Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở việt nam TT

1

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
Tính cấp thiết của đề tài
Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong những cây trồng quan trọng trong
chương trình an ninh lương thực thế giới chỉ sau ngô, lúa mỳ và gạo. Theo thống kê của tổ
chức Nơng lương thế giới (FAOSTAT, 2019), diện tích khoai tây trên thế giới năm 2017 đạt
19,30 triệu ha, năng suất trung bình đạt 20,11 tấn/ha, với tổng sản lượng 388,2 triệu tấn.
Tại Việt Nam, khoai tây là cây trồng lý tưởng cho vụ Đông ở Đồng bằng Sông Hồng,
tuy nhiên diện tích trồng hiện nay của cả nước chỉ là 20.480 ha với năng suất 14,8 tấn/ha, sản
lượng 303 nghìn tấn (FAOSAT, 2017). Có nhiều ngun nhân cả về mặt kinh tế lẫn kỹ thuật
dẫn đến sự hạn chế phát triển khoai tây ở Việt Nam. Về mặt kinh tế, nguyên nhân chính là do
trồng khoai tây kém hiệu quả so với các cây trồng khác và đầu ra hạn chế. Về mặt kỹ thuật,
nguyên nhân chủ yếu là do hiện tượng thối hóa giống gây ra do virus. Bệnh virus hại khoai
tây rất phổ biến, dễ lan truyền thông qua môi giới truyền bệnh. Khoai tây được trồng và nhân
giống bằng củ, khi cây bị nhiễm virus toàn bộ củ cũng bị lây nhiễm. Đây chính là hiện tượng
thối hóa giống khoai tây gây ra do virus. Có nhiều loại virus hại khoai tây, trong đó PVY là một
trong 10 loại virus phổ biến gây tổn thất năng suất nghiêm trọng nhất trong các nước nhiệt đới
trồng khoai tây.
Việc sản xuất giống sạch virus phải qua nhiều công đoạn phức tạp như nuôi cấy mô
nguyên liệu sạch bệnh, nhân và trồng vật liệu trong điều kiện cách ly, sản xuất củ giống ở các
vùng chuyên sản xuất giống rất tốn kém. Trong các giải pháp khắc phục bệnh virus, có thể
nói biện pháp hiệu quả và có tính bền vững nhất là việc tạo và sử dụng giống kháng virus.
Phương pháp chọn tạo giống khoai tây kinh điển là phương pháp lai tạo. Phương pháp
này vấp phải những khó khăn về mặt di truyền do bộ NST của khoai tây là tứ bội (2n=4x=48).
Bộ genome tứ bội tạo ra tỷ lệ phân ly lớn sau lai tạo, quá trình chọn lọc gặp khó khăn với một
quần thể rất lớn trước khi tìm được một con lai có tính trạng mong muốn để phát triển thành
giống. Thông thường tạo ra một giống khoai tây mới thời gian chọn lọc đòi hỏi 10-12 năm.
Chuyển gen kháng bệnh, gen mang các tính trạng mong muốn vào cây trồng cũng đã và đang
được áp dụng trong chương trình chọn tạo giống của nhiều cây trồng. Cơng nghệ này có thể
rút ngắn thời gian chọn tạo giống khoai tây so với phương pháp chọn tạo giống kinh điển.

Tuy nhiên, do những lo ngại về an toàn sinh học của các thể GMO nên hiện nay kỹ thuật
chuyển gen đang là vấn đề còn nhiều tranh luận. Trước bối cảnh này, việc sử dụng kỹ thuật
dung hợp tế bào trần để có thể chuyển và tích hợp các gen mong muốn nổi lên như một giải
pháp có tính khả thi cao. Dung hợp tế bào trần trong tạo giống khoai tây đã được Wenzel et
al., vào năm 1979 trải qua hơn 40 năm phát triển, kỹ thuật này đang ngày một hoàn thiện. Với
kỹ thuật này có thể i) tạo ra các con lai soma có thể duy trì những tính trạng mong muốn cho
đời sau và là nguồn vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống, ii) chuyển 1 gen hoặc tích
hợp nhiều gen từ các vật liệu dung hợp, iii) tái tổ hợp được genome nhân tế bào và tế bào
chất, iv) tránh được những luật lệ liên quan đến chuyển gen.
Nhằm góp phần nghiên cứu tạo giống khoai tây mang tính kháng bệnh virus PVY, đề
tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng
virus PVY ở Việt Nam” đã được thực hiện.
Mục tiêu của đề tài
Ứng dụng thành công kỹ thuật tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần, xác định
con lai soma, chọn lọc con lai backcross (BC) để tạo nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ chọn
tạo giống khoai tây kháng virus PVY có đặc tính nơng sinh học mong muốn.
Ý nghĩa khoa học của đề tài
Đề tài đã chứng minh và góp phần khẳng định khả năng duy trì tính kháng virus và cải
thiện đặc tính nơng sinh học của các dịng nhị bội qua dung hợp tế bào trần và khả năng


2

chuyển đặc tính kháng bệnh virus PVY từ các lồi khoai tây dại Solanum tarnii, Solanum
pinatisectum, Solanum bulbocastanum sang khoai tây trồng tứ bội Solanum tuberosum khi
dung hợp tế bào trần. Con lai soma có thể làm vật liệu khởi đầu trong công tác chọn tạo giống
khoai tây kháng bệnh virus và mang đặc tính nơng sinh học mong muốn. Đây là những dẫn
liệu khoa học quý, mới mẻ phục vụ nghiên cứu, giảng dạy công nghệ tế bào thực vật, công
nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài luận án đã tạo ra các dòng khoai tây 47/7, 47/26, 81-2,
131/11 là sản phẩm dung hợp của hai dòng nhị bội Solanum tuberosum và các dòng BC1
13.1300.3; BC1 13.1305.6 là sản phẩm lai lại của con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây
trồng. Các dòng này vừa có khả năng kháng bệnh virus, vừa mang các đặc tính nơng sinh học
q có thể sử dụng cho chương trình tạo giống khoai tây kháng virus có năng suất cao, phẩm
chất tốt. Ngoài ra, đề tài cũng hình thành được quy trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus
PVY, mang được những đặc tính nơng sinh học mong muốn thông qua việc sử dụng kỹ thuật
dung hợp tế bào trần.
Những đóng góp mới của đề tài
•
Khẳng định được các thông số tách, nuôi cấy, dung hợp, tái sinh, xác định con lai
soma phục vụ cho các nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần trên
các vật liệu khoai tây nhị bội (A15, A16, A56, B186, B208), khoai tây dại (S. tarnii, S.
pinatisectum, S. bulbocastanum) và khoai tây tứ bội (Rasant, Delikat, Atlantic).
•
Chứng minh và góp phần khẳng định được khả năng duy trì tính kháng bệnh virus
PVY từ các dịng nhị bội của khoai tây trồng Solanum tuberosum và khả năng chuyển đặc
tính kháng bệnh virus từ các lồi khoai tây dại S. tarnii, S. pinatisectum, S, bulbocastanum
sang khoai tây trồng tứ bội Solanum tuberosum qua dung hợp tế bào trần.
•
Đã tạo ra các dòng khoai tây 47/7, 47/26, 81-2, 131/11 là sản phẩm dung hợp của
hai dòng nhị bội Solanum tuberosum và các dòng BC1 13.1300.3; BC1 13.1305.6 là sản phẩm
lai lại của con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng. Các dịng này vừa có khả năng
kháng bệnh virus PVY vừa mang các đặc tính nơng sinh học q có thể sử dụng cho chương
trình tạo giống khoai tây kháng virus PVY có năng suất cao, phẩm chất tốt.
NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Phần Tổng quan tài liệu tập hợp tất cả các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các
vấn đề: tình hình sản xuất khoai tây; tìm hiểu về virus hại cây khoai tây và các hướng khắc
phục; các phương pháp chọn tạo giống khoai tây kháng virus.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Bảng 2.1. Các vật liệu đã thu thập, nguồn gốc, độ bội và các tính trạng
mong muốn phục vụ cho lai soma
Solanum
pinnatisectum

Dạng
vật liệu
Khoai
tây dại

Solanum tarnii

Khoai tây dại

Solanum
bulbocastanum
Atlantic
Delikat
Rasant
A15

Khoai
tây dại
Khoai tây trồng
Khoai tây trồng
Khoai tây trồng
Dòng nhị bội

Kiểu gen

Ký
hiệu

Độ
bội

pnt2G

2x

trn3G

2x

blb2G

2x
4x
4x
4x
2x

Nguồn gốc (Ngân hàng
gen, công ty, Viện NC)
Ngân hàng gen Khoai tây
quốc tế IPK, Đức
Ngân hàng gen Khoai tây
quốc tế IPK, Đức

Ngân hàng gen Khoai tây
quốc tế IPK, Đức
Mỹ
Công Ty NORIKA, Đức
Công Ty NORIKA, Đức
Viện nghiên cứu tài nguyên

Các tính trạng mục tiêu
cho chọn tạo giống
Kháng PVY, mốc sương
Kháng PVY, mốc sương
Kháng PVY, mốc sương
Năng suất, chất lượng
Năng suất, chất lượng
Năng suất, chất lượng
Kháng PVY, PVX


3
Kiểu gen

Dạng
vật liệu

Ký
hiệu

Độ
bội

A16

Dòng nhị bội

2x

A56

Dòng nhị bội

2x

B186

Dòng nhị bội

2x

B208

Dòng nhị bội

2x

Nguồn gốc (Ngân hàng
gen, công ty, Viện NC)
cây trồng-Bavaria – Đức
Viện nghiên cứu tài nguyên
cây trồng-Bavaria- Đức
Viện nghiên cứu tài nguyên

cây trồng-Bavaria – Đức
Viện nghiên cứu tài nguyên
cây trồng-Bavaria - Đức
Viện nghiên cứu tài nguyên
cây trồng-Bavaria - Đức

Các tính trạng mục tiêu
cho chọn tạo giống
Kháng PVY
Kháng PVY, PVX
Kháng PVY, PVX
Kháng PVY, PVX

