Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic và ứng dụng bổ sung vào thức ăn nuôi cá chim vây vàng

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG




Lê Đình Đức






“NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC VÀ ỨNG
DỤNG BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN NUÔI CÁ CHIM VÂY VÀNG
(Trachinotus blochii LACEPEDE, 1801) GIAI ĐOẠN GIỐNG”



LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch
Mã số: 60.54.10



Hướng dẫn khoa học:
1. TS Vũ Ngọc Bội
2. PGS.TS Lại Văn Hùng

Nha Trang - 4/2012
1
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được thực hiện
dưới sự cho phép của cơ quan chủ quản - Trường Đại học Nha Trang. Các kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.

Tác giả
2
LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ niềm tự hào vì đã được học tập và nghiên cứu tại
Trường Đại học Nha Trang, một trong những trường đầu ngành về nuôi trồng và
chế biến thủy sản.
Xin được gửi lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất đến TS. Vũ Ngọc Bội
và PGS.TS Lại Văn Hùng, những người thầy kính mến đã tận tình dìu dắt, hướng
dẫn, động viên tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Khoa Công nghệ Thực phẩm đã
giảng dạy và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại
trường.

Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Viện CNSH&MT, Bộ môn Công nghệ
Sinh học đã tạo điều kiện và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian đi học.
Xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Văn Duy, Th.S Ngô Văn Mạnh, các
bạn bè, đồng nghiệp và các bạn sinh viên đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt
quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, xin gửi lòng biết ơn đến gia đình thương yêu đã chia sẻ, động
viên tôi hoàn thành khóa học và luận văn này!


3
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 6
DANH MỤC BẢNG 7
DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ 8
MỞ ĐẦU 9
Chương 1. TỔNG QUAN 12
1.1. Giới thiệu về probiotic 12
1.2. Phân loại vi sinh vật probiotic 12
1.3. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến
sức khỏe của vật nuôi 14
I.4. Cơ chế tác động của probiotic 16
I.4.1. Cạnh tranh vị trí bám dính và loại trừ vi khuẩn gây bệnh 16
I.4.2. Sản sinh ra các chất ức chế 17
I.4.3. Kích thích hệ miễn dịch 20
I.4.4. Ức chế cơ chế dò tìm mật độ tới hạn của vi khuẩn gây bệnh 21
1.4.5. Khả năng kháng virus 23
1.5. Ứng dụng của probiotic 23
1.5.1. Ứng dụng trong y học và chăn nuôi 23
1.5.2. Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản 24

1.6. Lactobacillus - vi khuẩn probiotic điển hình 25
1.7. Tình hình nghiên cứu sử dụng Lactobacillus làm probiotic 28
1.7.1. Trong y học và chăn nuôi 28
1.7.2. Trong nuôi trồng thủy sản 29
I.8. Sản xuất chế phẩm probiotic sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản 32
I.8.1. Phân lập và tuyển chọn giống vi khuẩn probiotic 32
1.8.2. Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic 35
I.9. Cá Chim vây vàng 36
I.9.1. Giới thiệu về cá Chim vây vàng 36
I.9.2. Tình hình bệnh dịch trong nuôi cá biển 37
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40
4
2.1. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 40
2.1.1. Mẫu phân lập vi khuẩn Lactobacillus 40
2.1.2. Vi sinh vật chỉ thị 40
2.1.3. Cá Chim vây vàng 40
2.1.4. Muôi trường nuôi cấy vi sinh vật 40
2.1.5. Các thiết bị chuyên dụng 41
2.2. Phương pháp nghiên cứu 42
2.2.1. Phân lập Lactobacillus 42
2.2.2. Tuyển chọn các chủng Lactobacillus kháng Vibrio 42
2.2.3. Xác định đặc điểm hình thái và sinh hóa 43
2.2.3.1. Quan sát đặc điểm hình thái 43
2.2.3.2. Xác định đặc tính sinh hóa 43
2.2.4. Xác định khả năng sinh trưởng 43
2.2.5. Bố trí thí nghiệm xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp 43
2.2.6. Xác định các đặc tính probiotic 44
2.2.6.1. Xác định khả năng sinh enzym ngoại bào 44
2.2.6.2. Xác định khả năng sinh acid 44
2.2.6.3. Xác định khả năng sinh các chất kháng khuẩn 44

2.2.6.4. Xác định khả năng chịu mặn 45
2.2.6.5. Xác định khả năng chịu muối mật 45
2.2.7. Xác định chất phụ gia thích hợp cho quá trình đông khô 45
2.2.8. Bố trí thí nghiệm bổ sung chế phẩm probiotic vào thức ăn nuôi
cá Chim vây vàng 45
2.2.9. Xác định khả năng tăng trưởng và chuyển hóa thức ăn ở cá 46
2.2.10. Xác định thành phần vi sinh đường ruột cá 47
2.2.11. Xử lý thống kê 47
2.3. Cách tiếp cận các vấn đề nghiên cứu 48
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49
3.1. Phân lập và tuyển chọn Lactobacillus 49
3.1.1. Phân lập Lactobacillus từ nội tạng cá Chim vây vàng 49
3.1.2.Tuyển chọn chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio 49
3.1.3. Tuyển chọn chủng Lactobacillus sinh enzym ngoại bào 51
5
3.2. Xác định đặc điểm hình thái và sinh hóa của các chủng 52
3.2.1. Đặc điểm hình thái 52
3.2.2. Đặc tính sinh hóa 53
3.3. Xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp của các chủng 55
3.3.1. Đường cong sinh trưởng 55
3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 56
3.3.3. Ảnh hưởng của pH môi trường 58
3.3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc 60
3.4. Một số đặc tính khác của các chủng probiotic 62
3.4.1. Khả năng sinh acid 62
3.4.2. Khả năng sinh bacteriocin 63
3.4.3. Khả năng chịu mặn 63
3.4.4. Khả năng chịu muối mật 65
3.5. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic ở dạng đông khô 67
3.5.1. Nghiên cứu lựa chọn chất chống đông 67

3.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian bảo quản 69
3.6. Đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm probiotic dạng đông khô 70
3.7. Thử nghiệm bổ sung chế phẩm probiotic vào thức ăn nuôi cá Chim vây
vàng giai đoạn giống 71
3.7.1. Ảnh hưởng của chế phẩm probiotic đến tăng trưởng và
chuyển hoá thức ăn của cá 71
3.7.1.1. Chiều dài 71
3.7.1.2. Khối lượng và tốc độ sinh trưởng đặc trưng (SGR) 73
3.7.1.3. Hệ số phân đàn về chiều dài (CV
L
) 73
3.7.1.4. Hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) 74
3.7.3. Ảnh hưởng của chế phẩm probiotic đến hệ vi sinh đường ruột cá 76
3.7.3.1. Tổng số Lactobacillus spp. 76
3.7.3.2. Tổng số Vibrio spp. 78
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81
TÀI LIỆU THAM KHẢO 81
PHẦN PHỤ LỤC 89
6
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu
OD
CFU
APW
MRS
TCBS
MPN
FAO
Chữ viết tắt

Optical Density (Mật độ quang)
Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)
Alkaline Peptone Water
de Man, Rogosa and Sharpe
Thiosunfate Citrate Bile Salts Sucrose
Most Probable Number
Food and Agriculture Oganization of the United Nation
LAB Lactic acid bacteria
FCR Hệ số chuyển hóa thức ăn
SGR Tốc độ tăng trưởng đặc trưng
CV
L
Hệ số phân đàn theo chiều dài
7
DANH MỤC BẢNG
TT Tên bảng Trang
1

