nghiên cứu tách, điều chế chất chuẩn và xây dựng quy trình phân tích một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐOÀN MẠNH DŨNG

NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP
CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Huế - Năm 2020
i


ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐOÀN MẠNH DŨNG

NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP
CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC

Ngành: Hóa Phân tích
Mã số: 9 44 01 18
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện
2. PGS. TS. Nguyễn Hữu Tùng

Huế - Năm 2020
ii


LỜI CAM ĐOAN
Luận án này được hoàn thành tại Trường Đại học Khoa học,
Đại học Huế, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn
Đình Luyện và PGS.TS. Nguyễn Hữu Tùng. Tơi xin cam
đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi. Các kết quả trong
luận án là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử
dụng và chưa từng được cơng bố trước đó.
Tác giả

Đồn Mạnh Dũng

i


LỜI CẢM ƠN
Luận án được hoàn thành dưới sự hướng dẫn hết sức tận tình và đầy tâm
huyết của Thầy Nguyễn Đình Luyện và Thầy Nguyễn Hữu Tùng.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS. TS Nguyễn Đình
Luyện - Trường Đại học Sư phạm – Đại học Huế, PGS.TS. Nguyễn Hữu Tùng Trường Đại học Quốc gia Hà Nội là người đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo
mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Đặc biệt tôi xin tỏ lịng kính trọng nhất với GS. TS Trần Đình Thắng –
Trường Đại học Vinh, người Thầy đã dìu dắt, hỗ trợ mọi điều kiện tốt nhất cho tôi
trên con đường nghiên cứu khoa học.
Nhân dịp này, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học
Khoa học, Đại học Huế, Phòng Sau đại học, Khoa Hóa học cùng q thầy cơ giáo

giảng dạy lớp nghiên cứu sinh đã tận tình giúp đỡ tơi hồn thành luận án này.
Tác giả xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp gần xa đã giúp đỡ, động
viên, khích lệ tác giả trong suốt quá trình làm luận án.
Cuối cùng, tác giả xin dành tình cảm đặc biệt đến gia đình, người thân và các
người bạn của tác giả, những người đã luôn mong mỏi, động viên và tiếp sức cho
tác giả để hoàn thành bản luận án này.
Tác giả

Đoàn Mạnh Dũng

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN...................................................................................................... I
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................... II
MỤC LỤC..............................................................................................................III
KÝ HIỆU VIẾT TẮT............................................................................................... V
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU.......................................................................... VII
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ................................................................................. IX
MỞ ĐẦU.................................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN......................................................................................... 4
1.1. Giới thiệu về các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học và một số cây
thuốc.......................................................................................................................... 4
1.1.1. Giới thiệu chung.............................................................................................. 4
1.1.2. Các nghiên cứu về tách chiết một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh
học............................................................................................................................. 5
1.1.3. Một số lồi cây thuốc chứa các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học....6
1.2. Các phương pháp phân tích các hợp chất thiên nhiên...................................... 11
1.2.1. Phương pháp sắc ký khí................................................................................ 11

1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng.............................................................................. 12
1.3. Một số nghiên cứu liên quan đến luận án......................................................... 16
Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................22
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.................................................................... 22
2.2. Nội dung nghiên cứu........................................................................................ 23
2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 25
2.3.1. Thông tin về mẫu.......................................................................................... 25
2.3.2. Phương pháp chiết tách/phân lập.................................................................. 27
2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc và đặc trưng hóa - lý của HCTN.................29
2.3.4. Phương pháp tinh chế hctn để tạo ra chất chuẩn........................................... 29
2.3.5. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn và dữ liệu chất chuẩn...30
2.3.6. Phương pháp phân tích các HCTN................................................................ 30
2.3.7. Phương pháp đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích.......................32
iii


2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu............................................................................. 34
2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất........................................................................... 24
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 35
3.1. Chiết tách và xác định cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên..........................35
3.1.1. Chiết tách các HCTN từ cây Diệp hạ châu và đặc trưng cấu trúc..................35
3.1.2. Chiết tách các HCTN từ cây Đan sâm và đặc trưng cấu trúc........................42
3.1.3. Chiết tách các HCTN từ cây Mật nhân và đặc trưng cấu trúc.......................49
3.2. Tinh chế hợp chất thiên nhiên để tạo ra chất chuẩn.......................................... 53
3.2.1. Chất chuẩn hypophyllanthin và phyllanthin.................................................. 54
3.2.2. Chất chuẩn tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA.........................55
3.2.3. Chất chuẩn eurycomanone............................................................................ 57
3.3. Quy trình phân tích hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học.......................58
3.4.1. Tính ổn định của hệ thống thiết bị................................................................. 65
3.4.2. Độ đặc hiệu của phương pháp phân tích....................................................... 69

3.4.3. Khoảng tuyến tính......................................................................................... 72
3.5. Áp dụng thực tế................................................................................................ 79
3.5.1. Kiểm soát chất lượng của phương pháp phân tích......................................... 79
3.5.2. Hàm lượng các hctn trong các mẫu thực tế................................................... 86
3.6. Các hợp chất acetogenin chiết tách từ lá cây Mãng cầu xiêm..........................92
3.6.1. Xác định phân đoạn giàu hoạt chất acetogenin............................................. 94
3.6.2. Định tính các acetogenin chính trong phân đoạn AMF-3.............................. 95
3.6.3. Định lượng các acetogenin chính trong phân đoạn AMF-3........................... 97
3.7. Hàm lượng tinh dầu chiết tách từ cây Riềng đuôi nhọn...................................98
KẾT LUẬN........................................................................................................... 105
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 109
Danh mục các cơng trình cơng bố kết quả nghiên cứu của luận án.......................107
PHỤ LỤC............................................................................................................. 122