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nội dung 1: Xác định các thơng số tối ưu cho q trình dung hợp khoai tây từ các
nguyên liệu nhị bội, tứ bội và khoai tây dại
2.2.2. Nội dung 2: Xác định và đánh giá các thể lai soma của các tổ hợp dung hợp khoai
tây nhị bội
2.2.3. Nội dung 3: Xác định các thể lai soma của các tổ hợp dung hợp giữa khoai tây dại
nhị bội và khoai tây trồng tứ bội. Đánh giá khả năng kháng PVY của chúng
2.2.4. Nội dung 4: Đánh giá con lai backcross (BC1) của thể lai soma (khoai tây dại và
khoai tây trồng) với khoai tây trồng
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tách tế bào trần
Theo quy trình E.C.Cooking (1960) cải tiến theo Thach et al. (1993) và Thieme (1997)
2.3.2. Dung hợp tế bào trần
•
Trộn huyền phù tế bào trần của 2 dòng bố mẹ theo tỷ lệ 1:1
•
Sử dụng máy xung điện (electrofusion machine) của cơng ty Krϋss, Đức. Đặt buồng dung

hợp vào dưới kính hiển vi trong một tủ cấy vô trùng; hút 400 µm hỗn hợp tế bào trần trong dung
dịch dung hợp (Fusion Solution) vào buồng xung điện.
•
Khởi động máy xung điện với các thơng số như sau:
Trường AC
Xung
Lần xung Trước-AC-Sau
V
kHz
V
µs
No
s
s
s
0,0
800-1000 120 10-15 2
2,0
10
20
Khi bật AC
18-20
800
120 10
2
2,0
10
20
•
Sau một pha cực nhanh theo một chương trình đã được cài đặt sẵn, dưới tác dụng của

luồng xung điện, các tế bào trần kết hợp với nhau (có thể quan sát được dưới kính hiển vi),
khi chương trình ngừng lại, dùng pipet hút dịch tế bào trần vào đĩa petri (Ø = 3,5 cm) và bổ
sung 1,8 ml môi trường nuôi: VKM II hoặc VKM II + BSA; quấn parafilm rồi đem nuôi cấy
ở điều kiện 250C và tối.
2.3.3. Xác định con lai bằng đếm độ bội flow cytometry
Phương pháp đánh giá độ bội bằng máy Cell Lab QuantaTM Flow cytometry theo
phương pháp của Viện nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (CHLB Đức).
2.3.4. Chiết tách DNA tổng số
DNA tổng số của các mẫu được tách từ lá theo phương pháp CTAB cải tiến theo.
2.3.5. Xác định con lai bằng sinh học phân tử
Khi sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi SSR không thể hiện sự đa hình giữa bố mẹ và con
lai của chúng, tiếp tục sử dụng phản ứng SSR có gắn huỳnh quang (Biomers net GMbD cung


4

cấp) và sử dụng hệ thống GenomeLab GeXP 8800 Beckman GenomeLab Coulters) để phân
tích kết quả.
2.3.6. Lây nhiễm nhân tạo PVY
Phương pháp lây nhiễm nhân tạo virus PVY theo mô tả của Kado (1972) và Hill (1984)
2.3.7. Kiểm tra gen kháng PVY của các con lai soma bằng chỉ thị phân tử
Tính kháng bệnh virus PVY của các con lai soma được đánh giá bằng phương pháp
chỉ thị phân tử CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic sequences).
2.3.8. Đánh giá các đặc tính nơng sinh học
Trong điều kiện chậu vại: Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hồn tồn (RCB)
với 9 cây/lần lặp, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Trên điều kiện đồng ruộng: Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn
(RCB) với 3 lần nhắc lại, diện tích mỗi ơ thí nghiệm 30 m2.
2.3.9. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh.
Phương pháp định lượng đường khử (phương pháp iod-Ixekutz); Phương pháp định

lượng tinh bột; Phương pháp xác định hàm lượng chất khô.
2.3.10. Lai lại (backcross) giữa một số tổ hợp khoai tây có triển vọng với khoai tây trồng.
Thu hạt phấn của khoai tây trồng (dòng bố) → Khử đực các dòng nhận phấn (dòng
mẹ) → Thụ phấn → Bảo quản quả lai và thu hạt lai.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định các thông số tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần giữa các dòng khoai tây
nhị bội, khoai tây dại và khoai tây trồng
3.1.1. Nghiên cứu các thông số tách tế bào trần của các dòng khoai tây nhị bội, khoai tây
dại, khoai tây trồng phục vụ cho dung hợp tế bào trần
3.1.1.1 Ảnh hưởng của dung dịch enzyme khác nhau đến hiệu suất tách tế bào trần
Các dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại và khoai tây trồng khác nhau sẽ có cấu tạo thành
phần mơ và vách tế bào khác nhau. Vì vậy, việc xác định loại dung dịch enzyme có tỷ lệ
enzyme phân giải cellulose và pectine phù hợp với từng dòng để cho hiệu suất tế bào trần thu
được tối đa là rất cần thiết. Các kết quả thí nghiệm được thể hiện trên Bảng 3.1:
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng đội macerozyme và cellulase trong dung dịch enzyme đến mật độ tế
bào trần của các dòng khoai tây nhị bội (Tế bào trần/ml môi trường)
Dung dịch enzyme
Tên dòng

Dạng vật liệu

A15
A16
A56
B186
B208
pnt2G
trn3G
blb2G
Delikat

Rasant
Atlantic

Nhị bội
Nhị bội
Nhị bội
Nhị bội
Nhị bội
Khoai tây dại
Khoai tây dại
Khoai tây dại
Khoai tây trồng
Khoai tây trồng
Khoai tây trồng

E1
(TB x105/ml)
3,69 ± 0,24
4,12 ± 0,16
1,09 ± 0,05
3,60 ± 0,16
3,55 ± 0,08
1,61 ± 0,11
3,73 ± 0,08
3,65 ± 0,09
2,86 ± 0,12
3,80 ± 0,05
0,92 ± 0,05

E2

(TB x105/ml)
2,54 ± 0,09
1,15 ± 0,07
1,59 ± 0,09
2,35 ± 0,11
1,07 ± 0,04
3,12 ± 0,09
1,62 ± 0,10
1,52 ± 0,04
3,01 ± 0,11
1,91 ± 0,11
1,24 ± 0,06

E3
(TB x105/ml)
0,55 ± 0,05
2,65 ± 0,09
2,95 ± 0,05
0,68 ± 0,05
0,43 ± 0,02
0,86 ± 0,04
1,04 ± 0,06
1,01 ± 0,07
1,14 ± 0,09
0,78 ± 0,01
2,81 ± 0,08

Ghi chú: Dung dịch enzyme 1: 0,2% Macerozyme, 0,8% Cellulase
Dung dịch enzyme 2: 0,2% Macerozyme, 0,6% Cellulase
Dung dịch enzyme 3: 0,1% Macerozyme, 0,8% Cellulase

Dung dịch enzyme 4: 0,1% Macerozyme, 0,6% Cellulase

E4
(TB x105/ml)
0,12 ± 0,01
0,35 ± 0,03
0,74 ± 0,05
0,22 ± 0,01
0,10 ± 0,00
1,21 ± 0,04
0,34 ± 0,01
0,33 ± 0,01
0,10 ± 0,00
0,10 ± 0,00
1,11 ± 0,08


5

Từ kết quả Bảng 3.1 cho thấy: Các loại dung dịch enzyme khác nhau có ảnh hưởng
khác nhau đến hiệu quả tách tế bào trần. Để tách tế bào trần có hiệu suất cao nhất, mỗi dịng
khoai tây nhị bội cần một loại dung dịch enzyme phù hợp.
3.1.1.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzyme đến hiệu suất tách tế bào
trần
Các kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzyme có ảnh
hưởng rõ rệt đến kết quả tách tế bào trần. Thí nghiệm đã tiến hành ủ các mẫu lá ở các thời
gian ủ trong dung dịch enzyme khác nhau dao động trong khoảng 13-16h.
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ trong dung dịch enzyme đến mật độ tế bào trần thu được
Thời gian
Dòng

A15
A16
A56
B186
B208
pnt2G
trn3G
blb2G
Delikat
Rasant
Atlantic

13h
(TB x105/ml)
1,44 ± 0,06
1,09 ± 0,04
1,24 ± 0,03
2,45 ± 0,05
2,08 ± 0,05
0,52 ± 0,01
1,01 ± 0,04
1,24 ± 0,04
1,24 ± 0,03
3,18 ± 0,04
1,92 ± 0,02

14h
(TB x105/ml)
2,86 ± 0,05

2,93 ± 0,03
2,98 ± 0,02
4,56 ± 0,04
4,38 ± 0,05
1,74 ± 0,03
2,33 ± 0,04
2,63 ± 0,05
2,84 ± 0,04
4,13 ± 0,10
2,52 ± 0,04

15h
(TB x105/ml)
3,39 ± 0,11
4,01 ± 0,06
3,40 ± 0,12
3,81 ± 0,07
3,95 ± 0,06
2,81 ± 0,06
3,62 ± 0,12
3,43 ± 0,11
3,55 ± 0,05
3,83 ± 0,07
3, 59 ± 0,04

16h
(TB x105/ml)
2, 61 ± 0,05
3,45 ± 0,05
3,35 ± 0,07

2,76 ± 0,12
2,54 ± 0,10
3,46 ± 0,15
2,91 ± 0,08
2,41 ± 0,09
3,04 ± 0,07
2,83 ± 0,16
2,77 ± 0,10

Kết quả cho thấy, thời gian ủ mô lá trong dung dịch enzym có ảnh hưởng rõ rệt đến
kết quả tách tế bào trần, thời gian ủ thích hợp với các dịng dao động từ 15 ±1 giờ.
Thời gian ủ thích hợp cho các mơ lá của các dịng khác nhau là khác nhau.
3.1.1.3. Ảnh hưởng của tuổi cây in vitro đến mật độ tế bào trần thu được từ mẫu lá
Các dịng được nhân in vitro trên mơi trường MS (Murashige and Skoog 1962) sau đó được
tách tế bào trần ở các độ tuổi khác nhau (2 tuần, 3 tuần, 4 tuần, 5 tuần). Kết quả như sau:
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tuổi cây in vitro đến mật độ tế bào trần thu được từ mẫu lá
Tuổi cây
Dòng
A15
A16
A56
B186
B208
pnt2G
trn3G
blb2G
Delikat
Rasant
Atlantic

2 tuần
(TB x105/ml)

3 tuần
(TB x105/ml)

4 tuần
(TB x105/ml)

5 tuần
(TB x105/ml)

0,14 ± 0,02
1,59 ± 0,04
0,34 ± 0,02
0,85 ± 0,03
0,28 ± 0,02
0,47 ± 0,01
0,47 ± 0,01
0,28 ± 0,01
1,95 ± 0,03
1,28 ± 0,02
1,26 ± 0,04

3,69 ± 0,02
4,12 ± 0,06
2,95 ± 0,03
3,60 ± 0,09
3,55 ± 0,09
2,54 ± 0,20

2,98 ± 0,10
2,99 ± 0,10
2,60 ± 0,12
2,59 ± 0,28
2,94 ± 0,13

3,39 ± 0,08
4,01 ± 0,07
3,40 ± 0,03
2,91 ± 0,05
3, 94 ± 0,07
3,27 ± 0,05
3,48 ± 0,02
3,74 ± 0,08
3,91 ± 0,07
3,14 ± 0,04
4,02 ± 0,27

2,45 ± 0,06
2,01 ± 0,07
1,55 ± 0,04
1,87 ± 0,02
2,06 ± 0,04
2,14 ± 0,10
2,55 ± 0,22
2,72 ± 0,12
2,37 ± 0,07
2,02 ± 0,05
2,09 ± 0,03

Kết quả cho thấy: lá từ cây có thời gian ni cấy in vitro khác nhau có ảnh hưởng rõ
rệt đến hiệu quả tạo tế bào trần. Độ tuổi lá của cây in vitro thích hợp nhất để tách tế bào trần
cho tất cả các dòng là 3 - 4 tuần tuổi.
3.1.2. Xác định các thông số dung hợp tế bào trần
3.1.2.1 Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung điện đến chất lượng tế bào sau dung hợp
Do có nhiều tổ hợp lai nên khối lượng công việc là lớn và thu được nhiều kết. Trong
khuôn khổ thời gian cho phép, luận án đã chọn ra 2 tổ hợp lai từ các tổ hợp bố mẹ nhị bội là
B186 (+) B208 và tổ hợp lai khoai tây dại và khoai tây trồng trn3G (+) Delikat để trình bày.