Bảng 1.1. Mô tả trạng thái Eubiosis và Dysbiosis 16
2

Bảng 2.1. Bố trí các nghiệm thức trong thí nghiệm 46
3

Bảng 3.1. Khả năng kháng Vibrio của các chủng Lactobacillus 50
4

Bảng 3.2. Khả năng sinh enzym protease và amylase ngoại bào
của các chủng vi khuẩn Lactobacillus
52

5

Bảng 3.3. Hình thái tế bào và khuẩn lạc của các chủng L1.2,
L1.3 và L1.8
53
6

Bảng 3.4. Đặc tính sinh hóa của các chủng L1.2, L1.3 và L1.8 54
7

Bảng 3.5. Mật độ tế bào (OD
620
) theo thời gian nuôi cấy 55
8

Bảng 3.6. Khả năng sinh acid của chủng L1.2 và L1.3. 62
9

Bảng 3.7. Khả năng sinh bacteriocin của chủng L1.2 và L1.3 63
10

Bảng 3.8. Quy trình đông khô chế phẩm probiotic 68
11

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của chất chống đông đến tỷ lệ sống của
chủng L1.2 và L1.3
68
12

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến tỷ lệ sống

của chủng L1.2 và L1.3
69
13

Bảng 3.11. Chiều dài toàn thân, khối lượng, tốc độ sinh trưởng
đặc trưng (SGR) và hệ số phân đàn về chiều dài (CV
L
) của cá
71
14

Bảng 3.12. Thành phần của hệ vi sinh đường ruột cá Chim vây
vàng trước và sau khi sử dụng chế phẩm probiotic
75
8
DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ HÌNH VẼ
TT

Tên đ
ồ thị, h
ình v
ẽ

Trang

1

Hình 1.1. Sơ đồ tuyển chọn chủng probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản 34
2

Hình 1.2. Sơ đồ quy trình sản suất chế phẩm probiotic dạng bột 35
3

Hình 2.1. Sơ đồ tiếp cận các vấn đề nghiên cứu 48
4

Hình 3.1. Khả năng kháng
Vibrio
của một số chủng
Lactobacillus

49
5

Hình 3.2. Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2, L1.3 và L1.8 55
6


Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng của
chủng L1.2
56
7

Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng của
chủng L1.3
57
8

Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng của
chủng L1.8

57
9

Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của chủng L1.2 58
10

Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của chủng L1.3 59
11

Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của chủng L1.8 59
12

Hình 3.9. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của chủng L1.2

61
13

Hình 3.10. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh của chủng L1.3 61
14

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ muối (%) đến sinh trưởng
của chủng L1.2
64
15

Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ muối (%) đến sinh trưởng
của chủng L1.3
64
16

Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ muối mật (%) đến sinh
trưởng của chủng L1.2
66
17

Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ muối mật (%) đến sinh
trưởng của chủng L1.3
66
18

Hình 3.15. Ảnh hưởng của chất chống đông đến tỷ lệ sống của
chủng L1.2 và L1.3
69
19

Hình 3.16. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm probiotic 70
20

Hình 3.17. Chiều dài trung bình của cá 71
21

Hình 3.18. Khối lượng trung bình của cá 73
22

Hình 3.19. Hệ số phân đàn về chiều dài (CVL) của cá 74
23

Hình 3.20. Hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR) của cá 75
24

Hình 3.21. Mật độ của
Lactobacillus
spp. tổng số trong đường
ruột cá
77
25

Hình 3.22. Mật độ của
Vibrio
spp. tổng số trong đường ruột cá 78
9
MỞ ĐẦU
I. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, nuôi trồng thuỷ sản trở thành một trong những ngành kinh tế mũi
nhọn của nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Đây là ngành có tốc
độ tăng trưởng nhanh, trung bình hàng năm (từ năm 1970) là 8,9% so với tốc độ
tăng trưởng 1,2% của đánh bắt và 2,8% của nuôi động vật trên cạn trong cùng
thời điểm. Tổng sản lượng nuôi trồng thuỷ sản của toàn thế giới đạt 55,1 triệu tấn
năm 2009 với giá trị khoảng 98,4 tỷ USD trong đó nuôi trồng thuỷ sản nước mặn
đạt 20,1 triệu tấn và giá trị 30 tỷ USD. Sản lượng nuôi trồng thuỷ sản của các
nước châu Á đạt trên 40 triệu tấn tương đương với 80% sản lượng toàn cầu trong
năm 2009, tiếp theo là Châu Âu (6%) và Mỹ (5%) (FAO, 2010) [34].
Để đáp ứng nhu cầu phát triển của ngành nuôi trồng thuỷ sản, các cơ sở sản
xuất với quy mô lớn ra đời, đã đặt các loài thuỷ sản phải tiếp xúc với những điều
kiện bất lợi, chủ yếu là liên quan đến bệnh và các vấn đề về suy thoái môi trường
thường xuyên xảy ra, dẫn đến thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế.
Vi khuẩn và virus gây bệnh là các tác nhân gây bệnh chủ yếu trên động vật
thuỷ sản. Để phòng chống, điều trị và kiểm soát bệnh trên động vật thuỷ sản do
các tác nhân này gây ra đã dẫn tới việc tăng đáng kể việc sử dụng thuốc thú y
(hoá chất, thuốc kháng sinh và vacxin). Trong đó thuốc kháng sinh được sử dụng

phổ biến với số lượng rất lớn [6], [23].
Mỹ là nước sản xuất thuốc kháng sinh lớn nhất thế giới, khoảng 18.000 tấn
mỗi năm với mục đích sử dụng cho y tế và nông nghiệp, trong đó 12.600 tấn (gần
70%) được sử dụng không phải để chữa bệnh mà dùng để thúc đẩy tăng trưởng
(SCAN, 2003). Liên minh Châu Âu và Thụy Sĩ sản xuất 1600 tấn kháng sinh,
trong đó khoảng 30% được sử dụng cho vật nuôi, với mục đích tương tự để tăng
trưởng (SCAN, 2003).
Như vậy, việc sử dụng kháng sinh lâu dài như một biện pháp phòng ngừa
và yếu tố thúc đẩy tăng trưởng đã gây nên hiện tượng kháng thuốc của các chủng
vi khuẩn gây bệnh (tạo ra gen kháng kháng sinh). Nhiều nghiên cứu cho thấy các
loài vi khuẩn gây bệnh đã tăng lên theo từng năm. Đặc biệt, một số loài vi khuẩn
gây bệnh có thể truyền gen kháng kháng sinh sang các loài vi khuẩn gây bệnh
cho người. Tính chất nguy hiểm của tình trạng kháng thuốc ngày càng được ý
thức hơn khi người ta thấy rằng những vi khuẩn kháng thuốc đã gây ra các bệnh
10
chết người còn lớn hơn cả bệnh AIDS. Ở Mỹ hơn 100 ngàn ca bệnh gây ra bởi
Staphylococcus aureus kháng lại methicillin đã làm 18.600 người chết, trong khi
cũng trong năm đó số người bị chết do HIV/AID chỉ là 17.000 (Tạp chí y khoa
Mỹ 10, 2007). Để hạn chế hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh, toàn
bộ các nước trong Cộng đồng Châu Âu đã cấm sử dụng kháng sinh với vai trò là
chất kích thích tăng trưởng từ ngày 1 tháng 1 năm 2006 [16].
Probiotic (các vi khuẩn có lợi) được sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản, mà
mầm bệnh được kiểm soát thông qua một loạt các cơ chế khác nhau như: cạnh
tranh với vi khuẩn gây bệnh, sản sinh một số hợp chất kháng khuẩn như acid hữu
cơ, hydro peroxide, bacteriocin; tăng cường hệ miễn dịch ngày càng được xem
như là một thay thế cho thuốc kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh trên động
vật thuỷ sản. Ngoài ra, probiotic còn có khả năng tổng hợp một số loại vitamin
nhóm B, tổng hợp hệ enzym tiêu hoá tăng cường chuyển hoá thức ăn, do đó
probiotic được coi là một nhân tố thúc đẩy tăng trưởng. Những nghiên cứu về sử
dụng probiotic cho con người và động vật trên cạn đã được công bố từ lâu với rất