iv


KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Viết tắt

Tiếng Việt

ACN
ACRS
AOAC
ASEAN
CCĐC

Tiếng Anh
Acetonitril

Chất chuẩn đối chiếu hóa

Asean

Chemical

học của ASEAN

Reference Substance

Hiệp hội các nhà khoa

Association of Official

học Phân tích Hoa Kỳ

Analytical Chemists

Hiệp hội các nước Đơng

Association of Southeast

Nam Á

Asian Nations

Chất chuẩn đối chiếu

CE

Điện di mao quản

Capillary Electrophoresis

DAD

Detector chuỗi diot

Diot Array Detector

Khối phổ - ion hóa phun

Electron Spray Ionisation

mù electron

– Mass Spectrometry

ESI-MS
EtOAc

Ethyl acetat

EtOH

Ethanol

FLD

Detector huỳnh quang

Fluorescence Detector

GC

Sắc kí khí

Gas Chromatography

Sắc ký lỏng ghép nối

Gas Chromatography –

khối phổ

Mass Spectrometry

GC-MS
HCTN

Hợp chất thiên nhiên

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

High Performance Liquid
Chromatography

HPLC-MS

Sắc kí lỏng - khối phổ

High Performance Liquid
Chromatography– Mass
Spectrometry

HTSH

Hoạt tính sinh học

Bioactive

HCTN

Hợp chất thiên nhiên

Natural compounds

v


Viết tắt
LC-MS/MS

Tiếng Việt

Tiếng Anh

Sắc ký lỏng ghép 2 lần Liquid
khối phổ

Chromatograph

Tandem

Mass

Spectrometer
LOD

Giới hạn phát hiện

Limit of detection

LOQ

Giới hạn định lượng

Limit of quantity

MeOH
NMR

Methanol
Cộng hưởng từ hạt nhân

Nuclear

Magnetic

Resonance
NPLC

Sắc ký lỏng pha thuận

Normal Phase Liquid
Chromatography

PPPT

Phương pháp phân tích

Analysis method

PTN

Phịng thí nghiệm

Laboratory

Sắc ký lỏng pha đảo

Reversed Phase Liquid

RPLC

Chromatography
RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

Relative

Standard

Deviation
SKĐ

Sắc kí đồ

SPE

Chiết pha rắn

TCCL
TLC

Solid Phase Extraction

Tiêu chuẩn chất lượng
Sắc kí lớp mỏng

Thin
Chromatography

UV-Vis
VQG

Tử ngoại – khả kiến
Vườn quốc gia

vi

Ultraviolet – Visible

Layer


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Một số cơng trình nghiên cứu liên quan đến đề tài nghiên cứu...............17
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của PU-1 và so sánh với công bố ở tài liệu................39
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của PU-2 và so sánh với công bố ở tài liệu................41
Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của SM-1 và so sánh với công bố ở tài liệu...............46
Bảng 3. 4 Dữ liệu phổ NMR của SM-2 và so sánh với công bố ở tài liệu...............47
Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của SM-3 và so sánh với công bố ở tài liệu...............48
Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của EL-1 và so sánh với công bố ở tài liệu................52
Bảng 3.7. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn hypophyllanthin và
phyllanthin.............................................................................................................. 54
Bảng 3.8. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn tanshinone I,
cryptotashinone và tanshinone IIA.......................................................................... 56
Bảng 3.9. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn eurycomanone................57
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi
phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin............................................... 67
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân
tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA............................ 68
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ ổn định của hệ thống thiết bị LC-MS/MS khi phân
tích Eurycomanone.................................................................................................. 69
Bảng 3.13. Kiểm tra độ lặp lại của phương pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD khi

phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin, và phân tích Eurycomanone . 80

Bảng 3.14. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các PP LC-MS/MS và UPLC-DAD....81
Bảng 3.15. Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp LC-MS/MS đối với
hypophyllanthin và phyllanthin............................................................................... 83
Bảng 3.16.

Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp LC-MS/MS đối với

tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA................................................... 84
Bảng 3.17. Dữ liệu xác định giá trị LOD của các hợp chất hypophyllanthin,
phyllanthin và eurycomanone................................................................................. 86
Bảng 3.18.

Dữ liệu xác định giá trị LOD của các hợp chất

tanshinone I,

cryptotanshinone và tanshinone IIA........................................................................ 86
vii


Bảng 3.19. Hàm lượng (mg/g) hypophyllanthin và phyllanthin trong các mẫu thực
phẩm chức năng bào chế từ cây Diệp hạ châu......................................................... 88
Bảng 3.20. Hàm lượng (mg/g) tanshinone I, tanshinone IIA và cryptotanshinone
trong các mẫu cây Đan sâm..................................................................................... 90
Bảng 3.21. Hàm lượng (mg/g) eurycomanone trong cây Mật nhân ở các địa phương
khác nhau................................................................................................................ 91
Bảng 3.22. Phương trình đường thêm chuẩn và LOD, LOQ của phương pháp phân
tích.......................................................................................................................... 98

Bảng 3.23. Hàm lượng (%) các cấu tử và các nhóm hợp chất có mặt trong tinh dầu
chiết tách từ các bộ phận của cây Riềng đuôi nhọn............................................... 102

viii


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 3.1. Cơng thức cấu tạo của hypophyllanthin................................................... 38
Hình 3.2. Cơng thức cấu tạo của phyllanthin.......................................................... 40
Hình 3.3. Cơng thức cấu tạo của cryptotanshinone................................................. 45
Hình 3.4. Cơng thức cấu tạo của tanshinon IIA....................................................... 47
Hình 3.5. Cơng thức cấu tạo của Tanshinon I.......................................................... 48
Hình 3.6. Cơng thức cấu tạo của Eurycomanone..................................................... 52
Hình 3.7. Sắc đồ xác định độ tinh khiết của hypophyllanthin:................................ 55
Hình 3.8. Sắc đồ xác định độ tinh khiết của phyllanthin:........................................ 55
Hình 3.9. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của tanshinone I:................................... 56
Hình 3.10. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của cryptotanshinone:.........................56
Hình 3.11. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của tanshinone IIA..............................57
Hình 3.12. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất eurycomanone:..............58
Hình 3.13. Phổ ESI-MS của hợp chất hypophyllanthin........................................... 59
Hình 3.14. Phổ ESI-MS của hợp chất phyllanthin................................................... 59
Hình 3.15. Quy trình phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin bằng
phương pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD.................................................................. 60
Hình 3.16. Phổ ESI-MS của hợp chất tanshinone I................................................. 62
Hình 3.17. Phổ ESI-MS của hợp chất cryptotanshinone......................................... 62
Hình 3.18. Phổ ESI-MS của hợp chất tanshinone IIA............................................. 62
Hình 3.19. Quy trình phân tích đồng thời

tanshinone I, cryptotanshinone và

tanshinone IIA bằng phương pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD................................. 63
Hình 3.20. Quy trình phân tích eurycomanone bằng phương pháp LC-MS/MS.....64
Hình 3.21. Phổ ESI-MS của hợp chất eurycomanone............................................. 65
Hình 3.22. Sắc đồ LC-MS/MS đối với dung dịch chuẩn chứa: (a) hypophyllanthin,
ứng với các nồng độ khác nhau (b) phyllanthin, ứng với các nồng độ khác nhau và
(c) hypophyllanthin và phyllanthin......................................................................... 70
Hình 3.23. Sắc đồ LC-MS/MS đối với dung dịch chuẩn chứa: (a) tanshinone I, ứng
với các nồng độ khác nhau; (b) cryptotanshinone, ứng với các nồng độ khác nhau;
(c) tanshinone IIA, ứng với các nồng độ khác nhau; và (d) tanshinone I,
cryptotanshinone và tanshinone IIA........................................................................ 71
Hình 3.24. Sắc đồ LC-MS/MS đối vơi dung dịch chuẩn chứa: eurycomanone, ứng
ix