6

Tiến hành dung hợp tế bào trần ở mật độ 3x 105 tế bào/ml, chất lượng tế bào thu được sau
xung được thể hiện qua Bảng 3.4:
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần tạo xung điện đến khả năng tạo mô sẹo của tổ
hợp B186 (+) B208 và tổ hợp trn3G (+) Delikat
STT

CT

1
2
3
4

CT1
CT2
CT3
CT4

1
2
3
4

CT1
CT2
CT3
CT4

Thời gian tế
Thời gian xuất hiện
bào phân chia (ngày)
microcallus (ngày)
Tổ hợp B186 (+) B208
3
29,8
2
18,9
4
22,5
4
28,3
Tổ hợp trn3G (+) Delikat
5
27,3
2
18,2
4
28,7

4
30,3

Số lượng
macrocallus/đĩa
21,5
73,4
37,6
29,2
19,5
70,8
24,6
28,8

Chú thích: CT1: 700 kHz + 2 lần xung; CT2: 800 kHz + 2 lần xung;
CT3: 900 kHz + 2 lần xung; CT4: 1000KHz + 1 lần xung
Từ kết quả Bảng 3.4 cho thấy: tần số và số lần xung hợp ảnh hưởng rõ rệt đến chất lượng
tế bào sau dung hợp. Với thông số 800 kHz và 2 lần xung là thích hợp nhất cho dung hợp xung
điện trên đối tượng là các dòng khoai tây nhị bội và giữa khoai tây dại và khoai tây trồng.
3.1.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ ion Ca2+ của dịch dung hợp tới hiệu suất dung hợp
Ion Ca2+ là ion dẫn truyền điện tích và là ion khơng thể thiếu được trong quá trình
dung hợp bằng xung điện. Ion Ca2+ giúp tế bào xếp thành hàng, giúp cho hiệu suất dung hợp
tế bào cao hơn. Kết quả nghiên cứu được thể hiện qua Bảng 3.5:
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ Ca2+ đến khả năng kết dính thành hàng của tế bào trong quá
trình dung hợp (tế bào/hàng) và khả năng tế bào phân chia sau dung hợp.
STT

Tổ hợp lai
-5

1
2

CT1 (10 )
Tế
Thời
bào/hàng
gian
phân
chia
(ngày)
B186 (+) B208
3,1
5
Trn3G(+)Delikat
3,7
4

Nồng độ Ca2+ (M)
CT2 (10-4)
CT3 (10-3)
Tế
Thời
Tế
Thời
bào/hàng
gian
bào/hàng
gian
phân

phân
chia
chia
(ngày)
(ngày)
14,2
3
21,7
3
13,6
3
21,6
3

CT4 (10-2)
Tế
Thời
bào/hàng
gian
phân
chia
(ngày)
10,2
4
10,8
5

Qua Bảng 3.5 cho thấy nồng độ của Ca2+ có ảnh hưởng rõ rệt đến sự tạo hàng của tế
bào trong quá trình dung hợp xung điện. Số tế bào/ hàng tăng khi tăng nồng độ Ca2+ tăng 105
M đến 10-3 M trong dung dịch dung hợp.

3.1.2.3 Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến hiệu suất dung hợp
Tiến hành thí nghiệm dung hợp xung điện tế bào ở mật độ khác nhau để xác đinh mật
độ thích hợp nhất. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của mật độ protoplast đến kết quả dung hợp của tổ hợp nhị bội B186 (+)
B208
Mật độ
xung hợp
(tế
bào/ml)
1 x 105
2 x 105
3 x 105

Thời
gian
phân
chia
(ngày)
3
2
2

Số
macrocallus/
đĩa*

Số cây
tái sinh**

Tỷ lệ cây 2x

(%)

Tỷ lệ cây 4x
(%)

Tỷ lệ cây
hỗn bội (%)

28,5 ± 0,3
75,7 ± 1,5
85,6 ± 0,6

16 ± 1,0
35 ± 3,8
46 ± 1,7

56,25 ± 1,5
37,14 ± 0,6
13,88 ± 0,1

25,00 ± 1.5
34,29 ± 0,9
45,65 ± 0,7

18,75 ± 2,9
28,57 ± 1,5
40,47 ± 0,8


7

4 x 105
5 x 105

2
2

68,3 ± 1,0
62,6 ± 1,0

47 ± 3,1
29 ± 2,0

14,90 ± 0,6
10,31 ± 0,5

31,91 ± 1,0
24,13 ± 2,0

53,19 ± 0,4
65,56 ± 2,4

Chú thích: *sau 8 tuần ni cấy trên môi trường Cul-medium, **sau 2-3 tháng nuôi cấy trên
môi trường RJM

Từ kết quả Bảng 3.6 cho thấy: mật độ ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian bắt đầu phân chia
tế bào và tỷ lệ con lai tứ bội tạo thành. Mật độ tế bào tối ưu nhất để tạo cây tứ bội là 3x 105 tế
bào/ ml.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của mật độ protoplast đến kết quả dung hợp bằng xung điện của tổ hợp khoai
tây dại và khoai tây trồng Trn3G (+) Delikat
Mật độ

dung hợp
(tế
bào/ml)

Thời
gian
phân
chia
(ngày)

Số
macrocallus/đĩa
Sau 4 tuần

Số cây
tái sinh
Sau 8 tuần

1 x 105

3

32,5 ± 0,5

21 ± 1,2

2 x 105
3 x 105
4 x 105
5 x 105

2
2
2
2

65,7 ± 0,8
74,6 ± 0,6
88,3 ± 0,5
72,6 ± 0,8

55 ± 1,5
66 ± 2,0
81 ± 0,6
68 ± 2,3

Tỷ lệ cây
2x (%)

Tỷ lệ
cây 4x
(%)

Tỷ lệ
cây 6x
(%)

Tỷ lệ
cây hỗn
bội (%)

25,3 ± 0,9

45,0 ± 1,0

14,4 ± 1,2

16,2 ± 1,4
10,3 ± 0,7
2,3 ± 0,4
0,0 ± 0,0

30,9 ± 1,0
10,6 ± 0,1
9,6 ± 0,4
10,8 ± 0,2

32,3 ± 1,4
58,4 ± 1,6
61,9 ± 0,8
48,2 ± 1,5

15,3 ±
1,6
20,7 ±1,8
20,7 ±1,4
26,2 ±0,7
41,0 ±1,7

Như vậy mật độ tế bào tối ưu cho hiệu quả dung hợp tạo con lai 4x là 3 x 105 tế bào/ml;

con lai 6x là 4 x 105 tế bào/ml.
3.1.3. Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp
3.1.3.1. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy lỏng sau dung hợp đến sự phân chia và tái
sinh microcallus của các tổ hợp lai sau dung hợp
Tế bào trần của các tổ hợp lai sau khi dung hợp được nuôi cấy trên các loại môi trường
lỏng khác nhau: môi trường VKM II (Thieme et al., 1997), Medium A* (Ehsanpour et al.,
2001), KM8P* (Paula Conde et al., 2006) được trình bày ở bảng
Bảng 3.8. Sự phân chia của các tổ hợp lai nhị bội và tổ hợp lai giữa khoai tây dại và khoai tây
trồng trên các môi trường nuôi cấy khác nhau
Môi
trường
VKM II
A*
KM8P*

Thời gian xuất hiện tế
bào phân chia (ngày)

Thời gian xuất hiện
microcallus (ngày)

Số lượng microcallus
trung bình/đĩa petri

trn3G(+)Delikat

B186(+)B208

trn3G(+)Delikat

B186(+)B208

trn3G(+)Delikat

B186(+)B208

2
9
5

3
7
6

12
21
-

18
28

35,7
5,8
-

33,8
4,7

Chú thích: - là tế bào không phân chia
Như vậy, môi trường VKM II là mơi trường thích hợp để ni cấy tạo microcallus của

tế bào trần sau khi dung hợp.
3.1.3.2. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh chồi của các tổ hợp lai
Các tổ hợp lai sau khi dung hợp phân chia tạo microcallus trên môi trường lỏng VKM
II sau 3-4 tuần nuôi cấy, được chuyển sang nuôi cấy trong các đĩa peptri lớn ( 9cm), chứa
môi trường rắn Cul-medium (Moller et al, 1992) đặt trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng, cường
độ ánh sáng 4000 lux và nhiệt độ 210C để tạo macrocallus. Sau 3-8 tuần, chuyển các
macrocallus vào môi trường tái sinh khác nhau. Thí nghiệm theo dõi 10 đĩa petri/tổ hợp lai,
mỗi đĩa petri cấy 10 macrocallus. Mỗi callus chỉ lấy 1 chồi đầu tiên và lấy số lượng chồi trung
bình/đĩa. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai
Tổ hợp lai

Số lượng chồi tái sinh/chất lượng chồi
Môi trường RJM
Môi trường MSO
Môi trường K8P


8
B186 (+) B208
7,4/++
2,6/+
0,0/
trn3G (+) Delikat
8,4/++
0,0/
1,8/Chú thích: (-) Chồi yếu, màu trắng; (+) Chồi phát triển trung bình, màu vàng nhạt; (++) chồi tốt, mập, xanh

Từ kết quả Bảng 3.9 cho thấy mơi trường khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tái
sinh tạo chồi của các tổ hợp lai. Môi trường tối ưu để tạo chồi của cả 2 tổ hợp lai là RJM.

Kết luận: Từ các thí nghiệm dung hợp, tái sinh đã khẳng định được các thông số tối ưu sau:
+ Tần số dung hợp số 800 kHz và 2 lần xung.
+ Nồng độ Ca2+ trong dung dịch dung hợp xung điện thích hợp nhất là 10-3 M.
+ Mật độ tế bào dung hợp thích hợp với tổ hợp khoai tây nhị bội là 3 x 105 tế bào/ml; với tổ
hợp khoai tây dại và khoai tây trồng 4 x 105 tế bào/ml.
+ Các tế bào sau dung hợp được nôi cấy trên môi trường VKM II để tạo microcallus và tái
sinh trên môi trường RJM.
3.2. Xác định và đánh giá các thể lai soma của tổ hợp dung hợp khoai tây nhị bội (2n = 2x)
3.2.1. Tạo con lai
Có 10 tổ hợp lai được tạo thành từ các nguyên liệu nhị bội chọn lọc (A15, A16, A56,
B186, B208). Tuy nhiên, khả năng tái sinh của các tổ hợp này không đồng đều. Trong khuôn
khổ thời gian cho phép, luận án trình bày kết quả 3 tổ hợp lai có khả năng sinh trưởng, phát
triển tốt nhất để báo cáo. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.10
Bảng 3.10. Kết quả dung hợp, nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai nhị bội sau dung hợp
TT
Tổ hợp lai
1
2
3

Sự tái sinh các tổ hợp lai
Số lượng callus đem tái sinh
Số lượng cây
cây (callus)
tái sinh (cây)
1026 ± 11,4
25 ± 1,5
375 ± 8,1
53 ± 3,2
175 ± 9,6

