởi, 2009) ở Bảng 3.1.
Bảng 3.2.1 Các chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm
STT Chủng vi khuẩn Năm thu mẫu Nguồn gốc LD
50

1 T8 2008 Thốt Nốt - Cần Thơ
1,3x10
4
CFU/ml
2 CAF258 2006 Châu Phú - An Giang
4,7x10
2
CFU/ml
3 KSL103 2008 Kế Sách - Sóc Trăng
2,1x10
4
CFU/ml

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị

• Que cấy, đèn cồn, hộp quẹt, ống nghiệm, đĩa petri thủy tinh, micropipet
1ml, 5ml, hộp đầu col 1ml, 5ml, chai 100ml, 250ml, 500ml, lame, lamen,
đĩa Petri viết lông dầu, viết chì, bình xịt cồn, sổ ghi chép, kim tiêm 1ml, bộ
tiểu phẩu, ống nghiệm, buồng đếm hồng cầu
• Bể Composite (2m
3
), bể thí nghiệm (100L), máy bơm nước (cấp nước
cho hệ thống thí nghiệm), máy sục khí, ống sục khí, đá bọt, tủ ấm, nồi
thanh trùng, máy ly tâm, máy so màu quang phổ, máy trộn mẫu (vortex).
Các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho nghiên cứu…
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
12
3.2.3 Hóa chất và môi trường nuôi cấy vi khuẩn
• NaCl, Na
2
SO
4
, Na
2
HPO
4
.2.H
2
O, NaH
2
PO
4
.2H
2
O, KH

2
PO
4

• Formaline (37%).
• Methanol
• Glycerol
• Wright, Giemsa.
• Acid citric
• Tripticase soy agar (TSA), nutrient broth (NB), Nutrient agar (NA).
• Cồn tuyệt đối, NaCl, H
2
O
2
, vaselin, hóa chất nhuộm gram, dầu paraffin,
oxidase và một số hóa chất và môi trường để test truyền thống.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Chuẩn bị hệ thống bể
• Bể Composite được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorin 200ppm, phơi
khô. Sau đó cấp nước vào:
• Đối với bể 2m
3
để trữ cá thì cấp nước khoảng 2/3 bể, sục khí 1-2 ngày
trước khi thí nghiệm. Bể được đặt ngoài trời có mái che (tránh mưa).
• Đối với bể thí nghiệm 100L thì cấp khoảng 60L nước, sục khí. Bể được
đặt trong phòng kín nhiệt độ phòng 26-28
0
C.
• Nguồn nước sử dụng là nguồn nước máy
Các dụng cụ thí nghiệm như: xô, dợt, ống sục khí, đá bọt…cũng được

vệ sinh kỹ.
3.3.2 Cách chuẩn bị dung dịch vi khuẩn
Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn
Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường NA/TSA ở 28
0
C. Sau 24-48
giờ quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nhuộm gram kiểm tra tính thuần
của vi khuẩn.
Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm
Nuôi tăng sinh vi khuẩn: sau khi có được đĩa vi khuẩn thuần, dùng que
cấy tiệt trùng lấy khoảng 2 đến 3 khuẩn lạc cho vào chai chứa khoảng 30ml
NB đã tiệt trùng, đặt lên máy lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ.
Sau 24 giờ chuyển vi khuẩn sang ống falcol 50ml tiệt trùng, đem ly tâm
4000 vòng/phút ở 4
0
C trong 15 phút. Sau khi ly tâm loại bỏ dung dịch phía
trên và dùng nước muối sinh lý tiệt trùng để rửa vi khuẩn (lặp lại 2-3 lần).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13


Hình 3.1 Sơ đồ chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm
Lần ly tâm cuối, loại bỏ phần dung dịch phía trên và cho vào khoảng
25ml dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng, sau đó trộn đều mẫu bằng máy
vortex. Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ với
bước sóng 590nm và điều chỉnh OD tương ứng để xác định mật độ vi khuẩn.
OD=0,1±0,02 tương ướng mật độ vi khuẩn là 10
8
cfu/ml.
Tiến hành pha loãng dung dịch vi khuẩn với các mật độ tương ứng với

