Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa bắc thơm 7 chịu mặn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
*******



ĐỒNG THỊ KIM CÚC


NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ
TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7
CHỊU MẶN




LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP










Hà Nội - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
*******



ĐỒNG THỊ KIM CÚC


NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ
TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA BẮC THƠM 7
CHỊU MẶN
Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số: 62.62.01.11


LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS, TS. Lê Huy Hàm
2.TS. Lê Hùng Lĩnh

Hà Nội - 2014

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm tác giả.
Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa
từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị,
các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Tác giả luận án






Đồng Thị Kim Cúc
ii

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Lê Huy Hàm
(Viện trưởng – Viện Di truyền Nông nghiệp), TS. Lê Hùng Lĩnh (Trưởng bộ
môn Sinh học Phân tử) đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi
để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Tập thể cán bộ Bộ môn Sinh học Phân tử, lãnh
đạo và tập thể Trung tâm Thực nghiệm Sinh học Nông nghiệp Công nghệ cao

(Viện Di truyền Nông nghiệp) nơi tôi thực hiện các nội dung chính trong đề tài
luận án, đã tạo điều kiện và thời gian cho tôi hoàn thành luận án này.
Hoàn thành luận án còn có sự động viên, khuyến khích giúp đỡ của các
bạn bè đồng nghiệp và gia đình. Tất cả những sự giúp đỡ và tình cảm quý báu
này là nguồn động lực lớn giúp tôi hoàn thành công trình nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Tác giả luận án






Đồng Thị Kim Cúc
iii

MỤC LỤC
Lời cam đoan
i
Lời cảm ơn
ii
Mục lục
iii
Danh mục chữ viết tắt
viii
Danh mục bảng biểu
x
Danh mục hình vẽ
xii

MỞ ĐẦU
1
1. Tính cấp thiết của đề tài
1
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
2
2.1. Mục tiêu chung
2
2.2. Mục tiêu cụ thể
3
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3
3.1. Ý nghĩa khoa học
3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
3
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
4
4.1. Đối tượng nghiên cứu
4
4.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
4
5. Những đóng góp mới của luận án
4
CHƯƠNG I
5
TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế

giới và Việt Nam
5
1.1.1. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới
5
1.1.2. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam
6
1.2. Đất nhiễm mặn và các vùng nhiễm mặn ở Việt Nam
8
1.2.1. Đất nhiễm mặn
8
1.2.2. Giới thiệu chung về đặc điểm các vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam
9
1.2.2.1. Vùng lúa Đồng bằng Sông Cửu Long
9
1.2.2.2. Vùng lúa nhiễm mặn Đồng bằng Sông Hồng
12
1.3. Nghiên cứu di truyền về giống lúa chịu mặn
13
1.3.1. Cơ chế chống chịu mặn của cây lúa
14
1.3.2. Di truyền tính chống chịu mặn
19
iv

1.3.2.1. Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn
19
1.3.2.2. Nghiên cứu di truyền phân tử tính chống chịu mặn
21
1.3.3. Sự thể hiện gen chống chịu mặn
22

1.4. Chỉ thị phân tử và ứng dụng của chỉ thị phân tử
24
1.4.1. Chỉ thị phân tử
24
1.4.2. Một số chỉ thị phân tử thường dùng
26
1.4.3. Một số ứng dụng của chỉ thị phân tử
31
1.4.3.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền
31
1.4.3.2. Nghiên cứu lập bản đồ di truyền
34
1.4.3.3. Nghiên cứu trong chọn giống cây trồng
37
1.4.4. Chọn giống hồi giao nhờ chỉ thị phân tử (Marker Assited Backcrossing
- MABC)
40
1.5. Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo giống lúa chịu mặn
42
1.5.1. Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo lúa chịu mặn trên thế giới
42
1.5.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chống chịu mặn
47
1.5.3. Một số kết quả và thành tựu trong chọn tạo giống lúa chống chịu mặn ở
Việt Nam
50
1.5.3.1. Sử dụng các chỉ thị SSR liên kết chặt với QTL chịu mặn Saltol trong
chọn tạo lúa chịu mặn
50
1.5.3.2. Nghiên cứu lai tạo trong chọn tạo giống lúa chịu mặn

52
1.5.3.3. Một số kết quả chọn tạo và đánh giá khả năng chịu mặn ở lúa
52
CHƯƠNG II
54
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu
54
2.2. Địa điểm nghiên cứu
57
2.3. Nội dung nghiên cứu
58
2.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu, đánh giá khả năng chịu mặn và đặc điểm nông
sinh học các dòng/giống lúa mang locus gen Saltol chịu mặn nhập nội từ IRRI
và giống lúa thuần trồng đại trà trong nước làm cơ sở trong việc chọn tạo giống lúa
chịu mặn tại một số tỉnh ven biển miền Bắc Việt Nam
58
2.3.1.1. Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng/giống lúa trong điều kiện
nhân tạo
58
2.3.1.2. Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của một số giống lúa có
khả năng chịu mặn tại vùng ven biển ĐBSH
58
2.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ứng dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ
58
v

thị phân tử và lai trở lại quy tụ locus gen Saltol chịu mặn vào giống lúa Bắc
Thơm7