với các nồng độ khác nhau...................................................................................... 72
Hình 3.25. Đường hồi quy tuyến tính đối với hypophyllanthin trong phương pháp
LC-MS/MS............................................................................................................. 74
Hình 3.26. Đường hồi quy tuyến tính đối với phyllanthin trong phương pháp LCMS/MS.................................................................................................................... 74
Hình 3.27. Đường hồi quy tuyến tính đối với (a) hypophyllanthin và (b) phyllanthin
trong phương pháp UPLC-DAD............................................................................. 74
Hình 3.28. Đường hồi quy tuyến tính đối với tanshinone I trong phương pháp LCMS/MS.................................................................................................................... 76
Hình 3.29. Đường hồi quy tuyến tính đối với cryptotanshinone trong phương pháp
LC-MS/MS............................................................................................................. 77
Hình 3.30. Đường hồi quy tuyến tính đối với tanshinone IIA trong phương pháp
LC-MS/MS............................................................................................................. 77
Hình 3.31. Đường hồi quy tuyến tính đối với (a) tanshinone I (b) cryptotanshinone
và (c) tanshinone IIA trong phương pháp UPLC-DAD........................................... 78
Hình 3.32. Đường hồi quy tuyến tính đối với eurycomanone trong phương pháp
LC-MS/MS............................................................................................................. 78
Hình 3.33. Sắc đồ của mẫu DHC-VX..................................................................... 87

Hình 3.34. Sắc đồ của mẫu lá Diệp hạ châu............................................................ 89
Hình 3.35. Sắc đồ của mẫu Đan sâm ở Sapa........................................................... 89
Hình 3.36. Sắc đồ của (a) mẫu Mật nhân ở Hà Giang; (b) mẫu Mật nhân ở Bắc Giang

91
Hình 3.37. Quy trình phân tích định tính, định lượng các hợp chất acetogenin từ
dịch chiết của cây Mãng cầu xiêm.......................................................................... 93
1

Hình 3.38. Phổ H-NMR của phân đoạn AMF-3 trong dung mơi CDCl3................95
Hình 3.39. Sắc đồ HPLC-PDA đối với phân đoạn AMF-3......................................96
Hình 3.40. Phổ MALDI-TOF-HRMS của các hợp chất acetogenin trong phân đoạn
AMF-3.................................................................................................................... 97
Hình 3.41. Quy trình phân tích định tính, bán định lượng các hợp chất trong tinh dầu

chiết tách từ các bộ phận của cây Riềng đuôi nhọn............................................... 100

x


MỞ ĐẦU
Việt Nam nằm ở một trong những khu hệ thực vật phong phú nhất trên thế
giới, khu vực rừng nhiệt đới Đông Nam Á. Với bờ biển dài 3200 km và đường biên
giới trên đất liền dài tới 4630 km, rừng núi chiếm 3/4 diện tích cả nước, đất nước ta
sở hữu một nguồn tài nguyên động thực vật vô cùng phong phú. Theo các tài liệu đã
công bố, hiện nay có khoảng trên 12000 lồi thực vật hiện hữu ở Việt Nam [6], [7],
[10], [20], [24]. Theo thống kê của Phan Kế Lộc thì đã có 10386 lồi thực vật bậc
cao có mạch thuộc 2257 chi và 305 họ (trong đó có 733 lồi chỉ gặp trong trồng
trọt) [26]. Những nghiên cứu phát hiện thuốc từ nguồn thảo dược Việt Nam nhằm
giúp chủ động nguồn nguyên liệu sẵn có cũng đã được chú ý thực hiện. Một phần

các thuốc hiện đại là các hợp chất thiên nhiên hoặc các dẫn xuất của chúng được sử
dụng trực tiếp trong công nghiệp dược và chúng được phát triển và ứng dụng rất
nhanh ở châu Âu và Bắc Mỹ. Các chương trình sử dụng thuốc cổ truyền tại các
nước đang phát triển như Mexico, Trung Quốc và Nigeria đang được xúc tiến mạnh
mẽ đặc biệt là sử dụng chúng để hỗ trợ điều trị bệnh bằng các thực phẩm chức năng
[8], [10], [21].
Các nội dung chính trong những nghiên cứu về các HCTN có hoạt tính sinh
học là (i) Xây dựng các quy trình tách chiết thích hợp để thu được các hợp chất có
HTSH có giá trị cho các ngành dược, công nghệ sinh học, y sinh... ; (ii) Tách chiết
và tinh chế để thu được các HCTN có HTSH làm chất chuẩn để định lượng chúng
trong các loài cây thuốc (thực vật nói chung) khác nhau; (iii) Xây dựng quy trình
phân tích (định tính và định lượng) các HCTN có HTSH trong các đối tượng mẫu
khác nhau; (iv) Phân tích cấu trúc và xác định HTSH của các hợp chất mới; (v)
Nghiên cứu xác định HTSH của các hợp chất thiên nhiên và ứng dụng chúng vào
các lĩnh vực khác nhau.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam về tách các HCTN có HTSH từ
cây Diệp hạ châu, Đan sâm, Mật nhân...bằng sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột và phân
tích hàm lượng bằng HPLC [18], [27], [31]. Một số nghiên cứu đã xây dựng quy
trình phân tích HCTN có HTSH như acetogenin [46], [51], [90], tinh dầu bằng
1


phương pháp GC-MS, LC-MS/MS [33]. Mặt khác, gần đây, một số nghiên cứu về
các loài annona, bao gồm Mãng cầu xiêm (A. muricata) cho thấy chúng có chứa
một nguồn phong phú các hợp chất acetogenin annonaceous (AGEs) [98]. Các
nghiên cứu về cây thuộc chi Riềng đã cho thấy loài này chứa nhiều hợp chất có
HTSH có giá trị như camphor, camphen, borneol và bornyl acetat,… được sử dụng
rộng rãi làm hương liệu mĩ phẩm, thực phẩm và làm gia vị trong các món ăn [33].
Cho đến nay, mới có một vài nghiên cứu tập trung phân tích nhóm chất có HTSH
acetogenin trong cây Mãng cầu xiêm và phân tích các hợp chất trong tồn bộ cây