giá trị LD
50
của từng chủng đem gây cảm nhiễm. Đồng thời tiến hành đếm mật
độ vi khuẩn trên môi trường thạch nhằm kiểm tra lại mật độ vi khuẩn ở từng
dung dịch đem cảm nhiễm.
3.3.3 Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cá
Dụng cụ dùng cho thí nghiệm được chuẩn bị và được vệ sinh sạch bằng
chlorine.
Nguồn nước được trữ trong bể chứa khoảng 3 ngày trước khi bố trí thí
nghiệm.
Phục hồi và nuôi tăng sinh vk
E.ictaluri
Xác định đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
Nuôi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường NB lỏng
Ly tâm (2-3 lần)
Xác định mật độ vi khuẩn
Đo qua máy so màu
(DO)
Đếm trên môi trường
thạch (TSA)
Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
14
Cá tra giống có trọng lượng khoảng 20g/con, da sáng và phản ứng linh
hoạt với tiếng động. Cá mua về được trữ trong bể composite, có sục khí, cho
ăn thức ăn công nghiệp, cho ăn theo nhu cầu của cá. Thuần cá khoảng 1-2 tuần
trước khi tiến hành thí nghiệm.
Trước khi bố trí thí nghiệm, cá được kiểm tra kí sinh trùng và vi sinh.
Sau đó chọn những con cá khỏe, đồng cỡ để bố trí gây cảm nhiễm.
3.3.4 Bố trí thí nghiệm gây cảm nhiễm

Thí nghiệm thực hiện trên 3 chủng Edwardsiella ictaluri có LD
50
khác
nhau. Đối với chủng T8 có giá trị LD
50
là 1,3x10
4
CFU/ml, còn chủng
CAF258 là 4,7x10
2
CFU/ml và 2,1x10
4
CFU/ml là giá trị LD
50
của chủng
KSL103. Thí nghiệm gồm hai đối chứng: Cá không tiêm dung dịch vi khuẩn;
cá được tiêm nước muối sinh lý 0,85 % . Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn
ngẫu nhiên và được lập lại 3 lần với các ngiệm thức sau:
• Nghiệm thức 1: Cá được tiêm dung dịch vi khuẩn ở nồng độ LD
50

chủng T8.
• Nghiệm thức 2: Cá được tiêm dung dịch ở nồng độ LD
50
chủng CAF
258.
• Nghiệm thức 3: Cá được tiêm dung dịch vi khuẩn ở nồng độ chủng
KSL 103.
Mỗi nghiệm thức được bố trí cá với mật độ 10 con/ xô nhựa (100L)
chứa khoảng 60 L nước, có bố trí sục khí (Hình 3.1). Mỗi cá thể được tiêm 0.1

ml dung dịch vi khuẩn, vị trí tiêm ở xoang bụng (gốc vây ngực).
3.3.5 Thời gian thu mẫu
• Trước thí nghiệm ( Trước TN): Được thu trước khi tiêm vi khuẩn.
• Lần 1: Cá được thu từ khi xuất hiện dấu hiệu bệnh lý hay vừa chết
sau khi gây cảm nhiễm (4 đến 6 ngày), thu 10 con/chủng vi khuẩn.
• Lần 2: Cá được thu lúc kết thúc thí nghiệm (sau 12 ngày gây cảm
nhiễm), thu 10 con/ chủng vi khuẩn.
• Sau thí nghiêm (Sau TN): Thu cùng lúc với cá thu lần 2 (sau 12
ngày gây cảm nhiễm).
3.4 Phương pháp phân tích mẫu
Cá sau khi thu được cân trọng lượng, đo chiều dài và quan sát những
biểu hiện bên ngoài. Sau đó, dùng cồn (70
0
) sát trùng quanh khu vực lấy máu,
sau đó dùng ống tiêm tiệt trùng 1ml lấy máu ở động mạch đuôi của cá (lượng
máu tối thiểu là 0,3ml). Nhỏ máu xuống lam, dùng pipet hút 10µl máu cho vào
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15
ống nghiệm nhựa có chứa 1990µl dung dịch Natt & Herrick để đếm hồng cầu.
Tiếp tục nhỏ một giọt máu lên một góc lame khác (lập lại 3 lần) cho thao tác
trãi mẫu để đếm bạch cầu.
Trãi mẫu máu: cho lamelle chạm vào giọt máu, đẩy lamelle ngược về
phía trước (Hình 3.1). Mẫu máu sau khi khô được cố định bằng cách ngâm
trong methanol 1-2 phút (Rowley, 1990 trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thúy Liễu,
2008). Để mẫu khô tự nhiên và trữ lạnh.

