Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm mốc aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG LÊ THẢO NGUYÊN

KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
NẤM MỐC Aspergillus oryzae
ĐỂ SẢN XUẤT ACID KOJIC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG LÊ THẢO NGUYÊN
MÃ SINH VIÊN: 1501360

KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
NẤM MỐC Aspergillus oryzae
ĐỂ SẢN XUẤT ACID KOJIC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Lê Ngọc Khánh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp Dược

HÀ NỘI - 2020

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành nhất tới ThS. Lê Ngọc Khánh –
người thầy đã truyền dạy cho tôi những bài học quý báu cũng như lòng yêu khoa học từ
những ngày đầu nghiên cứu tới nay, đã hết lòng hướng dẫn, tận tâm chỉ bảo và giúp đỡ
tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Đàm Thanh Xuân đã cho tôi những lời khuyên
bổ ích, nhiệt tình hướng dẫn, giải đáp thắc mắc và giúp đỡ tơi trong suốt q trình nghiên
cứu.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo và các anh, chị kỹ thuật viên Bộ môn
Công nghiệp Dược, đặc biệt là tổ Công nghệ Sinh học đã chỉ bảo, giúp đỡ tơi giải quyết
khó khăn và tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, các phịng ban cùng tồn thể các
thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, tạo môi trường tốt nhất cho tôi học
tập và nghiên cứu tại trường trong suốt 5 năm.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ở bên,
tiếp cho tôi động lực, giúp đỡ tôi trên quãng đường học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020
Sinh viên

Hoàng Lê Thảo Nguyên


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2
1.1. Acid kojic ................................................................................................................. 2
Đặc điểm ................................................................................................................2
Ứng dụng ...............................................................................................................2
Phương pháp sản xuất acid kojic ..........................................................................4
1.2. Aspergillus oryzae .................................................................................................... 6
Chi Aspergillus ......................................................................................................6
Loài Aspergillus oryzae .........................................................................................7
1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh acid kojic của nấm mốc
Aspergillus oryzae ........................................................................................................... 9
Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men ...................................................9
Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy ......................................................................10
1.4. Một số nghiên cứu về khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng
sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae ....................................................... 11
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 13
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ....................................................................................... 13
Nguyên vật liệu ....................................................................................................13
Thiết bị sử dụng ...................................................................................................14
2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................................. 14
Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh acid
kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae. .........................................................................14
Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến khả năng sinh acid kojic của
nấm mốc Aspergillus oryzae ..........................................................................................14
2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 14
Phương pháp giữ giống .......................................................................................14


Phương pháp nhân giống ....................................................................................14
Phương pháp lên men thu acid kojic ...................................................................15

Phương pháp kết tinh ..........................................................................................15
Phương pháp định tính bằng thuốc thử FeCl3 5% ..............................................15
Phương pháp Schoorl - Regenbogen định lượng đường khử ..............................15
Phương pháp định lượng đường saccarose và tinh bột ......................................16
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................. 17
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh
acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae. .............................................................. 17
Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon trong môi trường lên men đến khả năng
sinh acid kojic của Aspergillus oryzae ..........................................................................17
Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ trong môi trường lên men đến khả năng sinh
acid kojic của Aspergillus oryzae ..................................................................................23
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến khả năng sinh acid kojic
của nấm mốc Aspergillus oryzae ................................................................................. 29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A. oryzae

Aspergillus oryzae

A. albus

Aspergillus albus

A. candidus

Aspergillus candidus

A. nidulans

Aspergillus nidulans

A. flavus

Aspergillus flavus

A. niger

Aspergillus niger

A. fumigatus

Aspergillus fumigatus

A. paraticus

Aspergillus paraticus


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các thành phần cơ bản trong môi trường lên men để sản xuất acid kojic từ
Aspergillus oryzae ...........................................................................................................9
Bảng 3.1. Môi trường lên men thu acid kojic từ quá trình lên men A. oryzae với các
nguồn carbon khác nhau ................................................................................................18
Bảng 3.2. Khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn carbon
trong môi trường lên men ..............................................................................................20

Bảng 3.3. Môi trường lên men thu acid kojic từ quá trình lên men A. oryzae với các
nguồn nitơ khác nhau ....................................................................................................24
Bảng 3.4. Khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn nitơ trong
môi trường lên men .......................................................................................................26
Bảng 3.5. Môi trường lên men thu acid kojic từ quá trình lên men A. oryzae với các điều
kiện pH khác nhau .........................................................................................................29
Bảng 3.6. Khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi điều kiện pH
môi trường lên men .......................................................................................................31


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Q trình hình thành acid kojic từ glucose ......................................................5
Hình 1.2. Quá trình hình thành di-O-acetylkojic acid từ tetra-O-acetyl-α-Dglucopyranosyl bromid bằng phương pháp tổng hợp hóa học ........................................6
Hình 1.3. Bào tử Aspergillus oryzae dưới kính hiển vi quang học (a), (b) (mơi trường
Czapek) và dưới kính hiển vi điện tử (c) .........................................................................8
Hình 3.1. Hình ảnh sinh khối của Aspergillus oryzae với các mơi trường nuôi cấy AG,
AS, AM, AT sau 12 ngày lên men ................................................................................19
Hình 3.2. Hình ảnh acid kojic kết tinh từ dịch lên men của A. oryzae trong môi trường
nuôi cấy AG (a) và AS (b) .............................................................................................19
Hình 3.3. Hình ảnh phản ứng của acid kojic (hòa tan trong ethanol) với sắt (III) clorid
3% ..................................................................................................................................20
Hình 3.4. Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi
nguồn carbon trong mơi trường .....................................................................................21
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh tỉ lệ đường tiêu thụ của Aspergillus oryzae khi thay đổi nguồn
carbon trong mơi trường lên men ..................................................................................22
Hình 3.6. Hình ảnh sinh khối của Aspergillus oryzae với các môi trường nuôi cấy GP,
GC, GN, GNC sau 12 ngày lên men .............................................................................25
Hình 3.7. Hình ảnh acid kojic kết tinh từ dịch lên men A. oryzae trong môi trường nuôi
cấy GC (a) và GP (b) .....................................................................................................25
Hình 3.8. Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi

nguồn nitơ trong mơi trường .........................................................................................27
Hình 3.9. Biểu đồ so sánh tỉ lệ glucose tiêu thụ của Aspergillus oryzae khi thay đổi
nguồn nitơ trong mơi trường lên men ............................................................................28
Hình 3.10. Hình ảnh sinh khối của Aspergillus oryzae với các môi trường nuôi cấy GP1,
GP2, GP3 sau 12 ngày lên men .....................................................................................30
Hình 3.11. Hình ảnh acid kojic kết tinh từ dịch lên men A. oryzae trong môi trường nuôi
cấy GP1 (a) và GP2 (b) .................................................................................................31
Hình 3.12. Biểu đồ so sánh hiệu suất sinh acid kojic của Aspergillus oryzae khi thay đổi
điều kiện pH mơi trường................................................................................................32
Hình 3.13. Biểu đồ so sánh tỉ lệ glucose tiêu thụ của Aspergillus oryzae trong các
môi trường lên men có điều kiện pH khác nhau............................................................33


ĐẶT VẤN ĐỀ

Acid kojic là một acid hữu cơ và là chất chuyển hóa thứ cấp, được tiết ra từ các
chủng vi nấm thuộc chi Penicilium, Mucor, Aspergillus… hoặc vi khuẩn nhóm
Gluconoacetobacter [17], [22]. Trong đó, qua nhiều nghiên cứu Aspergillus oryzae đã
cho thấy được tiềm năng lớn trong sản xuất sinh tổng hợp acid kojic, đồng thời không
sinh ra độc tố aflatoxin [32], [35], [46].
Acid kojic được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: y học, công nghiệp, thực phẩm, nơng
nghiệp, cơng nghiệp hóa chất và đặc biệt là trong công nghiệp mỹ phẩm [14], [16], [18],
[36]. Thị trường của acid kojic phát triển từ năm 1955 với nỗ lực sản xuất đầu tiên thuộc
về công ty Pfizer (Mỹ) [36]. Mặc dù đã được sản xuất và ứng dụng trên quy mơ cơng
nghiệp nhưng nỗ lực cải thiện q trình sản xuất acid kojic vẫn tiếp tục được nghiên cứu
một cách rộng rãi. Hai hướng nghiên cứu chính để nâng cao hiệu suất quá trình sản xuất
acid kojic là cải thiện chủng giống và tối ưu quá trình lên men [18], [36]. Hiện nay, ở
Việt Nam, nghiên cứu về những vấn đề trên chưa được công bố rộng rãi. Với những lý
do đó đồng thời mong muốn được góp phần vào các nghiên cứu về cải thiện khả năng
sinh acid kojic, đề tài “Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae để sản

xuất acid kojic” được tiến hành với các mục tiêu sau:
1.

Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh

acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae.
2.

Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến khả năng sinh acid

kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Acid kojic
Đặc điểm
Công thức tổng quát: C6H6O4
Tên khoa học: 5-hydroxy-2-(hydroxymethyl)pyran-4-on
Thành phần: C 50,70%; H 4,23%; O 45,07%
Khối lượng phân tử: 142,11 g/mol
Nhiệt độ nóng chảy: dao động từ 150 – 160℃ [10], [30].
Công thức cấu tạo:
OH
O
HO
O

Acid kojic ở điều kiện thường là chất rắn, kết tinh dưới dạng tinh thể hình que, lăng

trụ khơng màu, khơng mùi, tan trong nước (43,85 g/L), tan tốt trong ethanol, aceton,
ethyl ether, hầu như không tan trong benzen, chloroform [16], [18], [36].
Acid kojic là một ℽ-pyron đa chức năng và có tính acid yếu. Nó phản ứng ở mọi vị
trí trên vịng và có thể tạo ra một số sản phẩm có giá trị trong cơng nghiệp hóa học, ví
dụ như chelat kim loại, pyridon, pyridin, ether, azodyes, mannich base, các sản phẩm
cyanoethyl hóa [27], [47].
Ở vị trí cacbon số 5, nhóm hydroxyl hoạt động như một acid yếu, có khả năng tạo
thành muối với một số ít kim loại như natri, kẽm, đồng, canxi, niken và cadimi [18],
[36].
Một phản ứng đặc trưng của acid kojic là tạo thành phức màu đỏ sáng với ion Fe3+
[13].
Ứng dụng
 Trong y học
Acid kojic và các dẫn xuất của nó có tính chất kháng sinh, chống lại các vi khuẩn
Gram âm cũng như các vi khuẩn Gram dương. Tại nồng độ lớn hơn 0,5%, acid kojic có
khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, chống lại trực khuẩn lao trong điều kiện in
2


vitro dưới nhiều điều kiện khác nhau và tại nồng độ 0,045%, acid kojic ức chế hoàn toàn
sự phát triển bề mặt của trực khuẩn [33]. Dẫn xuất 7-iodo của acid kojic có hoạt tính
mạnh chống lại tụ cầu khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus [31].
Dưới dạng muối azidometalkojat, acid kojic cho thấy tác dụng kháng khuẩn và
kháng nấm trên một số loài Bacillus, Staphylococcus. Azidometalkojat dạng dẫn xuất
kẽm thể hiện tác động gây độc nhất định lên tế bào HeLa [26], [36].
 Trong mỹ phẩm:
Hiện nay acid kojic được ứng dụng rất nhiều trong ngành công nghiệp mỹ phẩm và
đây cũng là lợi ích nổi bật nhất của nó.
Acid kojic chủ yếu được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất kem làm trắng da,
kem dưỡng da, xà phòng làm trắng và các sản phẩm chăm sóc răng miệng. Tác dụng