2.3.2.1. Xác định vật liệu bố mẹ trong chọn tạo giống lúa mang locus gen
Saltol chịu mặn
58
2.3.2.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử và phương pháp lai trở lại trong chọn tạo
giống lúa Bắc thơm 7 chịu mặn
58
2.3.3. Nội dung 3: Đánh giá một số đặc tính nông sinh học chính, yếu tố thành
năng suất và khả năng chịu mặn của các dòng được tạo ra mang QTL Saltol
trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng
58
2.4. Phương pháp nghiên cứu
58
2.4.1. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng
61
2.4.2. Phương pháp thí nghiệm lúa chịu mặn
61
2.4.3. Một số kỹ thuật sử dụng trong phòng thí nghiệm
63
2.4.3.1 Tách chiết ADN tổng số
63
2.4.3.2. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của ADN tách chiết bằng phương
pháp điện di trên gel agarose
64
2.4.3.3 Nhân ADN bằng kỹ thuật SSR-PCR
65
2.4.3.4. Ghi nhận, xử lý và phân tích số liệu cho phản ứng điện di sản phẩm
PCR biến tính trên gel polyacrylamide
66
2.5. Khảo nghiệm các giống lúa
67

2.6. Phương pháp xử lý số liệu
67
CHƯƠNG III
68
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu đánh giá vật liệu sử dụng trong nghiên cứu và chọn tạo
giống lúa chịu mặn
68
3.1.1. Đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng/giống lúa trong điều kiện
nhân tạo
68
3.1.2. Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của một số giống lúa nhập
nội trong điều kiện tự nhiên.
73
3.1.2.1. Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của một số giống
lúa nhập nội tại Thanh Trì, Hà Nội năm 2010
73
3.1.2.2. Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của một số giống
lúa nhập nội tại Giao Thủy, Nam Định năm 2010
81
3.1.3. Đánh giá mức độ sâu bệnh hại chính trong thí nghiệm.
86
3.2. Nghiên cứu ứng dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử
88
vi

và lai trở lại chọn tạo giống lúa Bắc Thơm7 chịu mặn
3.2.1. Kết quả nghiên cứu xác định vật liệu bố mẹ trong chọn tạo giống lúa
mang QTL Saltol

88
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ứng dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ thị
phân tử và lai trở lại quy tụ QTL Saltol chịu mặn vào giống lúa BT7
89
3.2.2.1. Kết quả xác định chỉ thị phân tử liên kết Saltol và đa hình giữa giống
lúa BT7 và dòng FL478
89
3.2.2.2. Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình ngoài vùng locus gen Saltol
giữa giống lúa BT7 và dòng FL478 trên 12 NST
93
3.2.3. Kết quả cải tiến giống lúa BT7 chịu mặn bằng phương pháp chỉ thị
phân tử và lai trở lại
108
3.2.3.1. Kết quả lai tạo tạo con lai F1 của tổ hợp lai FL478/BT7
108
3.2.3.2. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC1F1 bằng phương pháp
chỉ thị phân tử
109
3.2.3.3. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC2F1 bằng phương pháp
chỉ thị phân tử
112
3.2.3.4. Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC3F1 bằng phương pháp
chỉ thị phân tử
122
3.3. Đánh giá một số đặc tính nông sinh học chính, yếu tố cấu thành năng
suất và khả năng chịu mặn của các dòng được tạo ra mang QTL Saltol
trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng ruộng
133
3.3.1. Kết quả đánh giá một số đặc tính nông sinh học và yếu tố cấu thành
năng suất của các dòng Bắc thơm 7- Saltol trong điều kiện nhà lưới.

133
3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn trong điều kiện mặn nhân tạo đối
với các dòng BT7-Saltol(thế hệ BC3F3)
139
3.3.3. Kết quả đánh giá một số đặc tính nông sinh học các dòng Bắc thơm 7-
Saltol (thế hệ BC3F3) ngoài đồng ruộng.
141
3.4. Kết quả đánh giá một số đặc tính nông sinh học,năng suất của các
dòng Bắc thơm 7- Saltol (thế hệ BC3F4) ngoài đồng ruộng
146
3.5. Kết quả đánh giá chất lượng gạo của các dòng BT7 – Saltol
149
CHƯƠNG IV
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
152
4.1. Kết luận
152
4.2. Đề nghị
153
vii

TÀI LIỆU THAM KHẢO
155
PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

PHỤ LỤC 3

viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

TT
Chữ viết tắt

Nghĩa của chữ viết tắt
1
ADN
Axit Deoxyribonucleic
2
AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism)
Đa hình chiều dài các đoạn được
nhân bản chọn lọc
3
APS
Amonium Persulfate
4
ARN
Axit Ribonucleic
5
Bp (Base pair)
Cặp bazơ nitơ
6
Bộ TNMT
Bộ Tài nguyên Môi trường
7
Ctv
Cộng tác viên
8
CTAB
Cetyltrimethyl Amonium Bromide
9
CTPT
Chỉ thị phân tử

10
BĐKH
Biến đổi khí hậu
11
ĐBSH
Đồng bằng sông Hồng
12
ĐBSCL
Đồng bằng sông Cửu Long
13
DNTPs
Deoxynucleotide triphosphate
14
EDTA
Ethylenediaminetetra Acetic Acid
15
IRRI (International rice research
institute)
Viện nghiên cứu lúa quốc tế
16
Kb
Kilo base
17
MABC (Marker assisted
backcrossing)
Chọn giống hồi giao nhờ chỉ thị phân
tử
18
NST
Nhiễm sắc thể

