Độ an toàn của cao chiết khổ sâm (Croton tonkinensis) đối với tôm thẻ (Penaeus vannamei) ở điều kiện in vitro

VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

ĐỘ AN TỒN CỦA CAO CHIẾT KHỔ SÂM (Croton tonkinensis)
ĐỐI VỚI TÔM THẺ (Penaeus vannamei) Ở ĐIỀU KIỆN IN VITRO
Trương Hồng Việt1*, Đỗ Thị Cẩm Hồng1, Trần Bùi Trúc Quân2, Vũ Thiên Ân1

TÓM TẮT
Các loại thảo mộc và cây thuốc hứa hẹn sẽ trở thành nguồn cung cấp các liệu pháp chữa bệnh cho
ni tơm cá vì các sản phẩm này cung cấp với giá rẻ hơn để điều trị và không gây độc. Dịch chiết
từ cây khổ sâm (Croton tonkinensis) được cho là có chứa các lớp chất chủ yếu là các hợp chất hữu
cơ như flavonoid, alkaloid, polyphenol... Mục tiêu của nghiên cứu này là kiểm tra tính an tồn của
cao chiết khổ sâm trong điều kiện in vitro để làm cở sở ứng dụng trong ao ni. Thí nghiệm kiểm
tra độc tính của cao chiết khổ sâm qua đường ăn được thực hiện với các nồng độ trộn vào thức ăn
từ 0 đến 45% (450 g/kg thức ăn). Đối với thí nghiệm ngâm cao chiết vào nước ni tơm được thực
hiện với các nồng độ từ 0 đến 160 ppm. Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết khổ sâm gây độc yếu
đối với tôm nuôi qua đường ăn. Ở nồng độ cao chiết 45%, tỷ lệ trung bình tơm bị chết sau 48 giờ là
15% và tỷ lệ trung bình tơm chết là 21,67% sau 96 giờ. Đối với thí nghiệm ngâm cao chiết khổ sâm
vào nước ni tơm cho thấy ở nồng độ 20 ppm, tôm sống 100% sau 96 giờ tiếp xúc với cao chiết
và tỷ lệ tôm chết 100% sau 96 giờ ở nồng độ 150 ppm. Giá trị LC50 của cao chiết khi cho trực tiếp
vào nước nuôi tôm được xác định ở các thời điểm 48, 72 và 96 giờ rất cao, với nồng độ lần lượt là
93,02; 81,25, và 81,25 ppm. Trong khi LC50 của các nồng cao chiết được trộn vào thức ăn không
được xác định do tỷ lệ gây chết tôm thí nghiệm < 50%. Từ các kết quả trên, chúng tơi kết luận cao
chiết khổ sâm an tồn đối với tơm thẻ chân trắng ở điều kiện in vitro.
Từ khố: Cao chiết, Croton tonkinensis, khổ sâm, LC50, tôm thẻ chân trắng.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm qua, việc sử dụng kháng
sinh và hố chất để phịng trị bệnh nhiễm khuẩn
đã gây ra tình trạng bất lợi trong lĩnh vực ni
trồng thủy sản. Điều này có thể làm xuất hiện
nhiều chủng vi khuẩn có khả năng kháng kháng

sinh. Ngồi ra, dư lượng của nó khơng những
làm hại mơi trường ni thuỷ sản mà cịn ảnh
hưởng khơng tốt đến sức khoẻ của con người
(Syahidah, 2014). Các loại thảo mộc và cây
thuốc hứa hẹn sẽ trở thành nguồn cung cấp
các liệu pháp chữa bệnh cho ni cá vì các sản
phẩm này cung cấp với giá rẻ hơn để điều trị và
chính xác hơn mà không gây độc (Madhuri &
ctv., 2012). Các chế phẩm thảo dược có vai trị
quan trọng trong kiểm sốt dịch bệnh vì chúng
có chứa các thành phần hoạt tính bao gồm chất
chống oxy hố, chống vi khuẩn, chống stress,

kích thích tăng trưởng, kích thích sự thèm ăn
và tăng cường miễn dịch ở cá và tôm (Citarasu
& ctv., 2001). Theo Lee & Gao (2012), các loại
thảo dược hoạt động như là một hương vị nên nó
có khả năng ảnh hưởng đến sự thèm ăn của vật
ni như tiết dịch tiêu hóa và tăng lượng thức ăn
ăn vào, đồng thời cũng là một trong những yếu
tố góp phần làm giảm hệ số chuyển hoá thức ăn
(Venketramalingam & ctv., 2007). Theo Đỗ Tất
Lợi (2004), trong rễ, thân và lá của cây khổ sâm
(Croton tonkinensis) có chứa các lớp chất chủ
yếu là các hợp chất diterpenoid như flavonoid,
alcaloid, polyphenol... Nó thuộc nhóm cây thuốc
và vị thuốc được dùng làm thuốc bổ, thuốc bồi
dưỡng, có tác dụng tốt với tiêu hóa và bệnh
đau dạ dày. Trong hầu hết các trường hợp, các
hoạt chất như là polyphenol, polysaccharides,

proteoglycans và flavonoids đóng một vai trị

Trung tâm Quan trắc Môi trường và Bệnh Thủy sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II.
Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
*Email:

1
2

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019

35


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

chính trong việc ngăn ngừa hoặc kiểm soát các
vi khuẩn lây nhiễm (Citarasu & ctv., 2003). Để
làm cơ sở cho sự an toàn của cao chiết trong
việc ứng dụng phịng bệnh tơm, chúng tơi thực
hiện các thí nghiệm đánh giá độ an tồn của
cao chiết khổ sâm qua đường ăn và qua đường
nước nuôi để xác định liều gây chết 50% sau
96 giờ thí nghiệm (APHA, 2005).

ml trong cồn thực phẩm, lấy với lượng xác định
rồi trộn vào thức ăn, sau đó thêm nước vào với
tỷ lệ nước và thức ăn 1:1. Bột thức ăn sau khi
trộn đều được đưa vào máy quay để tạo thành
hạt, rồi quạt gió cho khơ ở nhiệt độ phòng trong

vòng 24 giờ. Thức ăn được tách thành hạt riêng
lẻ và được bảo nơi thoáng mát đến khi làm thí
nghiệm.