Riềng đi nhọn [46], [51], [70], [89], [90]. Song, chưa có nghiên cứu nào xác định
được hàm lượng mỗi chất có HTSH trong các bộ phân của cây, để định hướng cho
các nghiên cứu tiếp theo tách chiết các hợp chất có giá trị từ các bộ phận riêng biệt
của cây.
- Về hướng (ii) – tinh chế để thu được các chất tinh khiết cũng được nhiều
nghiên cứu quan tâm, song chủ yếu là các PTN/các hãng dược chuyên ngành nghiên
cứu và giá thành chất chuẩn có HTSH khá đắt. Trong khi đó, ở VN, cho đến nay,
những nghiên cứu theo hướng này còn rất hạn chế.
Xuất phát từ các vấn đề trên, luận án này được thực hiện nhằm mục đích đóng
góp tích cực vào các hướng nghiên cứu (i), (ii) và (iii) ở trên.
Mục đích của nghiên cứu luận án:
Luận án này được thực hiện nhằm xây dựng được quy trình tách chiết, điều
chế chất chuẩn và phân tích một số HCTN có HTSH từ một số cây thuốc phân bố ở
các địa phương của nước ta: cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.), Đan sâm
(Salvia miltiorrhiza B.), Mật nhân (Eurycoma longifolia J.), Mãng cầu xiêm
(Annona muricata (Soursop)), Riềng đuôi nhọn (Alpinia macroura K. Schum.) - một
loài cây mới phát hiện.
Các nội dung nghiên cứu chính của luận án:
Để đạt được những mục đích trên, các nội dung nghiên cứu chính bao gồm:
- Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết các hợp chất phyllanthin,
hypophyllanthin từ cây Diệp hạ châu; hợp chất tanshinone I, cryptotanshinone,
tanshinone IIA từ cây Đan sâm và hợp chất eurycomanone từ cây Mật nhân bằng
2


các phương pháp sắc ký;
- Tinh chế các hợp chất thu được (phyllanthin, hypophyllanthin, tanshinone I,
cryptotanshinone, tanshinone IIA, eurycomanone) để tạo ra các chất chuẩn cho phân
tích định tính và định lượng chúng trong các dược liệu khác nhau;
- Xây dựng quy trình phân tích các hợp chất phyllanthin, hypophyllanthin,

tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA và eurycomanone bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiện đại LC-MS/MS, UPLC-DAD để có thể áp dụng cho các PTN
phân tích ở nước ta;
- Nghiên cứu xác định hàm lượng các hợp chất có HTSH trong dịch chiết lá cây
Mãng cầu xiêm bằng phương pháp sắc ký hiện đại: sắc ký lỏng ghép nối với các

detector khác nhau (qNMR, HPLC-PDA, MALDI-TOP HRMS) và các hợp chất có
trong tinh dầu các bộ phận (lá, thân, rễ...) của cây Riềng đi nhọn bằng phương
pháp sắc ký khí ghép nối với detector khối phổ (GC-MS).

3


Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH
SINH HỌC VÀ MỘT SỐ CÂY THUỐC
1.1.1. Giới thiệu chung
Hợp chất thiên nhiên hay hợp chất tự nhiên là các chất hóa học có nguồn gốc
từ thiên nhiên hoặc được con người tách ra từ các loại động vật, thực vật trong tự
nhiên có thể có hoạt tính sinh học hoặc có tác dụng dược học dùng để làm thuốc.
Trong sự phát triển của loài người, thiên nhiên có vai trị vơ cùng quan trọng, nó
khơng chỉ cho chúng ta nơi cư ngụ mà còn cung cấp cho chúng ta những vật chất
thiết yếu cho cuộc sống. Hóa học các hợp chất thiên nhiên là hóa học các hợp chất
hữu cơ được tạo ra từ các tổ chức sống (vi sinh vật, nấm, động thực vật...) tìm thấy
trong tự nhiên, thường có hoạt tính sinh dược học được sử dụng để phát hiện và
phát triển thuốc chữa bệnh [108].
Người ta cũng cần dựa vào những khái niệm cơ bản về tính chất của các chất
(alkaloit có tính kiềm yếu và chứa nitơ), về các đơn vị hợp thành phân tử (terpenoit
tạo thành từ các đơn vị isopren) hay trên cơ sở các mối liên kết cơ bản (các glycosit
do có các liên kết glycosit)... để phân chia các lớp chất chính trong tự nhiên. Như

vậy, các hợp chất thiên nhiên có thể phân chia thành các lớp chất chính sau: các hợp
chất terpenoit, các hợp chất steroit, các hợp chất alkaloit, các hợp chất flavonoit, các
hợp chất phenolic, các hợp chất lipit, các hợp chất cacbohydrat, các hợp chất axit
amin, peptit và protein, vitamin [21], [29], [108].
Các lồi thực vật có chứa khoảng 5 triệu hợp chất hóa học. Cho tới nay, đã có 0,5
%, nghĩa là 1.300 cây được nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa học và
giá trị chữa bệnh [15]. Thuốc từ dược liệu được sử dụng không chỉ các nước
Á Đơng mà cịn được tiêu thụ một lượng khá lớn ở các nước phương Tây. Ở các

nước có nền cơng nghiệp phát triển thì một phần tư số thuốc kê trong các đơn có
chứa hoạt chất từ dược liệu…[32].
Các hợp chất thiên nhiên là nguồn cung cấp các phân tử có sự đa dạng rất lớn về
cấu trúc và hoạt tính sinh học. Sự đa dạng về cấu trúc hoá học của các hợp chất thiên

4


nhiên có thể có liên quan đến sự đa dạng sinh học của các nguồn thiên nhiên sinh tổng
hợp ra các hợp chất này. Hơn nữa, các hợp chất có hoạt tính sinh học được tìm thấy từ
thiên nhiên có thể dùng trực tiếp trong y học, nhiều hợp chất khác được dùng như chất
dẫn đường hoặc phân tử hiện đại cho tổng hợp và bán tổng hợp thuốc. Việc sử dụng các
sản phẩm thiên nhiên đóng vai trị là nguồn các hợp chất dẫn đường làm phong phú và
đa dạng về cấu trúc của các hợp chất tổng hợp và bán tổng hợp thuốc [21].

