ỨNG DỤNG kỹ THUẬT GIẢI TRÌNH tự GEN THẾ hệ mới NGHIÊN cứu đặc điểm bộ GEN của một số CHỦNG ENTEROVIRUS 71 gây BỆNH CHÂN TAY MIỆNG ở VIỆT NAM năm 2011 – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y H NI

NGUYN TH HOA

ứNG DụNG Kỹ THUậT GIảI TRìNH Tự GEN THế Hệ
MớI
NGHIÊN CứU ĐặC ĐIểM Bộ GEN CủA MéT Sè
CHđNG ENTEROVIRUS 71 G¢Y BƯNH CH¢N TAY
MIƯNG
ë VIƯT NAM N¡M 2011 – 2013

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ


HÀ NỘI – 2017
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HOA

øNG DôNG Kü THUậT GIảI TRìNH Tự GEN THế Hệ
MớI
NGHIÊN CứU ĐặC ĐIểM Bé GEN CđA MéT Sè
CHđNG ENTEROVIRUS 71 G¢Y BƯNH CH¢N TAY

MIÖNG
ë VIÖT NAM N¡M 2011 – 2013
Chuyên ngành: Vi sinh
Mã số: NT. 62726805
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ
Người hướng dẫn khoa học:
1.PGS.TS Nguyễn Vũ Trung
2.TS. Lê Thị Hội


HÀ NỘI – 2017
MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN...........................................................................3
1.1. Bệnh Tay Chân Miệng................................................................................3
1.1.1. Sơ lược về bệnh TCM.......................................................................3
1.1.2. Tác nhân gây bệnh TCM...................................................................5
1.1.3. Một số kĩ thuật phát hiện EV-A71 trong phòng xét nghiệm.............5
1.1.4. Điều trị bệnh TCM............................................................................6
1.1.5. Phòng bệnh........................................................................................7
1.2. Đặc điểm EV-A71......................................................................................8
1.2.1. Phân loại............................................................................................9
1.2.2. Cấu trúc bộ gen của EV-A71............................................................9
1.3. Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới........................................................11
1.4. Các nghiên cứu ứng dụng NGS đối với EV-A71.....................................14
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........16
2.1. Đối tượng nghiên cứu...............................................................................16
2.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu...................................................16
2.1.2. Lựa chọn đối tượng nghiên cứu......................................................16

2.2. Vật liệu nghiên cứu...................................................................................16
2.2.1. Trang thiết bị, dụng cụ....................................................................16
2.2.2. Sinh phẩm hóa chất.........................................................................17
2.3. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................18
2.3.1. Quy trình kỹ thuật: theo hướng dẫn sử dụng của bộ kit TruSeq


Strand mARN LT sample Prep.......................................................18
2.3.2. Phân tích số liệu..............................................................................26
2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu.............................................................27
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................28
3.1. Trình tự bộ gen của các chủng EV – A71 gây bệnh TCM ở Việt Nam năm
2011 – 2013.............................................................................................28
3.1.1. Sự phân bố của các chủng EV-A71 được giải tình tự gây bệnh TCM
ở Việt Nam năm 2011-2013............................................................28
3.1.2. Mức độ lâm sàng bệnh TCM do một số chủng EV-A71 đã giải trình
tự gây bệnh......................................................................................28
3.1.3. Phân loại một số chủng EV-A71 gây bệnh TCM ở Việt Nam năm
2011-2013........................................................................................29
3.1.4. Đặc điểm bộ gen của một số chủng EV – A71 gây bênh TCM ở Việt
Nam năm 2011 – 2013....................................................................30
3.2. Sự biến đổi về đặc điểm di truyền của một số chủng EV – A71..............33
3.2.1. Đặc điểm nucleotide vùng VP1 của một số chủng EV-A71...........33
3.2.2. Đặc điểm vùng VP2 của một số chủng EV-A71.............................35
3.2.3. Đặc điểm nucleotide vùng VP3 của một số chủng EV-A71...........37
3.2.4. Đặc điểm nucleotide vùng VP4 của một số chủng EV-A71...........39
3.2.5. Đặc điểm nucleotide vùng 2A của một số chủng EV-A71..............41
3.2.6. Đặc điểm nucleotide vùng 2B của một số chủng EV-A71..............43
3.2.7. Đặc điểm nucleotide vùng 2C của một số chủng EV-A71..............45
3.2.8. Đặc điểm nucleotide vùng 3A của một số chủng EV-A71..............47