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.2.2. Xác định tính an toàn của cao chiết
khổ sâm trộn vào thức ăn tôm

2.1. Vật liệu
+ Cao chiết thô khổ sâm được cung cấp bởi
Viện hoá học và các hợp chất thiên nhiên. Dịch
thô được tách chiết bằng cồn tuyệt đối, cô đặc
và được bảo quản ở nhiệt độ phịng.
+ Tơm thẻ chân trắng được ương nuôi từ
tôm ấu trùng đến khi đạt trọng lượng từ 2-3
gram, có nguồn gốc từ Trung tâm Giống Hải
sản Nam Bộ thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi
trồng Thuỷ sản II. Tôm được thu mẫu kiểm
tra các mầm bệnh bao gồm WSSV (White
Spot Syndrome Virus), TSV (Taura Syndrome
Virus), IHHNV (Infectious Hypodermal and
Haematopoietic Necrosis Virus), YHV (Yellow
Head Virus) và bệnh hoại tử gan tuỵ cấp AHPND (Acute Hepatopancreatic necrosis
disease) bằng phương pháp PCR. Ngoài ra,
bệnh hoại tử gan tuỵ cấp được kiểm tra bằng
phương pháp mô học.
+ Nước biển được khử trùng bằng chlorine
với liều 30 ppm, sục khí mạnh và liên tục trong
1 tuần (để trung hoà chlorine) trước khi dùng.

+ Các thông số chất lượng nước như là
nhiệt độ (28-29°C), độ mặn (20‰), oxi hồ tan
(sục khí mạnh và liên tục, DO > 6 mg/l) và pH
(7,5-8,5) được duy trì trong suốt thời gian thí
nghiệm.
+ Tơm trước khi làm thí nghiệm được ni
thuần 7 ngày tại phịng thí nghiệm thuộc Trung
tâm Quan trắc Môi trường và Bệnh Thủy sản
Nam Bộ.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Trộn cao chiết thô vào thức ăn
Thức ăn tôm được nghiền thành bột mịn.
Cao chiết được pha thành dung dịch gốc 0,5 g/
36

2.2.2.1. Thí nghiệm thăm dò để xác định
khoảng gây độc của cao chiết khổ sâm trộn
vào thức ăn
Thí nghiệm được thực hiện với 6 nồng
độ cao chiết khổ sâm là 0, 2, 4, 8, 16 và 20%
lượng thức ăn tôm. Mỗi nghiệm thức được lặp
lại 3 lần trong bể nhựa 90 lít có chứa 30 lít
nước biển, mỗi bể thí nghiệm có 20 con tôm
cỡ 3-4 g/tôm. Tôm được cho ăn 3 lần/ngày với
tỷ lệ 3% trọng lượng thân, các bể được sục khí
liên tục, khơng thay nước trong suốt thời gian
thí nghiệm, và tôm chết được vớt ra ngay để
không ảnh hưởng xấu đến chất lượng nước
trong suốt thời gian thí nghiệm. Ghi nhận số
tôm chết hàng ngày và theo dõi trong 96 giờ để

xác định khoảng gây độc (nồng độ cao nhất mà
tôm sống 100% và nồng độ thấp nhất gây chết
tơm 100%).
2.2.2.2. Thí nghiệm xác định nồng độ gây
chết 50% (LC50) của cao chiết khổ sâm trộn
vào thức ăn
Thí nghiệm được thực hiện dựa theo
phương pháp của APHA (2005). Thí nghiệm
được bố trí 5 nồng độ cao chiết khổ sâm nằm
trong khoảng gây độc được xác định từ thí
nghiệm thăm dị. Nghiệm thức đối chứng,
tơm được cho ăn thức ăn trộn 0% cao chiết.
Phương pháp thực hiện giống như thí nghiệm
thăm dị ở mục 2.2.2.1. Ghi nhận số tơm
chết hàng ngày và theo dõi trong suốt 96 giờ
để xác định nồng độ gây chết 50% (LC50)
bằng chương trình máy tính (Stephan &
Rodgers, 1985) theo hướng dẫn của ASTM
(American Society for Testing and Materials,
Philadelphia) (1993).

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

2.2.3. Xác định tính an tồn của cao chiết
khổ sâm ngâm vào nước ni tơm
2.2.3.1. Thí nghiệm thăm dị để xác định
khoảng gây độc của cao chiết khổ sâm ngâm