Hình 3.4 Thao tác lấy mẫu máu và trải mẫu ( Đoàn Nhật Phương, 2007).
3.4 1 Phương pháp đếm hồng cầu (Natt and Herrick, 1952)
Lắc nhẹ cho đều ống nghiệm. Mật độ hồng cầu sẽ được xác định bằng
buồng đếm hồng cầu thông qua sự quan sát dưới kính hiển vi quang học

(40X). Đầu tiên xem ở vật kính 10X, định vị 5 vùng đếm (vùng ký hiệu chữ
C), đưa vào giữa thị trường, chuyển sang vật kính 40X. Đếm 2 lần lặp lại.

Hình 3.4.1 Buồng đếm hồng cầu (Phuong et al., 2007)
Cách tính mật độ hồng cầu:
R = C x 10 x 5 x D (tb/mm
3
)
Trong đó: R: mật độ tế bào hồng cầu/ mm
3
.
C: là tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm.
Lamelle

Lame

10X
40X

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
10: khoảng cách giữa lamella và buồng đếm (0,1 mm).
5: diện tích của 5 vùng đếm (0,2 mm
2
).
D: hệ số pha loãng (200).
3.4 2 Định lượng và định loại các tế bào bạch cầu (Humason, 1979)
v Nhuộm mẫu
Mẫu máu đã được cố định trên lame sẽ nhuộm bằng dung dịch nhuộm
Wright & Giemsa (Chinabut & ctv, 1991):

• Nhuộm với dung dịch Wright trong 3-5 phút. (Phụ lục B)
• Ngâm trong dung dịch pH 6,2 – 6,8 trong 5 -6 phút. (Phụ lục B)
• Nhuộm với dung dịch Giemsa trong 20 – 30 phút. (Phụ lục B)
• Ngâm trong dung dịch pH 6,2 trong 15 – 30 phút. (Phụ lục B)
• Rửa sạch lại bằng nước cất, để mẫu khô tự nhiên và đọc mẫu.
Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính X100. Định loại các tế bào máu
theo Chinabut & ctv (1991).
v Đọc kết quả
Đọc mẫu theo hình Z-Z:



Tổng bạch cầu (TBC)
Đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu trên 1.500 tế bào trên mẫu nhuộm.
TBC(tb/mm
3
)=(số bạch cầu trong 1500 tế bào x R)/số hồng cầu trong
1500 tế bào.
Trong đó:
TBC: mật độ tổng bạch cầu.
R: mật độ tế bào hồng cầu (tb/mm
3
).
Từng loại bạch cầu
Đếm tổng số bạch cầu bằng 200 tế bào.
Mật độ từng loại bạch cầu (tb/mm
3
) = (số lượng mỗi loại bạch cầu x
TBC)/200

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
17
3.5 Tái phân lập và tái định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri theo
phương pháp truyền thống
Sự tái định danh của vi khuẩn sẽ được thực hiện thông qua phương pháp định
danh truyền thống được mô tả theo phương pháp chung của phòng thí nghiệm
Bệnh học thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần thơ.
v Các bước thực hiện
• Ghi nhận các dấu hiệu bên ngoài của cá.
• Giải phẩu cá ghi nhận biểu hiện của các cơ quan nội tạng.
• Phân lập vi khuẩn từ 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng lên môi trường
thạch TSA. Áp dụng các biện pháp vô trùng để tránh trường hợp bị
tạp nhiễm.
• Ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 28-30
o
C. Sau 48 giờ quan sát và ghi
nhận hình thái của khuẩn lạc. Tiếp tục tách ròng, theo dõi để đạt đĩa
cấy thuần. Sau đó tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản về hình thái
(di động, gram, hình dạng), sinh lý (Oxidase, catalase, O/F) và một
số chỉ tiêu sinh hóa (Phụ lục A).
3.6 Xử lý số liệu
Số liệu sẽ được xử lý bằng phần mềm SPSS với mức ý nghĩa 0,05% ( phép thử
Ducan và phép thử LSD).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version