làm trắng da của nó được giải thích dựa trên cơ chế ức chế sự hình thành tyrosinase –
enzym xúc tác q trình chuyển hóa tyrosin thành melamin, từ đó ức chế hình thành
melamin, dẫn đến ngăn cản sự gia tăng sắc tố trong da người. Tác dụng này đã được
chứng minh trên in vitro và in vivo [19], [36], [42].
Nhiều nghiên cứu đã báo cáo về phương pháp tổng hợp dẫn xuất của acid kojic: acid
kojic dipalmitat, acid kojic laureat, acid kojic ester nhằm cải thiện độ tan và độ ổn định
của acid kojic trong các sản phẩm mỹ phẩm. Mặt khác, các dẫn xuất của acid kojic được
tổng hợp thơng qua liên kết ethylen của nhóm phosphonat với aldehyd có hoạt tính ức
chế enzym tyrosinase mạnh gấp 8 lần acid kojic. Phản ứng liên hợp acid kojic với các
acid amin cũng tạo ra các liên hợp có hoạt tính ức chế tyrosinase cao hơn và ổn định
hơn so với acid kojic đơn thuần [34], [37].
Ngoài tác dụng ức chế hình thành tyrosinase, acid kojic cịn có khả năng bảo vệ da
khỏi ảnh hưởng của tia cực tím [36].
 Trong cơng nghiệp thực phẩm
Acid kojic có nguồn gốc tự nhiên trong các món ăn truyền thống của Nhật Bản như
miso, nước tương và sake [14], [36]. Trong sản xuất, acid kojic cịn đóng vai trị là tiền
chất cho các chất điều hương vị điển hình như maltol và ethyl maltol (hợp chất có cơng
dụng cải thiện mùi vị thực phẩm, đồng thời cũng là một thành phần trong nước hoa)
[14], [27].
Một công dụng khác của acid kojic là ngăn ngừa sự hình thành các vết nâu (do các
phản ứng hóa học xảy ra bên trong thực phẩm) trong quá trình bảo quản và chế biến mì

3


thơ. Nó có tác dụng ức chế polyphenol oxidase trong nấm, táo, khoai tây, một số loại
tôm dựa trên khả năng ngăn cản hấp thu oxy cần thiết cho quá trình hóa nâu (là q trình
hình thành các sắc tố màu nâu ảnh hưởng đến mùi vị, màu sắc và giá trị của thực phẩm)
[19], [36], [43]. Do vậy, đây cũng là một ứng dụng phổ biến của acid kojic: dùng trong
bảo quản thực phẩm.

 Trong cơng nghiệp hóa học
Là thuốc thử để xác định sắt: Acid kojic là dẫn xuất pyron đầu tiên được sử dụng để
phân tích sắt trong quặng dựa trên phản ứng hóa học. Cơ sở của phương pháp này là khả
năng tạo phức hợp bền màu đỏ với lượng nhỏ ion sắt nồng độ 0,1 ppm của acid kojic.
Phức hợp chelat của acid kojic với kim loại được coi như cơ sở cho sự kiểm sốt giải
phóng của ion kim loại trong các chất có tác dụng làm thuốc hoặc các chất xúc tác [36],
[47].
Acid kojic có thể dễ dàng kết hợp với chitosan để sản xuất các hợp chất acid kojic
– chitosan (hoạt chất sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như
thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp và mơi trường) [44].
 Trong nơng nghiệp
Acid kojic có tác dụng nhất định chống lại côn trùng Heliothis zea và Spodoptera
frugiperda (loài sâu bướm gây hại cho cây trồng). Đồng thời nó được sử dụng như một
chất tạo phức chelat để sản xuất thuốc trừ sâu. Acid kojic có tác dụng ức chế sự phát
triển của ấu trùng Trogoderma (một loài bọ cánh cứng), làm mất khả năng sinh sản của
cả con đực và con cái thuộc chi này. Các dẫn xuất của acid kojic có tác dụng chống nấm
Phythium graminicola, Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani, gây bệnh thối hạt,
héo lá cho cây trồng [12], [21], [36].
Phương pháp sản xuất acid kojic
a. Phương pháp sinh tổng hợp
Acid kojic được sản xuất bằng phương pháp vi sinh vật với các chủng có khả năng
sinh acid kojic. Có 58 chi khác nhau được sử dụng để sản xuất acid kojic là Penicilium,
Mucor, Aspergillus... [22]. Năm 1907, tiến sĩ Saito lần đầu tiên phát hiện ra sự xuất hiện
của acid kojic từ sợi nấm Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên nguồn cơ chất là tinh
bột [41]. Yabuta cũng phân lập được acid kojic từ các môi trường dinh dưỡng của A.
albus, A. candidus và A. nidulans. Tiếp sau đó, nhiều vi sinh vật khác đã được chứng
minh là có khả năng sản xuất acid kojic. Đặc biệt, hầu hết các chủng thuộc nhóm A.

4

flavus – oryzae – tamarii đều có khả năng sinh acid kojic với sản lượng cao và A. oryzae,
A. flavus là hai chủng được sử dụng rộng rãi nhất cho mục đích này. Acid kojic cịn có
thể được sản xuất từ q trình lên men của Penicillium daleae, từ nhóm vi khuẩn
Gluconoacetobacter [9], [15]. Ngồi ra, acid kojic cịn có thể được sản xuất bằng cách
sử dụng một số loài thực vật như Kigella africana [23].
Rất nhiều loại cơ chất có thể được sử dụng để tổng hợp acid kojic, đó là các hợp
chất có hai nguyên tử carbon (ethanol, acid glycolic), ba (glycerol, dihydroxyaceton),
bốn (acid tartric), năm (ribitol, arabinose), sáu (glucose, manitol, sorbitol) hoặc bảy (acid
quinic, acid shikimic). Ngoài ra cịn có thể sử dụng các di-, tri- và polysaccharid như
gạo, khoai lang, lúa mì, lúa mạch đen, yến mạch [9], [14].
Kinoshita và Haworth đã nhận ra mối quan hệ chặt chẽ về cấu trúc của acid kojic và
glucose. Glucose (I) thơng qua q trình oxy hóa tạo thành chất trung gian ketonic (II),
sau đó mất hai phân tử nước để tạo thành acid kojic (III) [15]. Trong quá trình lên men,
glucose trong mơi trường chuyển đổi thành acid kojic thông qua hoạt động của hệ thống
enzym liên kết với tế bào bao gồm glucose-6-phosphat dehydrogenase, hexokinase và
gluconat dehydrogenase [10], [11]. Glucose hoạt động như một tiền chất trong tổng hợp
acid kojic và quá trình tổng hợp chấm dứt khi tất cả lượng đường trong mơi trường cạn
kiệt [38].