3.2.9. Đặc điểm nucleotide vùng 3B của một số chủng EV-A71..............49
3.2.10. Đặc điểm nucleotide vùng 3C của một số chủng EV-A71............51
3.2.11. Đặc điểm nucleotide vùng 3D của một số chủng EV-A71............53
3.2.12. Đặc điểm nucleotide vùng 3’UTR của một số chủng EV-A71.....55


3.2.13. Đặc điểm nucleotide vùng 5’UTR của một số chủng EV-A71.....57
3.3. Cây phát sinh loài.....................................................................................59
3.3.1. Cây phân loài dựa vào toàn bộ bộ gen của các chủng EV – A71...59
3.2.2. Xây dựng cây phát sinh loài dựa vào vùng gen VP1 của các chủng
nghiên cứu.......................................................................................61
Chương 4: BÀN LUẬN.................................................................................63
4.1. Trình tự toàn bộ bộ gen của một số chủng EV-A71 gây bệnh TCM ở Việt
Nam năm 2011 – 2013 bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới.........63
4.1.1. Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân bị bệnh TCM...........................63
4.1.2. Đặc điểm bộ gen của các chủng EV – A71 được giải trình tự........64
4.1.3. Đặc điểm các vùng gen của các chủng EV – A71 được giải trình tự
.........................................................................................................65
4.2. Sự biến đổi về mặt di truyền của các chủng EV – A71............................68
4.2.1. Sự biến đổi di truyền dựa vào trình tự tồn bộ bộ gen của các chủng
EV – A71.........................................................................................68
4.2.2. Sự biến đổi về mặt di truyền dựa trên trình tự các vùng gen của các
chủng EV – A71..............................................................................70
KẾT LUẬN ...................................................................................................74
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1.

Sự phân bố của các chủng EV-A71...........................................28

Bảng 3.2.

Mức độ lâm sàng bệnh TCM do một số chúng EV-A71 gây ra 28

Bảng 3.3.

Phân loại một số chủng EV-A71...............................................29

Bảng 3.4.

Kích thước bộ gen của một số chủng EV-A71..........................30

Bảng 3.5.

Tỷ lệ nucleotid của một số chủng EV-A71...............................31

Bảng 3.6.

Kích thước vùng gen trung bình các vùng của một số chủng EVA71............................................................................................32

Bảng 3.7.

Tỷ lệ nucleotid vùng VP1 một số chủng EV-A71.....................33

Bảng 3.8.

Tỷ lệ nucleotid vùng VP2 một số chủng EV-A71.....................35

Bảng 3.9.

Tỷ lệ nucleotid vùng VP3 một số chủng EV-A71.....................37

Bảng 3.10.

Tỷ lệ nucleotid vùng VP4 một số chủng EV-A71....................39

Bảng 3.11.

Tỷ lệ nucleotid vùng 2A một số chủng EV-A71......................41

Bảng 3.12.

Tỷ lệ nucleotid vùng 2B một số chủng EV-A71......................43

Bảng 3.13.

Tỷ lệ nucleotid vùng 2C một số chủng EV-A71.......................45

Bảng 3.14. Tỷ lệ nucleotid vùng 3A một số chủng EV-A71.......................47
Bảng 3.15. Tỷ lệ nucleotid vùng 3B một số chủng EV-A71.......................49
Bảng 3.16. Tỷ lệ nucleotid vùng 3C một số chủng EV-A71.......................51
Bảng 3.17. Tỷ lệ nucleotid vùng 3D một số chủng EV-A71.......................53


Bảng 3.18.

Tỷ lệ nucleotid vùng 3’UTR một số chủng EV-A71.................55

Bảng 3.19.

Tỷ lệ nucleotid vùng 5’UTR một số chủng EV-A71.................57

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1. Những biến đổi về mặt di truyền của vùng VP1.............................34
Hình 3.2. Những biến đổi về mặt di truyền của vùng VP2.............................36
Hình 3.3. Những biến đổi về mặt di truyền của vùng VP3.............................38
Hình 3.4. Những biến đổi về mặt di truyền của vùng VP4.............................40
Hình 3.5. Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 2A...............................42
Hình 3.6. Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 2B................................44
Hình 3.7. Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 2C................................46
Hình 3.8. Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 3A...............................48
Hình 3.9. Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 3B................................50
Hình 3.10. Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 3C..............................52
Hình 3.11. Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 3D..............................54
Hình 3.12. Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 3’UTR.......................56
Hình 3.13. Những biến đổi về mặt di truyền của vùng 5’UTR.......................58


DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1.