25 ± 2,1
1576
103

Tỷ lệ tái sinh
cây (%)
2,43
14,13
14,28
6,54

A15 (+) A56
A16 (+) B186
B186 (+) B208
Tổng
Kết quả tái sinh của các Bảng 3.10 cho thấy tỷ lệ tái sinh thành cây phụ thuộc vào các

tổ hợp genotype khác nhau. Tổ hợp B186 (+) B208 có tỷ lệ tái sinh cây/ callus cao nhất đạt
25 cây/ 175 callus đem tái sinh đạt 14,28%; tổ hợp A15 (+) A56 có tỷ lệ tái sinh cây/ callus
thấp nhất, đạt 2,43%. Từ 1576 callus của 3 tổ hợp dung hợp đem tái sinh cây thu được 103
cây, đạt tỷ lệ tái sinh trung bình là 6,54%.
Các con lai ngẫu nhiên có thể là đồng hợp nhân (homozygous) hoặc dị hợp nhân
(heterozygous). Một khâu quan trọng tiếp theo của kỹ thuật lai soma là phải chọn lọc được
chính xác có kiểu gen dị hợp nhân. Nghiên cứu này thực hiện các phương pháp xác định khác
nhau để từ một quần thể cây lai tái sinh tìm ra con lai soma và từ đó cung cấp nguồn vật liệu
quan trọng cho công tác chọn tạo giống khoai tây.
3.2.2. Xác định độ bội thể của cây tái sinh
Sử dụng máy Flow cytometry để đo độ bội của các con lai. Kết quả được thể hiện trên
Bảng 3.11, Hình 3.6.
Bảng 3.11. Kết quả xác định độ bội các con lai sau dung hợp

Tổ hợp lai
A15 (+) A56
A16 (+) B186
B186 (+) B208
Tổng

Số cây tái sinh
(dòng)
25 ± 0,6
53 ± 1,7
25 ± 1,2
103

Cây nhị bội (cây) Cây tứ bội (cây) Cây hỗn bội (cây)
7 ± 0,6
15 ± 1,0
5 ± 0,6
27

13 ± 0,6
17 ± 1,0
20 ± 0,6
60

5 ± 0,6
21 ± 1,7
0±0
26

Kết quả Bảng 3.11 cho thấy: trong 103 chồi tái sinh từ callus của 3 tổ hợp lai thì tỷ lệ
các cây lai có độ bội 2n = 4x đạt 60 cây (chiếm 58,3%). Trong 3 tổ hợp dung hợp thì tổ hợp
B186 (+) B208 có tỷ lệ con lai tứ bội cao nhất, đạt 80%.
Tỷ lệ con lai có độ bội 2n=4x thu được chiếm đa số, đạt 58,3% so với tổng số cây tái sinh.


9

Mẫu đối chứng chuẩn (2n=2x)

Dòng bố mẹ (2n=2x)

Con lai lục bội (2n=6x)
Con lai tứ bội (2n=4x)
Hình 3.6. Hình ảnh độ bội của dòng khoai tây “bố mẹ” và con lai

Sử dụng máy flow cytometry đã xác định được 60/103 dòng là con lai tứ bội. Tuy nhiên, đây
chỉ là kết quả bước đầu trong việc khẳng định con lai soma sau dung hợp. Các con lai tứ bội
có thể được tạo thành do 2 tế bào trần của cùng một dịng “bố” hoặc “mẹ” dung hợp tạo thành,
tức là khơng phải là con lai có kiểu gen dị hợp nhân. Chính vì thế cần xác định chính xác con
lai soma bằng phương pháp dùng chỉ thị phân tử.
3.2.3. Xác định con lai soma bằng chỉ thị phân tử
Kết quả xác định con lai soma với mồi STM 3023 bằng hệ thống
GenomeLab GeXP 8800 được thể hiện ở Bảng 3.12
Bảng 3.12. Kết quả xác định con lai soma của các tổ hợp dung hợp
Tổ hợp lai
A15 (+) A56
A16 (+) B186
B186 (+) B208
Tổng

Số cây tứ bội (2n= 4x) (cây)
13
17
20
60

Số cây lai soma (cây)
12
8
16
36

Tỷ lệ cây lai soma (%)
92,31
47,06
80,00
60

Kết quả Bảng 3.12 cho thấy trong tổng số 60 cây tứ bội có 36 cây tái sinh là con lai dị hợp
nhân chiếm 60%. Tổ hợp A15 (+) A56 có 13/60 cây là cây tứ bội nhưng lại là tổ hợp có 12/13
cây là cây lai soma, chiếm tỷ lệ cao nhất (92,31%) trong tổ hợp dung hợp. Một lượng lớn cây
tứ bội tái sinh nhưng lại không phải là cây lai soma, chúng là kết quả của sự dung hợp giữa
hai tế bào trần của cùng dòng “bố” hoặc dòng “mẹ”.


10

Hình 3.9. Xác định con lai soma của tổ hợp B186(+)B208 với cặp mồi STM 3023
Hình 3.9 biểu thị kích thước của các alen của dòng “bố”, dòng “mẹ” và dòng con lai soma

được phát hiện bằng hệ thống điện di mao quản này với mồi STM 3023. Có thể nhận thấy
kích thước các alen của dịng nhị bội “bố mẹ” chỉ hơn kém nhau hai cặp base: tổ hợp B186
(+)B208 cho kết quả các dòng “bố mẹ” cũng chỉ hơn kém nhau hai cặp base và các con lai
soma được xác định cũng có các peak có kích thước alen tương tự với peak của “bố mẹ”.


11

3.2.4. Đánh giá phẩm chất củ của các của các con lai soma trong điều kiện chậu vại
Trong nội dung chọn lọc con lai, đã chọn lọc được 36 con lai dị hợp tử tetraploid (4x).
Tuy nhiên, khi tách dòng và đánh giá chọn lọc trong điều kiện in vitro chỉ có 15 dịng của một
số tổ hợp cho khả năng sinh trưởng phát triển tốt. Các dòng này được đánh giá phẩm chất củ
trong điều kiện chậu vại. Các chỉ tiêu hóa sinh được thể hiện qua Bảng 3.13
Bảng 3.13. Một số chỉ tiêu hóa sinh của các dịng lai soma khoai tây và dịng ngun liệu
STT

Kí hiệu

1
2
3
4
5

A15
A16
A56
B186
B208

6
7
8
9
10

47/7
47/11
47/14
47/24
47/26

11

81-2

12
13
14
15
16
17
18
19
20

21-1
130/2
131/1
131/3

131/4
131/5
131/10
131/11
131/12

Hàm lượng chất khơ (%)

Đường khử (%)

Các dịng bố mẹ
20,52
0,25
17,41
0,25
20,13
0,18
18,31
0,21
17,70
0,20
Con lai của tổ hợp lai A15 (+) A56
20,47
0,14
20,11
0,45
20,35
0,13
20,23
0,18

22,78
0,13
Con lai của tổ hợp lai A16 (+) B186
20,06
0,15
Con lai của tổ hợp lai B208 (+) B186
20,57
0,19
20,81
0,25
16,62
0,39
15,97
0,22
20,85
0,27
19,78
0,42
14,03
0,56
20,91
0,14
20,02
0,41

Tinh bột (%)

94,88
88,45
94,43

88,69
87,63
92,97
95,18
92,14
90,01
96,95
97,46
90,35
96,68
86,40
89,04
92,76
92,52
88,24
97,42
95,90

Hàm lượng đường khử là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng của các giống
khoai tây chế biến. Chỉ tiêu này càng thấp thì càng tốt vì khi chế biến miếng khoai tây khơng
bị đổi màu và nâu hóa. Bên cạnh đó, hàm lượng tinh bột cũng là yếu tố rất được quan tâm.
Củ khoai tây có hàm lượng càng cao thì khi chế biến chip càng giịn, khó gãy, vỡ.
Kết luận: Như vậy qua đánh giá các tổ hợp lai, những con lai có củ phù hợp với hướng chế
biến khoai tây chip hiện nay là 47/7; 47/26; 81-2; 131/11. Đây là những dòng có triển vọng
về phẩm chất chế biến, cần tiếp tục đánh giá để phục vụ công tác chọn giống.
3.2.5. Kiểm tra sự có mặt của gen kháng trong các con lai soma từ vật liệu nhị bội
Trong nghiên cứu này sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Rysto là GP 122406 nhân
được đoạn DNA có kích thước 406 bp, sau dùng enzym EcoV để cắt. Kết quả được thể hiện
qua hình 3.10, 3.11:

12

Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu GP 122406 liên kết chặt với gen Rysto
trong bố mẹ nhị bội và con lai soma
Chú thích 1: A15; 2: A16; 3: A56; 4: B208; 5: B186;
6: 47/7; 7: 47/11; 8: 47/14; 9: 47/24; 10: 47/26; 11: 81-2; 12: 21-1; 13: 130/2;
14: 131/1; 15: 131/3; 16: 131,4; 17: 131/5; 18: 131/10; 19: 131/11; 20: 131/12

Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR được cắt với enzym cắt giới hạn EcoRV
Chú thích 1: A15; 2: A16; 3: A56; 4: B208; 5: B186;
6: 47/7; 7: 47/11; 8: 47/14; 9: 47/24; 10: 47/26; 11: 81-2; 12: 21-1; 13: 130/2;
14: 131/1; 15: 131/3; 16: 131,4; 17: 131/5; 18: 131/10; 19: 131/11; 20: 131/12

Từ các kết quả điện di hình 3.10 và 3.11 cho thấy tất cả các dịng bố mẹ và các dòng con lai
soma khoai tây đều chứa gen siêu kháng Rysto. Từ đây, có thể khẳng định rằng con lai soma
tạo ra bằng dung hợp tế bào trần có chứa gen kháng virus từ “bố mẹ” của chúng.
3.3. Xác định các thể lai soma của tổ hợp dung hợp giữa khoai tây dại (2n=2x) và khoai
tây trồng (2n = 4x). Đánh giá khả năng kháng virus PVY của chúng
Các dòng khoai tây dại và khoai tây trồng tách và tạo các tổ hợp dung hợp với các thông số
đã được xác định từ nội dung tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần của các dòng nghiên cứu.
Có 9 tổ hợp được kết hợp từ 3 dòng khoai tây dại và 3 dòng khoai tây trồng. Tuy nhiên, sau
q trình dung hợp, chỉ có 6 tổ hợp lai cho kết quả tái sinh tốt. Sáu tổ hợp lai này và tỷ lệ tái
sinh của các tổ hợp được thể hiện qua Bảng 3.14
Bảng 3.14. Kết quả nuôi cấy tái sinh chồi của các tổ hợp lai sau dung hợp
STT

Tên tổ hợp lai

Số lượng callus

tái sinh

Số lượng chồi
tái sinh

Tỷ lệ tái
sinh (%)

1
2

trn3G (+) Rasant
trn3G (+) Delikat

97
250

25
64

25,8
25,6

3
4
5

trn3G (+) Atlantic
pnt2G (+) Atlantic
pnt2G (+) Delikat

blb2G + Delikat

395
193
53
250

2
23
26
31

0,50
11,9
49,06
12,4


13
Tổng

1238

171

Từ Bảng 3.14 cho thấy các tổ hợp lai khác nhau thì khả năng tạo callus, tái sinh chồi cũng
khác nhau. Các tổ hợp lai trn3G (+) Delikat, pnt3G (+) Delikat, trn3G (+) Rasant có khả năng
tái sinh cao lần lượt là 49,06%, 25,6%, 25,8%. Các chồi này phát triển tốt. Các chồi này sẽ
được tách dịng, phân tích độ bội và sinh học phân tử để xác định con lai dị hợp tử.
3.3.1. Xác định con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng bằng đo độ bội thể