1.1.2. Các nghiên cứu về tách chiết một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính
sinh học
Cho đến nay ở Việt Nam và trên tồn thế giới đã có khá nhiều cơng trình
nghiên cứu về chiết tách các HCTN có HTSH. Một trong những nghiên cứu đầu tiên
là tách chiết thành công artermisin từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.)
và chuyển hóa thành nó thành các dẫn xuất có hoạt tính cao hơn (artermether,

artesunat…) làm thuốc chống sốt rét. Nghiên cứu phân lập taxol từ cây thông đỏ
(Taxus baccata L); Chiết l-tetrahydropalmatin từ rễ củ của một số loại cây Bình vơi
(Stephania spp.) làm thuốc an thần; Tách chiết berberin từ loài cây Vàng đắng
(Coscinium fenestratum); Tách curcumin từ cây Nghệ (Curcuma longa L.), rutin từ
nụ Hoa hòe (Styphnolobium japonicum L.); Tách vinblastin, vincristin từ cây Dừa
cạn (Catharanthus roseus L.)… [20], [35]. Hàng ngàn năm nay, tự nhiên là nguồn
cung cấp các tác nhân điều trị bệnh, với con số ấn tượng về lượng thuốc hiện đại có
nguồn gốc tự nhiên dựa trên cơ sở sử dụng làm thuốc truyền thống của chúng. Một
số lượng lớn thuốc bán chạy nhất trong thế kỷ 20 đều được tách chiết từ các thảo
dược khác nhau như: vincristin từ cây Dừa cạn - Vinca rosea, morphin từ cây Anh
túc - Papaver somniferum, Taxol từ cây Thông đỏ - Taxus brevifolia... Riêng trong
năm 2001, đã có tới 8 hợp chất (simvastatin, pravastatin, amoxycillin, axit
clavulanic, azithromycin, ceftriaxone, cyclosporin và paclitaxel) có mặt trong số 30
thuốc bán chạy nhất trên thế giới với tổng kinh phí khoảng 16 tỷ đô la Mỹ [29],
[108].
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu tập trung vào tách chiết các
HCTN có hoạt tính sinh học từ một số lồi thảo dược có sẵn ở nhiều địa phương của
nước ta như cây Diệp hạ châu, cây Đan sâm, cây Mật nhân, cây Mãng cầu xiêm và
cây Riềng đuôi nhọn...
5


1.1.3. Một số loài cây thuốc chứa các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
1.1.3.1. Cây Diệp hạ châu
Cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) cịn có tên gọi khác là cây Chó đẻ
răng cưa, thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), là một loại thảo mộc được sử dụng
nhiều trong các bài thuốc cổ truyền chữa đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm
da, lở ngứa, bệnh gan, sốt, đái tháo đường... Hiện nay các sản phẩm thuốc có nguồn
gốc từ Diệp hạ châu khá nhiều. Thành phần hóa học bao gồm lignan, tannin,
flavonoid, axit phenolic, terpenoid và các loại hợp chất khác. Đến nay, 93 hợp chất

đã được xác định và cấu trúc được làm sáng tỏ từ các chất chiết xuất từ cây Diệp hạ
châu bao gồm 22 lignan, 16 tannin, 12 flavonoid, 21 phenolic, 13 terpenoid và các
chất chuyển hóa thứ cấp khác. Thành phần có hoạt tính quan trọng nhất được tập
trung nghiên cứu chủ yếu là phyllanthin, hypophyllanthin, corilagin, geraniin,
brevifolin, các dẫn xuất của nó và rutin. Các hợp chất chiết từ các lồi Chó đẻ thân
xanh (P. amarus), cây Diệp hạ châu (P. urinaria) có hoạt tính kháng virus, kháng
khuẩn, đặc biệt là ức chế hoạt động của virus viêm gan B. Lignan là các hợp chất
đóng một vai trị quan trọng trong các hệ thống phịng thủ thực vật. Lignan có các
hoạt tính sinh học như là chất chống oxy hóa, chống ung thư, estrogen, kháng virus
và hạ huyết áp. Các ngành công nghiệp dược phẩm sử dụng chúng làm tiền chất cho
sự tổng hợp của thuốc chống ung thư. Phyllanthin là một lignan có hoạt tính chống
oxy hóa, chống viêm, miễn dịch và bảo vệ gan được sử dụng trong điều trị nhiều
bệnh gan [7], [10], [62]. Ngồi ra, phyllanthin có hoạt tính chống oxy hóa bao gồm
ức chế superoxide enzyme dismutase (SOD) và glutathione reductase và làm giảm
tổn thương oxy hóa do ethanol gây ra trong tế bào gan chuột. Nó có tác dụng làm
gia tăng lượng glutathione có vai trò bảo vệ và phục hồi tế bào gan, làm giảm men
gan do ức chế men ADN polymerase của virus viêm gan B. Các nghiên cứu chỉ ra
rằng hypophyllanthin là một lignan cơ lập từ P. urinaria có tiềm năng hoạt tính sinh
học bao gồm hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm, miễn dịch kháng virut, chống
ung thư, chống virut viêm gan B và tác dụng bảo vệ gan. Nó có tác dụng làm gia
tăng lượng glutathione có vai trị bảo vệ và phục hồi tế bào gan, làm giảm men gan
do ức chế men ADN polymerase của virus viêm gan B [50], [64], [87].
6


1.1.3.2. Cây Đan sâm
Cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza B.) thuộc chi Salvia, họ Hoa mơi
(Lamiaceae) cịn gọi là đơn sâm, huyết sâm, xích sâm. Thành phần hóa học chính
trong cây Đan sâm là acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và một số thành phần
khác. Các thành phần hoạt chất chính trong rễ của Đan sâm đã được chia thành hai

nhóm là tanshinontan trong lipid và acid phenolic tan trong nước [6], [7], [10]. Đến
nay, hơn 20 acid phenolic phân lập từ rễ cây Đan sâm đã được nghiên cứu. Các chất
có hoạt tính thân dầu tanshinon diterpenoid, bao gồm tanshinon I, tanshinon IIA,
cryptotanshinon... Hơn 30 tanshinon và quinon diterpenoid đã được phân lập và sinh
tổng hợp [55], [103]. Hiện nay có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây
Đan sâm. Các tác dụng đã được chứng minh bao gồm: làm giãn mạch vành, chống
huyết khối, chống thiếu máu cục bộ [57], [85]. Ngồi ra, Đan sâm cịn được chứng
minh có tác dụng chống đau thắt ngực [44], [54]. Tác dụng làm hạ đường huyết, hạ
lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở tế bào [49], [54]. Tác dụng an thần,
chống vi khuẩn, chống nấm, tốt cho trường hợp nấm ngồi da, mụn trứng cá, rụng
tóc, ngứa và mề đay [60], [103], [118]. Hoạt tính chống viêm [35], hoạt tính chống
oxy hóa mạnh [7], [54], và có tác dụng chống ung thư [2], [85].
Cryptotanshinon là thành phần được phân lập từ rễ của cây Đan sâm, có hoạt
tính kháng khuẩn mạnh, chống dermatophytic, chất chống oxy hóa, chống viêm và
chống ung thư, hoạt động của cryptotanshinon cũng có thể ức chế các tế bào sản
xuất endothelia endothelin-1 và tạo ra sự khác biệt của một số tế bào như các tế bào
gốc trung mô tủy xương. Các kết quả nghiên cứu in vivo cho thấy tanshinon IIA có
tác dụng giảm đáng kể kích thước vùng nhồi máu. Cơ chế có thể do khả năng dọn
gốc tự do ở màng ty thể tim [57], [103]. Tanshinon IIA ức chế quá trình oxi hóa
LDL và hoạt động của angiotensin II, từ đó làm giảm phì đại tế bào cơ tim [118].
Các kết quả nghiên cứu in vivo cho thấy tanshinon I có tác dụng giảm đáng kể kích
thước vùng nhồi máu. Cơ chế có thể do khả năng dọn gốc tự do ở màng ty thể tim.
Tanshinon I ức chế quá trình oxi hóa LDL và hoạt động của angiotensin II, từ đó
làm giảm phì đại tế bào cơ tim [49], [118].