nhiều công trình nghiên cứu có giá trị. Tuy nhiên, trong lĩnh vực nuôi trồng thuỷ
sản mới được áp dụng trong những năm gần đây và đã cho rất nhiều kết quả khả
quan [22], [23].
Cá Chim vây vàng là loài cá sống chủ yếu ở giữa và tầng mặt thuộc vùng
biển ấm. Cá Chim vây vàng có giá trị kinh tế cao, được nuôi nhiều ở các nước:
Đài Loan, Trung Quốc, Singapore, Indonesia… vì rất dễ nuôi, nhanh lớn, ít bị
bệnh. Đài Loan là nơi sản xuất giống đầu tiên vào năm 1989, sau đó công nghệ
sản xuất giống lan rộng ra nhiều nước như Trung Quốc, Indonesia và Việt Nam.
Từ năm 2006 Trường Cao đẳng Thủy sản Bắc Ninh đã thực hiện thành công dự
án “Nhập công nghệ sản xuất giống cá Chim vây vàng” đã chủ động được nguồn
con giống, mở ra một triển vọng mới cho nghề nuôi cá biển. Từ năm 2008,
trường Đại học Nha Trang cũng đã sản xuất thành công giống cá Chim vây vàng,
đã cung cấp hàng trăm nghìn con giống cho khu vực Nam Trung Bộ. Cá Chim
vây vàng là một trong ba đối tượng đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông
thôn đưa vào chương trình hành động “Phát triển nghề nuôi biển đảo năm 2010”.
Tuy nhiên, cùng với sự tăng trưởng nhanh của nghề nuôi biển đã dẫn tới ô
nhiễm môi trường nước biển và phát tán bệnh tật. Nhiều nghiên cứu gần đây cho
thấy đã có các sự cố về bệnh tật xảy ra tại các lồng nuôi. Bệnh do vi khuẩn, virus
và ký sinh trùng có thể xảy ra ở tất cả các giai đoạn của quá trình nuôi, đặc biệt là
các bệnh do vi khuẩn gây ra như bệnh xuất huyết trên da [09], [20].
11
Từ những phân tích ở trên, việc “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic
và ứng dụng bổ sung vào thức ăn nuôi cá Chim vây vàng” là cần thiết và là một
hướng đi mới trong việc ứng dụng probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản.
II. Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn probiotic thuộc giống
Lactobacillus trên cá Chim vây vàng
2. Thử nghiệm in vitro khả năng kháng khuẩn (Vibrio), khả năng sinh
enzym ngoại bào (protease, amylase), acid và các hợp chất kháng khuẩn, khả
năng chịu mặn, khả năng chịu muối mật.

3. Sản xuất chế phẩm probiotic dạng đông khô (lựa chọn chất chống đông
phù hợp, xác định thời gian bảo quản).
4. Thử nghiệm bổ sung chế phẩm probiotic vào thức ăn nuôi cá Chim vây
vàng giai đoạn giống nuôi tại Nha Trang, Khánh Hoà.
5. Xác định khả năng phát triển và khả năng kháng Vibrio spp. của các
chủng vi khuẩn probiotic bổ sung trong đường ruột cá Chim vây vàng.
III. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
1. Làm giàu bộ sưu tập chủng vi sinh vật probiotic biển.
2. Xây dựng được quy trình phân lập, tuyển chọn và sản xuất chế phẩm
probiotic để bổ sung vào thức ăn nuôi cá Chim vây vàng giai đoạn giống.
3. Đánh giá được hiệu quả của việc bổ sung chế phẩm probiotic (tốc độ tăng
trưởng, tỷ lệ sống và khả năng kháng Vibrio) trên cá Chim vây vàng khi được
nuôi bằng thức ăn bổ sung chế phẩm probiotic.
12
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về probiotic
Probiotic là một từ gốc tiếng Hy Lạp có nghĩa là "for life". Nó được dùng
để mô tả các vi khuẩn "thân thiện" thường sống ở đường ruột và có đóng góp vào
sức khỏe tốt của vật chủ. Thuật ngữ “Probiotic" được định nghĩa đầu tiên bởi
Lilly và Stillwell (1965): “Probiotic là nhân tố thúc đẩy tăng trưởng được sản
xuất bởi các vi sinh vật". Vượt qua thời gian cùng với sự hiểu biết lớn hơn về
probiotic, nhiều định nghĩa mới ra đời, một trong những định nghĩa được đa số
các nhà khoa học nhất trí “Probiotic là những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ
thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của vật chủ” (FAO/WHO, 2001)
[36].
Những nghiên cứu ứng dụng probiotic mới được chú ý trong khoảng hơn 2
thập kỷ gần đây nhưng tác dụng của nó thì đã được nhận thấy từ lâu. Eli
Metchnikoff (1845-1919) là người đầu tiên đặt nền móng cho việc sử dụng
probiotic. Năm 1908, Eli Metchnikoff đã chứng tỏ rằng việc tăng tuổi thọ của
một bộ phận nông dân Bungari là do sự tiêu thụ sữa lên men sữa chua với một

chủng Lactobacillus nhất định. Ông tin rằng Lactobacillus spp có một ảnh hưởng
quan trọng đến sức khỏe đường ruột, đặc biệt là nó ức chế các vi sinh vật không
mong muốn trong ruột già và ruột non, và do đó giúp ổn định hệ thống tiêu hóa
[22], [28].
Ngày nay probiotic được sử dụng rộng rãi và rất hiệu quả trong việc phòng
và trị bệnh cho con người. Một số chủng được sử dụng phổ biến cho con người
thuộc các giống Lactobaciluss spp. và Bifidobacterium spp. Ngoài việc sản xuất
các sản phẩm dược phẩm, probiotic còn được bổ sung vào rất nhiều các sản phẩm
thực phẩm như: sữa, đồ uống, bánh kẹo Các yếu tố quan trọng quyết định đến
việc sử dụng hiệu quả probiotic trong dược phẩm cũng như thực phẩm là việc
duy trì khả năng tồn tại và hoạt động của các chủng vi sinh vật có để tồn tại trong
thực phẩm trong suốt thời gian bảo quản của thực phẩm, trong quá trình vận
chuyển trong đường ruột với điều kiện axít và các enzym tiêu hóa ở dạ dày và
muối mật trong ruột non [31], [76].
1.2. Phân loại vi sinh vật probiotic
Vi sinh vật có hoạt tính probiotic bao gồm các nhóm sau [28]:
13
- Nhóm vi khuẩn lactic (LAB): gồm các chủng thuộc giống Lactobacilus và
Bifidobacterium. Đây là các chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình, kỵ khí
hoặc vi hiếu khí. Vi khuẩn lactic rất phổ biến trong tự nhiên, rất thân thuộc với
con người và động vật. Vi khuẩn này có nhiều trong các sản phẩm muối chua,
trong đường ruột của các người và động vật. Trong quá trình trao đổi chất vi
khuẩn lactic có khả năng chuyển hoá đường thành acid lactic. Ngoài ra nó còn có
khả năng sản sinh bacteriocin - một loại hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn với
phổ ức chế các vi khuẩn khác rất rộng. Loại chất kháng khuẩn này khác với thuốc
kháng sinh vì nó không gây ra đặc tính tính kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây
bệnh. Cả acid lactic và bacteriocin đều có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh
nhờ đó dẫn đến việc giải độc đường ruột và tăng khả năng tiêu hoá thức ăn.
- Nhóm vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh: các chủng có hoạt tính amilase và
protease (đặc biệt là protease kiềm). Đây là các chủng vi sinh vật thuộc nhóm