vào nước ni tơm
Thí nghiệm được thực hiện với 6 nồng
độ cao chiết khổ sâm là 0, 20, 40, 80, 160 và
180 ppm cho trực tiếp vào bể thí nghiệm. Mỗi
nghiệm thức được lặp lại 3 lần trong bể nhựa 90
lít có chứa 30 lít nước biển, mỗi bể thí nghiệm
có 20 con tơm. Tôm được cho ăn với thức ăn
thương mại 3 lần/ngày với tỷ lệ 3% trọng lượng
thân. Các bể được sục khí liên tục, khơng thay
nước trong suốt thời gian thí nghiệm, và tôm
chết được vớt ra ngay để không ảnh hưởng
xấu đến chất lượng nước trong suốt thời gian
thí nghiệm. Ghi nhận số tôm chết hàng ngày và
theo dõi trong suốt 96 giờ để xác định khoảng
gây độc (nồng độ cao nhất mà tôm sống 100%
và nồng độ thấp nhất gây chết tơm 100%).
2.2.3.2. Thí nghiệm xác định nồng độ gây
chết 50% (LC50) của cao chiết khổ sâm ngâm
vào nước ni tơm
Thí nghiệm được thực hiện dựa theo phương
pháp của APHA (2005). Thí nghiệm được bố trí
5 nồng độ cao chiết khổ sâm nằm trong khoảng
gây độc được xác định từ thí nghiệm thăm dị.
Nghiệm thức đối chứng khơng ngâm cao chiết.
Phương pháp thực hiện giống như thí nghiệm
thăm dị ở mục 2.2.3.1. Ghi nhận số tôm chết
hàng ngày và theo dõi trong suốt 96 giờ để xác
định nồng độ gây chết 50% (LC50).
2.2.4. Phương pháp mơ học

Quy trình xử lý mô học được thực hiện
dựa theo phương pháp được mô tả bởi Bell &
Lightner (1998). Tôm lờ đờ sắp chết (tôm nằm
nghiêng một bên) hoặc tôm sống sau khi kết thúc
thí nghiệm được cố định ngay vào dung dịch
Davidson (330 ml ethanol 95%, 220 ml formalin
100%, 115 ml axít acetic đậm đặc, và 335 ml
nước cất) trong suốt 24 giờ, sau đó chuyển qua
dung dịch ethanol 70% để bảo quản lâu hơn.
Mô gan tuỵ tôm được khử nước, được đúc vào
khối parafin, được cắt thành lát mỏng 5 μm, và
được nhuộm với hai thuốc nhuộm hematoxylin
và eosin. Kết quả quan sát cấu trúc mô bệnh học
được kiểm tra bằng cách quan dưới kính hiển vi.
III. KẾT QUẢ
3.1. Kết quả thử nghiệm độc tính của cao
chiết khổ sâm qua đường ăn
3.1.1. Thí nghiệm thăm dị để xác định
khoảng nồng độ gây độc của cao chiết
Tỷ lệ chết trung bình của tơm thí nghiệm
ở các thời điểm 24, 48, 72, và 96 giờ khi cho
tôm ăn với các nồng độ cao chiết khổ sâm được
trộn vào thức ăn bao gồm 0, 2, 4, 8, 16, và 20%,
được trình bày ở Bảng 1. Khơng có tơm chết ở
các nghiệm thức đối chứng (0%), nghiệm thức
2% và nghiệm thức 4% trong suốt 96 giờ thí
nghiệm. Ở nồng độ 8%, tỷ lệ tơm chết trung
bình từ 5±5% đến 8,33±5,77% sau 24 đến 96
giờ. Tỷ lệ trung bình tơm bị chết giống nhau ở
72 và 96 giờ ở các nồng độ cao chiết 8, 16 và

20% lần lượt là 8,33±5,77%; 13,33±2,89% và
16,67±2,89%; và các tỷ lệ này khơng có sự khác
biệt ý nghĩa thống kê (P > 0,05) (Bảng 1).

Bảng 1: Tỷ lệ chết (trung bình ± sai số chuẩn) của tơm thí nghiệm thăm dị sau khi tơm được
cho ăn cao chiết khổ sâm với các nồng độ khác nhau.
Tỷ lệ (%) trung bình tơm chết theo thời gian thí nghiệm
Nồng độ
cao chiết
24 giờ
48 giờ
72 giờ
96 giờ
0%
0±0
0±0
0±0
0±0
2%
0±0
0±0
0±0
0±0
4%
0±0
0±0
0±0
0±0
a
8,33a ± 5,77

8%
5±5
5±5
8,33 ± 5,77
13,33a ± 2,89
16 %
5±0
5±0
13,33a ± 2,89
16,67a ± 2,89
20 %
6,67 ± 2,89
16,67 ± 2,89
16,67a ± 2,89
* Các chữ cái thể hiện khác biệt ý nghiã thống kê P < 0,05 theo cột (Tukey’ HSD)
TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019

37


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

3.1.2. Thí nghiệm xác định LC50 của cao
chiết trộn vào thức ăn

ăn cao chiết, tơm chết sau 24 giờ, có tỷ lệ chết
trung bình từ 1,67±2,89% đến 5±0%. Tỷ lệ trung
bình tơm bị chết sau 48 giờ ở nồng độ cao chiết
cao nhất (45%) là 15±5%. Ở thời điểm 72 và
96 giờ, tỷ lệ trung bình tơm chết ở nồng độ cao

nhất của thí nghiệm (45%) là tương đương nhau
(21,67±2,89%). Kết quả phân tích thơng kê cho
thấy tỷ lệ trung bình tơm chết không khác biệt ý
nghĩa thống kê (P>0,05) giữa các nghiệm thức
cho tôm ăn các nồng độ cao chiết trong suốt 96
giờ thí nghiệm. Do các kết quả tỷ lệ tơm chết
<50%, nên số liệu này không xác định được giá
trị LC50 ở các thời điểm quan sát (Bảng 2).

