nghiên cứu sản xuất chế phẩm kháng nấm corynespora cassiicola từ vi khuẩn bacillus

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM
KHÁNG NẤM Corynespora cassiicola
TỪ VI KHUẨN Bacillus

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thành Trung
Đỗ Thị Thu Hà
Lại Thị Tâm
Phan Thị Hoài Thương
Lê Sanh Nhiều

Người hướng dẫn: Th.S Nguyễn Văn Minh
Ngành học: Cơng nghệ Sinh học

TP. Hồ Chí Minh, 2014


Trang i

ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................... 1
HƢƠNG 1.
1.1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4

GIỚI THIỆU VỀ CÂY CAO SU HEVEA BRASILIENSIS MUELL. ARG ......... 5
1.1.1 Phân loại học .............................................................................................. 5
1.1.2 Nguồn gốc .................................................................................................. 5
1.1.3 Đặc điểm thực vật học ............................................................................... 5
1.1.4 Vai trị và tình hình sản xuất ...................................................................... 5
1.1.5 Tình hình bệnh hại trên cây cao su ............................................................ 6
1.1.6 Tình hình nghiên cứu chế phẩm sinh học cho cây cao su.......................... 7

1.2

BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA TRÊN CÂY CAO SU .............................. 7
1.2.1 Phân bố....................................................................................................... 7
1.2.2 Triệu chứng bệnh trên cây cao su .............................................................. 8
1.2.3 Tác hại của bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su ............................ 10
1.2.4 Cách phòng trị .......................................................................................... 12

1.3

NẤM Corynespora cassiicola ............................................................................ 13
1.3.1 Lịch sử phát hiện nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) wei ...... 13
1.3.2 Phân loại học ............................................................................................ 13
1.3.3 Đặc điểm hình thái ................................................................................... 13
1.3.4 Đặc điểm sinh lý ...................................................................................... 14
1.3.5 Khả năng tồn tại ....................................................................................... 15
1.3.6 Khả năng phát tán .................................................................................... 15
1.3.7 Con đƣờng xâm nhập và khả năng gây bệnh của nấm Corynespora
cassiicola ............................................................................................................. 16

1.4

TỔNG QUAN VỀ Bacillus ................................................................................ 16
1.4.1 Phân loại................................................................................................... 16


Trang ii

1.4.2 Hình dạng, kích thƣớc .............................................................................. 18
1.4.3 Dinh dƣỡng và tăng trƣởng ...................................................................... 19
1.4.4 Ứng dụng của Bacillus ............................................................................. 21
1.4.5 Chất chuyển hóa kháng nấm của Bacillus ............................................... 22
1.5

QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM........................................................................ 24
1.5.1 Định nghĩa quy hoạch thực nghiệm ......................................................... 24
1.5.2 Ƣu điểm quy hoạch thực nghiệm ............................................................. 24
1.5.3 Đối tƣợng của quy hoạch thực nghiệm .................................................... 25
1.5.4 Thí nghiệm sàng lọc ................................................................................. 27
1.5.5 Tối ƣu hóa ................................................................................................ 29
1.5.6 Phần mềm quy hoạch thực nghiệm Minitab 16 ....................................... 35

HƢƠNG 2.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU......................... 37

2.1

THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .................................................... 38

2.2

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................ 38
2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................. 38
2.2.2 Cây cao su dùng để thử nghiệm ............................................................... 38
2.2.3 Chủng nấm Corynespora cassiicola thử nghiệm ..................................... 38
2.2.4 Mơi trƣờng - hóa chất .............................................................................. 38
2.2.5 Thiết bị - dụng cụ ..................................................................................... 39

2.3

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 39
2.3.1 Tái phân lập Bacillus ............................................................................... 39
2.3.2 Xác định hoạt tính chất kháng nấm của chủng Bacillus sp. S29 và
Bacillus sp. T3 bằng phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch................................ 41
2.3.3 Xây dựng đƣờng tƣơng quan giữa giá trị OD610 và mật độ tế bào .......... 42
2.3.4 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng của Bacillus sp. S29 và Bacillus sp.
T3

.................................................................................................................. 44


Trang iii

2.3.5 Chọn lựa yếu tố ảnh hƣởng tới hoạt tính chất kháng nấm của chủng
Bacillus sp. S29 và Bacillus sp. T3. .................................................................... 46
2.3.6 Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hƣởng chính đến q trình lên men
tăng sinh khối theo thiết kế Plackett – Burman .................................................. 48
2.3.7 Thí nghiệm khởi đầu ................................................................................ 49
2.3.8 Tìm khoảng tối ƣu cho quá trình lên men bằng phƣơng pháp leo dốc .... 50
2.3.9 Thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu xác định giá trị tối ƣu của các yếu tố ........... 52

HƢƠNG 3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 54

3.1

KẾT QUẢ TÁI PHÂN LẬP ............................................................................... 55

3.2

KẾT QUẢ THỬ KHẢ NĂNG KHÁNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP KHUẾCH
TÁN GIẾNG THẠCH ........................................................................................ 56

3.3

KẾT QUẢ TỐI ƢU HĨA MƠI TRƢỜNG CHO Bacillus sp. S29 và Bacillus
sp. T3 ................................................................................................................... 58
3.3.1 Kết quả xây dựng đƣờng tƣơng quan giữa giá trị OD610 và mật độ tế bào ..
.................................................................................................................. 58
3.3.2 Kết quả xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng và đƣờng kính vịng kháng
nấm vi khuẩn Bacillus sp. S29 và Bacillus sp. T3 .............................................. 60
3.3.4 Kết quả xác định yếu tố ảnh hƣởng chính theo ma trận Plackett – Burman
.................................................................................................................. 74
3.3.5 Kết quả thí nghiệm khởi đầu .................................................................... 83
3.3.6 Kết quả thí nghiệm tìm khoảng tối ƣu bằng phƣơng pháp leo dốc.......... 89
3.3.7 Kết quả thí nghiệm đáp ứng bề mặt theo thiết kế thí nghiệm Box Behnken .............................................................................................................. 92

3.4

KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHẤT KHÁNG NẤM

THEO THỜI GIAN TRÊN MÔI TRƢỜNG TỐI ƢU ..................................... 108

HƢƠNG 4.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 110


Trang iv

4.1

KẾT LUẬN ....................................................................................................... 111

4.2

ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................... 112

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 113
PH L C

................................................................................................................ 122


Trang v

DANH M C CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA

One-way analysis of variance

C.cassiicola

Corynespora cassiicola

CFU

Colony forming unit

CNSH

Cơng nghệ sinh học

Cs.