Quy trình kỹ thuật.....................................................................19

Sơ đồ 3.1.

Cây phát sinh loài dựa trên toàn bộ hệ gen của các chủng được
giải mã và các chủng tham chiếu..............................................59

Sơ đồ 3.2.

Cây phát sinh lồi dựa trình tự vùng VP1 của các chủng được
giải mã và các chủng tham chiếu..............................................61


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, bệnh Tay chân miệng (TCM) đã trở thành vấn
đề quan tâm hàng đầu của các nước trên thế giới, nhất là các nước đang phát
triển, trong đó có Việt Nam. Do sự gia tăng của bệnh, số người nhập viện
ngày càng nhiều dẫn đến tình trạng quá tải ở nhiều bệnh viện. Trong khi đó,
nhận thức và thực hành các biện pháp phịng bệnh của người dân còn hạn chế
và tập quán ăn uống và sinh hoạt của người dân chưa đảm bảo vệ sinh. Đến
nay, chúng ta vẫn chưa tìm được phương pháp điều trị và vắc xin dự phòng
một cách hiệu quả. Các vụ dịch TCM thường xảy ra hàng năm từ tháng 3 đến
tháng 11. Enterovirus 71 (EV-A71) là một trong những căn nguyên quan trọng
liên quan đến các vụ dịch TCM ở khắp nơi trong khu vực Châu Á Thái Bình
Dương nhất là ở Việt Nam [1].Vụ dịch năm 2011 và 2013 với số ca mắc hàng
năm trên 100 000 người, gây tử vong trên 200 trẻ, căn nguyên phân lập được
chủ yếu là Enterovirus 71 (EV-A71) với trên 68%, các chủng lưu hành có
genotype là C4 hoặc C4A. Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn chưa hiểu rõ
đặc điểm di truyền các chủng EV-A71 gây bệnh TCM trong vụ này [2].
Các vụ dịch TCM do EV-A71gây nên, đặc biệt các nhóm, dưới nhóm, đơi
khi kèm theo sự tái tổ hợp di truyền của các chủng. Do đó, hiểu biết những thay

đổi trong bộ gen của EV-A71 là cần thiết, đóng vai trị trong việc nghiên cứu
dịch tễ học, chẩn đốn, điều trị và phát triển vắc-xin phịng bệnh. Có nhiều kỹ
thuật xác định sự thay đổi di truyền của các chủng vi rút nói chung, trong đó có
EV-A71. Trong những năm gần đây giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) là một
công nghệ mới giúp giải mã nhanh chóng chính xác tồn bộ bộ gen của EV-A71.
Mặc dù kỹ thuật NGS được phát triển từ năm 2005, nhưng ở Việt Nam đây vẫn
còn là kĩ thuật mới và có rất ít các nghiên cứu về ứng dụng kĩ thuật này vào


2

phân tích các đặc điểm di truyền của EV-A71.
Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật giải trình
tự gen thế hệ mới nghiên cứu đặc điểm bộ gen của một số chủng
enterovirus 71 gây bệnh chân tay miệng ở việt nam năm 2011 – 2013”.
Với mục tiêu:
1. Xác định trình tự tồn bộ bộ gen của một số chủng EV-A71 gây
bệnh TCM ở Việt Nam năm 2011 – 2013 bằng kỹ thuật giải trình tự
gen thế hệ mới.
2. So sánh sự biến đổi về mặt di truyền giữa các chủng EV-A71.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN

1.1. Bệnh Tay Chân Miệng
1.1.1. Sơ lược về bệnh TCM
Bệnh TCM có thời gian ủ bệnh trung bình từ 3 đến 6 ngày. Đầu tiên, vi