Từ kết quả thí nghiệm thăm dị với các nồng
độ cao chiết trộn vào thức ăn từ 0 đến 20% cho
thấy tỷ lệ tôm chết rất thấp < 17% sau 96 giờ, vì
vậy thí nghiệm tiếp theo được thực hiện với các
nồng độ cao hơn. Tôm được cho ăn hàng ngày
với các nồng độ cao chiết khổ sâm được trộn
vào thức ăn bao gồm 0, 25, 30, 35, 40, và 45%.
Tỷ lệ chết trung bình của tơm thí nghiệm ở các
thời điểm 24, 48, 72, và 96 giờ được trình bày ở
bảng 2. Kết quả thí nghiệm cho thấy khơng có
tơm chết ở nghiệm thức đối chứng (0%) trong
suốt 96 giờ thí nghiệm. Ở tất cả các nghiệm thức

Bảng 2: Tỷ lệ chết (trung bình ± sai số chuẩn) của tơm thí nghiệm xác định LC50 sau khi tiếp
xúc với cao chiết khổ sâm với các nồng độ khác nhau.
Tỷ lệ (%) trung bình tơm chết theo thời gian thí nghiệm

Nồng độ
cao chiết

24 giờ

48 giờ

72 giờ

96 giờ

0%

0±0

0±0

0±0

0±0

25 %

3,33a ± 2,89

11,67ab ± 2,89

15a ± 5

16,67a ± 2,89

30 %

1,67a ± 2,89

10ab ± 0

18,33a ± 2,89

18,33a ± 2,89

35 %

3,33a ± 2,89

6,67a ± 2,89

15a ± 5

18,33a ± 5,77

40 %

5a ± 0

10ab ± 0

18,33a ± 5,77

20a ± 5

45 %

3,33a ± 2,89

15b ± 5

21,67a ± 2,89

21,67a ± 2,89

LC50

-

-

-

-

Các chữ cái thể hiện khác biệt ý nghĩa thống kê P < 0,05 theo cột (Tukey’ HSD)

3.1.3. Ảnh hưởng của cao chiết đến gan
tụy tôm qua đường ăn
Sau 96 giờ tôm được cho ăn cao chiết khổ
sâm, tôm sống được cố định bằng dung dịch
Davidson để phân tích cấu trúc mơ học, kết quả
được trình bày ở Hình 1. Gan tuỵ tơm ở nhóm
đối chứng (Hình 1A1) có cấu trúc bình thường

38

bao gồm có nhiều tế bào tiết hay tế bào B (chứa

một không bào lớn). Gan tuỵ của tôm ăn thức ăn
có trộn 2% cao chiết của khổ sâm (Hình 1B1),
4% (Hình 1C1) và 45% (Hình 1D1) vẫn duy trì
cấu trúc bình thường như nhóm đối chứng. Các
kết quả trên cho thấy cao chiết khổ sâm không
gây ảnh hưởng đến cấu trúc gan tụy của tơm.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

Hình 1. Cấu trúc mô học của gan tuỵ tôm được ăn cao chiết khổ sâm trộn vào thức ăn với liều 0, 2,
4 và 45% sau khi kết thúc thí nghiệm ở 96 giờ.
(A1) nhóm đối chứng hiện diện nhiều tế bào B,
(B1) nhóm ăn cao chiết khổ sâm 2%,

và (D1) nhóm ăn cao chiết khổ sâm 45% vẫn có cấu
trúc gan bình thường với nhiều tế bào B như nhóm đối chứng.

(C1) nhóm ăn cao chiết khổ sâm 4%,

Mũi tên: tế bào B có chứa một khơng bào lớn (X200).

3.2. Kết quả thử nghiệm độc tính của cao
chiết khổ sâm qua đường nước ni
3.2.1. Thí nghiệm thăm dị để xác định
khoảng nồng độ của cao chiết khổ sâm ngâm
vào nước nuôi tơm
Tỷ lệ chết trung bình của tơm thí nghiệm

khi tiếp xúc với các nồng độ cao chiết khổ sâm
khác nhau ở các thời điểm 24, 48, 72, và 96 giờ
được trình bày ở Bảng 3. Khơng có tơm chết
ở đối chứng (0 ppm) và nghiệm thức 20 ppm
trong suốt 96 giờ thí nghiệm. Ở nồng độ 40
ppm, tơm khơng chết sau 24 giờ tiếp xúc với
cao chiết, tỷ lệ chết trung bình được quan sát

sau 48 giờ rất thấp (16,67±2,89%), và tỷ lệ này
không thay đổi sau 96 giờ. Ở các nồng 80, 160
và 180 ppm, tỷ lệ trung bình tôm bị chết sau 24
giờ tăng dần theo nồng độ cao chiết, lần lượt là
13,33±7,64%; 21,67±7,64% và 38,33±2,89%;
và tỷ lệ tơm chết ở nghiệm thức 180 ppm có
khác biệt ý nghĩa thống kê (P<0,05) với các
nghiệm thức 80 và 160 ppm. Tỷ lệ trung bình
tơm chết 100% sau 72 giờ ở nồng độ 160 ppm.
Trong khi đó, ở nồng độ 180 ppm, tỷ lệ trung
bình tơm chết 100% sau 48 giờ. Tỷ lệ chết trung
bình của các nghiệm thức có khác biệt ý nghĩa
thống kê (P<0,05) sau 48, 72, và 96 giờ ở các
nồng độ từ 40 đến 180 ppm.