Cộng sự

NA

Nutrent Agar

NB

Nutrient Broth

nm

nanomet

OD

Optical Density

PTN

Phịng thí nghiệm

PDA

Potato Dextrose Agar

PDB

Potato Dextrose Broth

P–B

Plackett - Burman

VSV

Vi sinh vật

WHO

World Health Organization


Trang vi

DANH M C CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Bảng kết hợp dấu trong ma trận ................................................................... 28
Bảng 1.2. Bảng ma trận quy hoạch với N = 12, K = 11................................................ 29
Bảng 2.1. Các nguồn nitơ khảo sát ............................................................................... 46
Bảng 3.1. Kết quả phân lập ........................................................................................... 55
Bảng 3.2. Kết quả thử khả năng kháng bằng giếng khuếch tán .................................... 57
Bảng 3.3. Kết quả tƣơng quan giữa giá trị OD610 và mật độ tế bào (Log (N/mL)) ...... 58
Bảng 3.4. Giá trị OD610 và mật độ tế bào (Log (N/mL)) .............................................. 59
Bảng 3.5. Mật độ tế bào Bacillus sp. S29 và Bacillus sp. T3 tại mỗi thời điểm nuôi cấy
(Log (N/mL)) ................................................................................................................ 60
Bảng 3.6. Đƣờng kính vịng kháng nấm theo thời gian của chủng Bacillus sp. S29 và
Bacillus sp. T3 ............................................................................................................... 62
Bảng 3.7. Bảng kết quả các nguồn nitơ khảo sát .......................................................... 64
Bảng 3.8. Bảng kết quả các nguồn cacbon khảo sát ..................................................... 66
Bảng 3.9. Bảng kết quả các nguồn khoáng khảo sát ..................................................... 68
Bảng 3.10. Bảng kết quả dãy pH khảo sát .................................................................... 70
Bảng 3.11. Bảng kết quả dãy nhiệt độ khảo sát ............................................................ 72
Bảng 3.12. Bảng kết quả thí nghiệm các yếu tố chọn lọc ............................................. 73
Bảng 3.13. Giá trị các biến số trong thí nghiệm Plackett-Burman tìm yếu tố ảnh hƣởng
chính đến hoạt tính kháng nấm của Bacillus sp. S29 .................................................... 74
Bảng 3.14. Thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman và kết quả thí nghiệm với các mức độ
của các yếu tố ................................................................................................................ 75
Bảng 3.15. Bảng giá trị các biến số trong thí nghiệm Plackett-Burman tìm yếu tố ảnh
hƣởng chính đến hoạt tính kháng nấm của Bacillus sp. T3 .......................................... 79
Bảng 3.16. Thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman và kết quả thí nghiệm với các mức độ
của các yếu tố ................................................................................................................ 79
Bảng 3.17. Bảng bố trí thí nghiệm khởi đầu cho 4 yếu tố ảnh hƣởng chính ................ 84


Trang vii

Bảng 3.18. Bảng bố trí thí nghiệm khởi đầu cho 4 yếu tố ảnh hƣởng chính ................ 86
Bảng 3.19. Bảng tính bƣớc chuyển động phƣơng pháp leo dốc của chủng Bacillus sp.
S29................................................................................................................................. 89
Bảng 3.20. Kết quả đƣờng kính vịng kháng nấm thu đƣợc sau thí nghiệm leo dốc của
chủng Bacillus sp. S29 .................................................................................................. 90
Bảng 3.21. Bảng tính bƣớc chuyển động phƣơng pháp leo dốc của chủng Bacillus sp.
T3 .................................................................................................................................. 91
Bảng 3.22. Kết quả đƣờng kính vịng kháng nấm thu đƣợc sau thí nghiệm leo dốc của
chủng Bacillus sp. T3 .................................................................................................... 91
Bảng 3.23. Giá trị từng mức độ trong thiết kế thí nghiệm Box-Behnken..................... 93
Bảng 3.24. Bố trí và kết quả thí nghiệm Box-Behnken chủng Bacillus sp. S29 .......... 93
Bảng 3.25. Giá trị từng mức độ trong thiết kế thí nghiệm Box-Behnken................... 100
Bảng 3.26. Bố trí và kết quả thí nghiệm Box-Behnken chủng Bacillus sp. T3 .......... 101
Bảng 3.27. Đƣờng kính vịng kháng nấm theo thời gian của chủng Bacillus sp. S29 và
Bacillus sp. T3 ............................................................................................................. 108


Trang viii

NH

CÁC IỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Đƣờng tƣơng quan tuyến tínhgiữa giá trị OD610 và mật độ tế bào Bacillus
sp. S29 ........................................................................................................................... 58
Biểu đồ 3.2. Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD610 và mật độ tế bào Bacillus
sp. T3 ............................................................................................................................. 59
Biểu đồ 3.3. Đƣờng cong tăng trƣởng của Bacillus sp. S29 và Bacillus sp. T3 theo thời
gian ................................................................................................................................ 61
Biểu đồ 3.4. Đƣờng kính vịng kháng nấm theo thời gian của chủng Bacillus sp. S29 và