Hình 1.1. Quá trình hình thành acid kojic từ glucose
b. Phương pháp tổng hợp hóa học
Cơ chất ban đầu cho quá trình sản xuất acid kojic bằng phương pháp tổng hợp hóa
học cũng là carbonhydrat, nhưng chỉ có hexose và những dẫn chất của chúng mới được
sử dụng cho quá trình này. Maurer và cộng sự đã nghiên cứu để tìm ra phương thức hình
thành cấu trúc ℽ-pyron từ tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl bromid (IV). Đầu tiên HBr
được loại ra khỏi (IV) bằng diethylamin trong benzen, tetra-O-acetyl-(2-hydroxy-D5


glucal) (V) tạo thành được clo hóa trong ether khơ, hỗn hợp đồng phân diclorid (VI) tạo

ra bị thủy phân bởi Ag2CO3 hoặc nước thành 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-D-glucoson hydrat
(VII) và cuối cùng tạo thành di-O-acetylkojic acid (VIII) bằng anhydrid acetic và pyridin
ở 0oC hoặc bằng cách đun nóng với anhydrid acetic và natri acetat khan. Stacey và
Turton đã đơn giản hóa quá trình tổng hợp acid kojic bằng cách chuyển trực tiếp từ (V)
thành (VII) bằng acid perbenzoic, giản lược đi bước clo hóa [15].

Hình 1.2. Q trình hình thành di-O-acetylkojic acid từ
tetra-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl bromid bằng phương pháp tổng hợp hóa học
1.2. Aspergillus oryzae
Chi Aspergillus
Aspergillus là một trong những chi nấm được nghiên cứu nhiều nhất với khoảng 200
loài và phát tán khắp mọi nơi trong tự nhiên [1]. Aspergillus có dạng hình sợi, phân
nhánh, khuẩn ty có vách ngăn, khơng màu, màu nhạt hoặc trở nên nâu, nâu nhạt ở một
số vùng nhất định trên khuẩn lạc. Sợi nấm đa bào, đầu sợi nấm sinh sản phình to ra tạo
thành các tế bào hình chai, phía trên mọc các cuống sinh bào tử đính. Các bào tử đính
xịe ra như những bơng hoa cúc [2].
Các loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rãi trên các cơ chất tự nhiên,
trong các sản phẩm công nông nghiệp, ở nhiều vùng địa lý khác nhau nên chúng được
sử dụng trong nhiều lĩnh vực. Một số loài, đặc biệt là loài A. oryzae đã được sử dụng
nhiều trong công nghiệp lên men truyền thống để chế biến thực phẩm ở nhiều nước châu
Á như Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản. Một số loài thuộc chi Aspergillus như: A.
niger, A. oryzae đã và đang được sử dụng trong công nghệ sinh học để sản xuất enzym
như amylase, chitinase, protease, cellulase, pectinase; trong công nghiệp sản xuất chế
6


biến thực phẩm như: tương chao, nước mắm, nước tương; trong công nghiệp sản xuất
một số acid hữu cơ như: acid citric, acid gluconic [2].
Một số loài thuộc chi Aspergillus khác có khả năng tạo chất kháng sinh, như A.
fumigatus tạo thành fumagilin có tác dụng lên Entamoabae histolyca; A. humicola, A.

nidulans tạo thành humicolin, nidulin có tác dụng ức chế đối với với các loại vi khuẩn...
Trong số các chất này thực sự dùng trong công nghiệp dược phẩm hiện nay chỉ có lồi
A. fumigatus sản xuất fumagilin làm thuốc chữa lị amip.
Nhiều lồi thuộc chi Aspergillus có khả năng biến đổi sinh học, một số khác tạo ra
các loại độc tố, đặc biệt chú ý tới loại độc tố gây ung thư gan như loài A. flavus, A.
paraciticus tạo thành aflatoxin. Chủng A. niger GM156 (ĐB106) là một chủng đột biến
của chủng hoang dại A. niger GM56, có khả năng sinh tổng hợp xylanase trên các phế
phụ phẩm nông nghiệp. Xylanase là một loại enzym quan trọng được dùng rộng rãi trong
nhiều ngành công nghiệp và gần đây được sử dụng nhiều để tăng trọng trong chăn ni
[2].
Lồi Aspergillus oryzae
Một số chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus được sử dụng trong công nghệ lên
men, sản xuất enzym (amylase, protease, pectinase…) và các acid hữu cơ (acid citric,
acid gluconic…) trong đó có Aspergillus oryzae. Apergillus oryzae thuộc chi
Aspergillus, họ Trichocomaceae, bộ Eurotiales, lớp Eurotiomycetes, ngành Ascomycota
và thuộc giới nấm [4].
Nấm Aspergillus oryzae có cấu tạo đa bào, sinh sản bằng bào tử, không sinh độc tố
aflatoxin và tạo hương tốt. Khi mới phát triển hệ sợi có màu trắng, sau đó chuyển sang
màu vàng, khi già thì chuyển hẳn sang màu xanh lục, phân nhánh có vách ngang chia
sợi thành nhiều tế bào sợi mảnh, chiều ngang sợi khoảng 5 – 7 µm. Từ những sợi nằm
ngang hình thành những sợi thẳng đứng gọi là cuống đính bào tử, ở đầu có cơ quan sinh
sản vơ tính. Cuống đính bào tử của Aspergillus oryzae thường dài 1,0 – 2,0 mm nên có
thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ
bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài gọi là những tế bào hình chai.
Đầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử dính vào nhau, gọi là đính bào
tử, có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau (dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình
cầu có tia). Đây chính là đặc trưng ở nấm mốc Aspergillus oryzae [4].