19
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phản ứng trùng hợp chuỗi
20
RAPD (Random Amplification of
Polymorphic DNA)
Đa hình AND được nhân bản ngẫu
nhiên
21
RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphisms)
Đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới
hạn
ix

22
RIL (Recombinant Inbred Line)
Cận giao tái tổ hợp
23
SDS
Sodium Dodecyl Sulphate
24
SNPs (Single nucleotide
polymorphisms)
Đa hình của các nucleotit đơn
25
SSR (Simple Sequence repeat)
Sự lặp lại của trình tự đơn giản
26
STS (Sequence Tagged Site)

Điểm trình tự được đánh dấu
27
Submergence 1 ( Sub 1)
Gen chịu ngập 1
28
TBE
Tris – Bric Acid - EDTA
29
Tt
Thứ tự
30
TE
Tris – EDTA








x

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999

7
1.2
Diện tích bị nhiễm mặn ở ĐBSCL tháng 4 (1991 – 2000)
11
1.3
Sự tương quan giữa số thế hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen của dòng ưu tú
(nhận gen mong muốn) được đưa vào con lai BCnF1
41
2.1
Danh sách các dòng/giống lúa tham gia thí nghiệm
54
2.2
Tiêu chuẩn đánh giá (SES) ở giai đoạn tăng trưởng và phát triển
(IRRI, 1997)
62
2.3
Thành phần dung dịch đệm chiết EB (Extraction Buffer)
63
2.4
Thành phần dung dịch đệm CTAB (CTAB buffer)
64
2.5
Thành phần dung dịch đệm TE (Tris EDTA) (10;0,1)
64
2.6
Thành phần phản ứng PCR
65
2.7
Chế độ nhiệt của phản ứng PCR
65

3.1
Kết quả thanh lọc mặn nhân tạo sau 2 tuần xử lý có bổ sung 6g/l NaCl
(EC=12dS/m)
69
3.2
Kết quả thanh lọc mặn nhân tạo sau 3 tuần có bổ sung 6g/l NaCl
(EC=12dS/m)
70
3.3
Một số đặc điểm nông học và hình thái của các giống lúa tham gia thí
nghiệm tại Thanh Trì, Hà Nội năm 2010
74
3.4
Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các giống tham gia thí
nghiệm tại Thanh Trì, Hà Nội năm 2010
78
3.5
Một số đặc điểm nông học và hình thái của các giống lúa tham gia thí
nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định năm 2010
81
3.6
Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các giống tham gia thí
nghiệm tại Giao Thủy, Nam Định năm 2010
84
3.7
Mức độ nhiễm sâu bệnh của các giống tham gia thí nghiệm năm 2010
tại Nam Định và Hà Nội
87
3.8
Cơ cấu và năng suất giống lúa BT7 đang trồng tại một số tỉnh thành ở

vùng ĐBSH
89
3.9
Danh sách các chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí gen Saltol
92
xi

3.10
Các thông tin chi tiết chỉ thị cho đa hình tại vị trí vùng QTL/gene
Saltol và trên NST1 giữa giống Bắc Thơm 7 và FL478
95
3.11
Thông tin các chỉ thị đa hình trên NST3
96
3.12
Thông tin các chỉ thị phân tử đa hình trên NST5, NST10 và NST12
97
3.13
Thông tin chi tiết chỉ thị đa hình trên NST2, NST7 và NST9
99
3.14
Thông tin chi tiết các chỉ thị chi kết quả đa hình trên NST4, NST6,
NST8 và NST11
102
3.15
Kết quả xác định cá thể tái tổ hợp từ các chỉ thị RM1287, RM10694,
RM562 và RM7075
116
3.16
Các marker đa hình không liên kết với vùng gen Saltol dùng để sàng

lọc nền di truyền các cá thể mang QTLs/gen ở thế hệ BC2F1
118
3.17
Chỉ tiêu sinh trưởng và đặc điểm hình thái của các dòng BT7- Saltol
(thế hệ BC3F2) trong vụ xuân 2012 tại Thanh Trì- Hà Nội
134
3.18
Một số yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BT7 - Saltol
(thế hệ BC3F2) trong vụ xuân 2012 tại Thanh Trì - Hà Nội
137
3.19
Đánh giá khả năng chịu mặn (sau 3 tuần) của một số cá thể BT7 -
Saltol (thế hệ BC3 F3) - Vụ Mùa 2012
140
3.20
Chỉ tiêu sinh trưởng và phát triển của một số dòng BT7–Saltol (thế hệ
BC3F3) - Vụ Mùa 2012 tại Giao Thủy –Nam Định
142
3.21
Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng Bắc Thơm 7
chịu mặn (thế hệ BC3 F3) - Vụ Mùa 2012 tại Giao Thủy - Nam Định
144
3.22
Chỉ tiêu sinh trưởng và đặc điểm hình thái của các dòng BT7- Saltol
(thế hệ BC3F4) trong vụ xuân 2013 tại Giao Thuỷ - Nam Định
147
3.23
Năng suất và một số yếu tố cấu thành năng suất của các dòng BT7 –
Saltol (thế hệ BC3F4) trong vụ xuân 2013 tại Giao Thuỷ - Nam Định
148