Sử dụng phương pháp phân tích độ bội thể Flow cytometry để đo độ bội của các con lai tái
sinh của 6 tổ hợp lai. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.15, Hình 3.13.
Bảng 3.15. Kết quả tái sinh và phân tích độ bội thể của các tổ hợp lai khoai tây dại và khoai tây
trồng sau dung hợp
Độ bội (dòng) 2n =
STT

Tên tổ hợp lai

Số lượng
chồi tái sinh

2x

4x

6x

Hỗn bội
(2n>6)

1
2
3
4
5
6

trn3G (+) Rasant
trn3G (+) Delikat

trn3G (+) Atlantic
pnt2G (+) Atlantic
pnt2G (+) Delikat
blb2G (+) Delikat
Tổng

64
25
2
23
26
31
171

13
0
0
5
5
0
23

5
3
1
9
10
14
42

25
20
0
9
11
15
80

21
2
1
0
0
2
26

Hình 3.12. Hình ảnh độ bội thể của dòng khoai tây “bố mẹ” và con lai
Chú thích: A- Giống khoai tây trồng (4x), B- Dòng khoai tây dại (2x), C- con lai soma lục bội (6x)

Kết quả cho thấy từ 171 chồi tái sinh sau dung hợp chỉ có 80 cây có độ bội 2n = 6x. Tỷ lệ cây
lục bội (2n = 6x) phụ thuộc vào các tổ hợp dung hợp khác nhau. Trong 6 tổ hợp dung hợp thì
tổ hợp lai trn3G (+) Delikat cho tỷ lệ cây tái sinh có độ bội 6x là cao nhất (20/25 dịng) trong
khi đó tổ hợp lai giữa trn3G (+) Atlantic không cho kết quả tạo con lai lục bội.
3.3.2. Xác định con lai soma giữa khoai tây dại, khoai tây trồng bằng chỉ thị phân tử SSR
Các con lai 6x được xác định bằng chỉ thị phân tử SSR (Dinu and Thieme, 2001), sử dụng
cặp mồi theo Song et al. (2005). Hình 3.13 minh họa kết quả điện di cho phân tích chỉ thị
SSR sử dụng cặp mồi STM2022 nhằm xác định kiểu gen dị hợp nhân của các dòng lục bội
của tổ hợp lai trn3G+ Rasant. 25 dịng con lai tái sinh có khả năng phát triển tốt khơng bị
biến dị của tổ hợp lai dịng dại trn3G và giống Rasant được phân tích có 6 con lai lục bội
có kiểu gen dị hợp nhân.

14
Hình 3.13. Kết quả điện di cho phân tích chỉ thị phân tử STM2022 để xác định kiểu gen dị hợp nhân của tổ
hợp lai trn3G (+) Rasant
Chú thích: giếng 1- trn3G; giếng 2- Rasant; giếng 3-27 là 25 dòng lai tái sinh của tổ hợp lai trn3G
(+) Rasant. Trong đó, có 6 con lai lục bội dị hợp nhân gồm: giếng 6- con lai, giếng 12- con lai, giếng
20: con lai, giếng 21- con lai, giếng 22- con lai, giếng 24- con lai.
Bảng 3.16. Kết quả sử dụng marker phân tử trong xác định con lai soma
Tổ hợp lai

trn3G (+) Rasant
trn3G (+) Delikat
trn3G (+) Atlantic
pnt2G (+) Atlantic
pnt2G (+) Delikat
blb2G (+) Delikat
Tổng

Số cây
xác định
độ bội
64
25
2
23
26
31
171

Số dòng
lục bội
(2n= 6x)
25
20
0
9
11
15
80

Số dòng lai
soma
(Hetezygous)
6
18
0
6
9
14
53

Tỷ lệ con
lai/dòng
tái sinh (%)
9.4
72.0
0.0
26.1
34.6

45.2

Tên mồi xác định
con lai
STM2022, STIIKA
STM2022
STM1104
STM3023
STM3023
STM2022

Kết quả Bảng 3.16 cho thấy trong số 171 con lai tái sinh có 80 con có độ bội 6x nhưng
chỉ có 53 con có kiểu gen dị hợp nhân.
3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen kháng PVY trong các con lai soma giữa khoai tây dại và
khoai tây trồng
Từ 53 con lai thu được ở trên, chọn lọc được 13 con lai dị hợp tử có khả năng sinh trưởng
phát triển tốt, không bị biến dị trong điều kiện in vitro. Các con lai này được kiểm tra sự có
mặt của gen kháng Rysto, sử dụng cặp mồi đặc hiệu GP 122406. Kết quả điện di kiểm tra sản
phẩm PCR của các mẫu phân tích với cặp mồi GP 122406 được thể hiện trên Hình 3.14.

Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi GP 122406 của ADN các con lai soma và các dòng
bố mẹ khoai tây dại và khoai tây trồng
Chú thích: Ladder, 1- pnt2; 2- trn3; 3- blb2G;
4- 838/11; 5- 851/2; 6- 2195/2; 7- 2196/4; 8-2235/1; 9- 2044/1; 10- 1/6; 11- 3/9; 12- 248/1; 132281/10; 14- 2283/5; 15- 2292/4; 16- 2295/1;
17- Delikat; 18- Rasant; 19- Atlantic

Kết quả điện di kiểm tra cho thấy toàn bộ các dịng khoai tây phân tích đều thu được
băng ADN có kích thước 406bp.
Sản phẩm PCR thu được trên được tinh sạch và tiếp tục ủ với enzyme giới hạn EcoRV,
sau đó điện di kiểm tra. Kết quả thể hiện qua hình 3.15.

15
Hình 3.15. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY của các dòng lai soma và dòng bố mẹ khoai tây
dại và khoai tây trồng

Chú thích: Ladder, 1- pnt2; 2- trn3; 3- blb2G; 4- 838/11; 5- 851/2; 6- 2195/2; 7- 2196/4; 82235/1; 9- 2044/1; 10- 1/6; 11- 3/9; 12- 248/1; 13- 2281/10; 14- 2283/5; 15- 2292/4; 162295/1; 17- Delikat; 18- Rasant; 19- Atlantic
Quan sát Hình 3.15 cho thấy sản phẩm ủ với EcoRV đều xuất hiện các vạch băng tương ứng
với kích thước 200bp và 206bp ở tất cả các giếng (từ giếng 1 – 16). Như vậy tất cả các mẫu
ADN của các các con lai đều có mặt gen kháng virus PVY. Điều đó đồng nghĩa với việc các
dòng lai soma đã được chuyển gen kháng bệnh từ dịng khoai tây dại thơng qua dung hợp.
3.3.4. Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây
trồng bằng lây nhiễm nhân tạo
Các con lai soma và bố mẹ của chúng được đánh giá khả năng kháng virus bằng lây nhiễm
nhân tạo. Kết quả lây nhiễm được kiểm tra bằng kit test DAS-ELISA.
Bảng 3.17. Kết quả mức độ kháng bệnh của các con lai 4x sau khi lây nhiễm nhân tạo
STT

Dòng

N/B

Tỷ lệ
nhiễm%

1

Atlantic

10/10

100

2

Delikat

10/10

100

12

2281/10

0/10

0

3

Rasant

10/10

100

13

2283/5

0/10

0

4

pnt2G

0/10

0

14

2292/4

0/10

0

5

trn3G

0/10

0

15

2295/1

0/10

0

6

blb2G

0/10

0

Con lai của tổ hợp trn 3G (+) Delikat

STT

Dòng

N/B

Tỷ lệ
nhiễm%

Con lai của tổ hợp blb2G+Delikat

Con lai của tổ hợp ptn2G (+) Rasant
16

2044/1

0/10

0

Con lai của tổ hợp trn3G (+) Rasant

7

838/11

0/10

0

8

851/2

0/10

0

17

1/6

0/10

0

9

2195/2

0/10

0

18

3/9

0/10

0

Con lai của tổ hợp pnt2G (+) Delikat

Con lai của tổ hợp pnt2G (+) Atlantic

10

2196/4

0/10

0

19

248/1

0/10

0

11

2235/1

0/10

0

ĐC

Thuốc lá

10/10

100

Kết quả đánh giá cho thấy tất cả các dòng lai soma và khoai tây dại (trn3G, pnt2G)
khơng bị nhiễm virus, trong khi đó các dịng khoai tây trồng (100%) đều bị nhiễm với PVY
sau khi lây nhiễm nhân tạo. Điều này chứng tỏ gen kháng virus trong khoai tây dại đã được
chuyển sang các dòng lai soma.
3.3.5. Đánh giá các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng về các tính trạng

nơng sinh học và phẩm chất củ
Cùng với khả năng kháng lại các bệnh hại thì khả năng sinh trưởng và phát triển của
cây cũng là chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng tới năng suất chất lượng khoai tây thu được khi
trồng. Đây là những dữ liệu quan trọng để các nhà chọn tạo giống xem xét để có thể đề xuất
các dịng triển vọng có thể làm giống.
Kết quả Bảng 3.18 cho thấy đa số các con lai tạo ra đều có hình thái tương tự với khoai tây
trồng (tuberosum) trừ các con lai 245/6 của tổ hợp lai pnt2G (+) Atlantic. Khả năng ra hoa
của các con lai soma cũng rất khác nhau. Đặc biệt, các con lai của tổ hợp blb2G (+) Delikat
đều có khả năng ra hoa cao đạt thang điểm đánh giá từ 5, 7, 9. Đây sẽ là những con lai có
triển vọng cho chọn tạo giống vì chỉ những con lai có khả năng ra hoa mới có thể tiếp tục lai
trở với khoai tây trồng để chọn tạo được những giống khoai tây mang đặc tính mong muốn.


