Nghiên cứu ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất rượu nếp trắng

Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
i
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
HUỲNH THỊ MỸ DUYÊN
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME α - AMYLASE
TRONG SẢN XUẤT RƯỢU NẾP TRẮNG
Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Cần Thơ, 2009
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
ii
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME α - AMYLASE
TRONG SẢN XUẤT RƯỢU NẾP TRẮNG
Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. Nguyễn Công Hà Huỳnh Thị Mỹ Duyên
MSSV: 2051625
Lớp: CNTP K31
Cần Thơ, 2009
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
iii
Luận văn tốt nghiệp kèm theo sau đây, với tựa đề là “NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG
ENZYME α-AMYLASE TRONG SẢN XUẤT RƯỢU NẾP TRẮNG”, do Huỳnh

Thị Mỹ Duyên thực hiện và báo cáo, đã được hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp
thông qua.
Giáo viên hướng dẫn
Nguyễn Công Hà
Cần Thơ, ngày tháng năm 2009
Chủ tịch hội đồng
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
iv
LỜI CAM ĐOAN
Luận văn này là công trình nghiên cứu của Thầy hướng dẫn và bản thân. Các thông
tin về số liệu, hình ảnh, kết quả đã được trình bày trong luận văn này là trung thực
và chưa từng được công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây.
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
v
LỜI CẢM TẠ
Xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến thầy Nguyễn Công Hà, người trực
tiếp hướng dẫn đề tài đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức quý báu
trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn tất cả quý thầy cô trường Đại Học Cần Thơ, đặc biệt là quý thầy
cô trong bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho
tôi trong suốt những năm học qua.
Chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm của bộ môn Công Nghệ Thực
Phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tất cả các bạn sinh viên Công Nghệ Thực Phẩm khóa 31
đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt khóa học cũng như trong thời gian thực hiện đề
tài này.
Chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày tháng năm 2009

Sinh viên thực hiện
Huỳnh Thị Mỹ Duyên
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
vi
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................... iv
LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................v
MỤC LỤC................................................................................................................ vi
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................ viii
DANH SÁCH HÌNH............................................................................................... ix
TÓM TẮT ..................................................................................................................x
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ......................................................................................1
1.1 ĐẶT VẦN ĐỀ...................................................................................................1
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU..............................................................................1
CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU................................................................2
2.1 GẠO NẾP..........................................................................................................2
2.1.1 Thành phần amylose và amylopectin.........................................................2
2.1.2 Khả năng hấp thụ và sự trương nở của tinh bột..........................................4
2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ hồ hóa tinh bột ...................................5
2.2 ENZYME AMYLASE.....................................................................................5
2.2.1  - amylase ( - 1,4 glucan - 4 - glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1).............6
2.2.2 β-amylase (α-1,4-glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2)...............................8
2.2.3  - amylase (

-
1,4 glucan- glucohydrolase, EC 3.2.1.3)......................9
2.2.4 Oligo-1,6- glucosidase..............................................................................10
2.2.5 Pullulanase ................................................................................................11
2.2.6 Transglucosidase.......................................................................................11

2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME ......................11
2.3.1 Nồng độ cơ chất........................................................................................11
2.3.2 Nồng độ enzyme ......................................................................................12
2.3.3 Nhiệt độ.....................................................................................................13
2.3.4 pH môi trường...........................................................................................14
2.3.5 Các chất kìm hãm .....................................................................................14
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
vii
2.3.6 Các chất hoạt hóa......................................................................................15
2.4 PHƯƠNG TRÌNH ĐỘNG HỌC – PHƯƠNG TRÌNH MICHALIS-MENTEN
...............................................................................................................................16
CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
......19
3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM .....................................................................19
3.1.1 Thời gian và địa điểm ...............................................................................19
3.1.2 Nguyên liệu...............................................................................................19
3.1.3 Hóa chất ....................................................................................................19
3.1.4 Dụng cụ.....................................................................................................19
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................19
3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM ...................................................................................20
3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định nhiệt độ, pH tối ưu của enzyme α-amylase trong
quá trình thủy phân nguyên liệu nếp trắng. .......................................................20
3.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định hằng số K
m
của enzyme α-amylase trong quá
trình thủy phân nguyên liệu nếp trắng. ..............................................................21
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................22
4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH ENZYME α-
AMYLASE THỦY PHÂN NGUYÊN LIỆU NẾP TRẮNG ................................22