rút thường cư trú ở niêm mạc má hay niêm mạc hồi tràng và sau 24 giờ, vi rút
lan đến các hạch bạch huyết. Nhiễm vi rút huyết thường xảy ra nhanh chóng
sau đó và vi rút di chuyển đến niêm mạc miệng và da. Vào ngày thứ 7 sau khi
nhiễm bệnh, kháng thể trung hòa tăng cao và vi rút bị thải loại.
Các dấu hiệu tiền triệu bao gồm sốt nhẹ, mệt mỏi, đau bụng và đau trong
miệng. Trong giai đoạn toàn phát, bệnh nhân có biểu hiện sốt, đau đầu, nơn,
mệt mỏi, đau họng, loét miệng, ăn không ngon, tiêu chảy. Khám có thể thấy
các vết loét, xung quanh có viền đỏ, thường ở niêm mạc miệng, có thể thấy ở
lưỡi, vòm họng, lưỡi gà, a-mi-đan, lợi hoặc ở trên da lịng bàn tay, bàn chân
và ở kẽ ngón tay, ngón chân. Ở trẻ em dưới 5 tuổi, các triệu chứng điển hình
hơn ở người lớn. Các tổn thương trên da ban đầu thường là dạng dát sau đó
nhanh chóng tiến triển thành các phỏng nước hình oval, đường kính từ 210mm, màu xám trên nền ban hồng. Ở trẻ sơ sinh, các tổn thương này có thể
ở thân mình, đùi và mơng. Trong trường hợp khơng điển hình chỉ có rất ít
phỏng nước xen kẽ với hồng ban, hoặc chỉ có hồng ban mà khơng có phỏng
nước hoặc chỉ lt miệng đơn thuần.
Một số trường hợp có biến chứng hệ thần kinh trung ương. Biểu hiện
lâm sàng thường hay gặp nhất là viêm màng não, liệt mềm cấp, viêm não. Các


4

biến chứng ít gặp hơn bao gồm mất điều hịa tiểu não, hội chứng GuillainBarré, viêm tủy cắt ngang, tăng áp lực nội sọ lành tính, tỷ lệ tử vong trong số
các trường hợp mắc từ 40-80%. Các biến chứng khác là phù phổi cấp, xuất
huyết, suy tuần hoàn. Nhiều biến chứng có thể cùng phối hợp xảy ra trên cùng
một bệnh nhân.
Bệnh TCM thường xảy ra thành dịch từ nhỏ đến lớn đe dọa sức khỏe tính
mạng của trẻ em. Y văn thế giới cũng đã ghi nhận những vụ dịch TCM xảy ra
ở Đài Loan, Trung Quốc, Singapore. Tại Việt Nam, giai đoạn 2011-2013 số ca
mắc và tử vong do bệnh TCM tăng đột biến, trong khi đó, chúng ta vẫn chưa
tìm được phương pháp điều trị và vắc xin dự phòng.

-

Phân độ lâm sàng [4], [5]:
 Độ 1: Chỉ loét miệng và/hoặc tổn thương da.
 Độ 2: Biến chứng thần kinh hoặc tim mạch mức độ trung bình.
 Rung giật cơ.
 Đi loạng choạng.
 Ngủ gà.
 Yếu liệt chi.
 Mạch nhanh >150 lần/phút (khi trẻ nằm yên và không sốt).


5

 Sốt cao ≥ 3905C (nhiệt độ hậu môn).
 Độ 3: Biến chứng nặng về thần kinh, hô hấp, tim mạch.
 Co giật, hơn mê (Glasgow < 10 điểm).
 Khó thở: Thở nhanh, rút lõm ngực, SpO2 < 92% (không oxy hỗ trợ).
 Mạch nhanh >170 lần/phút hoặc tăng huyết áp.
 Độ 4: Biến chứng rất nặng, khó hồi phục
 Phù phổi cấp.
 Sốc, truỵ mạch.
 SpO2 < 92% với oxy qua gọng mũi 6 lít/phút.
 Ngừng thở.
- Phân loại mức độ bệnh [6]:
 Bệnh nhẹ: bệnh nhân độ 1 và độ 2a.
 Bệnh nặng: bệnh nhân từ độ 2b trở lên.
1.1.2. Tác nhân gây bệnh TCM [7]

6

Bệnh TCM do nhóm vi rút đường ruột (Enterovirus) gây nên.
Enterovirus gây bệnh cho người gồm các nhóm: Poliovirus (PV),
Coxsackievirus A (CVA), Coxsackievirus B (CVB), Echovirus (ECV) và
Enterovirus 68 đến 71 (EV68-71). Trong đó, tác nhân chủ yếu gây bệnh TCM
là EV-A71và CVA16. EV-A71 có thể gây ra các biến chứng thần kinh nặng và
dẫn đến tử vong, còn các vi rút đường ruột khác thường ở thể nhẹ.
1.1.3. Một số kĩ thuật phát hiện EV-A71 trong phòng xét nghiệm
Các mẫu bệnh phẩm có thể dùng để xác định căn ngun bao gồm phân,
dịch ngốy họng, ngốy hậu mơn, dịch nốt phỏng và dịch não tuỷ. Mỗi loại
bệnh phẩm có ưu nhược điểm riêng.
- Nuôi cấy
Nuôi cấy vi rút là kỹ thuật gây nhiễm vi rút (có trong mẫu bệnh phẩm)
lên dịng tế bào ni thích hợp nhằm tăng sinh phát triển, từ đó có thể xác
định được vi rút. Dịng tế bào thích hợp cho nuối cấy Enterovirus nói chúng là
tế bào L20B có nguồn gốc từ tế bào Lympho chuột và tế bào RD có nguồn
gốc từ sarcom mơ liên kết ở người.
- Phản ứng trung hịa
Phát hiện kháng thể IgM kháng EV-A71 đang được phát triển, nhưng có
thể cho kết quả dương tính giả và giá trị dự báo dương tính thấp.
- Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp: gián tiếp sử dụng kháng thể