16

Do các cây được trồng từ cây in vitro chuyển ra trồng trong điều kiện chậu vại nên các dòng
đạt năng suất, số củ/khóm và khối lượng củ/khóm đạt khơng cao.
Chỉ tiêu khối lượng trung bình củ/khóm (klc TB/khóm) là một yếu tố quan trọng để đánh giá
về năng suất của khoai tây trong điều kiện chậu vại. Từ kết quả Bảng 3.18 cho thấy chỉ có
một dịng lai soma 851/2 (185g/khóm) của tổ hợp trn3G (+) Delikat cho năng suất cao hơn
so với bố mẹ là khoai tây trồng ở ý nghĩa thống kê, trong khi đó các dịng soma khác đều cho
khối lượng củ/khóm thấp. Điều này có thể là do các dịng dại thường cho rất ít củ, trọng lượng
củ rất thấp, thậm chí một số dịng khơng có khả khăng ra củ nên các con lai soma được tạo ra
giữa khoai tây dại và khoai tây trồng thường cho trọng lượng trung bình thấp hơn khoai tây
trồng. Để cải thiện điều này, các dòng soma sẽ được lai lại với khoai tây trồng.
Qua quá trình đánh giá có một số một số con lai soma có xuất hiện các biến dị ở thân, lá, hoa
và củ (Hình 3.18). Nguyên nhân của hiện tượng này là do các con lai soma được tạo ra từ
phép lai dung hợp khác loài giữa khoai tây dại và khoai tây trồng. Các con lai xa sẽ mang một
số đặc điểm hình thái của khoai tây dại, các đặc điểm này khác với khoai tây trồng. Các biến
dị này sẽ mất đi khi được lai lại với khoai tây trồng. Các con lai tạo ra sau phép lai lại sẽ dần

có các tính trạng hình thái giống với khoai tây trồng mà khơng bị mất đi các tính trạng mong
muốn ở khoai tây dại.
A

A

B

C

Hình 3.18. Các biến dị ở con lai soma
Chú thích từ trái sang phải:
A: Hình thái cây của giống Atlantic, 248/1 và 245/6.
B: Hoa và nhị của Ransant và các con lai soma 1/6, 3/9 của tổ hợp lai trn3G và Rasant

C: Biến dị hình dạng củ của các con lai soma 1/6 và 3/9 của tổ hợp lai trn3G và Rasant.
Kêt luận:
- Đánh giá về khả năng kháng bệnh virus PVY qua lây nhiễm nhân tạo của các con lai soma
cho thấy các con lai soma đều có khả năng kháng bệnh virus PVY. Kết quả này khẳng định
rằng đã chuyển thành công gen kháng virus PVY từ khoai tây dại sang các dòng lai soma.
- Qua đánh giá về các đặc tính nơng sinh học cho thấy nhiều con lai soma có kiểu hình tương
đối giống với khoai tây trồng. Tuy nhiên, cũng tìm thấy một số biến dị ở một số con lai. Năng
suất của các con lai soma cũng thấp hơn khoai tây trồng là bố mẹ nên cần phải tiếp tục chọn
lọc và lai trở lại với các giống khoai tây trồng.


17

Klc TB/khóm
(gam)

Slc TB/khóm
(củ/khóm)

Độ sâu
mắt ngủ
1-9

Màu thịt
củ: 1-10

Màu vỏ
củ 1-8

Dạng củ
1-6
1=trịn, 6=dài

Khả năng
ra hoa
1-9
9=rất cao

Hình thái
cây/sức sinh
trưởng

Ký hiệu dịng

Tên giống

Bảng 3.18. Đánh giá các đặc tính nơng sinh học của các con lai soma trong điều kiện chậu vại

Atlantic
T,+++
7
2
2
2
3
3,9a±1,1
128,3a±19,12
Rasant
T,+++
b
b
Delikat
T,+++
4
3
2
3
3
8,03 ±2,25
169,6 ±18,2
S. tarnii
trn 3G
W,+
c
c

S. pinnatisectum
pnt2G
W,++
4
3
8
1
3
4,88 ±1,4
88,4 ±8,8
S. bulbocastanum
blb2G
W, ++
pnt2G (+) Atlantic
248/1
T,++
2
4
1
5
5,2d±1,2
108,9d±15,4
pnt2G(+) Rasant
2044/1
T,++
5
5
2
4
1

4,7e±2
151,1e±19,4
e
trn3G (+) Delikat
838/11
T, ++
2
4
2
3
5
4,56 ±1,5
102,2d±11,4
trn3G (+) Delikat
851/2
T, ++
2
5
4
3
5
4,89de±3,6
185,00f±8,3
trn3G (+) Delikat
2195/2
W,+++
9
2
2
3

3
2,2f±0,44
105,6d±14
de
pnt2G (+) Delikat
2196/4
T,+++
5
2
3
1
4,78 ±2,5
141,1g±17,9
pnt2G (+) Delikat
2235/1
T,+++
9
5
2
3
1
3,6a±0,13
97,6h±14,4
f
trn3G (+) Rasant
1/6
T, ++
5
8
4

5
2,67 ±2,5
98,3h±10
trn3G (+) Rasant
3/9
T,++
5
8
4
3
2,6f±2,56
125,6i±4,1
a
blb2G (+) Delikat
2281/10
T,+++
5
5
2
4
3
3,6 ±1,3
97,8h±14,4
blb2G (+) Delikat
2283/5
T,+++
9
3
2
3

3
4,4de±1,8
142,2g±2,94
blb2G (+) Delikat
2292/4
T,+++
7
3
2
3
5
4,3e±0,8
118,9i±6,4
f
blb2G (+) Delikat
2295/1
T,+++
7
5
2
3
3
2,6 ±0,3
106,1d±17,9
LSD0,05
0,47
7,39
CV%
7,6
4,7

Chú thích: (-) khơng xác định; (+)= yếu, (++)= Trung bình; (+++) = Khỏe; T = dạng khoai tây trồng, W= dạng dại, các chữ cái a, b,c… khác nhau
thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức α=0,05


18

3.4. Đánh giá con lai backcross (BC1) của thể lai soma (khoai tây dại và khoai tây trồng)
với khoai tây trồng
3.4.1. Lai hữu tính giữa các con lai soma (của khoai tây dại và khoai tây trồng) với các
giống khoai tây trồng và chọn lọc các con lai có đặc tính mong muốn
3.4.1.1. Chọn lọc các con lai
Con lai soma 6x được tạo ra từ tổ hợp khoai tây dại và khoai tây trồng thường mang nhiều
biến dị khác xa so với khoai tây trồng. Để tổ hợp được các đặc tính của khoai tây trồng vào
các con lai soma, các con lai soma này thường được lai lại với khoai tây trồng (sử dụng khoai
tây trồng làm bố). Lựa chọn 3 con lai có khả năng ra hoa cao nhất để làm cây mẹ. Các phép
lai hữu tính được tiến hành trên Sapa – Lào Cai vào năm 2016. Các hạt lai được gieo nảy và
tiếp tục được đánh giá, sàng lọc tính kháng PVY và các tính trạng nông sinh học. Kết quả lai
tạo được thể hiện qua Bảng 3.19.
Bảng 3.19. Kết quả lai hữu tính giữa các con lai soma và khoai tây trồng tứ bội
STT

Tổ hợp lai soma
(dòng mẹ)

Ký hiệu
dòng mẹ

Cây bố

Số quả

thu được

Số hạt thu
được

Ký hiệu

1
2
3

trn3G (+) Delikat
pnt2G (+) Delikat
trn3G (+) Delikat

2195/2
2235/1
2195/2

Rasant
Atlantic
Delikat

10
4
19

178
62
484

13.1300
13.1301
13.1302

4

blb2G (+) Delikat

2283/5

Delikat

18

352

13.1303

5

pnt2G (+) Delikat

2235/1

Delikat

21

738

13.1304

6

pnt2G (+) Delikat

2235/1

Rasant

23
95

284
2098

13.1305

Tổng

Kết quả lai hữu tính đã thu được 95 quả lai của 6 tổ hợp lai, đếm được tổng số 2098 hạt lai.
Một lượng lớn hạt lai đã được tạo ra, mỗi hạt lai sẽ là một dòng lai BC1 cần được đánh giá cả
về các đặc tính nơng sinh học cũng như tính kháng bệnh virus, nhằm đánh giá hiệu quả của
phương pháp chọn tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào kết hợp lai hữu tính.
3.4.1.2. Chọn lọc các con lai BC1 có khả năng kháng virus PVY
Để giảm tải công việc chọn lọc khi đánh giá một số lượng lớn hạt lai BC1 (2098 hạt) thì việc
sàng lọc tính kháng ở giai đoạn cây con là rất quan trọng. Sàng lọc những cây con sinh trưởng
phát triển yếu, khơng có khả năng kháng virus sẽ giúp cho việc theo dõi, đánh giá các thí
nghiệm tiếp theo được thuận lợi hơn. Các hạt lai BC1 sau khi được xử lý ngủ nghỉ với GA3

qua đêm được gieo trên nền giá thể mùn tơi xốp.
Bảng 3.20. Khả năng nảy mầm của hạt lai BC1
STT

Tổ hợp

1
2
3
4
5
6

trn3G (+) Delikat
pnt2G (+) Delikat
trn3G (+) Delikat
blb2G (+) Delikat
pnt2G (+) Delikat
pnt2G (+) Delikat

Dòng
“mẹ”
2195/2
2235/1
2195/2
2283/5
2235/1
2235/1
Tổng

Dòng
“bố”
Rasant
Atlantic
Delikat
Delikat
Delikat
Rasant

Ký hiệu
dòng lai
BC1 1300
BC1 1301
BC1 1302
BC1 1303
BC1 1304
BC1 1305

Số hạt
gieo
70
30
60
70
50
35
315

Số hạt nảy
mầm (hạt)

50
12
48
36
32
12
190

Số cây
khỏe
16
9
11
10
4
5
55

Khi cây có 2 lá thật, chuyển những cây sinh trưởng phát triển khỏe sang chậu vại để tiến hành
lây nhiễm nhân tạo với PVY. Sử dụng que thử nhanh virus của hãng Agdia để chọn lọc các
dịng sạch bệnh. Kết quả trình bày ở Bảng 3.21.
Bảng 3.21. Đánh giá khả năng kháng bệnh virus của con lai BC1 ở giai đoạn cây con.
Ký hiệu
dòng lai
BC1 1300
BC1 1301

Số cây
lây nhiễm
16

9

Số cây
sạch virus
6
3

Tỷ lệ
cây sạch virus
37,5
33,3


19
BC1 1302
BC1 1303
BC1 1304
BC1 1305
Tổng

11
10
4
5
55

9
4
2
2

26

81,8
40,0
50,0
40,0
47,3

Trong 55 dòng lai được lây nhiễm virus thì có 26 dịng khơng bị nhiễm bệnh đạt 47,3%. Hai
sáu dòng lai sạch bệnh này sẽ được tiếp tục theo dõi để chọn ra những dịng có tiềm năng
năng suất và các đặc tính nơng sinh học giống khoai tây trồng.
3.4.1.3. Chọn lọc các con lai BC1 có các đặc tính nơng sinh học mong muốn
Các dịng lai BC1 sau khi được chọn lọc kháng virus sẽ được chăm sóc, theo dõi các đặc tính
nơng sinh học để chọn lọc ra các dòng lai triển vọng để khảo nghiệm tiếp vụ sau.
Bảng 3.22. Bảng đánh giá hình thái và kiểu sinh trưởng của các con lai BC1

STT

Kí hiệu dòng

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
ĐC

BC1 1300.3
BC1 1300.6
BC1 1300.9
BC1 1300.13
BC1 1300.14
BC1 1300.16
BC1 1301.4
BC1 1301.5
BC1 1301.11
BC1 1302.1
BC1 1302.2
BC1 1302.3

BC1 1302.4
BC1 1302.5
BC1 1302.6
BC1 1302.7
BC1 1302.11
BC1 1302.10
BC1 1303.2
BC1 1303.3
BC1 1303.4
BC1 1303.6
BC1 1303.22
BC1 1304.1
BC1 1304.3
BC1 1305.6
Solara (ĐC)