7

(a)

(b)

(c)

Hình 1.3. Bào tử Aspergillus oryzae dưới kính hiển vi quang học (a), (b) (mơi
trường Czapek) và dưới kính hiển vi điện tử (c) [25].
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử của Aspergillus oryzae là 45%,
nhiệt độ thích hợp trong khoảng 28℃ – 32℃, độ ẩm khơng khí 85-95%, pH mơi trường
từ 5,5 đến 6,0, hồn tồn hiếu khí. Nấm mốc phải trực tiếp sử dụng các chất hữu cơ có
sẵn trong mơi trường để phát triển và đảm bảo hoạt động bình thường [4].
Aspergillus oryzae có các enzym thủy phân nội bào và ngoại bào như amylase,
glucoamylase, protease, pectinase, xylanase, hemicellulase... Trong đó hệ enzym
amylase tổng hợp từ Aspergillus oryzae có hoạt lực cao hơn so với một số chủng nấm
mốc và vi khuẩn khác. Ngồi ra Aspergillus oryzae có khả năng tổng hợp cả ba loại
enzym protease (acid, kiềm và trung tính).
Chủng Aspergillus oryzae là loại nấm sợi quan trọng trong công nghiệp, cách đây
hàng trăm năm nó được dùng để lên men rượu sake, pate đậu phộng, nước tương ở Nhật.
Người ta nhận ra rằng Aspergillus oryzae lên men tương ngon hơn so với một số chủng
khác vì chúng có khả năng biến đổi tinh bột của gạo nếp thành đường làm tương có vị
ngọt. Aspergillus oryzae đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ lên men truyền
thống ở nhiều nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Philippin, Indonesia và Việt
Nam. Cho đến thời điểm này thì chủng nấm mốc Aspergillus oryzae đã được đưa vào
sử dụng phổ biến trong công nghiệp sản xuất enzym (α-amylase, glucoamylase) và trong
các ngành chế biến thực phẩm.
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nấm mốc phải trực tiếp sử dụng các chất
hữu cơ có sẵn trong mơi trường để tổng hợp các chất cần thiết và chịu tác động từ các
yếu tố bên ngoài. Để nghiên cứu và ứng dụng Aspergillus oryzae vào sản xuất, cần hiểu

được ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng cũng như các điều kiện nuôi cấy khác lên
sự sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh sản phẩm của chúng.
8


1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh acid kojic của nấm mốc
Aspergillus oryzae
Ảnh hưởng của thành phần mơi trường lên men
Mỗi một q trình lên men vi sinh vật đều cần các môi trường lên men khác nhau,
tuy nhiên có một số thành phần cơ bản nhất định phải có trong tất cả các mơi trường lên
men. Để vi sinh vật phát triển, thành phần mơi trường lên men phải có: nước, nguồn
carbon, nguồn nitơ, chất khoáng, nguyên tố vi lượng và oxy (nếu quá trình lên men là
hiếu khí).
Đối với q trình lên men Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic, các thành phần
cơ bản sử dụng được mô tả trong bảng sau:
Bảng 1.1. Các thành phần cơ bản trong môi trường lên men để sản xuất
acid kojic từ Aspergillus oryzae [18], [36].
Thành phần

Nguồn

Carbon

Glucose, sucrose, fructose, mannose, galactose, xyloza,
arabinose, sorbitol, acetat, ethanol, maltose, tinh bột …

Nitơ

Cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4, NH4NO3…

Chất khoáng

KH2PO4, MgSO4.7H2O, ZnSO4, CuSO4.5H2O…

Oxy

Khơng khí vơ trùng (thơng qua sục khí)

Nguồn carbon khơng chỉ đóng vai trị là nguồn cung cấp năng lượng và duy trì sự
sống cho vi sinh vật trong quá trình lên men, mà cịn là cơ chất cho q trình sinh tổng
hợp acid kojic. Việc sử dụng các nguồn carbon khác nhau trong môi trường nuôi cấy sẽ
ảnh hưởng đến khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae. Nồng độ nguồn carbon
ban đầu trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh acid
kojic: nồng độ quá thấp sẽ không đáp ứng đủ nhu cầu của vi sinh vật còn nồng độ quá
cao sẽ làm cho môi trường trở nên ưu trương, cản trở hoạt động sinh lý của tế bào [36].
Việc sử dụng các nguồn nitơ khác nhau trong môi trường nuôi cấy ban đầu ảnh
hưởng đáng kể đến lượng acid kojic thu được. Sự thay đổi tỉ lệ C/N trong môi trường
nuôi cấy có thể dẫn đến sự ức chế hoặc tăng cường khả năng tổng hợp acid kojic. Nhiều
báo cáo cho rằng tỉ lệ C/N cao hơn 100 là điều cần thiết cho việc nâng cao sản lượng
acid kojic [20], [30], [32], [36]. Bởi vì nếu sử dụng cao nấm men hoặc pepton với nồng
độ cao trong môi trường lên men ban đầu thì glucose sẽ khơng thể chuyển hóa thành
9


acid kojic được, mà thay vào đó nó sẽ tập trung cho sự tăng trưởng của tế bào vi sinh
vật. [36], [39].
Ngoài các hợp chất carbon và nitơ, cần cung cấp một lượng cần thiết các chất
khoáng và nguyên tố vi lượng vào môi trường lên men ban đầu để vi sinh vật tăng trưởng
tốt và sản xuất ra các chất chuyển hóa mong muốn. Tuy nhiên các chất này không được
bổ sung trực tiếp mà được bổ sung vào môi trường lên men dưới dạng muối. Môi trường

Czapek-Dox chứa KH2PO4, KCl, NaNO3, MgSO4 và FeSO4.7H2O là môi trường thuận
lợi cho sự phát triển của vi sinh vật (A. oryzae và A. flavus) và sản xuất acid kojic. Một
trong những chất dinh dưỡng quan trọng cho sự phát triển của hầu hết các loại nấm là
phospho. Phospho có trong các phân tử như acid nucleic, phospholipid, đường phosphat
và đóng một vai trị thiết yếu trong chuyển hóa năng lượng [36].
Ảnh hưởng của điều kiện ni cấy
Ngồi ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng thì điều kiện ni cấy cũng là yếu tố
quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành acid kojic trong quá trình lên men nấm mốc
Aspergillus oryzae.
Nhiệt độ là một trong những thông số ảnh hưởng đến quá trình lên men nấm mốc
Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic. Mỗi vi sinh vật phát triển trong một khoảng
nhiệt độ thích hợp, nếu nằm ngồi khoảng nhiệt độ đó thì vi sinh vật sẽ bị hạn chế sự
phát triển. Nếu nhiệt độ quá thấp, nó sẽ tác động lên khả năng chuyển hoá các hợp chất,
làm ức chế hoạt động của các hệ enzym, thay đổi khả năng trao đổi chất của chúng, vì
thế làm vi sinh vật mất khả năng phát triển và ảnh hưởng đến quá trình sản xuất acid
kojic. Mặt khác nhiệt độ quá cao gây biến tính protein, làm hệ enzym lập tức khơng hoạt
động được, do đó vi sinh vật sẽ bị chết một cách nhanh chóng.
Ngồi nhiệt độ, pH mơi trường cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng và hình
thành sản phẩm trong quá trình lên men nấm mốc A. oryzae. Sự lên men acid kojic có
thể chia làm hai giai đoạn: giai đoạn tăng trưởng và giai đoạn sản xuất. Trong giai đoạn
tăng trưởng, các enzym liên quan đến con đường chuyển hóa acid kojic được tạo ra, sau
đó acid kojic được tổng hợp bằng cách chuyển đổi trực tiếp từ glucose thông qua các
phản ứng đa pha của các enzym này mà không bị phân cắt thành từng mảnh nhỏ [40].
pH môi trường lên men sẽ làm ảnh hưởng đến tính thấm qua màng, hoạt động chuyển
hóa vật chất trong tế bào vi sinh vật, ảnh hưởng tới hoạt tính enzym, do đó làm ảnh