7

đơn dòng kháng EV-A71 cho kết quả nhanh nhưng giá thành cao [8] [9].
- Kỹ thuật khuếch đại gen kỹ thuật RT – PCR (Reverse transcription –
polymerase chain reaction)

Một số tác giả sử dụng cặp mồi cặp mồi MD91/MD90 khuyếch đại vùng
gen ở đầu 5’UTR PCR primers và cặp mồi MAS01S/MAS02A khuếch đại
vùng gen VP1 [10].
- Kỹ thuật giải trình tự gen
Kỹ thuật này giúp định danh nhanh chóng chính xác vì mỗi loại vi rút có
một trình tự rất riêng biệt, khơng trùng lẫn với những lồi khác. Các phương
pháp giải trình tự gen cổ điển chỉ.
1.1.4. Điều trị bệnh TCM
- Nguyên tắc điều trị [4]:
Hiện nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, chỉ điều trị hỗ trợ (khơng
dùng kháng sinh khi khơng có bội nhiễm).
Theo dõi sát, phát hiện sớm và điều trị biến chứng.
Bảo đảm dinh dưỡng đầy đủ, nâng cao thể trạng.
- Điều trị cụ thể [4]:


8

 Độ 1:
 Điều trị ngoại trú và theo dõi tại y tế cơ sở.
 Tái khám mỗi 1-2 ngày trong 5-10 ngày đầu của bệnh
 Dặn dò dấu hiệu nặng cần tái khám ngay: Sốt cao ≥ 39 0C; thở
nhanh, khó thở; rung giật cơ, chới với, run chi, quấy khóc, bứt rứt
khó ngủ; Co giật, hơn mê; yếu liệt chi; da nổi vân tím.
 Chỉ định nhập viện:
 Biến chứng thần kinh, tim mạch, hô hấp (từ độ 2).
 Sốt cao ≥ 390C.
 Nôn nhiều.
 Nhà xa: không có khả năng theo dõi, tái khám.
- Độ 2: Điều trị nội trú tại bệnh viện huyện hoặc tỉnh

 Điều trị như độ 1.
 Nằm đầu cao 30o, cổ thẳng.


9

 Điều trị chống suy hơ hấp, co giật
 Immunoglobµlin (nếu có).
 Theo dõi mạch, nhiệt độ, huyết áp, nhịp thở, tri giác, ran phổi, mạch
mỗi 4- 6 giờ.
 Đo độ bão hòa oxy SPO2 và theo dõi mạch liên tục (nếu có máy).
- Độ 3: Điều trị nội trú tại bệnh viện tỉnh hoặc bệnh viện huyện nếu đủ điều kiện.
 Chống suy hô hấp, chống phù não, chống co giật.
 Điều trị hạ đường huyết, điều chỉnh rối loạn nước, điện giải, toan kiềm.
 Dùng thuốc vận mạch Dobutamin khi suy tim mạch
 Immunoglobµlin (nếu có).
 Theo dõi mạch, nhiệt độ, huyết áp, nhịp thở, tri giác, ran phổi, SpO 2,
mỗi 1- 2 giờ.
- Độ 4: Điều trị nội trú tại bệnh viện trung ương, hoặc bệnh viện tỉnh, huyện
nếu đủ điều kiện.Xử trí tương tự độ 3.
- Điều trị biến chứng: suy hơ hấp, suy tuần hồn, chống phù não


10

- Immunoglobµlin (nếu có):
 Chỉ định từ độ 2 và độ 3.
 Liều: 1g/kg/ngày truyền tĩnh mạch trong 6- 8 giờ x 2 ngày liên tiếp.
 Riêng độ 2 cần đánh giá lại lâm sàng trước chỉ định liều thứ 2. Không
dùng liều 2 nếu lâm sàng cải thiện tốt.

