Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống aspergillus, trichoderma và ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
------------------------

Lê Thị Huệ

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HP
ENZYME CHITINASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SI
THUỘC GIỐNG ASPERGILLUS, TRICHODERMA VÀ
ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học
PGS. TS. ĐỒNG THỊ THANH THU

Thành phố Hồ Chí Minh - 2010


DANH MỤC VIẾT TẮT
CPE

chế phẩm enzyme

CT

Canh trường

DNS

3,5-dinitrosalicylic axit

MT

Môi trường

OD

Mật độ quang

∆OD

Hiệu số giữa mật độ quang của mẫu thử thật và thử khơng

UI

Đơn vị hoạt độ enzyme (tính theo đơn vị quốc tế)

PTHQ

Phương trình hồi qui

TB

Giá trị trung bình

topt

Nhiệt độ tối ưu

pHopt

pH tối ưu

Luận văn thạc só

Cao học K18


MỞ ĐẦU
Vi sinh vật là nhóm sinh vật có số lượng nhiều nhất và có khả năng chuyển hóa vật chất
trong thiên nhiên mạnh nhất. Hiện nay người ta khai thác nhiều enzyme từ vi sinh vật và được ứng
dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn khai thác enzyme từ động vật và thực vật,
nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp
enzyme từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hồn tồn
theo qui mơ công nghiệp. Nhiều enzyme được khai thác từ vi sinh vật được tập trung nghiên cứu và
có nhiều ứng dụng trong thời gian qua như protease, amylase, cellulase, pectinase … Những năm
sau này người ta đang chú ý nhiều hơn về một loại enzyme khác nữa là chitinase, đây là enzyme
thủy phân chitin.
Chitin là một polymer sinh học có thể so sánh với các polysaccharide như cellulose, keratin.
Chitin phân bố rất rộng rãi ở dạng cấu trúc cơ bản trong thành tế bào của nấm và là bộ xương ngoài
của tơm cua và cơn trùng. Đây là một polymer có trọng lượng phân tử cao, không tan trong nước,
chứa các đơn phân là N-acetyl-glucosamine liên kết bởi liên kết 1,4-β. Chitin có nhiều cơng dụng
trong nhiều lĩnh vực như y học và cơng nghiệp…
Những enzyme có liên quan đến chuyển hóa và phân giải chitin đang được nghiên cứu nhiều
trong những năm gần đây. Chitin bị phân giải bởi hệ enzyme có tên gọi chung là chitinase. Enzyme
này được sản xuất bởi các tổ chức sống dưới tế bào để phục vụ nhu cầu chức năng sinh lý của
chúng. Sự phân giải chitin dưới tác động enzyme phụ thuộc vào các yếu tố hóa lý (tỉ lệ giữa cơ chất

và enzyme, pH, nhiệt độ…). Trong các nguồn thu nhận chitinase thì chitinase từ vi sinh vật là
nguồn quan trọng. Những nguồn sinh vật để thu nhận enzyme chitinase đáng kể là các chủng vi
khuẩn thuộc các chi Enterobacter và Streptomyces, các chủng nấm sợi thuộc các chi Asperillus,
Penicillium, và Trichoderma, và một số động vật nguyên sinh.
Những năm gần đây có nhiều cơng trình nghiên cứu tập trung vào enzyme chitinase do tiềm
năng ứng dụng to lớn của enzyme này trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong thu nhận tế bào
trần (thể nguyên sinh), sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine và N-acetyl glucosamine, sản
xuất thuốc trừ sâu sinh học, ứng dụng trong y học, trong việc kiểm sốt nấm kí sinh trên cây
trồng…v.v…
Vì những ứng dụng rộng rãi của chitinase như trên, mục đích đề tài chúng tơi nhằm nghiên
cứu sinh tổng hợp chitinase nhằm thu nhận chế phẩm chitinase từ một số chủng nấm sợi và bước
đầu khảo sát một số ứng dụng của enzyme này. Chúng tôi thực hiện đề tài: Khảo sát khả năng sinh
tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và
ứng dụng.

Luận văn thạc só

Cao học K18


Mục tiêu đề tài: Lựa chọn chủng nấm sợi có khả năng tổng hợp chitinase cao, thu nhận chế
phẩm chitinase từ canh trường và bước đầu nghiên cứu một số ứng dụng của chitinase.
Nhiệm vụ của đề tài
- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase của một vài chủng nấm sợi thuộc giống
Aspergillus, Trichoderma. Chọn chủng nấm sợi để nghiên cứu tiếp.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm sợi đã
chọn và tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm.
- Thu nhận chế phẩm chitinase.
- Khảo sát các điều kiện hoạt động tối ưu của chế phẩm chitinase: nhiệt độ, pH, nồng độ cơ
chất, thời gian thủy phân cơ chất.