3.24
Chất lượng lúa gạo của dòng Bắc Thơm 7 – Saltol
150
3.25
Đánh giá chất lượng cơm của dòng Bắc Thơm 7 – Saltol
150
xii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
1.1
Dự báo khí hậu toàn cầu và mực nước biển dâng trong thế kỷ 21
5
1.2
Diện tích và nồng độ mặn vùng ĐBSCL, ứng với kịch bản
nước biển dâng thêm 1,0 m so với hiện nay
11
1.3
Giới hạn xâm nhập mặn 4% tương ứng với các kịch bản khác
nhau của nước biển dâng
12
1.4
Các cơ chế chịu mặn ưu thế ở cây lúa
19
1.5
Vị trí các gen liên quan đến tính kháng mặn
45
1.6

Đoạn gen Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 của lúa, vị trí xác định
của các SSR marker.
49
1.7
Bản đồ QTL của những tính trạng mục tiêu liên quan đến hiện
tượng chống chịu mặn trên quần thể F8 (RIL) của tổ hợp lai
Tenasai 2/CB
51
3.1
Thí nghiệm thanh lọc mặn giai đoạn mạ trong điều kiện nhân tạo
của các dòng/giống sử dụng làm vật liệu
71
3.2
Thí nghiệm thanh lọc mặn nhân tạo của một số dòng/giống vật
liệu
72
3.3
Kết quả kiểm tra đa hình giữa giống BT7 và FL478 với 3 chỉ thị
RM493, RM3421b, RM140
90
3.4
Kết quả kiểm tra đa hình giữa giống BT7 và FL478 với 3 chỉ thị
G1a, SCK1b, SCK1d
90
3.5
Bản đồ locus gen Saltol và các chỉ thị phân tử đa hình trên NST1
91
3.6
Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST1 giữa
giống BT7 và FL478 bằng gel Polyacrylamide 6%

94
3.7
Kết quả khảo sát chỉ thị phân tử đa hình giữa giống BT7 và
FL478 trên NST1, NST2, NST3, NST4, NST5, NST8, NST9 và
104
xiii

NST11
3.8
Kết quả khảo sát chỉ thị phân tử đa hình giữa giống BT7 và
FL478
105
3.9
Kết quả khảo sát chỉ thị phân tử đa hình giữa giống BT7 và
FL478 trên NST3, NST6, NST7, NST8 và NST12
106
3.10
Bản đồ các chỉ thị phân tử đa hình giữa giống FL478 và Bắc
thơm 7
107
3.11
Kết quả chạy điện di với chỉ thị RM7643
109
3.12
Kết quả chạy điện di trên 94 cá thể BC1F1 (sử dụng chỉ thị
phân tử RM493)
110
3.13
Kết quả chạy điện di trên 94 cá thể BC1F1 (sử dụng chỉ thị
phân tử RM3412b)

111
3.14
Kết quả điện di gel Polyacrylamide 6%, của tổ hợp lai
BT7/FL478 (BC2F1) với chỉ thị RM3412b
112
3.15
Kết quả điện di gel Polyacrylamide 6%của tổ hợp lai BT7/FL478
(BC2F1) với chỉ thị RM493
113
3.16
Kết quả điện di gel Polyacrylamide 6%, của tổ hợp lai
BT7/FL478 (BC2F1) với chỉ thị RM1287
114
3.17
Kết quả điện di gel Polyacrylamide 6%, của tổ hợp lai
BT7/FL478 (BC2F1) với chỉ thị RM10694
115
3.18
Kết quả điện di gel Polyacrylamide 6%, của tổ hợp lai
BT7/FL478 (BC2F1) với chỉ thị RM562
115
3.19
Kết quả điện di gel Polyacrylamide 6%, của tổ hợp lai
BT7/FL478 (BC2F1) với chỉ thị RM7075
115
3.20
Kết quả kiểm tra di truyền các cá thể BC2F1 trên điện di gel
Polyacrylamide 6%, bằng chỉ thị RM490, RM20783, S08121a,
RM25181
117

3.21
Kết quả xử lý phần mềm GGT2 của 10 cá thể mang Saltol trong
119
xiv

quần thể BC2F1
3.22
Kết quả xử lý phần mềm GGT2 của 10 cá thể trên 12 nhiễm sắc
thể
120
3.23
Bản đồ di truyền của cá thể số 8 được xử lý bằng phần mềm
GGT2
121
3.24
Kết quả điện di gel Polyacrylamide 6%, của tổ hợp lai
BT7/FL478 (BC3F1) với chỉ thị RM3412
123
3.25
Kết quả điện di gel Polyacrylamide 6%, của tổ hợp lai
BT7/FL478 (BC3F1) với chỉ thị RM493
124
3.26
Kết quả xác đánh giá di truyền các cá thể trong quần thể BC3F1
bằng chỉ thị phân tử S11049, RM17, RM202
126
3.27
Kết quả xác đánh giá di truyền các cá thể trong quần thể BC3F1
bằng chỉ thị phân tử RM3753, R4M30,RM423
127

3.28
Kết quả xác đánh giá di truyền các cá thể trong quần thể BC3F1
bằng chỉ thị phân tử RM30, RM5338, S11055A
128
3.29
Kết quả xác đánh giá di truyền các cá thể trong quần thể BC3F1
bằng chỉ thị phân tử S07011, S01091, RM23662, RM5789
129
3.30
Kết quả phân tích nền di truyền của 88 cá thể BC3F1 trên 12
nhiễm sắc thể bằng phần mềm GGT2
130
3.31
Bản đồ di truyền của cá thể số IL-30
131
3.32
Bản đồ di truyền của cá thể số IL-32
132