1.1.5. Phịng bệnh
Hiện chưa có vắc xin phịng bệnh đặc hiệu.
Áp dụng các biện pháp phòng bệnh đối với bệnh lây qua đường tiêu hố
Phịng bệnh tại các cơ sở y tế:
Cách ly theo nhóm bệnh.
Nhân viên y tế: Mang khẩu trang, rửa, sát khuẩn tay trước và sau khi
chăm sóc.
Khử khuẩn bề mặt, giường bệnh, buồng bệnh bằng Chloramin B 2%.
Xử lý chất thải theo quy trình phịng bệnh lây qua đường tiêu hố.
Phịng bệnh ở cộng đồng: Vệ sinh cá nhân, rửa tay bằng xà phòng (đặc
biệt sau khi thay quần áo, tã, sau khi tiếp xúc với phân, nước bọt).


11

1.2. Đặc điểm EV-A71 [1]
EV-A71 thuộc họ (family) Picornaviridae. Do khơng có màng bao lipid
nên các Enterovirus đều bền vững trong môi trường vật chủ, kể cả khi tiếp
xúc với dịch vị ở dạ dày và chúng có thể tồn tại trong nhiệt độ phòng vài
ngày. Các vi rút này khơng bị hịa tan bởi các dung mơi hữu cơ (như ether và
chloroform), cồn. Tuy nhiên vi rút bị bất hoạt ở nhiệt độ trên 56 oC, khử trùng
bằng chlo, formaldehyde và tia cực tím. EV-A71 và các Enterovirus khác
cũng đã được tìm thấy ở trên mặt nước, nước ngầm và trong suối nước nóng.
Chu kỳ sống và sự nhân lên của vi rút: Chu kỳ sống của vi rút xảy ra
hoàn toàn trong tế bào chất. Giống như các lồi Enterovirus khác, chu kì sao
chép của EV-A71 tương tự như Polioviruses.
- Hấp phụ và xâm nhập: Vi rút xâm nhập vào tế bào vật chủ thích hợp
nhờ các receptor đặc hiệu. Vi rút xâm nhập theo cơ chế nhập bào thông qua
clathrin (clathrin-mediated endocytosis).
- Dịch mã: Bộ gen ARN sợi (+) có trình tự nucleotide giống với trình tự

của mARN nên có chức năng như mARN và được dịch mã thành polyprotein.
Sau đó, nhờ protease phân cắt polyprotein thành các protein cấu trúc và các
protein không cấu trúc (enzyme) để thực hiện các chức năng khác nhau.
- Tổng hợp ARN của vi rút: ARN polymerase phụ thuộc ARN của vi rút
dùng ARN sợi (+) để tạo ra ARN sợi (-). Sau đó, ARN polymerase phụ thuộc
ARN này lại dùng ARN sợi (-) làm khuôn để tạo ra nhiều bộ gen của vi rút là
ARN sợi (+).


12

- Lắp ráp và giải phóng: Các protein cấu trúc tham gia lắp ráp tạo capsid.
ARN của virion được đóng gói trong capsid và tạo thành hạt vi rút trưởng
thành. Các hạt vi rút mới được tổng hợp sẽ được giải phóng bằng sự ly giải
của tế bào vi rút được phóng thích tiếp tục lây nhiễm.
1.2.1. Phân loại
Sau khi được phân lập đầu tiên năm 1969, EV-A71 gây trên 28 dịch
TCM vừa và nhỏ [11]. Trong hơn 15 năm qua, các vụ dịch lớn ở khu vực
Đông Nam EV-A71. Dựa vào các kết quả giải tŕnh tự gen VP1 xác định có 4
nhóm EV-A71 độc lập là A, B, C và D. Các vi rút sẽ đươc xếp vào cùng một
genotype nếu có trình tự vùng gen VP1 giống nhau 92% trở lên. Nhóm A có
duy nhất chủng BrCr được phân lập ở Mỹ năm 1969. Trong vụ dịch nhỏ TCM
do EV-A71 tại Trung Quốc, có một chủng được xếp vào nhóm A, tuy nghiên
nguồn gốc của vi rút này chưa rõ ràng [11].
Nhóm D có một chủng duy nhất được phân lập ở Ấn Độ năm 2002.
Nhóm B được chia làm 6 dưới nhóm (subgenotype): B1–5 và B0. Giữa B1 và
B2 có 12% khác biệt về nucleotide. Chủng B1 và B2 là các chủng lưu hành
mạnh vào những năm 1970 và 1980 [12]. Chủng B3, B4, B5 được cho rằng
lưu hành từ năm 1997[13]. Chủng B5, lần đầu tiên được phân lập tại Nhật
Bản và Sarawak (Malaysia) vào năm 2003. Đây là căn nguyên tạo nên vụ dịch