Bacillus (B. subtilis, B. licheniformis…), các chủng này hiếu khí hoặc tuỳ tiện,
không gây bệnh, gây độc đối với người và vật nuôi. Nhóm vi khuẩn này có tác
dụng phân giải các hợp chất hữu cơ bị ô nhiễm trong môi trường nước nuôi. Các
vi khuẩn này còn đóng vai trò tăng cường khả năng tiêu hoá thức ăn trong đường
ruột. Ngoài khả năng sinh các loại enzym phân giải ở trên, vi khuẩn thuộc nhóm
này cũng có khả năng sinh bacteriosin: B. subtilis có khả năng sinh subtiline,
inturine, B. licheniformis có khả năng sinh bacitraxin. Các chất này đều có hoạt
tính kháng khuẩn, đặc biệt là bacidraxin được sử dụng nhiều trong chăn nuôi để
nâng cao tốc độ tăng trưởng và hiệu suất sử dụng thức ăn [30].
- Nhóm vi khuẩn quang tự dưỡng: gồm 5 giống Chlorobi, Cyanobacteria,
Chloroflexi (filamentous anoxygenic phototrophs), Firmicutes (heliobacteria) and
Proteobacteria (vi khuẩn tía có lưu huỳnh và không có lưu huỳnh. Chúng có khả
năng đồng hoá H
2
S và CO
2
để xây dựng tế bào và không sinh O
2
. Các vi khuẩn
này kỵ khí bắt buộc và cần ánh sáng trong quá trình đồng hoá. Chúng có khả
năng khử màu, khử mùi do các hợp chất chứa lưu huỳnh sinh ra. Ngoài ra chúng
còn có khả năng chuyển hoá NO
2
-
thành NO
3
-
, Fe
2+
thành Fe

3+
. Nhóm vi khuẩn
này có khả năng cải thiện chất lượng nước, cân bằng độ pH, loại trừ nhanh chóng
N-NH
3
, H
2
S, acid hữu cơ đồng thời tăng cường tốc độ tăng trưởng và khả năng
phòng chống dịch bệnh.
- Nhóm nấm men gồm một số loài Saccharomyces. Scholz (1999) đã cho
thấy các loại men S.cerevisiae và Phaffia rhodozyma giúp nâng cao sức đề kháng
chống vibriosis, cải thiện tỉ lệ tiêu hóa các chất dinh dưỡng, tăng khả năng đáp
14
ứng miễn dịch ở động vật. Màng tế bào nấm men là một nguồn giàu các chất
glucans và mannans giúp kích thích hệ miễn dịch do chứa nhiều nucleotides,
vitamin và vi khoáng là những chất bổ dưỡng cơ bản giúp nâng cao chức năng
của hệ miễn dịch [55], [60].
1.3. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe
của vật nuôi
Bên cạnh sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa còn đóng vai trò
quan trọng như là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể. Do đó, nó là hệ thống
bảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm.
Thêm vào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các phản ứng
đặc hiệu và không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Khu hệ vi
sinh vật đường ruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại các tác nhân
gây bệnh.
Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hoá của vật nuôi ở trạng thái vô trùng,
nhưng chỉ vài giờ sau khi sinh các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và trở thành
những “cư dân” bình thường trong đường tiêu hoá (WHO, 2001). Theo thời gian,
do tiếp xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước uống, số

lượng và tính đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng
lên. Số lượng tế bào vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của vật nuôi có thể
cao gấp mười lần số lượng tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng. Số lượng loài có thể
lên tới từ 400-500. Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của
đường tiêu hóa (dạ dày; tá tràng; ruột non và ruột già) ở loài động vật dạ dày đơn
rất khác nhau (khoảng 10
1
-10
3
; 10
1
-10
4
; 10
5
-10
8
và 10
9
-10
12
CFU/ml chất chứa
tương ứng) [68].
Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính [70]: trạng thái sinh lý
của vật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật. Các yếu tố này chịu tác động
của môi trường, của các stress và tác động qua lại lẫn nhau. Trong số các nhân tố
trên, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một biến động bất
lợi của một trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh vật. Sự
cộng sinh của các loài vi sinh vật trong đường tiêu hoá của vật nuôi (chủ yếu là
trong ruột) tạo nên một hệ sinh thái mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật

được xác lập chỉ một thời gian rất ngắn sau khi sinh.
Có nhiều quan điểm khác nhau về mối tương quan cân bằng của hệ vi sinh
vật ruột. Để đánh giá trạng thái cân bằng, các vi sinh vật ruột được chia thành 3
15
nhóm (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm các loài vi khuẩn kị khí (Clostridium;
Lactobacillus; Bifidobacteria; Bacteroides, Eubacteria); (2) nhóm vệ tinh
(Satellite flora), gồm chủ yếu là Enterococcus và E. coli, và (3) nhóm còn lại
(Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như Proteus, Staphylococcus và
Pseudomonas… Một quần thể vi sinh vật được coi là cân bằng khi tỷ lệ của các
nhóm dao động trong khoảng 90; 1,0 và 0,01% tương ứng. Trạng thái mà các
nhóm này hình thành một tỷ lệ 90:1:0,01 được gọi là trạng thái “eubiosis” (tiếng
Hy Lạp có nghĩa là sự chung sống có lợi giữa các vi khuẩn với nhau và với vật
chủ). Ở trạng thái “eubiosis”, vật chủ cung cấp các điều kiện sống lý tưởng như
nhiệt độ ổn định, pH trung tính, dinh dưỡng và sự đào thải các chất chuyển hóa.
Đổi lại, hệ vi sinh vật sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ thông qua tăng cường tiêu
hóa các chất dinh dưỡng, giải độc, tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin K,
loại trừ các vi sinh vật có hại, tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Sự cân
bằng của hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa bị tác động bởi một số nhân tố vô
sinh và hữu sinh như: sinh lý vật chủ, khẩu phần thức ăn và cơ cấu nội tại của
bản thân hệ vi sinh vật. Thức ăn là nền dinh dưỡng cơ bản của vi sinh vật, bởi
vậy sự thay đổi thành phần khẩu phần, thức ăn không đảm bảo vệ sinh, phương
pháp cho ăn không hợp lý đều làm tổn hại đến trạng thái cân bằng hệ vi sinh
vật ruột. Tương tự như vậy, các chất bài tiết của hệ tiêu hóa (dịch mật, các
enzym, chất đệm và chất nhầy ) cũng như kiểu và tần số nhu động ruột cũng tác
động trực tiếp đến hệ vi sinh vật. Kiểu và tần số nhu động ruột bị tác động rất lớn
bởi các stress (sinh đẻ, cai sữa, dồn chuồng, vận chuyển ). Khi quan hệ cân bằng
của hệ vi sinh vật ruột bị phá vỡ sẽ tạo nên trạng thái “dysbiosis” (trạng thái
“chung sống có hại”). Biểu hiện của trạng thái “dysbiosis” ở vật chủ thường là
thể tạng kém, sinh trưởng chậm và mắc các bệnh đường tiêu hóa như tiêu chảy,
viêm ruột hoại tử (tóm tắt trạng thái eubiosis và dysbiosis có trong Bảng 1). Để