1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Lúa gạo là một trong những cây lương thực có vai trò quan trọng đối với
con người. Trên thế giới cây lúa được xếp vào vị trí thứ hai sau cây lúa mì về
diện tích và sản lượng. Ở Châu Á, lúa gạo được coi là cây lương thực quan trọng
nhất, chiếm diện tích 135 triệu ha trong tổng số 148,4 triệu ha trồng lúa của toàn
thế giới. Trong tương lai, xu thế sử dụng lúa gạo sẽ còn tăng hơn vì đây là loại
lương thực dễ bảo quản, dễ chế biến và cho năng lượng khá cao. Theo tính toán
của Peng và cộng sự, đến năm 2030 sản lượng lúa của thế giới phải đạt 800 triệu

tấn mới có thể đáp ứng được nhu cầu lương thực của con người [88].
Trong tình trạng nguồn lương thực khan hiếm và giá lương thực tăng như
hiện nay, thế giới sẽ phải đối mặt với nguy cơ thiếu lương thực. Theo một
nghiên cứu của trường Đại học Stanford, đến năm 2030 sản lượng lương thực ở
Châu Á sẽ giảm 10% hoặc hơn, đặc biệt là sản phẩm lúa gạo. Năng suất và sản
lượng lúa luôn bị đe dọa bởi thiên tai, sâu bệnh và các yếu tố môi trường. Trong
đó, yếu tố đáng chú ý là hiện tượng đất nhiễm mặn. Đất trồng trọt bị ảnh hưởng mặn
ước tính khoảng 380 triệu ha, chiếm 1/3 diện tích đất trồng trên toàn thế giới.
Việt Nam với đường bờ biển dài 3.620 km trải dài từ Bắc vào Nam, hàng
năm những vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự xâm thực
của biển. Theo thống kê, diện tích đất ngập mặn năm 1992 là 494.000 ha, đến
năm 2000 là 606.792 ha [1]. Theo báo cáo mới nhất của Cục trồng trọt, tại
ĐBSCL, xâm nhập mặn đã ảnh hưởng đến 620.000 ha/1.545.000 ha lúa đông
xuân 2009 - 2010, chiếm 40% diện tích toàn vùng, tại các tỉnh ven biển như
Tiền Giang, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Kiên Giang và Bến Tre.
Trong đó, diện tích có nguy cơ bị xâm nhập mặn cao khoảng 100.000
ha/650.000 ha, chiếm 16% diện tích canh tác lúa của các tỉnh trên. Đặc biệt,
trong điều kiện khí hậu toàn cầu đang thay đổi, hiện tượng băng tan ở hai cực,
và hệ lụy của nó là nước biển dâng lên đe dọa các vùng đất canh tác thấp ven
2

biển. Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố chính gây khó khăn
cho chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo và ảnh hưởng xa hơn là mục tiêu
đảm bảo an ninh lương thực sẽ khó hoàn thành [124]. Do đó, việc hạn chế mức
độ gây hại của sự nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần được quan
tâm nghiên cứu.
Để đáp ứng được yêu cầu này, việc chọn tạo các giống lúa chịu mặn là rất
cần thiết. Nghiên cứu cải thiện giống lúa chịu mặn hiện nay chia ra làm hai
hướng chính. Thứ nhất, tạo giống chuyển gen hoặc giống có gen biểu hiện ở
mức độ khác với gen sẵn có để thay đổi khả năng chịu mặn. Tuy nhiên, hiện nay

các nghiên cứu về chuyển gen và thay đổi biểu hiện của gen để tăng khả năng
chịu mặn vẫn chưa đạt được nhiều thành công. Do đó, trong chọn tạo giống lúa,
hướng nghiên cứu khai thác sự đa dạng tự nhiên về nguồn gen giữa các dòng bố
mẹ để dùng trong lai tạo là một định hướng có hiệu quả. Thứ hai, khai thác sự đa
dạng tự nhiên về nguồn gen chịu mặn qua chọn lọc trực tiếp trong điều kiện mặn
hoặc chọn lọc di truyền các tính trạng số lượng, chọn lọc nhờ sự trợ giúp của các
chỉ thị phân tử. Chỉ thị phân tử là những chỉ thị có bản chất là đa hình ADN.
Thông qua việc phát hiện những đoạn ADN liên kết chặt với gen đích cho phép
chúng ta khẳng định sự có mặt hay vắng mặt của gen chịu mặn. Việc sử dụng
chỉ thị phân tử có thể giúp xác định nhanh sự có mặt của gen chống chịu mặn,
giúp các nhà chọn giống chủ động trong việc chọn lựa các tổ hợp lai hiệu quả.
Nhờ đó, quá trình chọn tạo giống chống chịu mặn trở nên nhanh, hiệu quả, tiết
kiệm thời gian, công sức và tiền của.
Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu
ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa Bắc Thơm 7 chịu mặn”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
2.1. Mục tiêu chung
Nghiên cứu ứng dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai
trở lại để cải tiến giống lúa trồng đại trà quy mô lớn trong sản xuất về đặc tính
3