Cấu trúc tán

Kiểu sinh trưởng

Hình thái/sức sinh trưởng

Trung gian
Dạng Lá
Dạng Lá
Trung gian
Trung gian
Dạng Lá
Dạng Thân
Trung gian

Dạng Thân
Dạng Thân
Dạng Thân
Trung gian
Dạng Thân
Dạng Thân
Trung gian
Trung gian
Trung gian
Dạng Thân
Trung gian
Trung gian
Dạng Lá
Trung gian
Dạng Lá
Trung gian
Trung gian
Dạng Thân
Trung gian

Đứng
Nửa đứng
Nửa đứng
Đứng
Nửa đứng
Nửa đứng
Đứng
Bò
Bò
Nửa đứng

Nửa đứng
Nửa đứng
Nửa đứng
Đứng
Nửa đứng
Nửa đứng
Nửa đứng
Đứng
Nửa đứng
Đứng
Bò
Đứng
Nửa đứng
Nửa đứng
Nửa đứng
Nửa đứng
Nửa đứng

T, +++
T, ++
T, +++
T, +++
T, +++
T, +++
T, +++
T, ++
T, ++
T, ++
T, +++
T, +++

T, +++
T, ++
T, +++
T, ++
T, +++
T, ++
T, +++
T, ++
T, +++
T, +++
T, +++
T, +++
T, +
T, +++
T, +++

Chú thích: T: dạng trồng; + yếu; ++ trung bình; +++ khỏe
Kết quả Bảng 3.22 cho thấy: Trong cùng một tổ hợp lai các dịng khác nhau có sự khác nhau
về cấu trúc tán và kiểu sinh trưởng của các dòng lai. Điều này là do sự phân ly của phép lai
hữu tính. Các dịng lai BC1 đều có sức sinh trưởng khá tốt, tương đương với khoai tây trồng
là Solara, ngoại trừ dòng BC1 1304.3. Dịng này mặc dù có kiểu hình giống với khoai tây
trồng, khơng cịn hình dạng giống với khoai tây dại nhưng sức sinh trưởng lại yếu.
Bảng 3.23. Bảng đánh giá năng suất và hình thái củ của các con lai BC1


20
STT

Kí hiệu

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26

BC1 1300.3
BC1 1300.6
BC1 1300.9

BC1 1300.13
BC1 1300.14
BC1 1300.16
BC1 1301.4
BC1 1301.5
BC1 1301.11
BC1 1302.1
BC1 1302.2
BC1 1302.3
BC1 1302.4
BC1 1302.5
BC1 1302.6
BC1 1302.7
BC1 1302.11
BC1 1302.10
BC1 1303.2
BC1 1303.3
BC1 1303.4
BC1 1303.6
BC1 1303.22
BC1 1304.1
BC1 1304.3
BC1 1305.6

slc/cây Kltbc/cây
(củ)
(gam)
7
8
11

11
16
3
5
7
7
6
13
11
6
8
5
9
9
12
4
18
7
12
5
5
20
5

130,4
120,8
120,1
60,8
50,8
190,8

170,1
150,7
130,4
120,1
70,1
60,8
140,8
120,8
150,1
100,7
90,8
50,2
180,1
60,5
150,3
100,4
180,1
150,6
50,4
140,1

Dạng củ

Màu vỏ
củ

Ovan dài
Vàng
Ovan
Tím

Ovan dài
Nâu đỏ
Ovan
Vàng
Ovan
Nâu đỏ
Ovan dài
Vàng
Trịn
Vàng
Ovan
Tím
Ovan
Tím đậm
Ovan dài
Kem nhạt
Ovan
Kem nhạt
Ovan
Nâu đỏ
Ovan ngắn
Nâu đỏ
Ovan dài
Nâu đỏ
Ovan
Nâu đỏ
Trịn
Vàng
Ovan
Vàng

Ovan
Vàng
Trịn
Kem nhạt
Ovan
Vàng
Ovan
Tím
Ovan
Đỏ một phần
Ovan
Vàng
Ovan
Vàng
Ovan
Vàng
Ovan
Vàng

Màu thịt
củ

Độ sâu
mắt ngủ

Vàng nhạt
Vàng TB
Kem
Kem
Vàng TB

Vàng nhạt
Vàng TB
Vàng nhạt
Vàng TB
Vàng nhạt
Vàng nhạt
Kem
Kem
Vàng nhạt
Vàng nhạt
Vàng TB
Vàng nhạt
Vàng nhạt
Kem
Vàng nhạt
Trắng kem
Vàng TB
Vàng nhạt
Vàng nhạt
Vàng nhạt
Vàng TB

Rất nơng
Sâu
Nơng
Nơng
Nơng
Nơng
Sâu
Trung bình

Trung bình
Nơng
Trung bình
Nơng
Trung bình
Nơng
Trung bình
Nơng
Trung bình
Nơng
Nơng
Nơng
Nơng
Trung bình
Rất sâu
Trung bình
Trung bình
Trung bình

Chú thích: slc/cây: số lượng củ/cây; kltbc/cây: khối lượng trung bình củ/cây

Số liệu Bảng 3.23 cho thấy các đặc điểm về hình dạng, màu sắc của vỏ củ, thịt củ hay độ sâu
mắt ngủ của các dòng con lai BC1 ngày càng hướng về giống trồng xác nhận.
Kết thúc vụ thanh lọc đánh giá các dòng lai BC1, kết quả đánh giá qua hai Bảng 3.22, 3.23
bước đầu đã chọn lọc được những dòng triển vọng nhất: tổ hợp 1300 thu được hai dòng
1300.3, 1300.6; tổ hợp 1301 thu được 3 dòng 1301.4, 1301.5, 1301.11; tổ hợp 1302 thu được
3 dòng: 1302.4, 1302.5, 1302.6; tổ hợp 1303 thu được 3 dòng: 1303.2, 1303.4, 1303.22; tổ
hợp 1304 thu được duy nhất dòng 1304.1; tổ hợp 1305 thu được một dòng 1305.6. Đây sẽ là
nguồn vật liệu được sử dụng đánh giá vụ sau.
3.4.1.4. Đánh giá các con lai BC1 sau thanh lọc

190 dòng nảy mầm từ 315 hạt lai đã được thanh lọc để chọn ra 26 dịng có khả năng sinh
trưởng phát triển tốt, đặc điểm nông sinh học giống với khoai tây trồng và sạch virus khi lây
nhiễm nhân tạo. Từ 26 dòng này tiếp tục được đánh giá về đặc điểm hình thái và thu được 13
dịng có thể phát triển thành dịng/giống tiếp. Củ của 13 dòng này được trồng trong điều kiện
chậu vại (giá thể sơ dừa) để tiếp tục chọn lọc các dòng triển vọng nhất.
Bảng 3.24. Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng/giống khoai tây khảo sát
STT

Dòng/giống

Số lá TB/cây

Chiều cao cây
TB (cm)

Số thân
TB/khóm

1

BC11300.3

19,36

86,10

5,8


21

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

BC1 1300.6
BC1 1301.4
BC1 1301.5
BC1 1301.11
BC1 1302.4
BC1 1302.5
BC1 1302.6
BC1 1303.2
BC1 1303.4
BC1 1303.22
BC1 1304.1
BC1 1305.6
Rasant

Delikat
Atlantic
Solara

17,53
16,57
19,56
18,23
18,26
17,16
14,34
15,48
20,37
19,59
17,23
19,51
20,37
22,48
20,67
21,13

82,11
80,27
94,32
89,26
90,12
87,56
87,93
82,59
89,68

93,12
84,10
92,21
97,63
92,28
95,12
91,10

5,0
4,0
4,5
4,4
5,0
5,1
5,0
5,5
5,7
5,1
4,9
6,0
5,2
4,5
5,5
5,0

Số liệu Bảng 3.24 cho thấy sự phát triển khá đồng đều giữa các dòng khảo sát và khá tương
đồng so với hai giống khoai tây trồng làm đối chứng
Bảng 3.25. Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng/giống khoai tây khảo sát
STT
1

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

Dòng/giống
BC1 1300.3
BC1 1300.6
BC1 1301.4
BC1 1301.5
BC1 1301.11
BC1 1302.4
BC1 1302.5
BC1 1302.6
BC1 1303.2
BC1 1303.4
BC1 1303.22
BC1 1304.1

BC1 1305.6
Rasant
Delikat
Atlantic
Solara (ĐC)

Phân Loại Củ (%)

Số củ TB/
khóm (củ)

Khối lượng TB/
khóm (gam)

Φ >5cm

3cm-Φ-5cm

Φ <3cm

8,2
6,7
7,3
8,0
6,3
4,7
7,0
7,3
6,7
5,3

7,3
6,3
8,7
5,3
8,7
8,0
9,0

642,0
440,0
464,7
540,0
386,7
286,7
236,3
316,7
253,3
434,7
420,0
386,7
552,6
486,7
634,0
443,3
616,7

42,4
10,3
22,5
44,5

10,4
25,9
5,6
8,3
18,7
43,0
36,6
18,5
35,8
38,5
28,8
27,5
20,4

34,5
55,5
51,8
39,6
59,5
32,6
34,6
38,2
38,9
38,1
44,8
49,8
39,3
34,6
46,6
44,2

54,6

14,1
34,2
25,7
15,9
30,1
41,5
59,8
53,5
42,4
18,9
18,6
31,7,7
24,9
26,9
24,6
28,3
25,0

Kết quả bảng 3.25 cho thấy số lượng củ trung bình trên khóm của các dịng BC1 so với
giống trồng khơng có sự sai khác q lớn, dao động chung từ 4 - 9 củ/khóm.
Qua các thí nghiệm đánh giá về sự sinh trưởng, phát triển, các yếu tố cấu thành năng
suất chất lượng giữa các dòng lai lại so với giống “bố” và giống trồng xác nhận bước đầu đã
chọn lọc được một số dòng triển vọng nhất: BC1 1300.3, 301.5, 1303.4, 1303.22 và 13.1305.6.
Các dòng này sẽ tiếp tục đánh giá ngoài đồng ruộng, kiểm tra gen kháng bằng chỉ thị phân tử
3.4.2. Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai BC1 triển vọng trên đồng ruộng và
kiểm gia sự có mặt của gen kháng PVY kháng bằng chỉ thị phân tử
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Rysto là GP
122406 nhân được đoạn ADN có kích thước 406 bp. Mẫu ADN tổng số của các vật liệu sau

tách chiết được chạy PCR với cặp mồi GP 122406. Một lượng nhỏ của sản phẩm chạy PCR


22

được lấy ra chạy điện di kiểm tra kết quả trước khi tiến hành ủ với enzyme EcoRV. Kết quả
điện di sản phẩm PCR được thể hiện trên Hình 3.20 dưới đây:

Hình 3.20. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY khi chạy cặp mồi GP 122406
Chú thích: 1- dòng 13.1300.3; 2- dòng 13.1301.5; 3- dòng 1303.4;
4- dòng 1303.22; 5- dòng 1305.6; 6- Atlantic; 7– Delikat; 8– Rasant

Sản phẩm PCR thu được ở trên được tinh sạch và tiếp tục ủ với enzyme giới hạn EcoRV, sau
đó điện di kiểm tra. Kết quả thể hiện trên bản điện di sau đây:

Hình 3.21. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY sau khi cắt bằng enzyme giới hạn EcoRV
Chú thích: 1- dịng 13.1300.3; 2- dịng 13.1301.5; 3- dòng 1303.4;
4- dòng 1303.22; 5- dòng 1305.6; 6- Atlantic; 7– Delikat; 8- Rasant