cải thiện quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột ở vật nuôi, một phương pháp
thường được áp dụng là bổ sung vào khẩu phần thức ăn một số loại kháng sinh
liều thấp như những chất kích thích sinh trưởng. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng
sinh trong thức ăn chăn nuôi một cách không có kiểm soát đã và đang gây ra
những hậu quả đáng lo ngại về vệ sinh an toàn thực phẩm và đặc biệt là gây nên
tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng của các vi khuẩn gây bệnh trên người
và vật nuôi. Hiện nay, khối liên minh châu Âu (EU) đã cấm sử dụng kháng sinh
để bổ sung vào thức ăn như chất kích thích sinh trưởng từ ngày 01 tháng 01 năm
2006. Việc cấm sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi cũng đặt ra những
thách thức lớn về kỹ thuật, đặc biệt đối với chăn nuôi gia súc, gia cầm và nuôi
16
trồng thủy sản. Để vượt qua những thách thức đó, đã có rất nhiều những nghiên
cứu nhằm tìm ra tác nhân để thay thế kháng sinh nhưng an toàn với vật nuôi. Một
trong những hướng đi mới, hiệu quả là sử dụng chế phẩm probiotic [21], [69].
Bảng 1.1. Mô tả trạng thái Eubiosis và Dysbiosis
Trạng thái Eubiosis
- Sự cùng tồn tại giữa vật chủ và
hệ vi sinh vật đường ruột – Sự cộng
sinh
- Sự bảo vệ bề mặt của đường tiêu
hóa chống lại các vi sinh vật xâm
nhiễm.
- Kích thích hệ miễn dịch của vật
chủ.
- Tiêu hóa các chất dinh dưỡng.
- Tổng hợp protein.
- Tổng hợp các vitamin
Trạng thái Dysbiosis
- Sự không cùng tồn tại giữa vật
chủ và hệ vi sinh vật đường ruột.

- Sự phá hủy biểu mô đường
ruột, làm cho thành đường ruột mỏng
đi dẫn đến giảm sự hấp thụ các chất
dinh dưỡng.
- Sinh ra các cơ chất gây độc
(NH
3
, chất độc…)
- Phân hủy, tăng sản sinh khí gas
(CH
4
, H
2
S, CO
2
).
- Làm yếu hệ thống miễn dịch
I.4. Cơ chế tác động của probiotic
Việc tăng cường khả năng chống xâm nhập cùng với tác dụng ức chế trực
tiếp đối với các vi khuẩn gây bệnh là hai nhân tố quan trọng giúp cho probiotic
làm giảm sự ảnh hưởng cũng như thời gian nhiễm bệnh của các vi khuẩn gây
bệnh. Các chủng probiotic thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh trong cả
các thử nghiệm in vitro và in vivo thông qua một số cơ chế khác nhau. Mặc dù đã
có nhiều công trình nghiên cứu về probiotic đã được công bố trong hơn một thập
kỷ qua nhưng do những giới hạn về phương pháp và giới hạn về đạo đức của việc
nghiên cứu trên động vật là những khó khăn trong việc tìm hiểu cơ chế tác động
của probiotic, hoặc chỉ có thể tìm hiểu và giải thích được từng phần. Mặc dù vậy
thông qua những lợi ích của việc sử dụng và điều trị bằng probiotic, cơ chế hoạt
động của vi khuẩn probiotic bao gồm:
I.4.1. Cạnh tranh vị trí bám dính và loại trừ vi khuẩn gây bệnh

Khả năng bám dính của các tế bào probiotic trong chất nhầy ruột và các tế bào
biểu mô từ lâu đã được xem là một trong những tiêu chí lựa chọn quan trọng nhất.
17
Khả năng bám dính vào niêm mạc ruột có thể giúp cho các tế bào probiotic không bị
rửa trôi khỏi đường ruột và nhờ đó chúng mới có khả năng cố định và phát triển
trong đường ruột. Từ đó, chúng mới có khả năng tác động đến hệ miễn dịch và cạnh
tranh loại trừ các mầm bệnh. Khả năng bám dính của các chủng probiotic phục
thuộc vào nhiều yếu tố như bản thân vi khuẩn probiotic, pH của đường ruột, các
enzym tiêu hóa trong đường ruột, sự có mặt của muối mật. Ngoài ra độ tuổi của vật
chủ và trạng thái sinh lý cũng ảnh hưởng rất lớn đến khả năng bám dính. Những cơ
thể vật chủ non và thể trạng khỏe mạnh thì khả năng bám dính của vi khuẩn
probiotic cũng tốt hơn. Khả năng bám dính được tạo nên nhờ một số nhân tố chủ
yếu: protein thành tế bào, carbohydrate và acid lipoteichoic [49].
Những nghiên cứu gần đây cho thấy khả năng bám dính của vi khuẩn
probiotic được coi như là cơ chế họat động probiotic. Một số phương pháp khác
nhau có được sử dụng để đánh giá khả năng bám dính của các chế phẩm sinh
học. Phổ biến nhất là đánh giá khả năng kết dính với tế bào niêm mạc ruột và
chất nhầy ruột [18].
Vi khuẩn probiotic còn có khả năng kết hợp với vi khuẩn gây bệnh theo
kiểu đồng keo tụ, chúng kết dính với nhau tạo thành chùm và từ đó có khả năng
loại bỏ các vi khuẩn gây bệnh nếu nồng độ các vi khuẩn probiotic đủ lớn. Đây là
cơ sở quan trọng giúp ta có thể đánh giá sơ bộ một chủng probiotic có khả năng
phù hợp hay không [61].
Cạnh tranh vị trí bám dính trên đường ruột là một tiêu chí quan trọng để
dánh giá hiệu quả của vi sinh vật probiotic. Vi khuẩn probiotic cạnh tranh vị trí
bám dính trên thành ruột hay trên các biểu mô khác có vai trò ngăn cản sự khu
trú và phát triển của các vi khuẩn gây bệnh. Người ta đã chứng minh khả năng
bám dính và phát triển trên bề mặt ruột của Lactobacillus GG và Lactobacillus
plantarum 299V để ngăn cản sự phát triển và lây lan của vi khuẩn Escherichia
coli 0157H7 gây bệnh tiêu chảy ở người và động vật nuôi. Ngoài ra một số vi