4.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC CỦA ENZYME α-AMYLASE THỦY
PHÂN NGUYÊN LIỆU NẾP TRẮNG.................................................................26
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................30
5.1 KẾT LUẬN .....................................................................................................30
5.2 ĐỀ NGHỊ.........................................................................................................30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................31
PHỤ LỤC
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
viii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng Tên bảng Trang
2.1
2.2
2.3
4.1
4.2
A.1
B.1
B.2
B.3
Thành phần hóa học của nếp
Đặc điểm của α-amylase được trích ly từ các nguồn
khác nhau
Các đặc tính kỹ thuật của enzyme glucoamylase được
trích ly từ các loại nấm mốc khác nhau
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt
tính enzyme α-amylase đối với nguyên liệu nếp trắng
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nếp trắng lên hoạt
tính enzyme α-amylase

Bảng tra hàm lượng đường
Kết quả thí nghiệm xác định hằng số K
m
của enzyme α-
amylase trên tinh bột tinh khiết
Kết quả thí nghiệm khảo sát động học enzyme α-
amylase trên nếp than
Kết quả thí nghiệm khảo sát động học enzyme α-
amylase trên gạo
2
7
9
23
26
32
33
33
33
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
ix
DANH SÁCH HÌNH
Hình Tên hình Trang
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7

2.8
2.9
2.10
2.11
2.12
4.1
4.2
4.3
4.4
Quá trình hydrat hóa tinh bột trong nước
Cơ chế tác động của enzyme α-amylase trên tinh bột
Cơ chế tác dụng của γ-amylase lên phân tử tinh bột
Tổng quát quá trình thủy phân tinh bột của amylase
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ enzyme
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến thời gian phản ứng
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến thời gian phản ứng
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng enzyme
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phản ứng enzyme
Ảnh hưởng của pH môi trường đến tốc độ phản ứng
Ảnh hưởng của pH đến thời gian thủy phân của enzyme
Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt tính
enzyme α-amylase đối với nguyên liệu nếp trắng
Đồ thị Michaelis – Menten biễu diễn ảnh hưởng tỷ lệ nếp
trắng sử dụng đến hoạt tính của enzyme α-amylase
Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trình
thủy phân tinh bột nếp trắng và nếp than xúc tác bởi
enzyme α-amylase
Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc 1/V = 1/f([S]) của quá trình
thủy phân tinh bột tinh khiết xúc tác bởi enzyme α-amylase

4
8
10
11
12
12
12
12
13
13
13
13
24
26
27
28
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
x
TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme α-amylase trong sản xuất rượu nếp trắng” đã được
thực hiện với mục tiêu tìm ra pH và nhiệt độ tối thích cho enzyme α-amylase hoạt động
trên nếp trắng, xác định hằng số K
m
của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân nếp
trắng và so sánh với các nguyên liệu khác như tinh bột tinh khiết, gạo, nếp than.
Với mục tiêu đó, đề tài đã thực hiện các thí nghiệm và thu được kết quả như sau:
Trên nguyên liệu nếp trắng, nhiệt độ để enzyme α-amylase hoạt động mạnh nhất là 85
0
C