Bacillus sp. T3 ............................................................................................................... 63
Biểu đồ 3.5. Kết quả các nguồn nitơ khác nhau............................................................ 65
Biểu đồ 3.6. Kết quả các nguồn cacbon khác nhau....................................................... 67
Biểu đồ 3.7. Kết quả các nguồn khống vơ cơ khác nhau ............................................ 69
Biểu đồ 3.8. Bảng kết quả dãy pH khảo sát .................................................................. 71
Biểu đồ 3.9. Bảng kết quả dãy nhiệt độ khảo sát .......................................................... 73
Biểu đồ 3.10. Đƣờng kính vịng kháng nấm theo thời gian chủng Bacillus sp. S29 và
Bacillus sp. T3 ............................................................................................................. 109

NH

ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1. Đồ thị các ảnh hƣởng chính (Main Effects Plot) ........................................ 77
Đồ thị 3.2. Đồ thị các ảnh hƣởng chính (Main Effects Plot) ......................................... 82
Đồ thị 3.3. Đồ thị đƣờng mức biểu thị giá trị tối ƣu của các yếu tố ............................. 98
Đồ thị 3.4. Đồ thị bề mặt biểu thị giá trị tối ƣu của các yếu tố ..................................... 98
Đồ thị 3.5. Đồ thị đƣờng mức biểu thị giá trị tối ƣu của các yếu tố ........................... 105
Đồ thị 3.6. Đồ thị bề mặt biểu thị giá trị tối ƣu của các yếu tố ................................... 106


Trang ix

NH

CÁC H NH

Hình 1.1. Hai dạng đốm và xƣơng cá ............................................................................. 8
Hình 1.2. Đốm, đốm có lỗ và viền vàng ......................................................................... 8
Hình 1.3. Héo và bạc đầu lá ............................................................................................ 8

Hình 1.4. Dạng xƣơng cá và cháy phiến lá ..................................................................... 8
Hình 1.5. Triệu chứng trên thân cây ............................................................................... 9
Hình 1.6. Tán cây bị rụng lá corynespora ....................................................................... 9
Hình 1.7. Khuẩn lạc nấm Corynespora cassiicola trên mơi trƣờng PDA .................... 14
Hình 1.8. Bào tử nấm Corynespora cassiicola nhuộm bằng dung dịch lactophenol.... 14
Hình 1.9. Sơ đồ đối tƣợng nghiên cứu .......................................................................... 26
Hình 1.10. Thiết kế CCD với 4 điểm góc (cube poit), 4 điểm dọc trục và 5 lần lặp lại
tại điểm thí nghiệm trung tâm (0,0) .............................................................................. 33
Hình 1.11. Ma trận bố trí thí nghiệm theo thiết kế Box-Behnken ................................ 34
Hình 1.12. Giao diện phần mềm Minitab 16.2.0........................................................... 36
Hình 2.1. Kết quả kháng nấm của vi khuẩn .................................................................. 42
Hình 2.2. Đƣờng cong sinh trƣởng trong hệ thống lên men kín ................................... 44
Hình 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus sp. S29 và Bacillus sp. T3 trên môi trƣờng NA
sau 24 giờ ni cấy........................................................................................................ 56
Hình 3.2. Nhuộn gram Bacillus sp. S29 và Bacillus sp. T3 .......................................... 56
Hình 3.3. Kết quả thử khả năng kháng bằng giếng khuếch tán .................................... 57
Hình 3.4. Kết quả giá trị tối ƣu của các yếu tố ảnh hƣởng chính ................................ 99
Hình 3.5. Kết quả giá trị tối ƣu của các yếu tố ảnh hƣởng chính ............................... 107


Trang 1

ĐẶT VẤN ĐỀ


Trang 2

Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) trồng ở các nƣớc vùng xích đạo và
nhiệt đới, là loại cây chính đƣợc sử dụng trong sản xuất cao su tự nhiên (Souza và cs.,
2013), có hơn 9,5 triệu ha, trong khoảng 40 quốc gia đƣợc dành để trồng cây cao su với

sản xuất khoảng 6,5 triệu tấn cao su khô mỗi năm. Việc cung cấp cao su tự nhiên của
thế giới là hầu nhƣ không theo kịp với nhu cầu toàn cầu cho 12 triệu tấn cao su tự
nhiên trong năm 2020 (Venkatachalam và cs., 2007).
Hiện nay, bệnh rụng lá Corynespora do vi nấm Corynespora cassiicola (Berk. &
Curt.) đã làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và năng suất cho mủ của cây cao su, đặc
biệt gây thiệt hại nặng nề đến kinh tế của các quốc gia. Năm1936, bệnh đƣợc phát hiện
đầu tiên ở nƣớc cộng hòa Sierra Leone và các mẫu nấm đã đƣợc Mason và Deighton
thu thập (Wei, 1950). Sau đó, bệnh xuất hiện lần lƣợt ở Ấn Độ, Malaysia, Nigeria,
Indonesia, Braxin, Sri Lanka, Cameroon,Thái Lan, Banglade và tại Việt Nam vào năm
1999. Manju và cộng sự (2001) đã đƣa ra một mô tả về mức độ nghiêm trọng của bệnh
rụng lá Corynespora. Các biện pháp kiểm sốt hóa học đƣợc sử dụng phổ biến nhằm
làm giảm sự ảnh hƣởng của Corynespora cassiicola đối với cây cao su nhƣng việc sử
dụng quá nhiều đã gây tác động xấu đến mơi trƣờng, suy thối đất trồng và gây ra các
đột biến kháng thuốc. Để khắc phục những nhƣợc điểm do biện pháp hóa học gây ra
nhƣ trên, hiện nay, biện pháp sinh học đang đƣợc các nhà khoa học đầu tƣ nghiên cứu,
ứng dụng và khuyến khích sử dụng. Biện pháp này sử dụng các loài thiên địch, kí sinh,
vi sinh vật, các sản phẩm có nguồn gốc sinh học nhƣ thuốc thảo mộc, sản phẩm công
nghệ sinh học nhƣ giống chuyển gen kháng nhằm ngăn chặn hoặc giảm bớt thiệt hại do
bệnh hại gây ra. Đây là một biện pháp tốt, có nhiều triển vọng trong tƣơng lai.
Với nhóm vi sinh vật đƣợc sử dụng trong biện pháp sinh học, thì Bacillus là một
trong những nhóm vi khuẩn đƣợc nghiên cứu và đã có nhiều tài liệu chứng minh
Bacillus có khả năng kiểm sốt sinh học đối với nấm bệnh trên cây trồng nhƣ kiểm soát
nấm Aspergillus flavus trên đậu phộng (Kong và cs., 2010), kiểm soát Fusarium solani
gây bệnh trên cây cà chua (Ebtsam và cs., 2009), kiểm soát nấm Fusarium oxysporum
f. sp. spinaciae (Zhao và cs., 2013). Bacillus có nhiều lồi có lợi cho con ngƣời, có khả