khuẩn thuộc giống Lactobacillus cũng được biết có thể khóa chặt các thụ thể bề
mặt trong đường ruột để hạn chế được sự bám dính của các vi sinh vật gây bệnh
khác [70].
I.4.2. Sản sinh ra các chất ức chế
Mặc dù tác dụng có lợi cho sức khỏe của sữa lên men chỉ được phát hiện
vào đầu thế kỷ 20 qua những nghiên cứu của Metchnikoff. Nhưng sữa và rau quả
lên men đã được sử dụng từ nhiều thế kỷ trước. Ngày nay vi khuẩn lactic (LAB),
18
vi khuẩn propionic, được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp với vai trò là giống
khởi động, đồng khởi động hoặc bảo vệ sinh học để kéo dài thời gian bảo quản
của rất nhiều sản phẩm thực phẩm như sữa, rau quả, thịt Cơ sở khoa học của
quá trình bảo quản này là quá trình lên men lactic, propionic. Nhờ các quá trình
này sẽ tạo ra được một môi trường ph thấp và nhiều các chất kháng khuẩn được
tạo ra. Các vi khuẩn probiotic (LAB, Bifidobacterium) có khả năng sản sinh hàng
loạt các chất ức chế: acid hữu cơ, H
2
O
2
, CO
2
, bacteriocin, các hợp chất kháng
khuẩn phân tử lượng thấp, và một số các hợp chất khác. Các chất này được sinh
ra bên trong đường ruột và bên ngoài môi trường nuôi sẽ có tác dụng ức chế sự
phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác [49], [72].
- Acid hữu cơ
Acid hữu cơ được tạo nên bởi hầu hết các vi khuẩn lactic thông qua quá
trình lên men đường hexose. Các acid hữu cơ được hình thành phụ thuộc vào các
chủng giống vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy. Các chủng vi khuẩn lactic lên men
đồng hình có khả năng sử dụng đường theo con đường đường phân để tạo ra hai
phân tử acid lactic từ một phân tử glucose. Các chủng vi khuẩn lactic lên men dị

hình có khả năng tạo ra acid lactic, ethanol, acid acetic, propionic, CO
2
. Các acid
hữu cơ khác như acetic, propionic có các giá trị Pka thấp hơn, có khả năng ức chế
cao hơn acid latic và có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn, nấm men, nấm
mốc. Thêm vào đó dưới tác dụng của pH thấp do các acid không phân ly làm
giảm gradien H
+
cũng là nguyên nhân gây ức chế vi khuẩn và cuối cùng có khả
năng tiêu diệt vi khuẩn. Hơn thế nữa acid lactic đã cho thấy khả năng dễ dàng
thấm qua màng tế bào của vi khuẩn Gram – qua lớp phospholipid dẫn đến acid
lactic có những tính chất như những chất kháng khuẩn khác [49].
- H
2
O
2

Khi có mặt của FAD oxydase và O
2
, vi khuẩn có khả năng sản sinh ra
H
2
O
2
. Khả năng kháng khuẩn của H
2
O
2
nhờ vào khả năng oxy hóa mạnh thành tế
bào vi khuẩn của H

2
O
2
. Trong điều kiện tự nhiên, khả năng này được tăng cường
nhờ sự có mặt của hệ enzym lactoperoxidase sẽ tạo nên hypothiocyanate (OSCN
-
) hoặc oxyacid cao hơn (O
2
SCN
-
và O
3
SCN
-
). Tác động của những oxyacid này
sẽ phá hủy các enzyms trao đổi chất của vi khuẩn chẳng hạn như glyceraldehyte -
3-phosphate dehydrogenase hoặc phá hủy thành tế bào vi khuẩn.
19
- CO
2

CO
2
là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic không đồng hình. CO
2
có
thể tạo ra môi trường yếm khí, nhờ đó có khả năng gây ức chế đối với các vi
khuẩn hiếu khí thông qua việc tác động lên thành tế bào vi khuẩn. Khả năng ức
khuẩn của CO
2

có được nhờ vào khả năng ức chế các enzym decarboxylase và khả
năng tích lũy CO
2
trong lớp phospholipid và làm rối loạn tính thấm của màng tế
bào. CO
2
có khả năng ức chế nhiều vi khuẩn đặc biệt là các vi khuẩn Gram Tác
dụng ức khuẩn của CO
2
đã được ứng dụng trong thương mại cho nhiều sản phẩm
đông lạnh bằng việc bao gói sản phẩm trong môi trường CO
2
[49]
-Bacteriocin
Bacteriocin là những hợp chất kháng khuẩn có bản chất là các protein được
tổng hợp bằng nhiều chủng vi khuẩn khác nhau, có khả năng tiêu diệt hoặc ức
chế khả năng phát triển của nhiều loại vi khuẩn khác. Chúng thuộc nhóm protein
đồng thể, có phổ tác dụng, cơ chế, khối lượng phân tử, nguồn gốc di truyền, và
tính chất sinh hóa khác nhau. Trong nhiều tài liệu thì bacteriocin thường bị nhầm
lẫn với kháng sinh, nhưng chúng khác kháng sinh ở một số điểm: được tổng hợp
ở ribosom, tế bào chủ miễn dịch với chúng do có khả năng tạo các protein miễn
dịch, cơ chế tác dụng của bacteriocin và kháng sinh khác nhau và phổ diệt khuẩn
của bacteriocin hẹp hơn. Thông thường bacteriocin được sản xuất bởi các vi
khuẩn Gram (-) có phổ tác dụng rộng hơn so với bacteriocin được tạo ra từ vi
khuẩn Gram (+). Bacteriocin tạo ra từ vi khuẩn Gram (+), chủ yếu là vi khuẩn
LAB có khả năng ức chế các chủng tương tự nó hoặc những loài gần nó (168).
Bacteriocin sản xuất bởi LAB được chia thành 4 loại chính: (I) Lantibiotics, (II)
Bacteriocin bền nhiệt mạch ngắn (<10kDa), (III) Bacteriocin không bền nhiệt
mạch dài (>30Kda). (IV) Bacteriocin phức tạp có chứa lipid và carbohydrat.
Nhưng những thông tin liên quan đến việc phân loại vày bị giới hạn và phục vụ