ở B-ru-nây, Sarawak và Đài Loan năm 2006. Chủng B0 được mô tả, phân lập
ở Châu Âu từ 1963 đến 1967 [14].
Nhóm C cũng được chia thành 5 dưới nhóm (subgenotype): C1-5. C1
được phân lập tại Châu Âu và Mỹ năm 1987. C2 mới nổi từ năm 1995. C3 –


13

C5 liên quan đến những vụ dịch ở Nam Á từ năm 1997 [1] [15]. Trong vụ
dịch TCM lớn nhất do EV-A71 gây ra ở Trung Quốc giữa năm 2008 có 201
chủng C4 được ghi nhận là lưu hành rộng rãi.
1.2.2. Cấu trúc bộ gen của EV-A71 [16]
Bộ gen của EV-A71 chứa một sợi dương ARN dài khoảng 7400 nucleotid
chưa tính phần PolyA. Về mặt di truyền nó rất gần với CV-A16. Cấu trúc gen
gồm vùng 5’-UTR, khung đọc mở (ORF) mã hóa một polyprotein, 3’-UTR,
phần PolyA.
Vùng 5’-UTR gồm 742 nucleotid, tại đây có 6 cấu trúc mã hóa stem-loop
trong đó stem-loop I là stem-loop hình lá tham gia vào q trình tổng hợp
ARN của vi rút cịn stem-loop II đến VI gồm các các trình tự tiếp nhận
ribosome ở bên trong ((internal ribosome entry site – IRES) liên quan đến
quá trình dịch mã protein. Vùng 5’-UTR của EV-A71 giống với polioviru và
có thể chia thành 3 vùng: vùng 5′ terminal cloverleaf vì nucleotide 1 đến 89
hoặc 101 nucleotid, vùng IRES có kích thước từ nucleotide 123–126 đến
nucleotide 602–605, và vùng siêu biến đổi khoảng 120 nucleotid.
Khung đọc mở mã hóa một polyprotein gồm protein cấu trúc P1 dài 2586
nucleotid, protein không cấu trúc P2 (1,734 nt) và P3 (2,259 nt), tham gia vào
sự sao chép ARN của vi rút. Polyprotein được chia thành 11 protein gồm 4
protein capsid thuộc P1 là VP1, VP2, VP3, VP4 và 7 protein không cấu trúc
gồm P2 có 2A, 2B, 2C và P3 có 3A, 3B, 3C, 3D [12]. VP1, VP2, VP3 tạo
thành tiểu đơn vị pentamer, gồm 60 bản sao được kết nối để tạo thành capsid

có cấu trúc khối đa diện đều, các vùng này có nhiều các quyết định kháng
nguyên tuy nhiên các kháng thể trung hòa đã được xác định chủ yếu từ các
kháng nguyển của vùng VP1, trong khi đó VP4 gắn vào mặt trong của vỏ


14

capsid. Ở vùng 2A chứa gen mã hóa enzyme protease đóng vai trị trong sự
phân cắt protein của tế bào vật chủ trong đó có dystrophin là thành phần chính
của tế bào cơ tim [17].
Vùng VP1 gồm 891 nucleotid, vùng này gây ảnh hưởng đáng kể đến sự
biến đổi về gen, về đặc điểm hình thái và thích hợp cho qua trình phát sinh
lồi của vi rút. Vùng gen mã hóa protein VP1 được chứng minh là vùng gen
kháng nguyên, quyết định đến tính kháng nguyên và tính độc lực của vi rút.
Những đột biến trong vùng VP1dễ dẫn đến thay đổi thành phần acid amin và
đặc tính gây bệnh của vi rút, từ đó có thể hình thành biến chủng mới
Vùng không dịch mã 3’-UTRs (81nt) chứa 3 cấu trúc mã hóa stem-loop
X, Y, Z [18].
Phần PolyA gắn ở đầu 3’


15

Hình 1.1. Cấu trúc gen của EV-A71
Những đột biến chuỗi nucleotide trong 5’-UTR, VP3, và gen ARN
polymerase phụ thuộc ARN ở 3D đóng vai trị quan trọng trong cơ chế gây
bệnh và gây độc thần kinh [19]. Đột biến nucleotide từ vỏ capsid VP1, VP2
và một nucleotide trong stem-loop II của vùng 5’-UTR tăng khả năng nhiễm
bệnh và tử vong [19].