Trang 3

năng tạo ra nhiều hợp chất sinh học nhƣ chất kháng nấm và kháng khuẩn, các enzym

ngoại bào, các chất kích thích sinh trƣởng thực vật và các chất hoạt động bề mặt
(Bottone và cs., 2003).
Hiện nhóm nghiên cứu đã có những kết quả khả quan bƣớc đầu, đã phân lập
đƣợc 3 chủng vi khuẩn nội sinh cây cao su và 2 chủng Bacillus phân lập tự do trong đất
có khả năng kiểm sốt sinh học in vitro nấm C. cassiicola. Kết quả định lƣợng hoạt
tính ức chế nấm C. cassiicola là 100% đối với cả 5 chủng tuyển chọn đƣợc và tiêu diệt
đƣợc nấm C. cassiicola ở nồng độ ngun chất của dịch ni cấy (khơng có khả năng
mọc lại trên môi trƣờng mới sau khi xử lý với dịch nuôi cấy vi khuẩn). Những kết quả
sàng lọc bƣớc đầu này đã đƣợc gửi công bố hội nghị CNSH toàn quốc tại Hà Nội (đã
chấp nhận đăng bài) và Hội Nghị CNSH tồn quốc khu vực phía nam 2013. Trong
nghiên cứu này, chúng tơi tập trung chính vào nghiên cứu sâu hơn về khả năng kiểm
soát sinh học và sản xuất chế phẩm kháng nấm để thử nghiệm trên quy mơ thực
nghiệm.
Từ định hƣớng nghiên cứu đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu sản xuất chế phẩm kháng nấm Corynespora cassiicola từ vi khuẩn Bacillus”
Mục tiêu của đề tài:
 Đánh giá in vitro khả năng kháng nấm Corynespora cassiicola.
 Tối ƣu hóa mơi trƣờng và điều kiện nuôi cấy để sản xuất chất kháng

nấm Corynespora cassiicola.


Trang 4

HƢƠNG 1. TỔNG QU N
TÀI IỆU


Trang 5

1.1

GIỚI THIỆU VỀ

ÂY

O SU HEVEA BRASILIENSIS

MUELL. ARG
1.1.1 Phân loại học
Cây cao su trên thế giới thuộc vào năm họ thực vật sau: Euphorbiaceae,
Moraceae, Apocynaceae, Aslepiadaceae, Compositae. Trong đó mỗi họ lại có nhiều
giống, mỗi giống có nhiều loại. Nhƣng cây cao su thuộc loại Hevea brasiliensis (giống
Hevea, họ Euphorbiaceae) là cây duy nhất đƣợc chọn để canh tác qui mơ lớn. (Nguyễn
Hữu Trí, 2004)

1.1.2 Nguồn gốc
Cây cao su có nguồn gốc từ vùng rừng nhiệt đới, lƣu vực sông Amazone Nam
Mĩ (Souza và cs., 2013), đƣợc du nhập vào Việt Nam năm 1897. Đến đầu thế kỷ 20
đƣợc trồng thành đồn điền tại Đông Nam Bộ. Đầu thập niên 50 một số diện tích cao su
cùng định hình tại Tây Nguyên và miền Trung. (Nguyễn HữuTrí, 2004)

1.1.3 Đặc điểm thực vật học
Cây cao su thuộc loại thân gỗ, to, cao. Ở những cây lâu năm có thể cao từ 20 m
đến 30 m. Cấu tạo của thân cao su có phần quan trọng là vỏ thân, đây là bộ phận sản
sinh ra nhựa mủ quyết định đến năng suất sản lƣợng mủ. Lá cao su mọc cách, có ba lá
chét nhỏ cuống dài, có hình bầu dục, đi nhọn, mặt nhẵn gân song song. Đối với cây
cao su thì lá có vai trị rất quan trọng, ảnh hƣởng trực tiếp đến sản lƣợng mủ. Về
phƣơng diện sinh thái cây cao su phát triển tốt ở vùng xích đạo. Địi hỏi nhiệt độ trung
bình 25oC, lƣợng mƣa 1500 mL mỗi năm, có thể chịu đƣợc hạn nhiều tháng, ít địi hỏi

về chất lƣợng đất, ở nƣớc ta cây cao su đƣợc trồng từ Bắc đến Nam. (Nguyễn Hữu Trí,
2004)

1.1.4 Vai trị và tình hình sản xuất
Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, cung cấp mủ và gỗ cho rất nhiều
ngành công nghiệp. Đây cũng là loại cây có giá trị kinh tế cao trong các lĩnh vực nông
– lâm – công nghiệp. Trong những năm gần đây, sản lƣợng mủ không ngừng đƣợc