chủ yếu cho việc tinh sạch bacteriocin [49], [65].
Bacteriocin từ LAB được sử dụng như những chất bảo quản tự nhiên trong
thực phẩm và ứng dụng trong probiotic. Với những mục đích này thì ưu điểm của
bacteriocin là có phổ kháng khuẩn tương đối rộng, ức chết nhiều vi khuẩn gây
bệnh. Tuy nhiên nhiều bacteriocin từ LAB có phổ kháng khuẩn hẹp và hầu hết
không có tác dụng đối với vi khuẩn Gram Do vậy việc kết hợp bacteriocin với
các cơ chế bảo quản khác sẽ làm tăng khả năng khả năng ức chế các vi khuẩn
Gram Đối với ứng dụng probiotic bacteriocin phải có hoạt tính trong đường
20
ruột, đây là một điểm hạn chế đối với các bacteriocin có bản chất protein tự
nhiên. Ví dụ nhiều nghiên cứu cho thấy nisin, một loại bacteriocin nhóm (I) được
tạo ra bởi nhiều chủng Lactococcus lactis bị suy thoái hoặc bị mất hoạt tính trong
môi trường đường ruột.
- Các hợp chất kháng khuẩn phân tử lượng thấp
Reuterin là chất kháng khuẩn phân tử lượng thấp được tạo thành bởi vi
khuẩn probiotic đã được nghiên cứu chuyên sâu nhất. Reuterin được tạo thành
bởi một số chủng Lactobacillus là một chất ức khuẩn mạnh trong đường ruột
người và động vật. Reuterin được hình thành trong pha cân bằng của quá trình
sinh trưởng kị khí trên hỗn hợp glucose và glycerol hoặc glyceraldehyd. Trong
suốt pha logarit reuterin không được tạo ra do việc giảm khả năng trao đổi
glucose. Chỉ đến khi tế bào đạt đến pha cân bằng thì reuterin mới được tổng hợp.
Hơn thế nữa reuterin được tổng hợp khi tiếp xúc với tế bào mục tiêu. Reuterin có
phổ kháng khuẩn rộng đối với cả vi khuẩn Gram + và vi khuẩn Gram – như nấm
men, mốc và động vật nguyên sinh. Phổ kháng khuẩn rộng được giải thích bằng
khả năng ức chế enzym ribonucleotide reductase do đó can thiệp vào quá trình
tổng hợp DNA [49].
- Các chất kháng khuẩn khác
Vi khuẩn probiotic cũng có khả năng sản xuất các chất kháng khuẩn khác
như diacetyl, acetandehyde và ethanol. Diacetyl là sản phẩm của quá trình trao
đổi citrate và kết quả tạo nên mùi và hương cho bơ. Những vi khuẩn Gram –

nhạy cảm với diacetyl hơn vi khuẩn Gram + và cơ chế tác dụng được cho là do
dyacetyl can thiệp vào quá trình sử dụng arginine. Do nồng độ của các chất này
tạo ra thấp nên tác động kháng khuẩn cũng không nhiều.
I.4.3. Kích thích hệ miễn dịch
Vi khuẩn đường ruột có tác dụng quan trọng về chức năng bảo vệ niêm mạc
ruột và đường ruột trưởng thành và cần thiết cho phát triển đầy đủ mô bạch huyết
của cơ thể, đường ruột liên quan đến mô bạch huyết. Điều này được thể hiện
trong khi nghiên cứu trên chuột đã cho thấy vi khuẩn đầu tiên định cư trong ruột
của chuột sơ sinh (vi khuẩn đi tiên phong) có thể điều chỉnh biểu hiện gen trong
tế bào biểu mô đường ruột của vật chủ. Điều này dẫn đến vi môi trường đường
ruột bị thay đổi và ảnh hưởng đến quá trình định cư tự nhiên sau này. Quá trình
định cư ban đầu của vi sinh vật đường ruột ở chuột sơ sinh cũng rất quan trọng
trong việc kích thích phát triển miễn dịch bình thường. Sự vắng mặt hoặc sự có
21
mặt không đầy đủ của các tác nhân vi sinh vật kích thích ban đầu đã được chứng
minh là gây ra các khuyết tật trong hàng rào chức năng đường ruột, làm giảm
phản ứng viêm, bị lỗi phản ứng IgA. Độ sai lệch miễn dịch này có thể được sửa
chữa phục hồi của hệ vi sinh vật đường ruột, nhưng chỉ khi điều này xảy ra trong
thời kỳ sơ sinh [43], [55], [60].
Những kết quả trên cho thấy sự phơi nhiễm sớm của vi khuẩn và một hệ vi
sinh đường ruột khỏe mạnh quyết định đến việc cung cấp các kích thích và phát
triển hệ miễn dịch tự nhiên trên vật chủ.
Chính vì vậy việc sử dụng probiotic với mục đích cân bằng hệ vi sinh
đường ruột góp phần quan trọng trong việc hình thành cơ chế miễn dịch của vật
chủ.ects
I.4.4. Ức chế cơ chế dò tìm mật độ tới hạn của vi khuẩn gây bệnh
Dò tìm mật độ tới hạn (Quorum - sensing) đã được nghiên cứu là một trong
những cơ chế giao tiếp chính giữa các tế bào vi khuẩn trong một quần thể. Hình
thức đơn giản nhất là việc giải phóng ra các hợp chất hóa học đặc trưng mà dựa
vào nó tế bào vi khuẩn có thể dò tìm và nhận biết được đồng loại. Nói cách khác

Quorum - sensing là cơ chế vi khuẩn điều khiển gene liên quan đến mật độ quần
thể bằng cách tạo ra (producing), phóng thích (releasing) và dò tìm (detecting)
các phân tử tín hiệu; là tiến trình các tế bào vi khuẩn thông tin liên lạc với nhau
bằng các phân tử tín hiệu. Có một số các hợp chất đã được nghiên cứu, chúng
được gọi là autoinducers (chất tự cảm) do bản thân các vi khuẩn tổng hợp nên.
Có 5 loại hợp chất chính trong hệ thống quorum sensing của vi khuẩn bao gồm
oligopeptid, N-AHL, quinolone, -butyrolactone và furanone (Kangmin Duan,
2009). Hầu hết tín hiệu quorum-sensing là các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, đa
dạng và rất nhiều chất chưa được nghiên cứu [28], [73].
Trong các vi khuẩn Gram dương, các phân tử Quorum-sensing thường là
các oligopeptid. Chúng thường được tìm thấy trong tế bào như các tiền peptid.
Chúng bất hoạt cho đến khi được tách ra từ quá trình tiết ra ở màng tế bào và một
số trường hợp các peptid đã bị biến đổi. Các phân tử tín hiệu được giải phóng ra
khỏi tế bào và khuếch tán vào môi trường, được tiếp nhận bởi các tế bào bên
cạnh bằng hai hệ thống. Các peptid tín hiệu kết hợp với histidine kinase trên
màng tế bào và tác động đến hoạt động của nó, kết quả là tạo ra quá trình
phosphoril hóa. Quá trình phosphoril hóa kích thích quá trình sao chép gene đích.
22
Con đường thứ hai của cơ chế này là sử dụng phân tử N-AHL, được tìm
thấy chỉ ở vi khuẩn gram âm. Hệ thống đầu tiên được nghiên cứu là vi khuẩn
Vibrio fischeri, là loại vi khuẩn có khả phát sáng khi ở nồng độ cao. Trong vi
khuẩn này, gen Luxl mã hóa một enzym xúc tác quá trình tổng hợp N-3-
(oxohexanoyl) homoserine lactone autoinducer (3-OC6-AHL). Ở nồng độ cao,
AHL kết hợp với các điều chỉnh phiên mã LuxR, chất có khả năng kết hợp với
lux promoters, kết quả là tạo ra sự phát sáng. AHL được tìm thấy ở 50 loài vi
khuẩn gram âm khác nhau. Quá trình tổng hợp gen và biểu hiện gen diễn ra đồng
thời ở vi khuẩn V.Harveiy luxl và luxR, nhưng những quá trình tổng hợp và chất
nhận của hệ thống khác thì chưa được biết đến. Những nghiên cứu mới đây cũng
cho thấy một kiểu tín hiệu tương tự như AHL là Aryl – homoserin lactone cũng
được tìm thấy ở vi khuẩn quang tự dưỡng Rhodopseudomonas palustris.