10


hưởng đến sự phát triển của A. oryzae cũng như q trình sản xuất acid kojic. Do đó cần

một điều kiện pH thích hợp trong suốt giai đoạn tăng trưởng và sản xuất.
1.4. Một số nghiên cứu về khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng
sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae
 Nghiên cứu ở nước ngoài
Kitada và cộng sự (1967) đã khảo sát việc sử dụng các nguồn carbon khác nhau như
tinh bột, saccarose, fructose, glucose, xyloza trong quá trình lên men nấm mốc
Aspergillus oryzae để sản xuất acid kojic. Kết quả thu được đều cho thấy rằng: vi sinh
vật có khả năng phát triển tốt trong những môi trường trên, tuy nhiên trong quá trình lên
men bằng tinh bột, fructose và xyloza thì khơng sinh ra acid kojic. Ngồi ra, trong q
trình lên men sử dụng glucose làm nguồn carbon, sản lượng acid kojic thu được là cao
nhất [29], [36]. Nhóm tác giả cũng đã khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose dao động
từ 25 - 150 g/L khi sản xuất acid kojic từ nấm mốc Aspergillus oryzae. Mặc dù lượng tế
bào vi sinh vật tối đa không thay đổi đáng kể ở mức trên 50 g/L nhưng lượng acid kojic
cao nhất thu được tại nồng độ 100 g/L glucose, cho hiệu suất 0,24 g acid kojic / 1g
glucose [30], [36].
Rosfarizan và cộng sự đã chỉ ra rằng nguồn nitơ hữu cơ thường tốt hơn các nguồn
nitơ vơ cơ cho q trình lên men sản xuất acid kojic [36], [39]. Kitada và cộng sự nhận
định pepton là nguồn nitơ hữu cơ thuận lợi nhất để sản xuất acid kojic từ quá trình lên
men Aspergillus oryzae [30].
Kwak và Rhee (1992) đã báo cáo rằng nhiệt độ tối ưu cho quá trình sản xuất acid
kojic trong hầu hết các trường hợp là từ 25oC-30oC [32]. Hassan và cộng sự đã xác định
30oC là nhiệt độ tối ưu cho quá trình sản xuất acid kojic từ lên men chủng Aspergillus
oryzae var. effusus NRC14 [24]. Kitada và cộng sự (1967) cũng chỉ ra pH tối ưu để sản
xuất acid kojic còn phụ thuộc vào loại carbon hoặc nitơ sử dụng; các nhà nghiên cứu
này đã xác định khi sử dụng amoni nitrat làm nguồn nitơ thì lượng acid kojic tối đa đạt
được ở pH=3,08 [30], [36]. Ngoài ra, Arnstein và Bentley đã báo cáo rằng nồng độ
phosphat trong môi trường nuôi cấy ban đầu cũng ảnh hưởng đáng kể đến việc sản xuất
acid kojic của Aspergillus oryzae. Các tác giả chứng minh rằng khi sử dụng phosphat
với nồng độ cao (0,55 – 13,72 mM) trong môi trường nuôi cấy sẽ thu được tỉ lệ acid
kojic cao hơn so với khi sử dụng phosphat với nồng độ thấp (0,0055 – 0,055 mM) [9].

11


 Nghiên cứu ở trong nước
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh
acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae còn khá ít hoặc chưa được cơng bố nhiều.
Nhóm tác giả Trương Phương (tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh) đã
cơng bố đề tài điều chế kojic dipalmitat gồm hai phần: “Sàng lọc chủng Aspergillus
oryzae và nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận acid kojic” và “Tổng hợp ester – kojic
dipalmitat” đăng tải trên Tạp chí Dược học (2013). Trong báo cáo “Sàng lọc chủng
Aspergillus oryzae và nghiên cứu điều kiện lên men thu nhận acid kojic”, với phương
pháp lên men trong môi trường lỏng được lắc với tốc độ 200 vịng/ phút, nhóm tác giả
này đã ghi nhận chủng Aspergillus oryzae 4F được phân lập từ mẫu cơm, bánh mì tại
quận Bình Thạnh, Thành phố Hồ Chí Minh cho nồng độ acid kojic cao nhất (36,25 g/l)
và lựa chọn điều kiện lên men thích hợp với chủng 4F: nuôi cấy tại nhiệt độ 30℃, sử
dụng glucose làm nguồn carbon với nồng độ 100 g/l, sử dụng pepton casein làm nguồn
nitơ với nồng độ 2,5 g/l trong thời gian 15 ngày [7]. Ngoài ra, trong đề tài “Khảo sát khả
năng sinh acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae”, dược sĩ Nguyễn Thị Huyền cũng
đã tiến hành chiết tách, định tính acid kojic từ dịch ni cấy nấm mốc Aspergillus oryzae
và lựa chọn nồng độ glucose thích hợp cho quá trình lên men sinh acid kojic là 10%,
thời gian nuôi cấy là 12 ngày [3].

12


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
Nguyên vật liệu


Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae VTCC-F045 do Viện vi sinh vật và Công

nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp.