7


1.1.3.3. Cây Mãng cầu xiêm
Cây Mãng cầu xiêm (Annona muricata (Soursop)) có tên gọi khác là Na xiêm hay

mãng cầu gai thuộc chi Annona, họ Na [94]. Nghiên cứu về thành phần hóa học của
Mãng cầu xiêm cho thấy sự đa dạng về cấu trúc hợp chất bởi có nhiều lớp chất đã được
phân lập và xác định cấu trúc. Khái qt từ các cơng trình nghiên cứu đã cho biết các
lớp chất bao gồm: cacbohydrat, lipit, amino axit, phenolic axit, proanthocyanidin,
tannin, flavonoit, monotecpen, sesquitecpen, ditecpen, tritecpen, ancaloit, polyprenol,
hợp chất thơm, cyclopeptit, acetogenin,.. [22], [59]. Trong số đó, các hợp chất
acetogenin có cấu trúc rất đặc biệt và chỉ được tìm thấy trong Mãng cầu xiêm cũng như
các lồi thuộc họ na, sự độc đáo này không chỉ dừng lại ở cấu trúc hóa học mà hoạt tính
sinh học của chúng cũng nổi bật nhờ khả năng gây độc các dòng tế bào ung thư trên cơ
thể con người, đồng thời cấu trúc của các hợp chất này cũng khá đa dạng [95], [100].
Mãng cầu xiêm (lá, rễ và hạt) được dùng làm thuốc tại rất nhiều nơi trên thế giới, nhất
là tại các quốc gia Nam Mỹ [8], [9]. Phần lớn các nghiên cứu về ung thư trên chi
Annona tập trung vào lớp chất mới có nguồn gốc từ thiên nhiên được gọi là
annonaceous acetogenin. Ba nhóm nghiên cứu độc lập đã phân lập các hợp chất
acetogenin từ chi Annona này đã cho thấy khả năng chống khối u, chống ung thư và
chống lại các độc tính có chọn lọc với các loại tế bào ung thư khác nhau (mà khơng làm
hại các tế bào khỏe mạnh), có tám nghiên cứu lâm sàng đã được công bố dựa trên các
phát hiện này. Nhiều hợp chất acetogenin đã chứng minh tính gây độc chọn lọc về tác
6

dụng gây độc các tế bào ung thư với liều lượng rất thấp khoảng 1/10 . Cụ thể là dòng tế
bào bào ung thư biểu mơ
ở phổi, dịng khối u ở ngực người, ung thư tuyến tiền liệt, dịng tế bào ung thư biểu

mơ tuyến tụy, dòng tế bào ung thư tuyến đại tràng, dòng tế bào ung thư gan dòng tế
bào ung thư hệ bạch huyết ở người và nhiều loại thuốc kháng ung thư ác tính ở ngực
người [59], [95]. Xem xét hoạt động kháng u và gây độc tế bào, annonacin có thể
được sử dụng như là một chất dẫn đường để phát triển tiềm năng của các tác nhân
chống ung thư. Tuy nhiên, một chú ý rất quan trọng là annonacin chỉ ức chế sự phát
triển bình thường của các khối u phổi trong thời gian kéo dài hai tuần, nó khơng tiêu

diệt các khối u và cũng khơng làm ngừng sự tăng trưởng của chúng một cách hoàn
toàn [22].
8


1.1.3.4. Cây Mật nhân
Cây Mật nhân (Eurycoma longifolia J.) là một lồi thực vật có hoa thuộc họ
Simaroubaceae [7], [45], [96]. Các nghiên cứu cho thấy cây Mật nhân chứa các lớp
chất có hoạt tính sinh học như quassinoid, alkaloid, triterpenoid, steroid, dẫn xuất
squalene và eurycolactone, eurycomalactone, laurycolactone, biphenyl neolignan...
[96]. Theo y học cổ truyền, Mật nhân có vị đắng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt,
tiêu viêm, lợi thấp, lợi tiểu, thường dùng chữa tiểu tiện ra máu, nhức mỏi, ăn không
tiêu, đầy hơi, chướng bụng,... Vỏ rễ cây Mật nhân có vị rất đắng nên sử dụng làm
thuốc tẩy giun, trị sốt rét, kiết lỵ, ngộ độc, thuốc trị ghẻ lở…. Dịch
chiết từ rễ của Mật nhân được sử dụng làm thuốc chữa rối loạn chức năng tình dục,
lão hóa, sốt rét, ung thư, tiểu đường, lo âu, đau nhức, táo bón, hồi sức, sốt, tăng
năng lượng, tăng sức mạnh, bệnh bạch cầu, loãng xương, căng thẳng, giang mai...
[24], [36], [45]. Eurycomanone là một quassinoid có hoạt tính sinh học cao được
phân lập từ mật nhân, hợp chất này vẫn chưa được tìm thấy ở các lồi thực vật khác
ngoài mật nhân, và được coi là một hợp chất đánh dấu đặc trưng của cây Mật nhân
[45], [96]. Eurycomanone là một quassinoid chính trong dịch chiết từ rễ E.
longifolia, nó làm tăng đáng kể sản xuất testosterone theo liều lượng. Nó tăng
cường sự tạo men testosterone ở các tế bào tinh hoàn của chuột bằng cách ức chế sự
chuyển đổi aromatase của testosterone thành estrogen. Nó giúp điều trị vơ sinh, tăng
cường sinh lực phái mạnh và có tác dụng chống estrogen [96].
1.1.3.5. Riềng đuôi nhọn
Riềng đuôi nhọn (Alpinia macroura K. Schum.) thuộc chi Riềng (Alpinia), họ
Gừng (Zingiberaceae). Là lồi cây có giá trị sử dụng làm thuốc, làm cảnh, cho tinh
dầu… (theo kinh nghiệm dân gian). Tinh dầu từ thân rễ (tươi hoặc khô) của hầu hết
các lồi riềng đều có chứa các hợp chất có tính kháng khuẩn, kháng nấm, tiêu diệt