Bảng 3: Tỷ lệ chết (trung bình ± sai số chuẩn) của tơm thí nghiệm thăm dị sau khi tiếp xúc
với cao chiết khổ sâm với các nồng độ khác nhau.
Tỷ lệ (%) trung bình tơm chết thời gian thí nghiệm

Nồng độ
cao chiết

24 giờ

48 giờ

72 giờ

96 giờ

0 ppm
20 ppm
40 ppm
80 ppm
160 ppm
180 ppm

0±0
0±0
0±0
13,33a ± 7,64
21,67a ± 7,64
38,33b ± 2,89

0±0
0±0
16,67a ± 2,89
31,67b ± 2,89
95c ± 8,66
100c ± 0

0±0

0±0
16,67a ± 2,89
33,33b ± 2,89
100c ± 0
100c ± 0

0±0
0±0
16,67a ± 2,89
33,33b ± 2,89
100c ± 0
100c ± 0

* Các chữ cái thể hiện khác biệt ý nghiã thống kê P < 0,05 theo cột (Tukey’ HSD)

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019

39


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

3.2.2. Thí nghiệm xác định LC50 của cao
chiết được ngâm vào nước nuôi tơm
Tỷ lệ chết của tơm thí nghiệm khi tiếp xúc

với các nồng độ cao chiết khổ sâm khác nhau ở
các thời điểm 24, 48, 72, và 96 giờ, được trình
bày ở Bảng 4.

Bảng 4: Tỷ lệ chết (trung bình ± sai số chuẩn) của tơm thí nghiệm xác định LC50 sau khi tiếp
xúc với cao chiết khổ sâm với các nồng độ khác nhau.
Tỷ lệ (%) trung bình tơm chết thời gian thí nghiệm
Nồng độ
cao chiết
24 giờ
48 giờ
72 giờ
96 giờ
0 ppm
30 ppm
60 ppm
90 ppm
120 ppm
150 ppm
LC50 (ppm)

0±0
0a ± 0
10ab ± 5
18,33bc ± 2,89
18,33bc ± 5,77
28,33c ± 5,77
-

0±0
6,67a ± 2,89
18,33ab ± 7,64
36,67b ± 12,58
86,67c ± 11,55

90c ± 8,66
93,02

0±0
11,67a ± 2,89
30ab ± 15
50b ± 5
93,33c ± 7,64
100c ± 0
81,25

0±0
11,67a ± 2,89
30ab ± 15
50b ± 5
93,33c ± 7,64
100c ± 0
81,25

(-) không xác định; Các chữ cái thể hiện khác biệt ý nghĩa thống kê P < 0,05 theo cột (Tukey’ HSD).

Số liệu cho thấy khơng có tơm chết ở
nhóm đối chứng (0 ppm) trong suốt 96 giờ
thí nghiệm. Ở nồng độ 30 ppm, tôm không
chết sau 24 giờ tiếp xúc với cao chiết, tỷ lệ
chết trung bình được quan sát sau 48 giờ rất
thấp (6,67±2,89%), và tỷ lệ chết trung bình
giống nhau ở 72 và 96 giờ (11,67±2,89%). Ở
các nồng 90, 120 và 150 ppm, tỷ lệ trung bình
tơm chết sau 24 giờ lần lượt là 18,33±2,89%;

18,33±5,77% và 28,33±5,77%; và các tỷ lệ
tôm chết này khơng có khác biệt ý nghĩa
thống kê (P>0,05). Tỷ lệ trung bình tơm chết
100% sau 72 và 96 giờ ở nồng độ 150 ppm.
Trong khi đó, ở nồng độ 120 ppm, tỷ lệ trung
bình tơm chết 93,33±7,64% sau 72 và 96 giờ.
Ở các thời điểm 48, 72, và 96 giờ thí nghiệm,
tỷ lệ trung bình tơm chết của nghiệm thức
cho tơm ăn các nồng độ cao chiết có khác
biệt ý nghĩa thống kê (P<0,05). Từ số liệu tỷ
lệ gây chết tôm được thu nhận, giá trị LC50
được xác định ở các thời điểm 48, 72 và 96
giờ lần lượt là 93,02; 81,25; và 81,25 ppm
(Hình 2, 3, và 4). Trong khi, ở thời điểm 24
giờ, giá trị LC50 khơng xác định được do tỷ
lệ chết thấp.

40

Hình 2. Đồ thị phân tích hồi quy để xác định
LC50 sau 48 giờ tiếp xúc với cao chiết khổ sâm.

Hình 3. Đồ thị phân tích hồi quy để xác định
LC50 sau 72 giờ tiếp xúc với cao chiết khổ sâm.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

Hình 4. Đồ thị phân tích hồi quy để xác định
LC50 sau 96 giờ tiếp xúc với cao chiết khổ sâm.
IV. THẢO LUẬN
Các nghiên cứu gần đây đã báo cáo rằng để
đánh giá tác động của thức ăn lên đường tiêu
hóa (gan và dạ dày), có thể sử dụng phương
pháp mơ bệnh học để giám sát (Božidar & ctv.,
2011; Miriam & Menon, 2005). Ở cơ quan gan
tuỵ của tôm, cấu trúc cơ bản bao gồm các ống
được phân nhánh và có các loại tế bào biểu mô
như là tế bào mầm (E), tế bào sợi (F), tế bào dự
trữ (R), và tế bào tiết (B) xếp thành ống được
gọi là ống gan. Các ống gan dễ dàng bị thay đổi
cấu trúc và các tế bào biểu mơ khi tiếp xúc các
chất độc hố học hay chất độc sinh học (Jacobs,
1928; Bhavan & Geraldin, 2000). Ngoài ra, theo
Bautista & ctv., (1994) và Wu & ctv., (2008)
báo cáo rằng cơ quan gan tuỵ rất nhạy với các
loại thức ăn khác nhau, các chất gây ô nhiễm
nước và các chất có tính độc. Vì vậy, nó thường
được dùng để kiểm tra ảnh hưởng của các chất
độc khác nhau. Mẫu gan tuỵ của tôm sắp chết
hoặc tôm sống sau khi kết thúc thí nghiệm được
cố định trong dung dịch Davidson để phân tích
cấu trúc mơ học. Kết quả nghiên cứu cho thấy
gan tuỵ tơm ở nhóm tơm được cho ăn thức ăn có
trộn cao chiết của khổ sâm với liều 2, 4 và 45%
vẫn duy trì cấu trúc bình thường như nhóm đối
chứng. Kết quả phân tích mẫu mơ học của thí
nghiệm cho ăn cao chiết cho thấy, gan tuỵ của