và pH tối thích của enzyme α-amylase có giá trị là 6,5. Trên các nguyên liệu khác nhau
như nếp trắng, gạo, nếp than và tinh bột tinh khiết, giá trị pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của
enzyme α-amylase không khác nhau do trong những nguyên liệu này không có thành phần
nào làm thay đổi điện tích bề mặt của enzyme hoặc làm biến tính protein trong enzyme.
Hằng số K
m
của enzyme α-amylase là 17,0755% và V
max
là 7,3926% trong 30 phút. Hợp
chất màu anthocyanine trong nếp than làm cho ái lực của enzyme α-amylase với nếp trắng
lớn hơn với nếp than. Tỷ lệ amylopectin trong nếp trắng nhiều hơn trong gạo làm cho độ
nhạy của enzyme α-amylase với nếp trắng nhỏ hơn với gạo. Tinh bột tinh khiết rất nhạy
đối với enzyme α-amylase nên K
m
của enzyme α-amylase trên nếp trắng (17,0755%) lớn
hơn rất nhiều so với tinh bột tinh khiết (0,7824%).
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
1
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU
1.1 ĐẶT VẦN ĐỀ
Ngày nay, khoa học càng hiện đại, xã hội càng phát triển thì nhu cầu cuộc sống của
con người càng được nâng cao. Con người đòi hỏi xã hội phục vụ cho nhu cầu của
mình phải tiến bộ hơn về mọi mặt cả về vật chất lẫn tinh thần, từ ăn uống, trang
phục, nhà ở đến vui chơi, giải trí… nhưng quan trọng nhất vẫn là vần đề ăn uống
hằng ngày. Trước kia, khi cuộc sống vật chất còn khó khăn con người chỉ cần ăn no,
mặc ấm nhưng ngày nay khi cuộc sống vật chất được cải thiện, con người đòi hỏi ăn
ngon, mặc đẹp, bữa ăn phải đầy đủ những chất dinh dưỡng cần thiết.
Không những thế, truyền thống dân tộc Việt Nam có nhiều những hội hè, đình
đám… Trong những dịp như thế, rượu là một thức uống không thể thiếu. Rượu là

một thức uống có cồn nên giúp dễ tiêu hóa để nâng cao sức khỏe hay để chúc mừng
trong những dịp lễ Tết, cưới xin… Các loại rượu vang nếu uống với liều lượng vừa
phải thì rất có lợi cho sức khỏe.
Nghề nấu rượu thủ công đã có từ xa xưa. Ngày nay, nghề nấu rượu đã rất phổ biến
có loại chưng cất và có loại không qua chưng cất. Các loại rượu ra đời ngày càng đa
dạng hơn và càng được ưa thích hơn như rượu nho, rượu nếp than, rượu gạo, rượu
nếp trắng… Rượu nếp trắng là một thức uống có cồn thường được sản xuất bằng
phương pháp truyền thống nên thời gian sản xuất ra rượu thường kéo dài.
Việc ứng dụng enzyme α-amylase vào quy trình sản xuất rượu nhằm rút ngắn thời
gian sản xuất cũng như giảm chi phí sản xuất là rất quan trọng nên đề tài “Nghiên
cứu ứng dụng enzyme α-amylase trong sản xuất rượu nếp trắng” cần được thực
hiện.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mỗi enzyme đều có những điều kiện hoạt động khác nhau như pH, nhiệt độ, nồng
độ cơ chất… Khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc rất lớn vào những điều kiện
này. Do đó, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme α-amylase trong sản xuất rượu
nếp trắng” được thực hiện hướng đến những mục tiêu chính như sau:
- Tìm ra nhiệt độ và pH tối thích cho enzyme α-amylase hoạt động tốt nhất
trên nguyên liệu nếp trắng.
- Xác định hằng số K
m
của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân nếp
trắng nhằm xác định ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (nếp trắng) lên hoạt tính
enzyme α-amylase.
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
2
CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 GẠO NẾP
Ngũ cốc là loại nguyên liệu chứa hàm lượng tinh bột rất cao phù hợp với ngành

công nghiệp sản xuất rượu. Trong đó, nếp trắng là một loại gạo với hàm lượng
tinh bột trên 70 % được sử dụng rộng rãi trong sản xuất rượu.
Trong phân tử tinh bột bao gồm hai thành phần: amylose và amylopectin. Hai
thành phần này khác hẳn về tính chất hóa học cũng như về tính chất vật lý. Ví dụ:
amylose tạo màu xanh với iod còn amylopectin cho màu tím đỏ, amylose dễ hòa
tan trong nước ấm và tạo nên dung dịch có độ nhớt không cao, còn amylopectin
chỉ hòa tan khi đun nóng và tạo nên dung dịch có độ nhớt cao.
Tinh bột là hỗn hợp của hai loại glucan là amylose và amylopectin. Hầu hết các
loại tinh bột đều chứa từ 20 ÷ 30 % amylose, tinh bột gạo nếp có thành phần gần
như 100 % amylopectin (Hoàng Kim Anh, 2007).
Bảng 2.1: Thành phần hóa học của nếp trắng
Thành phần Hàm lượng (%)
Nước 13
Protein 6.2
Lipid 1.6
Glucid 74
Tro 0.28
(Nguồn: BONS.LUH,1991)
2.1.1 Thành phần amylose và amylopectin
2.1.1.1 Amylose
Amylose là một polymer mạch thẳng cấu tạo từ D-glucose nhờ các liên kết α-1,4.
Quá trình thủy phân amylose có thể thực hiện bằng các enzyme α-amylse, β-
amylase, glucoamylase. Tuy nhiên do trong amylose cũng chứa khoảng 0,1% các
liên kết phân nhánh α-1,6 nên β-amylase không thể thủy phân amylose một cách
hoàn toàn. Trọng lượng phân tử của amylose trong khoảng 10
5
÷ 10
6
.
Độ hòa tan và tính lưu biến