Trang 6

nâng cao nhờ những cải tiến về giống, kỹ thuật nơng nghiệp, quy trình khai thác... Đến
năm 2004 thì tổng diện tích cao su cả nƣớc đạt 454.000 ha. Sản lƣợng 402.700 tấn,
năng suất 1370 kg/ha/năm. Năm 2005 toàn ngành cao su xuất khẩu 587.000 tấn đạt
kim ngạch xuất khẩu 804 triệu USD, là nông sản đứng thứ 2 về kim ngạch xuất khẩu
sau lúa. Nếu tính cả đồ gỗ thì tổng kim ngạch xuất khẩu của tồn ngành cao su Việt
Nam năm 2005 ƣớc lƣợng trên 1 tỉ USD. Hơn nữa những nghiên cứu gần đây về ảnh
hƣởng của vƣờn cây cao su với môi trƣờng đã nêu lên khả năng đóng góp về sinh khối
và dƣỡng chất của cây cao su sau một chu kỳ trồng, khai thác tƣơng đƣơng với rừng
nhiệt đới ở vùng nhiệt đới ẩm, giúp cho đất trồng cây cao su đƣợc cải thiện về lý và
hóa tính (Trần Thị Thúy Hoa, 2006). Trong tƣơng lai khi nghị định thƣ Kyoto đƣợc
thông qua thì việc bán hạn ngạch về khí thải sẽ mang lại cho ngƣời trồng cao su thêm
một khoản thu nhập đáng kể. (Trần Văn Cảnh, 2006)

1.1.5 Tình hình bệnh hại trên cây cao su
Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, rất nhạy cảm với thời tiết. Do vậy,
cây cao su bị rất nhiều côn trùng và vi sinh vật gây hại. Hiện nay, trên cây cao su có rất
nhiều bệnh nhƣ bệnh về lá, bệnh về thân cành, bệnh rễ... (Phan Thành Dũng, 2004).
Các bệnh này ảnh hƣởng rất lớn đến sản lƣợng và phẩm chất mủ. Đặc biệt là các bệnh
về lá nhƣ bệnh phấn trắng do nấm Oidium heveae Steinm, bệnh héo đen đầu lá do nấm

Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) gây ra, bệnh đốm mắt chim do nấm Drechslera
heveae Petch, bệnh rụng lá mùa mƣa do nấm Phytophthora spp. và nghiêm trọng nhất
là bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.
(Phan Thành Dũng, 2006). Bệnh rụng lá Corynespora là một bệnh mới, mức độ tàn phá
của nó trên cây cao su và nhiều loại cây trồng khác là vơ cùng lớn.
Ngồi các bệnh do vi sinh vật gây ra, trên cây cao su cịn có các bệnh do cơn
trùng gây ra. Các loại cơn trùng gây hại cây cao su có thể kể đến nhƣ: mối, sâu, sùng
hại rễ, nhện, ốc sên, rệp… (Phan Thành Dũng, 2004).


Trang 7

1.1.6 Tình hình nghiên cứu chế phẩm sinh học cho cây cao su
Các biện pháp hóa học đƣợc sử dụng phổ biến để hạn chế ảnh hƣởng của nấm
Corynespora cassiicola đối với cây cao su nhƣng việc sử dụng quá nhiều đã gây tác
động xấu đến môi trƣờng và gây các đột biến kháng thuốc. Vì vậy, việc dùng các biện
pháp sinh học để phòng ngừa và điều trị bệnh đƣợc xem là rất hữu ích (Han và cs.,
2005; Klich và cs., 1994).
Nhƣng hiện nay việc nghiên cứu chế phẩm để trị bệnh rụng lá trên cây cao su vẫn
chƣa đƣợc quan tâm ở cả trong và ngoài nƣớc. Chỉ có nhóm tác giả Nguyễn Văn Minh
và cộng sự nghiên cứu về khả năng kháng nấm Corynespora cassiicola của chủng
Bacillus sp. T9 và Bacillus sp. T16, đã chứng minh cả hai chủng có hoạt tính ức chế
nấm là 100% và tiêu diệt đƣợc nấm ở nồng độ nguyên chất của dịch nuôi cấy. (Nguyễn
Văn Minh và cs., 2013)

1.2

ỆNH R NG Á ORYNESPORA TRÊN CÂY CAO SU

1.2.1 Phân bố

Bệnh rụng lá Corynespora do tác nhân là nấm Corynespora cassiicola, có tác
hại lớn tại các nƣớc trồng cao su trong khu vực Đông Á và Nam Á. Bệnh xuất hiện lần
đầu trên cây cao su tại Sierra Leone (Châu Phi) năm 1936, tiếp theo lần lƣợt ghi nhận
tại Ấn Độ năm 1958; Malaysia năm 1961; Nigeria năm 1968; Thái lan, Sri Lanka và
Indonesia năm 1985; Brazil và Bangladesh năm 1988. Bệnh gây thiệt hại nặng nhất tại
Sri Lanka, nơi phải nhổ bỏ và trồng lại trên 5.000 ha. Tại Malaysia, Thái Lan và
Indonesia nhiều ngàn ha cao su bị hại nặng làm ảnh hƣởng lớn đến sản lƣợng và sinh
trƣởng đôi khi gây chết toàn bộ cây. (Phan Thành Dũng, 2009)
Bệnh xuất hiện tại Việt Nam vào tháng 8 năm 1999, gây hại nặng cho các dịng
vơ tính: RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Năm 2010, bệnh đã phát sinh trên diện
rộng ở một số tỉnh miền Đông Nam Bộ, Tây Ngun và miền Trung, tập trung trên
dịng vơ tính cao su RRIV4, hiện chiếm diện tích đã trồng khá lớn ở cả những vùng cao
su đại điền và tiểu điền. (Phan Thành Dũng và cs., 2010)


Trang 8

1.2.2 Triệu chứng bệnh trên cây cao su
1.2.2.1 Các dạng triệu chứng phổ biến
Bệnh gây hại chủ yếu trên lá, cuống và chồi với những triệu chứng khác nhau.
(Phan Thành Dũng, 2000; Phan Thành Dũng và cs., 2010)