tôm ở tất cả các nghiệm thức thí nghiệm có biểu
hiện cấu trúc mơ học bình thường như được thấy
ở các lồi tơm (Bell & Lightner, 1988; Caceci
& ctv., 1988; Lightner & ctv., 1996; Bhavan &
Geraldine, 2000). Ở hai nhóm ăn cao chiết khổ

sâm, các tế bào biểu mơ của ống gan tuỵ được
biệt hố thành nhiều tế bào B và giống với cấu
trúc mô học của tôm đối chứng. Các nghiên cứu
trước đây báo cáo rằng tế bào B có liên quan
đến sự hấp thu chất lỏng và các phân tử nhỏ bên
trong ống gan, đây là một đặc tính của tế bào
B ở các lồi giáp xác (Lyon & Simkiss, 1984;
Al-Mohanna & Nott, 1986; Vogt, 1993). Ngồi
ra, tế bào B cịn là nguồn enzyme giúp cho q
trình tiêu hố ngoại bào (Loizzi, 1971; Gibson &
Barker, 1979; Caceci & ctv., 1988). Sự gia tăng
của tế bào B giúp thuận lợi trong việc tổng hợp
và bài tiết các enzyme tiêu hố. Điều này cũng
giúp cho tơm thẻ chân trắng hấp thụ nhiều năng
lượng từ thực phẩm ăn vào và làm tăng mức độ
trao đổi chất để giữ chức năng cơ thể trở nên
bình thường (Li & ctv., 2008). Ở mức độ phân
tử, dịch chiết từ lá khổ sâm Croton tonkinensis
cho thấy có sự ức chế mạnh yếu tố nhân NFκB trong các đại thực bào RAW264.7. NF-κB là
một yếu tố phiên mã kích hoạt sự biểu hiện của
nhiều gen liên quan đến quá trình viêm như là
các cytokine interleukin IL-1β, IL-2 và TNF-α
(tumor necrosis factor - yếu tố gây hoại khối u)
(Tak & Firestein, 2001; Aquila & ctv., 2009).

Thêm vào đó, các diterpenoids được chiết xuất
từ khổ sâm cho thấy có tác dụng ức chế enzyme
SIRT1 (Dao & ctv., 2010). Enzyme này có chức
năng khử nhóm acetyl của protein đóng vai trị
quan trọng trong việc điều hồ tế bào phản ứng
với các yếu tố gây stress (Sinclair & Guarente,
2006). Đối với các diterpenoids thuộc nhóm
ent-Kaurane được chiết tinh từ lá cây khổ sâm
có khả năng kích thích sự biệt hố để hình thành
ngun bào xương (Osteoblast), là các tế bào
quan trọng nhất trong các mô xương và rất quan
trọng cho sự hình thành xương.
Số liệu thử nghiệm độc tính qua đường ăn
cho thấy tất cả các nghiệm thức ăn cao chiết với
nồng độ từ 0 đến 20% có tỷ lệ tơm chết trung
bình rất thấp từ 5 đến 6,67% sau 24 giờ. Trong
khi ở nồng độ cao chiết 4%, tỷ lệ sống của tơm
thí nghiệm là 100% sau 96 giờ. Đối với nồng
độ cao chiết cao nhất (45% trong thức ăn), tỷ
lệ trung bình tơm bị chết sau 48 giờ là 15%,
trong khi, ở thời điểm 72 và 96 giờ, tỷ lệ trung

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019

41


VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II

bình tơm chết là tương đương nhau (21,67%),

các tỷ lệ này không khác biệt ý nghĩa thống kê
(P > 0,05) giữa các nghiệm thức cho tôm ăn các
nồng độ cao chiết trong suốt 96 giờ thí nghiệm.
Do các kết quả tỷ lệ tơm chết < 50%, nên số
liệu này không xác định được giá trị LC50 ở các
thời điểm quan sát. Điều này cho thấy cao chiết
khổ sâm được trộn vào thức ăn có tính an tồn
cao đối với tơm ni khi được phịng trị bệnh
AHPND trong phịng thí nghiệm cũng như trong
ao nuôi (liều hiệu quả 2%). Đối với thử nghiệm
qua đường nước nuôi. Kết quả cho thấy, ở nồng
độ 20 ppm, tôm sống 100% sau 96 giờ tiếp xúc
với dịch chiết và tỷ lệ tôm chết 100% sau 72 và
96 giờ ở nồng độ 150 ppm. Ở các nồng cao 90,
120 và 150 ppm, tỷ lệ trung bình tơm chết sau 24
giờ lần lượt là 18,33; 18,33 và 28,33%, và các
tỷ lệ tơm chết này khơng có khác biệt ý nghĩa
thống kê (P > 0,05). Ở các thời điểm 48, 72, và
96 giờ thí nghiệm, tỷ lệ trung bình tơm chết của
nghiệm thức cho tơm ăn các nồng độ cao chiết
có khác biệt ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Giá trị
LC50 được xác định ở các thời điểm 48, 72 và
96 giờ rất cao lần lượt là 93,02; 81,25; và 81,25
ppm. Điều này cho thấy cao chiết khổ sâm gây
độc yếu đối với tôm thẻ chân trắng. Theo Giang
& ctv., (2005) các diterpenoids tinh được tinh
sạch từ lá khổ sâm Việt Nam có hoạt tính gây
độc yếu hoặc khơng gây độc đối với Artemia.
Từ các cơ sở trên, nghiên cứu này đề xuất rằng
cao chiết khổ sâm an toàn và có thể ứng dụng

phịng bệnh trên tơm ni ở quy mô trang trại.

sau 96 giờ tiếp xúc với cao chiết và tỷ lệ tôm
chết 100% sau 96 giờ ở nồng độ 150 ppm. Giá
trị LC50 được xác định ở các thời điểm 48, 72
và 96 giờ với nồng độ rất cao lần lượt là 93,02;
81,25; và 81,25 ppm.