Amylose thu được bằng phương pháp công nghiệp thường là sản phẩm thoái hóa
nên không hòa tan. Amylose mới tách ra từ tinh bột (bằng cách tạo phức với n-
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
3
butanol) ở dạng bột xốp khô, có thể hòa tan dễ dàng trong nước nóng đến nồng độ
15%. Amylose cũng có thể dễ dàng hòa tan trong dung dịch kiềm loãng, tại nồng độ
kiềm tối ưu. Ngoài ra, một số dung môi khác cũng hòa tan được amylose là
chloralhydrate, acid dichloacetic, acid formic, urea… trong đó dung môi tốt nhất là
dimethylsulphoxide. Do trọng lượng phân tử lớn và cấu hình mạch thẳng nên độ
nhớt của dung dịch amylose thu được cũng cao.
Dung dịch amylose rất dễ tạo keo, ngay cả ở nhiệt độ cao. Tốc độ tạo keo là hàm
của thời gian, nhiệt độ, pH, nồng độ và phương pháp hòa tan amylose. Trong dung
dịch amylose có khuynh hướng liên kết lại với nhau để tạo ra các tinh thể. Khi tốc
độ liên hợp là cực tiểu sẽ tạo ra khối không tan của các hạt đã thoái hóa, khi tốc độ
liên hợp là cực đại, dung dịch sẽ chuyển thành thể keo (Hoàng Kim Anh, 2007).
Phản ứng đặc trưng với Iodine
Khi tương tác với iod, amylose sẽ cho phức màu xanh đặc trưng. Iod được coi là
thuốc thử đặc hiệu để xác định hàm lượng amylose trong tinh bột bằng phương
pháp trắc quang. Tác nhân hoạt động trong trường hợp này là HI hoặc muối của
chúng. Trong phức amylose-iodine, các phân tử iodine sẽ chui vào trong vòng ưa
béo của xoắn amylose tạo thành một chuỗi các nguyên tử nằm cạnh nhau.
Phản ứng xảy ra với amylose khô dễ dàng hơn với amylose ướt. Nước chỉ có vai trò
tạo điều kiện hình thành vòng xoắn và tạo độ linh động cho phân tử amylose và
iodine.
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, mạch amylose chứa 200 gốc đường glucose có
khả năng gắn kết với iodine lớn nhất (khoảng 20% khối lượng) ở nhiệt độ 20
0
C.
Phức hợp này hấp thụ sóng mạnh nhất tại bước sóng 620nm cho màu xanh thẫm. Ái