Hình 1.1. Hai dạng đốm và xƣơng cá.
(Phan Thành ũng và cs., 2010)

Hình 1.3. Héo và bạc đầu lá.
(Phan Thành ũng và cs., 2010)

Hình 1.2. Đốm, đốm có lỗ và viền vàng.
(Phan Thành ũng và cs., 2010)

Hình 1.4. Dạng xƣơng cá và cháy phiến lá.
(Phan Thành ũng và cs., 2010)


Trang 9

Hình 1.5. Triệu trứng trên thân cây. Hình 1.6. Tán cây bị rụng lá Corynespora.
(Phan Thành ũng và cs., 2010)

(Phan Thành ũng và cs., 2010)

1.2.2.2 Triệu chứng bệnh trên lá
Trên lá non vết bệnh có hình trịn màu xám đến nâu với vòng màu vàng bao
xung quanh, tại trung tâm vết bệnh đơi khi hình thành lỗ, lá bị hại xoăn lại biến dạng
sau đó rụng tồn bộ. Những lá đã chuyển màu xanh, triệu chứng đặc trƣng với vết bệnh
màu vàng sau chuyển màu đen, đƣờng kính khoảng 1 – 3 mm, phân bố dạng xƣơng cá
dọc theo gân lá. Nếu gặp điều kiện thuận lợi các vết lan rộng gây chết từng phần lá do
sự phá hủy của diệp lục, sau đó tồn bộ lá đổi màu vàng – vàng cam và rụng từng lá
một. (Phan Thành Dũng, 2000; Phan Thành Dũng và cs., 2010)
Trên lá già một số vết bệnh xuất hiện vết thủng. Triệu chứng đặc trƣng với vết
bệnh màu đen có hình dạng xƣơng cá dọc theo gân lá. Nếu gặp điều kiện thuận lợi các
vết lan rộng gây chết từng phần lá do lục lạp bị phá hủy, sau đó tồn bộ lá đổi màu
vàng – cam và rụng từng lá một. (Phan Thành Dũng, 2000; Phan Thành Dũng và cs.,
2010)
1.2.2.3 Triệu chứng bệnh trên cuống lá và chồi
Dấu hiệu đầu tiên với vết nứt dọc theo cuống và chồi có dạng hình thoi, có mủ rỉ
ra sau đó hóa đen, khi dùng dao cắt bỏ lớp vỏ ngoài sẽ xuất hiện những sọc đen ăn sâu
trên gỗ, chạy dọc theo vết bệnh.

Trang 10

Trên cuống lá với vết nứt màu đen có chiều dài 0,5 – 3,0 mm. Nếu cuống lá bị
hại, tồn bộ lá chét bị rụng khi cịn xanh dù khơng có một triệu chứng nào xuất hiện
trên phiến lá.
Trên chồi, các chồi xanh dễ nhiễm bệnh hơn, nhƣng đôi khi nấm bệnh cũng tấn
công và gây hại cả chồi đã hóa nâu. Vết bệnh có thể phát triển dài đến 20 cm gây chết
chồi, đôi khi chết cả cây. (Phan Thành Dũng, 2000; Phan Thành Dũng và cs., 2010)

1.2.3 Tác hại của bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su
1.2.3.1 Sri Lanka
Dịng vơ tính RRIC 103 do RRISL lai tạo từ năm 1958 đƣợc đánh giá sinh
trƣởng mạnh và sản lƣợng mủ cao, đến cuối thập niên 70 khuyến cáo trồng đại trà. Đến
năm 1985, phải hủy và trồng lại trên 5.000 ha các dịng vơ tính cũ (PB 86,...) với sản
lƣợng thấp nhƣng có khả năng kháng bệnh. Chính phủ bồi thƣờng cho ngƣời trồng cao
su bị thiệt hại trên 5.000.000 USD.
Trong giai đoạn 1985 – 1986 các dịng vơ tính mẫn cảm với bệnh: RRIC 103,
RRIC 104, RRIM 600, 725, Tjir 1, IAN 873 FX 25 và RRIIC 52. Gần đây có thêm một
số dịng mẫn cảm mới: RRIC110, RRIC 131, RRIC 132 và RRIC 133. (Jayasuriya và
Thennakoon, 2007; Phan Thành Dũng, 1995)
1.2.3.2

n
Dịch bệnh lớn bùng phát năm 1996, nguy hiểm nhất trên dịng vơ tính RRII 105

chiếm gần 80% diện tích cao su trong nƣớc. Bệnh gây giảm sản lƣợng mủ đến 50% ở
vùng bị hại nặng. Hằng năm, phun thuốc đại trà trên 10.000 ha, để hạn chế dịch bệnh
và áp dụng ở những vùng có điều kiện thuận lợi cho bệnh xuất hiện.
Giai đoạn ban đầu: RRIM 600, RRIM 610, RRIM 622 và Tjir 1. Giai đoạn sau:

RRII 105, RRII 118, RRII 300, PR 107, PR 255, PR 261, PB 86, PB217,
PB235, PB255, PB 260, PB 311. (Jayasinghe,1997; Phan Thành Dũng, 1995)