V. KẾT LUẬN

Bautista, M.N., Lavilla-Pitogo, C., Subosa, P.F.,
Begino, E.T., 1994. Aflatoxin B1 contamination
of shrimp feeds and its effect on growth and
hepatopancreas of preadult Penaeus monodon.
J. Sci. Food Agricult, 65, 5–11.

Cao chiết khổ sâm không gây độc đối với
tôm nuôi qua đường ăn ở nồng độ 4% trộn vào
thức ăn (tỷ lệ sống của tơm thí nghiệm 100%
sau 96 giờ). Kết quả thử nghiệm cho thấy ở
nồng độ cao chiết lên đến 45% (450g/kg thức
ăn), tỷ lệ trung bình tơm bị chết sau 48 giờ là
15% và 21,67% sau 96 giờ ăn cao chiết. Giá trị
LC50 không được xác định do tỷ lệ gây chết tôm
của cao chiết qua đường ăn < 50%.
Cao chiết khổ sâm không gây độc hoặc gây
độc yếu đối với tôm nuôi khi tiếp xúc trực tiếp
trong nước. Ở nồng độ 20 ppm, tôm sống 100%
42

LỜI CẢM ƠN
Đề tài này được thực hiện từ kinh phí của
hợp đồng đề tài nhánh số 02/HĐ-TS với Viện
Hoá học và các Hợp chất Thiên nhiên.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt


Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc
Việt Nam, Nhà xuất bản Y học.

Tài liệu tiếng Anh
Al-Mohann, S.Y. and Nott, J.A., 1986. B-cells
and digestion in the hepatopancreas of
Penaeussemisulcatus (Crustacea, Decapoda). J.
Mar. Biol. Assoc. U. K, 66, 403–414.
APHA, 2005. Standard methods for examination
of water and waste water. Edited by Eaton, A.
D., Cleseri, L. S., Rice, E. W., Greenberg, A. E.,
Publish Health Assosiation, Washington DC.
Aquila, S., Weng, ZY., Zeng, YQ., Sun, HD., Rios,
JL., 2009. Inhibition of NF-κB activation and
iNOS induction by ent-kaurane diterpenoids in
LPS-stimulated RAW264.7 murine macrophages.
J Nat Prod, 72:1269–1272.
ASTM, 1993. Standard practice for using brine
shrimp nauplii as food for test animals in aquatic
toxicology. ASTM E1191-90, American Society
for Testing and Materials, Philadelphia. PA.

Bell, T.A. and Lightner, D.V., 1988. A Handbook
of Normal Penaeid Shrimp Histology, World
Aquaculture Society, Baton Rouge, LA.
Bhavan, P.S., and Geraldine, P., 2000. Histopathology
of the hepatopancreas and gills of the prawn
Macrobrachium malcolmsonii exposed to
endosulfan. Aquat. Toxicol, 50, 331–339.
Božidar S. B. Marko, Z. Zoran and Vesna D.,
2011. Histological methods in the assessment
of different feed effects on liver and intestine of

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II
fish. Journal of Agr. Sc., 56:87-100.
Caceci, T., Neck, K.F., Lewis, D.H., and Sis, R.F.,
1988. Ultrastructure of the hepatopancreas of
the Pacific white. shrimp, Penaeus vannamei
(Crustacea: Decapoda). J. Mar. Biol. Assoc, U.
K. 68, 323–327.
Citarasu T, Babu, M.M., Punitha, S.M.J.,
Venketramalingam, K. and Marian, M.P., 2001.
Control of pathogenic bacteria using herbal
biomedicinal products in the larviculture system
of Penaeus monodon. International Conference
on Advanced Technologies in Fisheries and
Marine Sciences, MS University, India.
Citarasu, T., Venkatramalingam, K., , Micheal
babu, M., Raja jeya sekar, R., & Petermarian,

M., 2003. Influence of the antibacterial herbs,
Solanum trilobatum, Andrographis paniculata
and Psoralea corylifolia on the survival, growth
and bacterial load of Penaeus monodon post
larvae. Aquaculture International, 11: 583–595.
Dao, T. T.; Le, T. V. T.; Nguyen, P. H.; Thuong, P.
T.; Minh, P. T. H.; Woo, E. R.; Lee, K. Y.; and
Oh, W. K. Planta Med., 2010. SIRT1 Inhibitory
Diterpenoids from the Vietnamese Medicinal Plant
Croton tonkinensis. J. Nat. Prod. 76. 1011− 1014.
Giang, P. M., Son, P. T., Hamada, Y., and Otsuka, H.,
2005. Cytotoxic Diterpenoids from Vietnamese
Medicinal Plant Croton tonkinensis GAGNEP.
Chem. Pharm. Bull, 53(3) 296—300.
Gibson, R. and Barker, P. L., 1979. “The decapod
hepatopancreas”, Oceanography and Marine
Biology, 17: 285-346.
Jacobs, W., 1928. Untersuchungen Ã1⁄4berdie
Cytologie
der
Sekretbildung
in
der
Mitteldarmdriise von Astacus leptodactylus.
Zeitschrift
fuer
Zellforschung
und
mikroskopische Anatomic, 8: 1-62.
Lee, J-Y. and Gao, Y., 2012. Review of the application