các lồi kí sinh và côn trùng. Những thử nghiệm invivo và invitro đã cho thấy dịch
chiết từ thân rễ ở một số loài riềng (bằng nước, alcohol, ete) đều có tác dụng diệt
khuẩn mạnh, chẳng hạn các loại khuẩn: Bacillus subtilus, Eschirichia coli,
Stachilococcus aureus [12], [14], [78]. Giữa hương thơm và tinh dầu riềng cũng có
những mối quan hệ chặt chẽ, trong tinh dầu riềng có chứa chủ yếu các hợp chất
9


camphor, camphen, borneol và bornyl acetat, chính bởi các hợp chất này làm cho các
lồi riềng đều có tính hăng cay, được sử dụng rộng rãi làm hương liệu mĩ phẩm, thực
phẩm và làm gia vị trong các món ăn. Tinh dầu riềng nếp có chứa các hợp chất có tác
dụng như những tác nhân chống nấm và diệt khuẩn rất tốt [37], [66], [71]. Chúng cịn
có khả năng bảo vệ nhiều loài thực vật nhờ khả năng tiêu diệt các loài vi sinh vật gây
bệnh [37], [75]. Khi khảo sát riêng rẽ hoạt tính của sáu hợp chất chính trong tinh dầu từ
thân rễ loài A. galanga, kết quả còn cho thấy: terpinen-4-ol là hợp chất hoạt động nhất;
n-pentan cùng dietyl ete chiết từ thân rễ khô là tác nhân chống lại Trichophyton
meutagrophytes; acetoxy chavicol acetat có hoạt tính chống lại 7 loại nấm với nồng độ
nhỏ nhất nằm trong khoảng 20-250µg/ml. Tuy có hoạt tính cao nhưng tinh dầu riềng
chưa được sử dụng rộng rãi trong y học hiện đại [76], [99], [115]. Tinh dầu ở loài
Alpinia calcarata có khả năng chống oxy hóa gốc tự do trong kháng nấm trên cây trồng
[42], [43]. Tinh dầu quả của lồi Alpinia maclurei có khả năng kháng lại tụ cầu khuẩn
[113]. Từ tinh dầu rễ của loài A. pinnaensis ở Việt Nam được Văn Ngọc Hướng và cộng
sự công bố có khả năng kháng vi sinh vật kiểm định [33]. Như vậy, trước đây các nhà
nghiên cứu chỉ chú trọng vào đánh giá về thành phần loài tinh dầu trong thực vật. Tuy
nhiên, thời gian gần đây đã thử hoạt tính sinh học của các mẫu tinh dầu được nghiên
cứu, hầu hết các loại tinh dầu đều có tính ứng dụng cao như kháng khuẩn, kháng nấm,
kháng côn trùng,..
Thực vật luôn là nguồn cung cấp sản phẩm thiên nhiên phong phú cho y học kể cả
các hoạt chất sử dụng trực tiếp hay các chất dẫn đường tạo hoạt chất có hoạt tính cao
bằng phương pháp tổng hợp. Thực vật còn cung cấp đa dạng các cấu trúc phức tạp mà

hầu như khơng thể tổng hợp được trong phịng thí nghiệm. Hơn thế nữa, trong q trình
tiến hóa, để tồn tại các thực vật cịn có khả năng tạo ra các hợp chất có hoạt tính cao
hơn ngăn cản các động vật tiêu thụ chúng. Ngày nay, rất ít các loài động thực vật đã
được nghiên cứu toàn diện, phần lớn chúng chưa được nghiên cứu, khám phá. Những
nhóm chất chính trong giới thực vật gồm: phytosterol, terpenoit, alkaloit, glycosit,
đường, các phenol và polyphenol tự nhiên [29].

Tiềm năng của thực vật bậc cao là nguồn cung cấp dược phẩm mới nhưng chỉ
được khảo sát bước đầu. Trong số các sinh vật thì chỉ một tỷ lệ phần trăm nhỏ là đã
10


được nghiên cứu về mặt hóa học thực vật, và một phần còn nhỏ hơn nữa được đưa
vào các nghiên cứu sàng lọc sinh học và dược lý học [21], [29], [108].
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
Để phân tích các HCTN có HTSH người ta thường sử dụng các phương pháp
khác nhau như: Phân tích định tính bằng phương pháp sắc ký giấy (TLC); Phân tích
định lượng bằng phương pháp sắc ký khí (GC) hoặc phương pháp sắc ký lỏng (LC)
ghép nối với các detector khác nhau.
Để phân tích cấu trúc các HCTN nói riêng và các hợp chất hữu cơ nói chung,
người thường sử dụng các phương pháp phổ khác nhau như quan phổ hấp thụ phân
tử (UV-Vis), quang phổ hồng ngoại (IR), khối phổ (MS), phổ cộng hưởng từ hạt
nhân (NMR)...
Dưới đây sẽ giới thiệu sơ lược về các phương pháp GC, LC.
1.2.1. Phương pháp sắc ký khí
Trong thảo dược cũng tồn tại nhiều thành phần, trong đó có thành phần rất dễ
bay hơi. Các thành phần rất dễ bay hơi này có những đặc tính riêng biệt của từng
lồi thảo dược, chính những tính riêng biệt này tạo ưu thế cho việc xây dựng sắc ký
dấu vân tay của các thảo dược theo phương pháp sắc ký khí. Phân tích bằng GC thu
được sự chính xác và độ nhạy cao cho các thành phần hóa học dễ bay hơi. Tuy

nhiên, phương pháp phân tích này cũng gặp khó khăn khi các mẫu thảo dược ở dạng
phân cực và không phải là thành phần dễ bay hơi.
Trong phương pháp sắc ký khí ghép nối detector khối phổ (GC-MS), mẫu
được tiêm vào cổng bơm của thiết bị GC, được làm bay hơi, và được tách trong cột
GC, sau đó được phân tích bởi detector MS và ghi phổ. Thời gian từ lúc tiêm mẫu
và rửa giải ra khỏi cột được gọi là thời gian lưu (t R). Các thiết bị sử dụng cho GCMS thông thường bao gồm một cổng tiêm ở một đầu của một cột kim loại (thường
được đóng gói với một loại vật liệu như silicagel để thúc đẩy quá trình tách tối đa)
và một máy dò (MS) ở đầu kia của cột. Một khí mang (có thể là argon, heli, nitơ,
hydro, hay một vài khí khác) đẩy mẫu xuống cột. Trong lúc GC phân tách các hợp
chất trong hỗn hợp, các detector MS cung cấp thông tin hỗ trợ trong việc xác định
cấu trúc của mỗi hợp chất. Các cột sử dụng trong GC-MS có thể là hai loại sau: cột
11