Trang 11

1.2.3.3 Indonesia
Vào thập niên 80, 1200 ha cao su bị nhiễm bệnh nặng và phải chặt bỏ 400 ha,
thiệt hại khoảng 200 triệu Rupiah. 70% diện tích cao su trong nƣớc bị bệnh gây hại ở
mức độ khác nhau. Nhiều dịng vơ tính cao sản phải loại bỏ: IAN 873, một số PR 300
serses. Bệnh làm giảm sản lƣợng từ 30 – 50%.
Giai đoạn ban đầu: RRIC 103, KRS 21, RRIM 600, RRIM 725, PPN 2444, PPN
2477, PPN 2658, IAN 873 VÀ GT 1. Giai đoạn sau: AVROS 2037, PR 300, PR 303 và
nhiều dịng vơ tính thuộc series IR 100, IR 200. (Jayasinghe,1997)
1.2.3.4 Malaysia
Dịch bệnh bùng phát năm 1985, nhiều ngàn ha cao su bị hại nặng, làm ảnh
hƣởng lớn đến sản lƣợng và sinh trƣởng, đôi khi chết tồn bộ cây. Các dịng vơ tính
cao su GT 1, RRIM 600 và một số RRIM 2000 series, IAN 873 phải loại bỏ do mẫn
cảm với bệnh. Bệnh hiện diện trên cả nƣớc và gây hại nặng các tỉnh phía nam.
Giai đoạn ban đầu: RRIC 103, Fx 25, RRIM 725, KRS 21, PPN 2658, PPN
2444 và PPN 2447. Giai đoạn sau: GT 1, PR 107, PBIG, PB 217, PR 261, RRIM 600,
RRIM 605, RRIM 701, RRIM 702, RRIM 705, RRIM 2015 và RRIM 2020. (Phan
Thành Dũng, 1995; Chee, 1988)
1.2.3.5 Thái L n
Xuất hiện năm 1985 và làm chết 2% số cây của dịng vơ tính RRIC 103 và KRS
21 trong vƣờn thí nghiệm trao đổi giống quốc tế. Bệnh hại nặng ở các vùng phía Nam,
Tây và Tây Nam. Số lƣợng dịng vơ tính mẫn cảm tăng đáng kể.
Giai đoạn ban đầu: RRIC 103, KRS 21. Giai đoạn sau: RRIM 600, GT 1, KTS
225, 226, PR 255, PR 305, RRIT 251 và Songkhla 36. (Phan Thành Dũng, 1995)
1.2.3.6 Châu Phi

Xuất hiện hầu hết tại các nƣớc trồng cao su nhƣ: Cote d’Ivore, Gabon,
Cameroon và Nigeria. Bệnh gây hại trên nhiều dịng vơ tính và làm rụng đến 50% tán
lá, dẫn đến giảm 20 – 30% sản lƣợng ở vùng có điều kiện thuận lợi. Các dịng vơ tính
bị nhiễm bệnh: RRIC 103, RRIC 110, PB 235, PB 260, PB 28/59, một số dịng vơ tính


Trang 12

IRCA, MDF 372, RRIM 600, GT 1 và một số dịng vơ tính NIG 800 series.
(Jayasinghe,1997; Jayasinghe, 1998).
1.2.3.7 Việt N m
Xuất hiện vào tháng 8 năm 1999 tại RRIV, gây hại cho dịng vơ tính: RRIC 103,
RRIC 104. LH 88/372. Cuối năm 1999, hiện diện tại công ty Đồng Nai, Dầu Tiếng,
Phƣớc Hoà và Đồng Phú. Đầu năm 2000, gây hại nặng trên diện tích gần 200 ha tại
cơng ty Lộc Ninh ở các lứa tuổi của cây cao su. Gây bệnh trên lá non, già và cả chồi.
Hậu quả, gây rụng lá hàng loạt làm ảnh hƣởng lớn đến sinh trƣởng và sản lƣợng. Hơn
3000 cây cao su của các dịng vơ tính RRIC 103, RRIC 104, LH 88/372 phải tiêu huỷ.
Tiếp theo nhiều diện tích cao su trồng bằng dịng vơ tính RRIC 104 phải trồng lại. Từ
đó đến nay, bệnh có sự thay đổi về triệu chứng cũng nhƣ đang tích luỹ để có cơ hội
bùng phát.
Giai đoạn ban đầu: RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Giai đoạn gần đây:
RRIV4. Nhiều dịng vơ tính nhiễm bệnh ở mức độ khác nhau trong đó có RRIM 600,
GT 1, PB 235, PB 260, VM 515, RRIC 110… (Phan Thành Dũng và cs., 2010)

1.2.4 Cách phòng trị
Do gây hại quanh năm và trong suốt giai đoạn sinh trƣởng từ vƣờn ƣơng đến
vƣờn khai thác, nên dịng vơ tính cao su kháng bệnh đóng vai trị quyết định. Tránh
trồng các dịng vơ tính cao su mẫn cảm: RRIC 103, RRIC 104, RRIV 3, RRIV 4...
Ghép tán bằng các dòng vơ tính cao su kháng bệnh.
Áp dụng 1 trong những công thức: (1) hexaconazole (5% a.i) nồng độ 0,2 –

0,3%; (2) Hỗn hợp carbendazim (50% a.i) 0,1 – 0,15% + hexaconazole (5% a.i) 0,1 –
0,15% (phối trộn theo tỷ lệ 1:1); (3) Thuốc phối trộn sẵn gốc carbendazim và gốc
hexaconazole nồng độ tùy vào hàm lƣợng thuốc gốc (0,2 – 0,3%). Pha phối hợp với
chất bám dính BDNH 2000 nồng độ 0,2% (vƣờn ƣơng, nhân, vƣờn năm 1), 0,3%
(vƣờn năm 2 – 4), 0,5% (vƣờn năm 5 trở đi). Cần chú ý phun mặt dƣới lá là nơi nấm
xâm nhập với chu kỳ 7 – 10 ngày/ lần. (Phan Thành Dũng, 2009)