16

1.3. Kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) [20]
Thông tin di truyền của mọi cơ thể sinh vật được mã hóa trong phân tử
ADN (acid deoxynucleic), đây là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn được
tạo thành từ bốn loại nucleotide gồm A (adenine), C (cytosine), G (guanine)
và T (thymine). Các nucleotide này nối tiếp nhau theo một trình tự xác định,
và khác nhau ở từng lồi, thậm chí ở từng các thể. Giải trình tự ADN là kỹ
thuật giúp xác định sự sắp xếp của bốn loại nucleotide A, T, C, G trên phân tử
ADN, nhờ đó nghiên cứu được đặc điểm di truyền ở mức độ sinh học phân tử.
Hiện nay, giải trình tự gen đang là xu thế phát triển và được ứng dụng cao
trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như giải trình tự để định danh,
định type vi khuẩn, vi rút, nhận dạng cá thể, nhận dạng loài, xác định đột biến
gen, ứng dụng trong sản xuất vắc-xin, điều trị đích ung thư.... Các phương
pháp giải trình tự cổ điển luôn bị hạn chế bởi nhiều mặt như thời gian, số
lượng, quy mô, độ phân giải, cản trở các nhà khoa học có được những thơng
tin quan trọng từ nghiên cứu của họ. Để khắc phục những hạn chế đó, địi hỏi
sự ra đời của giải trình tự gen thế hệ mới (NGS). Hệ thống NGS thương mại
xuất hiện đầu tiên năm 2005 bởi 454 Life Sciences. Với cách tiếp cận giải
trình tự hồn tồn khác, giải trình tự gen thế hệ mới đã tạo ra một cuộc cách
mạng mang tính đột phá trong nghiên cứu về hệ gen.
Nguyên lý của giải trình tự gen thế hệ mới tương tự với phương pháp
Sanger đều dựa vào giải trình tự các đoạn ADN nhỏ, các đoạn này được phát
hiện dựa vào tín hiệu phát ra từ các đoạn bổ sung được tổng hợp từ sợi ADN
khn. Giải trình tự gen thế hệ mới có hơn 1 triệu các phản ứng diễn ra song
song tạo ra hàng trăm gigabase trong dữ liệu của một trình tự và cho phép giải
trình tự nhanh chóng một lượng lớn các cặp base của tồn bộ bộ gen. Với khả

17

năng giải trình tự nhanh, giải trình tự gen thế hệ mới cho phép giải trình tự
đầy đủ bộ gen trong vài giờ hoặc vài ngày.
NGS gồm 3 bước
- Chuẩn bị thư viện: Trong bước này các đoạn ADN có độ dài phù hợp được
chuẩn bị bằng cách cắt đứt các phân tử ADN dài hoặc tổng hợp các đoạn
ADN ngắn (bằng PCR hoặc lai).
- Gắn ADN và làm giàu: Các phân tử được gắn với mồi dùng để tách thành
các đoạn ngắn đơn, được cố định vào một chất nền, mỗi phân tử dạng đơn
đóng vai trị như một mẫu cho sự khuếch đại.
- Giải trình tự ADN: Sự trùng hợp ADN kết hợp với đọc trình tự.
NGS ngày càng phát triển và ứng dụng nhiều vào các lĩnh vực đặc biệt là
nghiên cứu bộ gen của vi sinh vật giúp con người ngày càng hiểu rõ hơn về sự
đa dạng sinh thái, tiến hóa, hoạt động của vi sinh vật từ đó chúng ta có thể
kiểm sốt được sự bùng phát của các tác nhân gây bệnh. NGS có tính ứng
dụng rất to lớn trong lĩnh vực vi rút học. Những tiến bộ trong cơng nghệ NGS
có thể cung cấp cho chúng ta nhiều thông tin bao gồm định danh chính xác vi
rút, xác định chính xác đặc điểm kháng thuốc, kiểu gen và đường lây truyền
của chúng trong bệnh viện, trong cộng đồng cũng như độc lực của các loại vi
rút này. Do đó, cơng nghệ NGS sẽ giúp tăng cường điều tra dịch tễ học của vụ
dịch, từ đó áp dụng các biện pháp kiểm sốt để can thiệp kịp thời tại bệnh
viện và tại cộng đồng. Ngồi ra, thơng tin từ các kết quả nghiên cứu giúp cho
các nhà lâm sàng quản lý, chăm sóc một cách tốt nhất bệnh nhân. NGS có thể