lực của amylose với iodine phụ thuộc tuyến tính với chiều dài của mạch polymer.
Khi chiều dài mạch của amylose giảm, khả năng gắn của polymer với iodine và
bước sóng hấp thụ mạnh nhất cũng giảm (Hoàng Kim Anh, 2007).
2.1.1.2 Amylopectin
Amylopectin là một glucan phân nhánh; trong phân tử amylopectin, ngoài liên kết
α-1,4, tỷ lệ liên kết phân nhánh α-1,6 chiếm khoảng 4%. Trung bình mỗi nhánh của
amylopectin chứa khoảng 15 ÷ 30 gốc glucose. Cấu trúc tinh thể của tinh bột có liên
quan chặt chẽ đến thành phần amylopectin và khả năng tạo các chuỗi xoắn kép.
Amylopectin có phân tử lượng trong khoảng 10
7
đến 10
8
.
Amylopectin cũng có khả năng gắn kết nhất định với iodine. Ở nhiệt độ 20
0
C, khả
năng gắn của amylopectin với iodine chỉ khoảng 0,2% khối lượng và phức hợp với
iodine thể hiện hấp thụ mạnh nhất ở bước sóng 550 nm.
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
4
Quá trình thủy phân amylopectin cũng giống như quá trình thủy phân amylose. β-
amylase không thủy phân được các liên kết nhánh α-1,6, phần mạch nhánh còn sót
lại này được gọi là các dextrin giới hạn (limit dextrin).
Khi đun nóng trong nước, amylopectin tạo thành dung dịch trong, đặc, dính và có
độ nhớt cao. Khác với amylose, amylopectin không bị thoái hóa, khả năng tạo gel
cũng kém (trừ khi nồng độ rất cao). Tuy nhiên, dung dịch amylopectin bị giảm độ
nhớt rất nhanh trong môi trường acid, trong quá trình hấp tiệt trùng và khi chịu một
lực cắt lớn (Hoàng Kim Anh, 2007).
2.1.2 Khả năng hấp thụ và sự trương nở của tinh bột

2.1.2.1 Quá trình trương nở
Khi hòa tan tinh bột vào nước, đầu tiên các phân tử nước sẽ thâm nhập vào giữa các
các phân tử tinh bột có kích thước lớn và tương tác với các nhóm hoạt động của tinh
bột, tạo ra lớp vỏ nước và làm cho mắt xích nào đó của phân tử tinh bột bị yếu đi.
Kết quả, phân tử tinh bột bị “rão” ra rồi trương lên. Quá trình trương xảy ra không
hạn chế sẽ làm bung các phân tử tinh bột và hệ chuyển thành dạng dung dịch. Quá
trình trương luôn luôn đến trước quá trình hòa tan và đây là một quá trình phụ thuộc
điều kiện nhiệt độ bên ngoài (Hoàng Kim Anh, 2007).
2.1.2.2 Quá trình hấp thụ nước
Ở trạng thái tự nhiên, các phân tử tinh bột liên kết với nhau bằng liên kết hydro rất
bền. Ở nhiệt độ lạnh, tinh bột vẫn có thể hấp thụ nước một cách thuận nghịch nhưng
với một lượng rất nhỏ.
- Liên kết với nước kiểu 1:
Khi hấp thụ nước sẽ xảy ra sự hydrat hóa các nhóm hydroxy tự do và kết quả là tạo
thành liên kết hydro với nước theo kiểu 2.
- Liên kết với nước kiểu 2:
R
RO
O
H
H
R O
RO
H
H
H
H
O
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang

5
Nhiệt độ tăng làm đứt các liên kết kiểu 1, và làm khả năng hấp thụ nước tăng. Nhiệt
độ tăng cao quá sẽ làm đứt tiếp các liên kết hydro kiểu 2. Nói chung quá trình
hydrat hóa tinh bột trong nước gồm các giai đoạn sau:
Hình 2.1: Quá trình hydrat hóa tinh bột trong nước
Nhiệt độ để phá vỡ hạt, chuyển tinh bột từ trạng thái ban đầu có mức độ hydrat hóa
khác nhau thành dung dịch keo gọi là nhiệt độ hồ hóa. Các hạt tinh bột có kích
thước và nguồn gốc khác nhau cũng có nhiệt độ hồ hóa khác nhau. Các hạt nhỏ có
cấu tạo chặt, liên kết hydro kiểu 1 rất bền nên nhiệt độ hồ hóa các hạt nhỏ lớn hơn
các hạt lớn, vì thế nhiệt độ hồ hóa tinh bột (là hỗn hợp các hạt có kích thước khác
nhau) thường không phải là một điểm mà là một khoảng nhiệt độ. Trong quá trình
hồ hóa, độ nhớt tinh bột tăng dần đến điểm cực đại rồi giảm xuống (Hoàng Kim
Anh, 2007).
2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ hồ hóa tinh bột
Nhiệt độ hồ hóa phụ thuộc vào thành phần amylose và amylopectin. Các ion kim
loại liên kết với tinh bột cũng ảnh hưởng đến độ bền của liên kết hydro bên trong
phân tử tinh bột. Các chuỗi trong mạch tinh bột chứa các ion tích điện trái dấu sẽ
đẩy nhau làm lỏng lẻo cấu trúc tinh bột dẫn đến thay đổi nhiệt độ hồ hóa. Các muối
vô cơ ở nồng độ thấp phá hủy các liên kết hydro nên làm tăng khả năng hòa tan của
tinh bột, tuy nhiên ở nồng độ cao nó gây hiện tượng kết tủa tinh bột và giảm sự
hydrat hóa. Các chất không điện ly như đường, rượu cũng ảnh hưởng đến nhiệt độ
hồ hóa và làm cho nhiệt độ hồ hóa tăng lên (Hoàng Kim Anh, 2007).
2.2 ENZYME AMYLASE
Amylase là một trong những hệ enzyme quan trọng nhất trong ngành công nghệ
sinh học hiện nay do có những ứng dụng hết sức rộng rãi trong công nghiệp thực
phẩm, dược phẩm, công nghệ lên men, công nghiệp dệt và công nghiệp giấy.
Amylase đầu tiên được sản xuất ở quy mô công nghiệp năm 1894, nó có nguồn gốc
từ nấm mốc và được sử dụng như một loại dược phẩm để chữa bệnh về tiêu hóa.
Ngày nay các amylase vi sinh vật đã thay thế thành công acid trong công nghiệp
thủy phân tinh bột. Amylase cũng được sử dụng rộng rãi để đường hóa trong công