Hệ thống LuxS/autoinducer-2 (AI-2) với trung gian là các gốc furanone.
Furanone có nhiều loại từ những lọai không bền như 4,5 dihydroxy- 2,3
pentanedione được tạo ra bởi LuxS. LuxS/AI-2 được tìm thấy ở cả vi khuẩn
Gram dương vả Gram âm. Đây là một phân tử tín hiệu phổ biến ở nhiều loại vi
khuẩn. Những nghiên cứu cũng cho thấy các chất nhận của AI-2 đối với
V.harveyi và Salmonella enterica là typhimurium kết hợp với các đồng phân lập
thể dạng S và R của 2-methyl-2,3,3,4 tetrahydroxytetrahydrofuran. Vì quá trình
tổng hợp AI-2 liên quan đến con đường trao đổi chất trung tâm nên vai trò của hệ
thống tín hiệu LuxS/Ai-2 vẫn còn đang tranh cãi. Thay vào đó AI-2 có thể là chất
được hấp thụ và thể hiện được mật độ tế bào ngay lập tức trong môi trường.
Trong các loài Streptomyces thì chất tự cảm ứng là -butyrolactone điều khiển
nhiều quá trình khác nhau bao gồm quá trình sản sinh kháng sinh và hình thành
sợi nấm.
Nhờ Quorum - sensing, vi khuẩn có thể kích hoạt sự hoạt động của các gen
mã hóa các tiến trình như: tạo màng sinh học, tạo bào tử, phát sáng, sản xuất
kháng sinh, tiết ra các độc tố v.v…
Trong tự nhiên, để cạnh tranh, đặc tính Quorum - sensing của loài vi khuẩn
này sẽ có thể bị các loài vi khuẩn khác triệt tiêu hoặc khống chế. Vì vậy việc sử
dụng các chủng vi khuẩn probiotic có khả năng triệt tiêu hoặc khống chế
Quorum- sensing của các vi khuẩn loài gây bệnh sẽ có ý nghĩa rất lớn.
23
Các dòng vi khuẩn có khả năng làm suy giảm hoặc làm bất hoạt AHL của
tác nhân gây bệnh, hoặc có khả năng tích lũy PHB, làm ức chế sự phát triển của
tác nhân gây bệnh sẽ có thể trở thành vi khuẩn probiotic.
1.4.5. Khả năng kháng virus
Một số vi khuẩn probiotic có khả năng kháng virus mặc dù cơ chế kháng
của chúng hiện chưa được làm rõ. Một số các thí nghiệm in vivo đã chỉ ra rằng
một số các hợp chất hóa học và sinh học như dịch chiết tảo biển và vi khuẩn có
thể làm bất hoạt virus. Một số chủng Pseudomonas, Vibrios, Aeromonas được
phân lập từ các trại nuôi cá hồi cho thấy hoạt tính kháng trên 50% virus IHNV

(infectious hematopoetic necrosis virus). Hai chủng Vibrio khác (NICA 1030 và
NICA 1031) được phân lập từ ao nuôi tôm sú đã thể hiện hoạt tính kháng virus
IHNV và OMV (Oncorhynchus masou virus) với tỉ lệ chết lần lượt là 62 và 99%.
Trong một thí nghiệm khác, vi khuẩn biển Moraxella có khả năng kháng đặc hiệu
cao với nhóm poliovirus [67], [74].
1.5. Ứng dụng của probiotic
1.5.1. Ứng dụng trong y học và chăn nuôi
Ứng dụng trong y học
Các chế phẩm probiotic khi được bổ sung vào đường ruột sẽ giúp làm sạch
đường ruột, ức chế các vi sinh vật gây bệnh, cân bằng hệ sinh thái của các vi sinh
vật trong đường ruột, loại bỏ các quá trình lên men bất lợi do các vi sinh vật có
hại này gây nên, làm cho các chức năng của đường ruột được hoạt động tốt hơn,
tăng hệ số hấp thu và sử dụng các chất dinh dưỡng trong thức ăn. Ngoài ra, các
hoạt chất sinh học từ chế phẩm probiotic như acid amin, các enzym, các
nucleotit, các acid nucleic, các vitamin, đặc biệt là biotin có tác dụng tăng cường
các quá trình chuyển hóa của tế bào, kích thích và tăng cường khả năng miễn
dịch, tăng sức đề kháng chống lại sự xâm nhập của các vi khuẩn có hại [66].
Lợi ích của việc sử dụng probiotic cho con người, bao gồm:
- Cải thiện sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường ruột.
- Sản xuất enzym lactase và các enzym tiêu hoá, do đó tăng khả năng tiêu
hoá đường lactose và thức ăn.
- Tăng cường hệ miễn dịch, giảm nguy cơ ung thư ruột kết.
- Hỗ trợ trong điều trị các bệnh dị ứng do thức ăn, làm giảm mức LHD
cholesterol trong máu, giảm huyết áp trong tăng huyết áp.
- Đóng một vai trò quan trọng trong phòng chống và điều trị tiêu chảy.
24
Ứng dụng trong chăn nuôi
Probiotic được sử dụng để bổ sung vào thức ăn cho động vật nuôi với mục
đích phòng trị bệnh và được coi như một nhân tố thúc đẩy tăng trưởng. Các
chủng probiotic được sử dụng ở động vật bao gồm Lactobacillus,

Bifidobacterium, Bacillus, Streptococcus, Pediococcus, Enterococcus và nấm
men như Saccharomyces cerevisiae và S. boulardii. Một số lợi ích của việc sử
dụng probiotic cho động vật nuôi như [28]:
- Cải thiện tăng trưởng vật nuôi thông qua việc kiểm soát các bệnh nhiễm
trùng đường ruột với một cơ chế tương tự như cơ chế thúc đẩy sự tăng trưởng
của kháng sinh.
- Cải thiện việc sử dụng thức ăn, đạt được bằng cách tăng hiệu quả của quá
trình tiêu hóa hiện có và thúc đẩy sự tiêu hóa chất trước đây không có khả năng
tiêu hoá.
- Giảm rối loạn đường ruột bao gồm các triệu chứng nôn hoặc tiêu chảy,
chán ăn và tiêu hóa thức ăn kém.
- Cải thiện sức khỏe bằng cách tăng sức đề kháng với bệnh truyền qua việc
cạnh tranh đối kháng với vi khuẩn gây bệnh và kích thích miễn dịch.
- Thành lập/tái thành lập hệ vi khuẩn đường ruột ở các cơ thể còn non, hoặc
tái lập hệ vi khuẩn đường ruột sau khi sử dụng thuốc kháng sinh.
Mỗi loài vật nuôi khác nhau ở những địa phương khác nhau cần có các chế
phẩm probiotic với những chủng vi sinh vật đặc thù và thích hợp riêng.
1.5.2. Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản
Ngoài các hướng ứng dụng ở trên, một hướng đi mới đang được nhiều nhà
khoa học tập trung nghiên cứu đó là sử dụng vi khuẩn probiotic trong nuôi trồng
thủy sản.
Mặc dù đã có rất nhiều ứng dụng thành công chế phẩm probiotic cho con
người và động vật nuôi nhưng việc sử dụng chế phẩm này trong nuôi trồng thuỷ
sản (tôm, cá, nhuyễn thể…) chỉ mới bắt đầu trong khoảng hơn một thập kỷ gần
đây. Để phù hợp trong lĩnh vực nuôi trồng thuỷ sản định nghĩa probiotic đã được
mở rộng thêm bao gồm cả các chế phẩm vi sinh vật có nguồn gốc tự nhiên được
bổ sung vào trong ao, đìa nuôi [20], [33], [40], [47].
Chế phẩm probiotic sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản dưới hai phương