chịu mặn cho một số vùng ven biển Đồng Bằng Sông Hồng.
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Xác định được khả năng chịu mặn và đặc điểm hình thái các dòng/giống
mang locus gen Saltol chịu mặn (dòng sử dụng làm vật liệu cho gen) nhập nội từ
Viện nghiên cứu lúa quốc tế và xác định giống lúa trồng phổ biến sử dụng làm
giống được cải tiến (nhận gen).
- Ứng dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại
(MABC) quy tụ locus gen Saltol chịu mặn vào giống Bắc Thơm 7. Đáp ứng nhu
cầu giống lúa chất lượng, chịu mặn cho vùng ven biển Đồng Bằng Sông Hồng.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Những thành công trong công tác chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai
trở lại nhằm đưa QTL chịu mặn vào lúa sẽ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi
trong công tác chọn tạo giống nói chung, không chỉ đối với tính chịu mặn mà
còn đối với nhiều đặc tính nông học khác, ứng phó kịp thời đối với sự biến đổi
khí hậu trong tương lai.
- Ứng dụng phương pháp chọn giống phân tử kết hợp với truyền thống để
chọn lọc nhanh và chính xác nguồn gen chịu mặn, quy tụ vào giống lúa Bắc
Thơm 7 đang được trồng phổ biến tại miền Bắc Việt Nam giúp khắc phục được
những hạn chế của chọn giống truyền thống đặc biệt là đối với các QTL chịu
mặn khi ở trạng thái dị hợp, giảm chi phí trong chọn giống, rút ngắn thời gian và
ứng dụng nhanh vào thực tiễn sản xuất.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Thành công trong việc chuyển locus gen Saltol nhờ sử dụng chỉ thị phân
tử sẽ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi trong công tác chọn tạo giống.
- Những dòng/giống lúa Bắc Thơm 7 mang locus gen Saltol chọn lọc
được trong đề tài sẽ được nhân rộng, đặc biệt cho các tỉnh đồng bằng ven biển ở
4

Miền Bắc - Việt Nam, nơi chịu ảnh hưởng rõ nét nhất của tác động biến đổi khí
hậu.
- Ý nghĩa quan trọng nhất là chọn tạo được giống lúa có nền di truyền
giống Bắc Thơm 7 nhất, đồng thời mang locus gen Saltol, có khả năng sinh
trưởng phát triển bình thường trong điều kiện mặn.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài
4.1. Đối tượng nghiên cứu
- Là các giống lúa thuần mang locus gen Saltol được nhập nội từ IRRI,
các giống lúa thuần đang được trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam và các chỉ
thị phân tử có liên quan được sử dụng trong nghiên cứu.

4.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Thí nghiệm được triển khai tại: Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử
thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp (Từ Liêm, Hà Nội); Trung tâm Chuyển giao
Công nghệ và Khuyến nông (Thanh Trì, Hà Nội); huyện Giao Thuỷ, Nam Định.
- Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2010 đến năm 2013.
5. Những đóng góp mới của luận án
- Ứng dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại
(MABC) là một trong những công trình nghiên cứu đầu tiên trong nghiên cứu
cải tiến giống lúa Bắc Thơm 7 về đặc tính chịu mặn cho vùng ven biển Đồng
Bằng Sông Hồng.
- Sử dụng phương pháp chọn giống bằng phương pháp MABC có thể
chuyển được locus gen/gen đích vào giống trong khoảng 2-3 thế hệ, trong khi sử
dung phương pháp lai trở lai phải mất ít nhất 8 thế hệ.
- Sử dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại đã
quy tụ locus gen chịu mặn Saltol vào giống lúa Bắc Thơm 7 với đầy đủ các đặc
tính quý của giống nhưng có thể chịu mặn đến 6 ‰.

5

CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
1.1. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới
và Việt Nam
1.1.1. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp trên thế giới
Biến đổi khí hậu (BĐKH) là sự biến động trạng thái trung bình của khí
hậu toàn cầu hay khu vực theo thời gian từ vài thập kỷ đến hàng triệu năm.
Những biến đổi này được gây ra do quá trình động lực của trái đất, bức xạ mặt
trời, và gần đây có thêm hoạt động của con người [126].
Biến đổi khí hậu ngày nay không còn là vấn đề của một quốc gia hay của
một khu vực mà là vấn đề toàn cầu. Biến đổi khí hậu sẽ tác động nghiêm trọng

đến sản xuất, đời sống và môi trường trên phạm vi toàn thế giới. Nhiệt độ tăng,
mực nước biển dâng cao (Hình 1.1), sẽ gây hiện tượng ngập lụt, gây nhiễm mặn
nguồn nước, ảnh hưởng đến nông nghiệp, gây rủi ro lớn đối với công nghiệp và
các hệ thống kinh tế - xã hội trong tương lai.