nghiệp sản xuất rượu bia. Các amylase có độ tinh sạch cao và những tính chất phù
Hạt tinh
bột
Hấp thụ
nước qua vỏ
Ngưng tụ
nước lỏng
Hydrat hóa và
trương nở
Phá vỡ vỏ hạt đứt
liên kết các phân tử
Phân tán
Dung dịch
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
6
hợp có triển vọng to lớn trong công nghiệp dược phẩm và công nghiệp hóa chất tinh
khiết.
α-amylase, β-amylase, glucoamylase là những enzyme biến tính tinh bột quan trọng
nhất. α-amylase (endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase, EC 3.2.1.1) là loại enzyme
ngoại bào thủy phân liên kết 1,4-α-D-glucoside của phân tử amylose một cách ngẫu
nhiên. Đó cũng là những endo-enzyme phân cắt bên trong mạch tinh bột với sản
phẩm chính tạo thành là các dextrin. β-amylase (α-1,4-glucan maltohydrolase, EC
3.2.1.2) là một exo-enzyme thủy phân từ đầu không khử của mạch amylose,
amylopectin và glycogen, chúng cắt lần lượt các liên kết glucoside tạo ra maltose.
Do enzyme này không thủy phân được liên kết α-1,6 glucoside ở amylopectin nên
kết quả thủy phân cuối cùng thường gồm 50 ÷ 60% maltose và dextrin giới hạn.
Glucoamylase (α-1,4-glucan glucohydrolase EC 3.2.1.3) là enzyme thủy phân liên
kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ đầu không khử của mạch tinh bột tạo ra đường
glucose. Enzyme thủy phân liên kết α-1,6 glucoside trong phân tử amylopectin,

glycogen và những polymer khác như pullulanase, exopullulanase, isoamylase
thường được sử dụng kết hợp với β-amylase trong sản xuất siro hay đường glucose
với mục đích tăng hiệu suất thủy phân.
Trong sản xuất rượu người ta thường sử dụng enzyme α-amylase và glucoamylase.
2.2.1  - amylase ( - 1,4 glucan - 4 - glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)
 Đặc tính
α-amylase từ động vật và vi sinh vật được hoạt hóa bởi các ion hóa trị I như Cl
-
>
Br
-
> I
-
, α-amylase từ thực vật được hoạt hóa bởi các ion hóa trị II như Ca
2+
. α-
amylase bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Cu
2+
, Hg
2+
.
Ion Ca
2+
là một trong những thành phần quan trọng tham gia vào việc hình thành
và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme α-amylase. Đồng thời, nó còn có vai trò
quan trọng trong việc duy trì sự tồn tại của enzyme α-amylase khi bị tác động của
các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme thủy phân protein. Nếu
enzyme α-amylase bị mất ion Ca
2+
thì nó bị mất hoàn toàn khả năng thủy phân cơ