Như vậy có thể nhận thấy gen kháng bệnh virus được truyền từ dòng dại sang con lai
soma thông qua dung hợp tế bào. Các con lai soma được lai lại với giống trồng tạo con lai
BC1 và chúng duy trì gen kháng bệnh được truyền từ dịng khoai tây dại sang.
3.4.3. Khảo sát diện hẹp các dòng lai BC1 triển vọng trên đồng ruộng
Các dòng lai triển vọng lại được tiếp tục đánh giá chọn lọc trên điều kiện đồng ruộng
để đánh giá độ ổn định về hình thái, khả năng sinh trưởng và năng suất.
Bảng 3.26. Đặc tính nơng sinh học các dịng/giống khoai tây khảo sát trên điều kiện đồng ruộng
Dòng/gi
ống

Tỷ lệ

mọc %

Sức sinh
trưởng của cây

Độ đồng đều
giữa các khóm

Dạng
cây

Sơ thân/
khóm

Màu sắc lá

1300.3
1301.5

9
91

Trung bình
Kém

Trung bình
Trung bình

5,5
4,0

Xanh đậm
Xanh đậm

1303.4

93

Trung bình

Trung bình

5,5

Xanh đậm

1303.22

95

Trung bình

Trung bình

1305.6

97

Trung bình

Trung bình

Rasant

100

Trung bình

Trung bình

Delikat

100%

Trung bình

Trung bình

Đứng
Đứng
Nửa
đứng
Nửa
đứng
Nửa
đứng
Nửa
đứng
Nửa
đứng

100%

Trung bình

Trung bình

100%

Trung bình

Trung bình

Atlantic
(ĐC)
Solara
(ĐC)

4,5
6,0

Xanh trung
bình
Xanh trung
bình

5,0

Xanh đậm

4,5

Xanh đậm

Đứng

5,5

Xanh trung
bình

Đứng

5,0

Xanh đậm

Màu sắc
thân
Xanh tím
Xanh tím
Xanh
nhạt
Xanh
đậm
Xanh
đậm
Xanh
nhạt
Xanh

đậm
Xanh
đậm
Xanh
đậm


23

Theo Bảng 3.26, sự khác nhau lớn nhất nhận thấy ở dòng lai lại so với giống trồng và giống
sử dụng làm “bố” trong phép lai backcross chính là tỷ lệ mọc của củ giống được trồng trong
điều kiện vụ đông năm 2017 - 2018. Trong khi các giống trồng có tỷ lệ mọc đạt 100% thì các
dịng BC1 đạt tối đa là 97%, thấp nhất là dòng 1301.5 đạt 91%.
Về sức sinh trưởng và độ đồng đều giữa các khóm thì hầu hết các dịng lai lại đều tương
đương với các giống trồng, ở mức độ trung bình như nhau.
Bảng 3.27. Thời gian sinh trưởng qua các giai đoạn của các dòng/giống khoai tây
Dòng/giống

Thời gian từ
trồng đến mọc
(ngày)

BC1 1300.3
BC1 1301.5
BC1 1303.4
BC1 1303.22
BC1 1305.6
Rasant
Delikat
Atlantic (ĐC)

Solara (ĐC)

18
16
12
12
13
10
11
12
15

Thời gian từ
trồng đến hình
thành tia củ
(ngày)
28
26
24
23
25
23
22
25
24

Thời gian từ hình
thành tia củ đến thu
hoạch (ngày)

Tổng thời gian
sinh trưởng
(ngày)

66
67
67
75
62
87
88
68
62

112
109
103
110
100
120
121
105
101

Qua kết quả theo dõi ở Bảng 3.27 thì thời gian từ trồng tới mọc của các dịng/giống dao đồng
từ trong khoảng 10 - 18 ngày. Trong đó Rasant bắt đầu mọc sớm nhất (sau trồng 10 ngày).
Hai dòng 1300.3 và 1301.5 mọc chậm nhất (16 - 18 ngày), cịn lại thì mọc trong khoảng từ
11 - 15 ngày. Như vậy, trong khoảng thời gian sinh trưởng khoảng 4 tháng trồng khoai tây,
đã thu được một khối lượng sản phẩm lớn, có ý nghĩa và giá trị cao.
Theo số liệu trong Bảng 3.27, có thể nhận thấy sự tương đồng của các dòng lai lại so với các

giống trồng. Các số liệu này so với số liệu đánh giá vụ xuân năm 2017 ở Sapa cho thấy các
dòng BC1 vẫn giữ được các đặc điểm vượt trội về sinh trưởng, phát triển của các giống trồng
qua 2 lần đánh giá.
Các yếu tố hình thành năng suất, phẩm chất củ thu được của các dòng/giống khảo sát
Những dòng lai BC1 được trồng khảo sát cùng giống khoai tây trồng và các yếu tố cấu thành
nên năng suất. So sánh đồng thời các tiêu chí này giữa dịng lai BC1 và giống trồng xác nhận
để từ đó chọn lọc ra dịng triển vọng nhất giới thiệu cho chương trình chọn tạo.
Bảng 3.28. Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng/giống khoai tây khảo sát
Phân loại củ (%)
Dòng/giống

BC1 1300.3
BC1 1301.5
BC1 1303.4
BC1 1303.22
BC1 1305.6
Atlantic
Rasant
Delikat
Solara (ĐC)
CV
LSD0,05

Kltbc/khóm
(g/khóm)

Kltbc/m2
(g/m2)

NSLT

(tấn/ha)

NSTT
(tấn/ha)

750
540
310
390
560
460
460
670
670
13,4
120

3570
2900
1730
2530
3100
1530
2900
3130
3560
10,3
470

45,0

32,4
18,6
23,4
33,6
27,6
27,6
40,2
40,2

35,7
29,0
17,3
25,3
31,0
29,0
15,3
35,6
31,3
0.47
10.3

Φ ≤ 3cm
45,0
35,5
22,5
35,5
48,4
25,9
35,3
32,7

37,6

3cm ≤
Φ ≥ 5cm
Φ≤ 5cm
37,0
45,5
51,8
42,6
39,5
32,6
41,2
44,9
32,6

18,0
20,0
25,7
21,9
12,1
41,5
23,5
22,4
29,8


24

Kết luận:
Đã khẳng định được gen kháng của khoai tây dại có thể duy trì sang thế hệ BC1 khi lai lại

giữa con lai soma và khoai tây trồng.
Các đặc tính nơng sinh học của các con lai soma (6x) giữa khoai tây dại và khoai tây trồng
được cải thiện, có các đặc tính giống với khoai tây trồng hơn sau phép lai lại với khoai tây trồng.
Từ các kết quả thanh lọc, đánh giá ngoài đồng ruộng qua 2 vụ trồng cho thấy con lai BC1
1300.3 và BC1 1305.6 là những con lai triển vọng mang những tính trạng quý và kháng virus.
Đây là nguồn vật liệu quý để phát triển thành giống hoặc làm vật liệu cho công tác chọn tạo
giống.
KIẾN LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
1. Đã xây dựng thành cơng quy trình tách, dung hợp và ni cấy tế bào trần của các dòng
khoai tây nhị bội (A16, A15, A56, B186, B208); các dòng khoai tây dại (S.tarnii,
S.pinatisectum, S.bulbocastanum); các giống khoai tây trồng tứ bội S.tuberosum (Rasant,
Delikat, Atlantic). Tùy theo giống, có thể thay đổi thành phần dung dịch hỗn hợp enzyme
macerozyme/cellulase theo tỉ lệ 0,2 – 0,8%; 0,2 - 0,6% là thích hợp để tách tế bào trần; thời
gian ủ enzyme 15 ± 1 giờ là tốt nhất với tất cả các dòng nghiên cứu; tuổi cây in vitro từ 3 4 tuần tuổi. Dung hợp bằng phương pháp xung điện ở tần số 800 kHz, 2 lần xung và mật độ
tế bào thích hợp để tiến hành dung hợp là từ 3 x 105 tế bào/ml đến 4x 105 tế bào/ml; mơi
trường thích hợp để nuôi cấy, tái sinh tế bào trần sau dung hợp là môi trường VKM II lỏng,
môi trường tái sinh là RJM.
2. Đã dung hợp 3 tổ hợp của các dòng khoai tây trồng nhị bội (diploid) và tái sinh cây thành
công. Bằng phương pháp xác định độ bội nhờ thiết bị Flow cytometry và xác định con lai
dị nhân (heterozygote) qua phân tích chỉ thị SSR có sử dụng thiết bị Beckman Genome lab
coulters đã xác định được 36 con lai soma tứ bội (tetraploid) dị nhân. Các con lai đã được
đánh giá ở điều kiện chậu vại kết quả chọn được 4 con lai vừa có khả năng kháng virus
PVY, vừa có phẩm chất chế biến chip tốt là 47/7; 47/26; 81-2; 131/11. Kết quả đã khẳng
định các bước của quá trình dung hợp và chọn lọc con lai soma.
3. Đã tiến hành dung hợp, tái sinh và chọn lọc con lai soma của các tổ hợp giữa khoai tây
dại nhị bội (diploid) S. tarnii, S. Pinnatisectum, S. bulbocastanum mang gen siêu kháng PVY
Rysto với khoai tây trồng tứ bội có đặc tính nơng sinh học q nhưng mẫn cảm với PVY
(Atlantic, Delikat, Rasant), chọn tạo dược 13 con lai soma lục bội (hexaploid). Kết quả lai
lại của con lai soma 6x với khoai tây trồng thu được 26 dòng lai sạch bệnh virus. Qua 2 vụ

trồng, đã chọn được 02 dịng BC1 có khả năng kháng virus PVY, mang các đặc tính nơng
sinh học q là BC1 1300.3 và BC1 1305.6. Đây sẽ là vật liệu khởi đầu có giá trị cho chương
trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở Việt Nam.
4. Bằng việc đánh giá khả năng chuyển đặc tính kháng virus qua lai soma và lai lại hữu tính
(Backcross) cho thấy, gen siêu kháng PVY Rysto có mặt trong các dịng khoai tây dại đều
được chuyển vào con lai soma qua dung hợp tế bào trần, cũng như hiện diện trong con lai
BC1 khi được chọn lọc.
Đề nghị
1. Nên đẩy mạnh hướng nghiên cứu dung hợp tế bào trần như một hướng có hiệu quả trong
chọn tạo giống khoai tây, nhằm chuyển các đặc tính quý (kháng bệnh và kháng stress phi
sinh học) từ khoai tây dại vào khoai tây trồng, điều mà các biện pháp chọn tạo giống truyền
thống (lai hữu tính) không thể thực hiện được. Sử dụng các kỹ thuât tách, dung hợp, tái sinh,
chọn lọc con lai soma khoai tây mà đề tài đã nghiên cứu thành công.
2. Sử dụng các vật liệu khởi đầu BC1 1300.3 và BC1 1305.6 vào các chương trình chọn tạo
giống khoai tây kháng PVY. Tiếp tục tiến hành lai lại thêm nhiều lần với khoai tây trồng và
chọn lọc theo hướng tăng cường các đặc tính nơng sinh học q (năng suất cao, phẩm chất
tốt) và duy trì tính kháng PVY .