Nguyên liệu sử dụng trong đề tài:

- Cao nấm men (Merck, Đức), pepton (Merck, Đức) đạt tiêu chuẩn tinh khiết
phân tích.
- Hóa chất pha môi trường nuôi cấy: glucose, tinh bột, (NH4)2SO4, maltose, kali
dihydro phosphat, magie sulfat (Trung Quốc), thạch bột, saccarose (Việt Nam) đạt tiêu
chuẩn tinh khiết hóa học.
- Hóa chất định tính, định lượng: kali natri tartrat, natri hydroxyd, đồng sulfat,
kali iodua, acid sulfuric 98%, natri thiosulfat, HCl 10%, sắt III clorid 3% (Trung Quốc)
đạt tiêu chuẩn tinh khiết hóa học.


Mơi trường sử dụng trong đề tài: Môi trường lỏng nuôi cấy A. oryzae (g/100ml):

Glucose 10%; peptone 0,3%; KH2PO4 0,1%; MgSO4.7H2O 0,05%. Môi trường được
điều chỉnh pH, tiệt khuẩn ở 110OC trong 15 phút, làm nguội trước khi sử dụng. Môi
trường đặc giữ giống có thành phần tương tự trên, bổ sung thêm thạch bột 2%.
 Các dung dịch sử dụng được pha theo hướng dẫn của DĐVN V:
- Dung dịch Fehling A: Hòa tan 34,66 g đồng sulfat trong nước đã acid hóa bằng
2 giọt đến 3 giọt acid sulfuric lỗng vừa đủ 500 ml.
- Dung dịch Fehling B: Hịa tan 173 g natri kali tartrat và 50 g natri hydroxyd
trong 400 ml nước, làm nguội, thêm nước vừa đủ 500 ml.
- Dung dịch acid sulfuric 25%: Cho từ từ 143 ml acid sulfuric 98% vào 500 ml
nước, khuấy liên tục, làm nguội, thêm nước vừa đủ 1000 ml.

- Dung dịch natri thiosulfat 0,1 N: Hòa tan 25,0 g natri thiosulfate và 0,2 g natri
carbonat trong nước khơng có carbon dioxyd vừa đủ 1000 ml.
- Dung dịch hồ tinh bột: Nghiền 1 g tinh bột với 5 ml nước, rồi vừa đổ vừa khuấy
vào 100 ml nước sôi. Đun sôi cho đến khi thu được chất lỏng chỉ hơi đục, pha trước khi
dùng.

13


Thiết bị sử dụng
Tủ cấy vô trùng Sanyo Clean Bench (Nhật), tủ ấm Memmert (Đức), máy lắc ổn
nhiệt Bio-shaker BR-300LF (Nhật), bể điều nhiệt (Hàn Quốc), thiết bị ly tâm Hettich
(Đức).
2.2. Nội dung nghiên cứu
Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh
acid kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae.
 Tiến hành lên men sản xuất acid kojic với các nguồn carbon khác nhau: glucose,
saccarose, maltose, tinh bột; đánh giá ảnh hưởng của nguồn carbon tới lượng acid
kojic sinh ra.
 Tiến hành lên men sản xuất acid kojic với các nguồn nitơ khác nhau: pepton, cao
nấm men, (NH4)2SO4 và (NH4)2SO4 kết hợp với cao nấm men; đánh giá ảnh
hưởng của nguồn nitơ tới lượng acid kojic sinh ra.
Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến khả năng sinh acid kojic
của nấm mốc Aspergillus oryzae
 Tiến hành lên men sản xuất acid kojic với các điều kiện pH khác nhau:
- Không điều chỉnh pH trong quá trình lên men.
- Giữ pH 5,5 trong 2-3 ngày đầu, sau đó cố định bằng 2,5 cho tới khi kết thúc
quá trình lên men
- Cố định pH môi trường bằng 2,5 từ đầu cho tới khi kết thúc quá trình lên men.
 Đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường lên men tới lượng acid kojic sinh ra.

2.3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp giữ giống
Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng giữ giống với thành phần như mục 2.1.1. Lấy
một vòng que cấy từ khuẩn lạc nấm mốc trong ống giống, cấy thành một đường thẳng
lên bề mặt thạch, sao cho đường cấy đều, không bị đứt quãng. Thao tác thực hiện trong
tủ cấy vô trùng. Nuôi trong tủ ấm thường ở 30℃. Sau một khoảng thời gian nhất định
có được ống giống cần thiết. Bảo quản ống giống trong tủ lạnh 2℃ – 4℃.
Phương pháp nhân giống
Chuẩn bị 50 ml môi trường lỏng nhân giống với thành phần như mục 2.1.1. Lấy
một vòng que cấy từ khuẩn lạc nấm mốc trong ống giống, cấy vào môi trường đã chuẩn
bị ở trên. Thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Nuôi trong máy lắc ổn nhiệt ở 30℃,

14


tốc độ lắc 150 vòng/ phút trong 2-3 ngày. Kết thúc thời gian nhân giống, ly tâm thu lấy
sinh khối.
Phương pháp lên men thu acid kojic
Chuẩn bị 100 ml môi trường lỏng nuôi cấy với thành phần như mục 2.1.1. Lấy sinh
khối từ môi trường nhân giống, cấy vào môi trường đã chuẩn bị ở trên. Thao tác thực
hiện trong tủ cấy vô trùng. Nuôi trong máy lắc ổn nhiệt ở 30℃, tốc độ lắc 150 vòng/
phút trong 12 ngày. Kết thúc thời gian lên men, lọc lấy dịch để kết tinh acid kojic và xác
định lượng glucose đã được tiêu thụ.
Phương pháp tách chiết và tinh chế acid kojic từ dịch lên men
Acid kojic là sản phẩm ngoại bào nên sau khi lên men, tiến hành lọc loại sinh khối,
thu lấy dịch lọc. Cô cách thủy đến 20% - 25% thể tích. Để kết tinh lạnh ở 4℃ trong 24h,
lọc thu tinh thể. Sấy ở nhiệt độ 50℃ trong 12 giờ, thu được sản phẩm thô.
Acid kojic là một chất phân cực, tan trong ethanol, tiến hành tinh chế acid kojic từ
sản phẩm thơ bằng ethanol 96o. Hịa tan sản phẩm thô trong ethanol với nồng độ 4%,
đun cách thủy ở nhiệt độ 70℃ để giúp hòa tan. Lọc nóng trên phễu lọc Buchner, thu