mao quản và cột nhồi [25].
Các bộ ghép nối hay được sử dụng rộng rãi nhất trong GC-MS là các kiểu ion
hóa va chạm electron (EI) và ion hóa hố học (CI). Tuy nhiên, trong hệ thống GCMS hiện đại, có thể sử dụng nhiều kiểu khác nhau để phát hiện các ion phân tử. Ví
dụ, khối phổ TOF kết hợp trục giao với GC được sử dụng để xác định độ tinh khiết
và nhận danh các hợp phần bằng cách đo và tính tốn chính xác khối lượng của các
thành phần nguyên tố. Ngày nay, một máy GC-MS được tích hợp trực tuyến với cơ
sở dữ liệu MS khác nhau của một số hợp chất tham khảo để tìm kiếm các phổ phù
hợp cho các hợp chất tách được [25], [38]. Hệ khối phổ là hệ có độ nhạy cao, được
sử dụng để phân tích khối lượng. Thơng tin mang lại là khối lượng phân tử cũng
như các thông tin có liên quan đến cấu trúc của phân tử. GC-MS, đó là một kỹ thuật
ghép nối phát triển từ việc kết hợp kỹ thuật GC và MS, là loại hình ghép nối đầu
tiên trở nên hữu ích cho mục đích nghiên cứu và phát triển. GC-MS đã được ứng
dụng rộng rãi trong việc phân tích tinh dầu có mặt trong thảo dược. Với GC-MS
người ta biết được những thông tin liên quan đến định tính và định lượng các thành
phần có mặt trên bản sắc ký, những thơng tin này rất hữu ích trong các nghiên cứu
đánh giá mối tương quan giữa thành phần hóa học và hoạt tính của thảo dược [38],

[104]. Với MS, phương pháp phát hiện hay được sử dụng là quang phổ khối lượng
bẫy ion, tứ cực (một hoặc ba tứ cực) và thời gian bay (TOF) là những công cụ được
dùng thường xuyên nhất, ngày nay cả LC-MS và GC-MS cũng là các kỹ thuật ghép
nối được sử dụng phổ biến nhất [111]. Khối phổ thu được bằng kỹ thuật ghép nối
này cung cấp thơng tin về cấu trúc dựa trên việc giải thích của các phân mảnh. Độ
phong phú tương đối của các mảnh ion có thể được so sánh với thư viện phổ. Các
hợp chất rất dễ bay hơi, kích thước nhỏ, và bền vững ở nhiệt độ cao trong điều kiện
GC có thể dễ dàng phân tích bằng GC-MS. Đơi khi, một số hợp chất phân cực mà
đặc biệt khi chúng có chứa nhóm hydroxyl thì cần phải được dẫn xuất hố để phân
tích GC-MS. Kỹ thuật dẫn xuất phổ biến nhất là sự chuyển hóa chất phân tích thành
dẫn xuất trimetylsilyl của nó [38].
1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một công cụ phân tích hiện

12


đại, được sử dụng nhiều trong các phịng thí nghiệm nghiên cứu các HCTN hiện
nay. Lợi thế của việc sử dụng cơng cụ HPLC trong việc phân tích các thảo dược bởi
vì các thiết bị này rất dễ sử dụng và không bị hạn chế bởi các thành phần bay hơi
hay không bay hơi cũng như độ bền, độ phân cực của mẫu nghiên cứu. Thông
thường hệ HPLC thường được sử dụng để phân tích hầu hết các hợp chất có mặt
trong thảo dược. Các hợp chất có khả năng hấp thụ quang thì sử dụng detector UVVis hoặc detector hấp thụ huỳnh quang Fluorescene detector, đối với các hợp chất
khơng có khả năng hấp thụ quang thì sử dụng detector tán xạ ánh sáng ELSD
(Evaporative Light Scattering Detector) [91], [111]. Sự phát triển của kỹ thuật ghép
nối LC với các detector khác nhau đã giúp nâng cao hiệu quả tách và phân tích và
do vậy, trong 20 năm qua đã ra đời các hệ thống thiết bị hiện đại như LC/UV,
LC/UV- DAD, LC/MS và gần đây là LC/NMR. Với các hệ thiết bị đó, khơng chỉ
thuận lợi trong phân tích (định tính, định lượng) các HCTN, mà cịn cho phép phân
tích cấu trúc và nhận dạng chất, đồng thời lưu trữ dữ liệu phổ của các hợp chất mới

để ngày càng bổ sung vào thư viện phổ của các HCTN trong các phần mềm đi kèm
các hệ thiết bị đó. Mặt khác, các hệ thiết bị đó cịn hỗ trợ thuận lợi việc nghiên cứu
và phân tích các loại mẫu phức tạp như các mẫu thực vật thô, các hợp phần tách
chiết từ các mẫu thực vật... (các mẫu phức tạp đó có thể chứa đến hàng trăm thành
phần khác nhau) [72], [73], [74].
Để tiến hành phân tích, trước hết mẫu được ly trích bằng một dung mơi hữu cơ và
được làm sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (nếu cần). Sau đó, dịch chiết được
làm sạch và được hòa tan trong dịch pha động tiêm vào hệ thống HPLC với các
detector UV, PDA, FLD hoặc MS, MS/MS. Detector huỳnh quang (FLD) – một trong
những detector có độ nhạy cao – cũng thường được sử dụng, song trước khi qua detetor
FLD, chất phải được dẫn qua cột DA (để nó phản ứng với một chất chọn lọc, tạo dẫn
xuất huỳnh quang). Nguyên lý tách trong phương pháp LC nói chung và HPLC nói
riêng là dựa vào ái lực của các cấu tử với 2 pha (khi dòng mẫu đi qua cột tách) - pha
tĩnh (có thể là dạng pha đảo hoặc pha thuận), thường là pha rắn và pha động (lỏng) và
do vậy, mỗi cấu tử sẽ được rửa giải ra khỏi cột ở các thời gian khác nhau (được gọi là
thời gian lưu) theo một trình tự xác định. Cấu tử ra khỏi cột

13