Trang 13

1.3 NẤ

Corynespora cassiicola

1.3.1 Lịch sử phát hiện nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) wei
Nấm Corynespora là lồi có phổ ký chủ rộng nên đã có rất nhiều nhà khoa học
tìm thấy loại nấm này trên nhiều ký chủ khác nhau. Đầu tiên, vào năm 1896 Cooke
phát hiện nấm này trên cây dƣa leo và cây dƣa hấu tại Mỹ, đặt tên là Cercospora
melonis. Sau đó, Gusgow (1906) đã đặt tên là Corynespora maizei khi ơng tìm thấy
chúng trên cây dƣa leo tại Đức. Đến năm 1948, các nhà khoa học Trung Quốc cho rằng
loại nấm họ tìm đƣợc trên cây đậu nành, đậu đũa tại Trung Quốc tƣơng tự nhƣ những
loại nấm gây bệnh trên cùng loại ký chủ ở Mỹ trƣớc đó và họ đặt tên là Corynespora
vignicola Kawamura. Liu (Kawamura, 1948).
Mặc dù có rất nhiều tên gọi khác nhau nhƣng cuối cùng Wei cũng đã thu thập,
phân tích tất cả những tài liệu về nấm này và khẳng định chúng đều thuộc một loài là
Corynespora cassiicola. Và ông đã đặt tên cho chúng là Corynespora cassiicola (Berk.
& Curt.) Wei (Wei, 1950). Hiện nay, các kỹ thuật sinh học phân tử phát triển, càng
khẳng định nhận định của Wei là hoàn toàn đúng.

1.3.2 Phân loại học

Theo nghiên cứu phân loại gần đây nhất (Kirk và cs., 2004) thì nấm
Corynespora cassiicola đƣợc phân loại nhƣ sau:
Lớp:

Dothideomycetes

Bộ:

Pleosporales

Họ:

Corynesporascaceae

Giống:

Corynespora

Loài:

Corynespora cassiicola

1.3.3 Đặc điểm hình thái
Kích thƣớc trung bình của đính bào tử phân lập từ cây cao su (Hevea
brasiliensis) là 64,4 x 5,52 µm (23,42 – 132,6 x 2,60 – 7,80 µm). Bào tử nảy mầm
tạo ra một hoặc nhiều ống mầm giữa các vách ngăn, nhƣng các ống mầm


Trang 14

thƣờng mọc nhiều ở các tế bào tận cùng của bào tử (Chee, 1988). Phan Thành Dũng
(2004), đã ghi nhận sự biến thiên về kích thƣớc và hình dạng của đính bào tử phân lập
từ lá cao su bị nhiễm bệnh ngồi tự nhiên và ni cấy trên mơi trƣờng Potato
Dextrose Agar (PDA). Chiều rộng trung bình của đính bào tử và cuống bào tử lớn
hơn và số vách ngăn trung bình nhiều hơn. Đính bào tử phân lập từ lá cao su thƣờng
dài, thon và có hình que trong mơi trƣờng ni cấy nhƣng có đáy hơi rộng.

Hình 1.7. Khuẩn lạc nấm Corynespora cassiicola trên mơi trƣờng PDA.

Hình 1.8. ào tử nấm Corynespora cassiicola nhuộm ằng ung ịch lactophenol.

1.3.4 Đặc điểm sinh lý
Corynespora cassiicola phát triển và hình thành bào tử tốt trên môi trƣờng
Potato Sucrose Agar (PSA) (Sarma và cs., 1970). Onesirosan và cs. (1974) đã tìm
thấy điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của C. cassiicola là 28ºC. Ở 32 –


Trang 15

36ºC nấm phát triển chậm và khuẩn lạc hình thành không đều. Phan Thành Dũng
(1995), C. cassiicola phân lập từ cây cao su nảy mầm trên môi trƣờng PSA
nhiều hơn trên môi trƣờng PDA và Rubber Leaf Extract Agar và điều kiện nhiệt
độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 28ºC. Chee (1988) cho rằng C. cassiicola phân
lập từ cây cao su (H. brasiliensis) nuôi trên môi trƣờng PSA đƣợc đặt trong bóng tối 3
ngày sau đó đặt dƣới ánh sáng 3 ngày ở 26ºC thì bào tử đính hình thành nhiều hơn.
Ẩm độ thích hợp nhất để phân lập C. cassiicola là 90%. Tuy nhiên, sự hình thành
bào tử vẫn xảy ra ở ẩm độ 80, 90 và 100%. (Mushrif, 2006)

1.3.5 Khả năng tồn tại
Corynespora cassiicola là tác nhân gây ra bệnh đốm lá trên các loại cây

trồng bằng cách sống và lan truyền mầm bệnh trên đồng ruộng. Nó có thể sống tới 2
năm trên xác bã cây trồng phổ ký chủ rộng. Ở các vƣờn trồng cao su, sự có mặt của
các loại cỏ giúp tăng sự sống của mầm bệnh và kiểm soát các loại cỏ có thể giảm bớt
đƣợc sự tác động của bệnh. Tuy nhiên, chúng có thể sống trên tất cả các bộ phận của
cây cao su bị nhiễm bệnh và xác bã cây trồng tiềm tàng dƣới dạng sợi nấm có màu
nâu đậm (Pernezny và cs., 1993). Đặc điểm này góp phần quan trọng trong thiết lập
hệ thống bảo vệ và điều chỉnh việc kiểm sốt nhằm giảm sự tích lũy nguồn bệnh. Năm
2004, Anonymous đã công bố rằng C. cassiicola có thể sống trên xác bã và hạt đậu
nành trên đất bỏ hoang nhiều năm. Nấm có thể sống trên các loại cây trồng cịn sót lại
trên đồng ruộng cũng nhƣ trên xác bã cây trồng và xác bã giun trịn (Mushrif, 2006).
Bào tử có khả năng tồn tại trong đất với thời gian dài, trên lá cao su khô nấm vẫn tồn
tại và giữ nguyên khả năng gây bệnh đến 3 tháng (Phan Thành Dũng, 2004). C.
cassiicola phân lập từ cây cao su là loại gây bệnh chuyên biệt trên cây cao su và
không gây bệnh trên lá cây tiêu, đu đủ và cà chua (Phan Thành Dũng, 1995).

1.3.6 Khả năng phát tán
Trên cây cao su, C. cassiicola tạo số lƣợng bào tử lớn với các vách ngăn nằm
ngang (trung bình là 2 – 16 vách ngăn) và xác định chu kỳ ngày đêm của sự phóng