(Ứng phó với biến đổi khí hậu và biển dâng, 2009)
Hình 1.1. Dự báo khí hậu toàn cầu và mực nước biển dâng trong thế kỷ 21
6

Những thách thức của biến đổi khí hậu đối với sản xuất lúa gạo là vô cùng
quan trọng. Phần lớn lúa gạo mà thế giới sử dụng được trồng ở các vùng đất
thấp hoặc vùng đồng bằng ở các quốc gia như Việt Nam, Thái lan, Bangladesh,
Ấn Độ Những khu vực này lại có nguy cơ bị xâm nhập mặn khi mực nước
biển dâng cao, cho thấy sự cần thiết của các giống lúa có khả năng chịu đựng
được cả tình trạng ngập nước lẫn độ mặn cao. Theo báo cáo của FAO (2010),
trên 800 triệu ha đất trên toàn thế giới bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi muối và
khoảng 20% diện tích tưới (khoảng 45 triệu ha) được ước tính bị vấn đề xâm
nhập mặn theo mức độ khác nhau [38]. Điều này là nghiêm trọng hơn kể từ khi
các khu vực tưới tiêu có trách nhiệm bảo đảm một phần ba sản xuất lương thực
Thế giới.
Ở Châu Á nếu nước biển dâng lên 1m, khoảng 25.000km
2
rừng đước sẽ bị
ngập, 10.000km
2
đất canh tác và diện tích nuôi trồng thủy sản trở thành đầm lầy
ngập mặn. Ở hạ lưu sông Nil (Ai Cập), 6 triệu người phải di dời và 4.500km
2
đất
nông nghiệp bị ngập và nhiễm mặn. Ở Bangladesh 18% diện tích đất nông

nghiệp bị ngập ảnh hưởng đến 11% dân số. Theo ước tính của Viện nghiên cứu
Lúa Quốc tế (IRRI) mỗi năm nông dân Ấn Độ và Bangladesh bị thiệt hại tới 4
triệu tấn thóc do lũ lụt, do nhiều giống lúa chỉ chịu ngập trong vòng chưa đầy
một tuần. Còn ở Maldives hơn 80% diện tích đất thấp hơn mực nước biển và có
thể bị ngập, mặn khi nước biển dâng cao [112].
1.1.2. Ảnh hưởng của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp ở Việt
Nam
Việt Nam là một trong những nước chịu ảnh hưởng nặng nề do mực nước
biển dâng. Nước biển dâng thì phần lớn đất màu mỡ nhất của Việt Nam sẽ bị
ngập mặn. Theo đó, sản lượng lúa có thể giảm đáng kể do mực nước biển dâng
cao và sự thay đổi lượng mưa làm thay đổi thủy văn ở các vùng đồng bằng. Do
chúng ta có bờ biển dài hơn 3.620 km, 28 tỉnh, thành phố giáp biển nên mực
7

nước biển dâng cao sẽ làm giảm lưu lượng dòng chảy của các con sông, thậm
chí ngay cả tại các nơi xa bờ biển [126].
Bảng 1.1. Kịch bản nước biển dâng ở Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999
(Đơn vị tính: cm)
Kịch bản nước
biển dâng
Các mốc thời gian của thế kỷ 21
2020
2030
2040
2050
2060
2070
2080
2090
2100

Thấp (B1)
11
17
23
28
35
42
50
57
65
Trung bình (B2)
12
17
23
30
37
46
54
64
75
Cao(A1F1)
12
17
24
33
44
57
71
86
100

(Kịch bản BĐKH nước biển dâng cho Việt Nam, phần II)- nguồn Bộ Tài nguyên Môi trường - 2001.
Các nhà khoa học chỉ ra rằng, khi nước biển dâng, tùy mức độ sẽ có
những phần diện tích canh tác ở Đồng bằng Sông Cửu Long, Đồng bằng Sông
Hồng, các đồng bằng duyên hải khác bị ngập mặn. Theo kịch bản A1FI lũ sẽ gây
ngập 90% diện tích trong 4,5 – 5 tháng/năm, vào mùa kiệt nước mặn (nồng độ
muối 4%) xâm nhập trên 70% diện tích…Đây lại là những vựa lúa của cả nước
nên khi đó chắc chắn an ninh lương thực bị đe dọa. Không những thế, vào cuối
thế kỷ 21, nhiệt độ trung bình năm ở các vùng khí hậu phía Bắc có thể tăng so
với trung bình thời kỳ 1980 – 1999 khoảng 3,1 – 3,6
0
C; trong đó Tây Bắc là
3,3
0
C; Đông Bắc là 3,2
0
C; Đồng bằng Bắc Bộ là 3,1
0
C và vùng Bắc Trung Bộ là
3,6
0
C. Mức nhiệt độ tăng trung bình năm của các vùng khí hậu phía Nam là
2,4
0
C; ở Nam Trung Bộ là 2,1
0
C; ở Tây Nguyên là 2,6
0
C. Kéo theo đó là lượng
mưa tăng khoảng 9 – 10% ở Tây Bắc, Đông Bắc; 10% ở Đồng bằng Bắc Bộ,
Bắc Trung Bộ; 4 – 5 % ở Nam Trung Bộ và khoảng 2% ở Tây Nguyên, Nam

Bộ. Lượng mưa thời kỳ từ tháng 3 đến tháng 5 sẽ giảm 6 – 9% ở Tây Bắc, Đông
Bắc và Đồng bằng Bắc Bộ; khoảng 13% ở Bắc Trung bộ. Lượng mưa vào giữa
mùa khô ở Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Nam Bộ lại giảm khoảng 13 – 22%.
Lượng mưa các tháng cao điểm của mùa mưa tăng 12 – 19% ở phía Bắc và Nam
Trung Bộ, còn ở Tây Nguyên và Nam Bộ chỉ vào khoảng 1 – 2% [126].
8