of garlic, Allium sativum in aquaculture. World
Aquaculture Society, P447-458. V43 (4).
Lightner, D.V., Hasson, K.W., White, B.L., and
Redman, R.M., 1996. Chronic toxicity and
histopathological studies with Benlate, a
commercial grade of benomyl, in Penaeus
vannamei (Crustacea: Decapoda). Aquat.
Toxicol, 34, 105–118.
Loizzi, R. F., 1971. Interpretation of crayfish
hepatopancreatic function based on fine
structural analysis of epithelial cell lines and

muscle network. Zeitschrift fuer Zellforschung
und mikroscopische Anatomic, 113: 420-440.
Lyon, R. and Simkiss, K., 1984. The ultrastructure
and metal-containing inclusions of mature cell
types in the hepatopancreas of a crayfish. Tissue
and Cell, Volume 16, issue 5. Page 805 - 817.
Available online 2005.
Madhuri, S., Mandloi, A. K., Govind, P. and Sahni,
Y.P., 2012. Antimicrobial activity of some
medicinal plants against fish pathogens. IRJP, 3
(4). ISSN. 2230-8407.
Miriam P. and Menon N. R., 2005. Histopathological
changes in the hepatopancreas of the penaeid
shrimp Metapenaeus dobsoni exposed to
petroleum hydrocarbons. J. Mar: Biol. Ass, India,
47 (2) : 160 – 168.
Sinclair, DA. and Guarente, L., 2006. Unlocking the
Secrets of Longevity Genes. Scientific American.

294 (3): 48–51. 54–7.
Stephan, CE and Rodgers, JW., 1985. Advantages of
using regression analysis to calculate results of
chronic toxicity tests. In: Bahner RC. Hansen DJ
(eds) Aquatic toxicology and hazard assessment.
Eight Symposium. ASTM STP 891, American
Society for Testing and Materials. Philadelphia.
pp 328–338.
Syahidah, A., 2014. Status and potential of herbal
applications in aquaculture. Iranian Journal of
Fisheries Sciences, 14, 27-44.
Tak, PP. and Firestein, GS., 2001. NF-κB: A key role
in inflammatory diseases.  J Clin Invest, 107:7–
11. doi: 10.1172/JCI11830.
Venketramalingam, K., Christopher, J. G., and Citarasu,
T., 2007. Zingiber officinalis an herbal appetizer
in the tiger shrimp Penaeus monodon (Fabricius)
larviculture. Aquac Nutr, 13(6):439–443.
Vogt, G., 1993. Differentiation of B-cells in the
hepatopancreas of the prawn Penaeus monodon.
Acta Zool, 74: 51-60.
Vuddhakul, V., Bhoopong, P., Hayeebilan, F., and
Subhadhirasakul, S., 2007. Inhibitory activity of
Thai condiments on pandemic strain of Vibrio
parahaemolyticus. Food Microbiology, 24, 413418. />Wu, J.P., Chen, H.H., and Huang, D.J., 2008.
Histopathological and biochemical evidence of
hepatopancreatic toxicity caused by cadmium
and zinc in the white shrimp, Litopenaeus
vannamei. Chemosphere, 73. 1019–1026.

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019

43


VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II

SAFETY OF CROTON TONKINENSIS EXTRACT WITH RESPECT TO
WHITE-LEG SHRIMP (Penaeus vannamei) UNDER IN VITRO
      Truong Hong Viet1 *, Do Thi Cam Hong1, Tran Bui Truc Quan2, Vu Thien An1
ABSTRACT
Herbs and medicinal plants promise to be a source of therapeutic supply for shrimp and fish culture
because these products are cheaper cost to treat and non-toxic. The extract of Croton tonkinensis
plant was thought to contain mainly organic compounds such as flavonoids, alkaloids, polyphenols...
The aim of this study is to investigate the safety of crude extract of C. tonkinensis under in vitro.
The toxicity test of the Croton extract via oral was performed with concentrations from 0 to 45%
(450g/kg feed). For the extract immersion experiments into the culture water was carried out at
concentrations from 0 to 160 ppm. The results showed that the Croton extract is not toxic to whiteleg shrimp via oral treatment. At 45% concentration, the average shrimp mortality is 15% and
21.67% after 48 and 96 hours, respectively. For the experiment of soaking extract in shrimp water,
shrimp survive 100% after 96 hours of exposure to the extract at 20 ppm concentration and the
100% dead shrimp after 96 hours at 150 ppm concentration. The high relative LC50 values of Croton
extract which was immersed into shrimp culture water, ​​were determined as 93.02; 81.25; and 81.25
ppm, at 48, 72 and 96 hours, respectively. While LC50 values of Croton extract which was mixed
into shrimp feed were not computed due to the experimental shrimp mortality < 50%. From the
above results, we conclude that the extract is safe for white-leg shrimp under in vitro.
Keywords: AHPND, Croton tonkinensis, Extract, LC50, White-leg shrimp.
Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước
Ngày nhận bài: 15/5/2019
Ngày thông qua phản biện: 17/6/2019
Ngày duyệt đăng: 26/6/2019

Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemics, Research Institute for Aquaculture No.2.
International University, Vietnam Naional University, HCMC.
* Email:

1
2

44

TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ 13 - THÁNG 6/2019