chất.
α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt. α-amylase bền
nhiệt hơn các amylase khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong
phân tử (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
7
Bảng 2.2: Đặc điểm của α-amylase được trích ly từ các nguồn khác nhau
STT Enzyme Nguồn
Khoảng pH tối
thích
Khoảng nhiệt
độ tối thích
(
0
C)
1 α-amylase vi khuẩn Bacillus subtilis
4,5 - 9
(6,5 - 7,5)
70 - 85
(95)
2
α-amylase vi khuẩn
chịu nhiệt
Bac. licheniformic
5,8 - 8
(7,0)
90 - 105
(120)
Aspergillus oryzae 4,0 - 7,0 55 - 60

3 α-amylase nấm sợi
Aspergillus niger 5,0 - 6,0 80
Dịch malt 3,5 - 6,5 70
4 α-amylase malt
Bột malt 4,5 - 7,0 85
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
α-amylase có nguồn gốc khác nhau có thành aicd amin khác nhau, mỗi loại α-
amylase có một tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng, khá giàu tyrosine, tryptophan,
acid glutamic và acid aspartic. Tâm hoạt động chứa các nhóm -COOH, -NH
2
. α-
amylase là một metaloenzyme, trong phân tử đều chứa từ 1 ÷ 30 nguyên tử gam
Ca/mol, song không ít hơn 1 ÷ 6 nguyên tử gam Ca/mol. Khi tách hoàn toàn Ca ra
khỏi enzyme thì α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất vì Ca tham gia vào
sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 2,3 của enzyme. Ngoài duy trì cấu hình hoạt
động của enzyme, Ca còn có tác dụng đảm bảo cho α-amylase có độ bền cực lớn
đối với tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzyme phân giải protein
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
 Cơ chế tác dụng
α-amylase có khả năng phân cắt liên kết -1,4 glycoside ở bất kỳ vị trí nào trên
mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó α-amylase được gọi là enzyme nội phân
(endoenzyme)
Quá trình th
ủ
y phân này trải qua nhiều giai
đ
oạn:
 Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số cơ chất bị thủy phân nhanh
tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh.
 Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp vừa được tạo

thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-, trimaltose. Các chất này bị thủy phân rất
Luận văn tốt nghiệp khóa 31 – 2009 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công Nghệ Thực Phẩm – Khoa NN & SHUD Trang
8
chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide.
Dưới tác dụng của α-amylase, amylose sẽ bị phân giải khá nhanh tạo thành
oligosaccharide. Các oligosaccharide này bị phân cắt tiếp tục tạo ra các sản phẩm
malttotetrose, matotriose, maltose. Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân
của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì α-amylase
không phân cắt được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh trong phân tử
amylopectin nên sản phẩm cuối cùng là 72% maltose, 19% glucose, các dextrin
phân tử thấp và các izomaltose 8% (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Dưới tác dụng của α-amylase, dung dịch hồ tinh bột sẽ bị làm loãng nhanh chóng
và các dextrin sẽ được tạo thành cho phản ứng màu với iodine hay cho màu đỏ
nâu. Do đó có thể xác định hoạt tính enzyme bằng cách đo độ nhớt của dung dịch
hồ tinh bột hoặc xác định lượng tinh bột đã bị phân giải dựa vào phản ứng màu với
iodine hoặc bằng cách xác định đường khử tạo thành (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
2.2.2 β-amylase (α-1,4-glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2)
 Đặc tính
Enzyme β-amylase là một loại albumin, tâm xúc tác của nó chứa gốc -SH, -
COOH, cùng với vòng amidazol, của các gốc histidine. Enzyme β-amylase chỉ phổ
biến trong thực vật, đặc biệt có nhiều trong các hạt nảy mầm. Trong vi khuẩn
không có β-amylase. Sự tồn tại β-amylase trong nấm mốc vẫn chưa xác định.
Enzyme β-amylase không bền khi có Ca
2+
, bị kìm hãm bởi kim loại nặng như
Cu
2+
, Hg

2+
, acetanic, iod, ozon. β-amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng
bền với acid hơn. Enzyme β-amylase bị vô hoạt ở 70
0
C. Nhiệt độ tối thích là 55
0
C
Hình 2.2