Việt Nam là một trong những nước bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất bởi
mực nước biển dâng, dẫn đến sự xâm nhiễm mặn ngày càng gia tăng, chủ yếu là
Đồng bằng Sông Hồng và Đồng bằng Sông Cửu Long. Mặn là hiện tượng liên kết
với nước biển dâng mang nước mặn tiến sâu vào đất liền, biến nhiều vùng đất
trồng lúa bị mặn hóa [4].
1.2. Đất nhiễm mặn và các vùng nhiễm mặn ở Việt Nam
1.2.1. Đất nhiễm mặn
Đất nhiễm mặn là loại đất có chứa nhiều cation Na + hấp phụ trên bề mặt
keo đất và trong dung dịch đất [1;4].
Sự hình thành đất nhiễm mặn do 2 nguyên nhân chủ yếu là ảnh hưởng của
nước ngầm hay do ảnh hưởng của nước biển mặn theo trủy triều tràn vào.
Hạn chế của đất nhiễm mặn:
- Đất có thành phần cơ giới nặng. Tỉ lệ sét từ 50-60%. Đất chặt, thấm
nước kém. Không bị ướt, dẻo dính. Khi bị khô đất co lại, nứt nẻ, rắn chắc, khó
làm đất.
- Đất chứa nhiều Na+ dưới dạng muối tan NaCl, Na
2
SO4 nên áp suất
thẩm thấu dung dịch đất lớn làm ảnh hưởng tới quá trình hút nước và dinh
dưỡng cây trồng.
- Đất có phản ứng trung tính hoặc hơi kiềm
- Hoạt động của vi sinh vật yếu
Ở Việt Nam, các vùng nhiễm mặn tập trung chủ yếu ở 2 vùng châu thổ

lớn là ĐBSH và ĐBSCL. Ảnh hưởng của nước biển ở vùng cửa sông vào đất
liền ở ĐBSH chỉ khoảng 15km, nhưng ở vùng ĐBSCL lại có thể xâm nhập tới
40 – 50 km (FAO, 2000) [37].
Theo kịch bản biến đổi khí hậu mới nhất (2011 - do Bộ Tài nguyên - Môi
trường xây dựng) dự báo khoảng 7.600km
2
(tương đương 20% diện tích)
ĐBSCL sẽ chìm khi nước biển dâng 75cm và ở mức 100cm thì phạm vi ngập
trải rộng trên diện tích 15.116km
2
, tương đương 37,8% diện tích tự nhiên toàn
9

vùng. Dự báo vào năm 2030, khoảng 45% đất của ĐBSCL có nguy cơ nhiễm
mặn cục bộ. Nhiễm mặn gây hại rất lớn cho sự sinh trưởng và phát triển của cây
lúa, trung bình năng suất lúa có thể giảm 20-25%, thậm chí tới 50%[`126], ảnh
hưởng nghiêm trọng đến canh tác 3 vụ mùa, sản lượng lương thực bị mất đi
đáng kể, đe dọa an ninh lương thực quốc gia.
Hơn 21.000km
2
diện tích tự nhiên với những điều kiện tự nhiên thuận lợi
của đồng bằng sông Hồng đã được khai thác từ lâu đời, biến vùng châu thổ này
thành vựa lúa lớn thứ hai của cả nước, sau đồng bằng sông Cửu Long. Diện tích
đất đai được sử dụng vào hoạt động nông nghiệp ở đây lên tới 79 vạn ha. Tuy
nhiên, những năm gần đây diện tích đất bị nhiễm mặn ngày càng tăng cao.
Các vùng lúa nhiễm mặn ở ĐBSH thuộc các tỉnh như: Thái Bình, Hải
Phòng, Nam Định, Ninh Bình,…Vùng ven biển thuộc Hải Phòng bị nhiễm mặn
khoảng 20.000 ha ở cả hai dạng nhiễm mặn tiềm tàng và nhiễm mặn xâm nhiễm
từ 0,3-0,5%. Tỉnh Thái Bình có khoảng 18.000 ha nhiễm mặn. Tỉnh Nam Định
có khoảng10.000 ha. Tỉnh Thanh Hóa có khoảng 22.000 ha đất nhiễm mặn [1].

1.2.2. Giới thiệu chung về đặc điểm các vùng lúa nhiễm mặn ở Việt Nam
Theo tác giả Hoàng Kim, PhạmVăn Biên và R.H.Howeler (2003) thì nước
ta có khoảng 1 triệu ha đất nhiễm mặn, trong đó có 2 vùng nhiễm mặn lớn là
vùng châu thổ sông Hồng và vùng lúa ĐBSCL[48].
1.2.2.1. Vùng lúa Đồng bằng Sông Cửu Long
Xâm nhập mặn là một trong những vấn đề lớn ở Đồng Bằng Sông Cửu
Long và nó có xu hướng trầm trọng hơn trong tương lai do mực nước biển dâng
và lưu lượng nước từ thượng nguồn suy giảm [4].
ĐBSCL có diện tích tự nhiên là 3,96 triệu ha, chiếm 12% diện tích cả
nước, trong đó diện tích đất sản xuất nông nghiệp khoảng 2,9 triệu ha, đất sản
xuất lâm nghiệp là 430.770 ha, đất khác chiếm 277.000 ha và đất chuyên dùng
khoảng 262.682 ha [13].