dịch lọc, tiến hành cơ đến 20% - 25% thể tích. Để kết tinh lạnh, lọc thu tinh thể. Sấy
50℃ trong 12 giờ thu được acid kojic [7].
Phương pháp định tính bằng thuốc thử FeCl3 5%
Dịch lên men của các môi trường thu được, sau khi ly tâm lọc tách sinh khối thu
dịch lọc, mỗi môi trường được lấy khoảng 1 ml vào mỗi ống nghiệm khác nhau. Mỗi
ống nghiệm được nhỏ 1-2 giọt dung dịch FeCl3 3%. Lắc đều. Acid kojic có trong dịch
sau lên men sẽ phản ứng với ion Fe3+ tạo ra dung dịch màu đỏ [7].
Phương pháp Schoorl - Regenbogen định lượng đường khử
Lấy chính xác 5 ml dịch mơi trường lên men ban đầu khi chưa cấy giống cho vào
bình định mức 50 ml và lấy chính xác 5 ml dịch mơi trường lên men sau khi kết thúc
q trình lên men (đã lọc loại sinh khối) cho vào bình định mức 25 ml, pha loãng với
nước cất vừa đủ.
Lấy chính xác 5 ml dịch mơi trường đã pha lỗng ở trên cho vào bình nón 250 ml.
Thêm chính xác 10 ml dung dịch Fehling A, 10 ml dung dịch Fehling B. Thêm vừa đủ
nước cất để đạt tổng thể tích 50 ml. Đun sơi trong lị vi sóng 2 phút, làm nguội về nhiệt
độ phòng, thêm 3 g KI, lắc tan hoàn toàn. Thêm 10 ml dung dịch acid H2SO4 25%, I2

15


lập tức giải phóng cho dung dịch màu nâu. Chuẩn độ I2 giải phóng ra bằng dung dịch
Na2S2O3 0,1 N với chỉ thị dung dịch hồ tinh bột.
Mẫu trắng tiến hành làm tương tự nhưng thay dịch môi trường lên men bằng nước cất.
Hiệu số mililit giữa thể tích dung dịch Na2S2O3 0,1 N chuẩn độ cho mẫu trắng (V0) và
mẫu thử (V) cho ta số ml Na2S2O3 0,1 N tương ứng với lượng đường tiêu thụ cần xác
định. Tra bảng phụ lục tìm được lượng đường đó.
Tính tốn kết quả:
Thể tích Na2S2O3 cần thiết để định lượng mẫu trắng là Vt.
Thể tích Na2S2O3 cần thiết để định lượng mẫu khởi điểm là Vkđ.
Thể tích Na2S2O3 cần thiết để định lượng mẫu kết thúc là Vkt

Xác định ∆Vkđ (hoặc ∆Vkt) = Vt - Vkđ (hoặc Vkt) → tra bảng được x mg glucose tương
ứng
Lượng glucose/maltose trong mẫu khởi điểm hay kết thúc được tính theo cơng thức sau:
mglucose/maltose =

x∗V∗D
5∗1000

(g)

Trong đó: V là thể tích dịch lên men, D là độ pha loãng [5].
Phương pháp định lượng đường saccarose và tinh bột
Lấy chính xác 5 ml dịch mơi trường lên men ban đầu vào cốc có mỏ 100 ml và 5 ml
dịch lên men môi trường sau khi kết thúc vào cốc có mỏ 100 ml, thêm 20 ml nước cất
và 5 ml dung dịch HCl đậm đặc. Đun sôi dung dịch trong vịng 20 phút, lấy bình ra và
làm nguội. Trung hòa acid dư bằng dung dịch NaOH đến khoảng pH = 6,5 – 7 với chỉ
thị phenolphtalein. Sau đó chuyển dung dịch đã trung hịa vào bình định mức 50 ml,
thêm nước cất đến vạch và định lượng đường khử bằng phương pháp Schoorl –
Regenbogen (phương pháp 2.3.6).
 Hàm lượng saccarose tính theo cơng thức:
msaccarose = mglucose ∗ 0.95
Trong đó, 0.95 là hệ số chuyển từ glucose thành saccarose.
 Hàm lượng tinh bột tính theo cơng thức:
mtinh bột = mglucose ∗ 0.9
Trong đó, 0.9 là hệ số chuyển từ glucose thành tinh bột [6].

16


CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh acid
kojic của nấm mốc Aspergillus oryzae
Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon trong môi trường lên men đến khả năng
sinh acid kojic của Aspergillus oryzae


Mục tiêu: Đánh giá khả năng sinh acid kojic của Aspergillus oryzae trong các

môi trường lên men chứa các nguồn carbon khác nhau và lựa chọn nguồn carbon thích
hợp để sản xuất acid kojic.


Tiến hành: Nhân giống Aspergillus oryzae trong bình nón 250 ml có chứa 50

ml mơi trường với 4 mơi trường nhân giống chứa các nguồn carbon khác nhau tại bảng
3.1 dưới đây, điều kiện hơ hấp hiếu khí (tốc độ lắc 150 vòng/ phút) ở 30oC trong 2 – 3
ngày. Kết thúc thời gian nhân giống, ly tâm thu lấy sinh khối.
Lấy sinh khối từ môi trường nhân giống, lên men Aspergillus oryzae trong bình nón
250 ml có chứa 100 ml môi trường với 4 môi trường lên men AG, AS, AM, AT; điều
kiện hơ hấp hiếu khí (tốc độ lắc 150 vòng/ phút) ở 30oC trong 12 ngày. Trong đó AG,
AS, AM, AT là các mơi trường lên men chứa nguồn carbon khác nhau lần lượt là:
glucose, saccarose, maltose và tinh bột. Các môi trường này được sử dụng để so sánh
khả năng sinh tổng hợp acid kojic từ quá trình lên men nấm mốc Aspergillus oryzae khi
thay đổi nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy.
Kết thúc thời gian lên men, tiến hành tách chiết và tinh chế thu acid kojic, đồng thời
định lượng đường trong các mẫu dịch lọc. Xác định hàm lượng đường glucose, maltose
ban đầu và cịn lại đối với mơi trường lên men AG và AM theo phương pháp 2.3.6; xác
định hàm lượng đường saccarose, tinh bột ban đầu và còn lại đối với môi trường lên
men AS và AT theo phương pháp 2.3.7.

17