- Bước đầu thử nghiệm ứng dụng nấm sợi sinh enzyme chitinase hoặc chế phẩm chitinase.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài
Thời gian

: từ tháng 8/2009 – 7/2010

Địa điểm

: Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh

Trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh.

Luận văn thạc só

Cao học K18


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

HỆ ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI

1.1.1. Khái quát về enzyme
1.1.1.1. Cấu trúc [1, 23]
Enzyme là một loại phân tử protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia xúc tác cho các
phản ứng sinh học.
Enzyme có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, được cấu tạo từ các L-acid amin
liên kết nhau bởi liên kết peptid. Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là trung tâm hoạt động
của enzyme.
Enzyme gồm hai nhóm: nhóm enzyme một cấu tử gồm những enzyme có thành phần hóa học

duy nhất là protein; nhóm enzyme hai cấu tử gồm những enzyme có hai thành phần: phần protein
thuần gọi là apoenzyme có vai trị xúc tác, phần thứ hai phi protein là coenzyme là những chất hữu
cơ đặc hiệu có vai trị thúc đẩy q trình xúc tác. Ngồi ra có một số kim loại như Zn, Cu, Mn, Fe ...
đóng vai trị liên kết enzyme và cơ chất trong quá trình xúc tác phản ứng, liên kết giữa apoenzyme
và coenzyme, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử.
1.1.1.2. Cơ chế hoạt động [16, 23]
Trung tâm hoạt động của enzyme (E) có cấu trúc không gian tương ứng với cơ chất mà
chúng xúc tác, phản ứng hình thành trong quá trình enzyme tiếp xúc với cơ chất như “chìa khóa-ổ
khóa“ tạo phức hợp enzyme-cơ chất. Quá trình tác động của enzyme vào cơ chất để tạo sản phẩm
trải qua ba giai đoạn:
Giai đoạn 1: Enzyme (E) tương tác với cơ chất (S) nhờ những liên kết tạo phức E-S
Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzyme (E), cơ chất sẽ bị thay đổi cấu hình khơng
gian và mức độ bền vững các liên kết, liên kết bị phá vỡ tạo sản phẩm.
Giai đoạn 3: Enzyme tách ra, được giải phóng nguyên vẹn. Sản phẩm (P) tạo thành.
Sơ đồ cơ chế tác động enzyme:
E

+

S



E-S



E

+

P

1.1.1.3. Phân loại enzyme [16, 23]
Có nhiều cách phân loại enzyme, ở đây chúng tôi đề cập đến cách phân loại dựa vào kiểu xúc
tác của enzyme. Tại Hội nghị Sinh Hóa học năm 1961 họp tại Moscow đã đề ra một bảng phân loại
mới, trong đó enzyme được chia ra làm 6 lớp chính:
-

Oxydoreductase (lớp enzyme oxy hóa hồn ngun sinh học)

Luận văn thạc só

Cao học K18


-

Transferase (lớp enzyme vận chuyển)

-

Hydrolase (lớp enzyme thủy phân)

-

Liase (lớp enzyme phân giải chất không theo con đường thủy phân)

-

Ligase hay Syntetase (lớp enzyme tổng hợp chất)

-

Isomerase hay Mutase (lớp enzyme đồng phân hóa)

1.1.2. Enzyme chitinase [32]
1.1.2.1. Cấu trúc
Chitinase [Poly- Beta- 1- 4 – (2-acetalmido-2-deoxy) - D-glucoside glucanohydrolase]
thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay
chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử Nacetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14.
3 → Hydrolase
2 → Glycosylase
1 → Glycosidase
14 → Chitinase
Chitinase cịn có các tên gọi khác (tùy theo xuất xứ enzyme) là chitodextrinase, β-poly-Nacetyl glucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC
(Streptomyces griceus) ...
Căn cứ vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18 và
Glycohydrolase 19 và Glycohydrolase 20.
 Họ Glycohydrolase 18
Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote,
Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngồi ra cịn có các enzyme khác
như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase.
Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β
cuộn trịn, chúng hoạt động thơng qua một cơ chế kiểm sốt mà trong đó các đoạn β polymer bị
phân cắt tạo ra sản phẩm là β anomer. [32]
Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như Aeromonas
hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia
marcescens…

Luận văn thạc só

Cao học K18


Hình 1.1. Cấu trúc khơng gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 [68]
 Họ Glycohydrolase 19
Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra cịn có ở xạ khuẩn
Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với một
vịng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển.
Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II,IV.

Hình 1.2. Cấu trúc không gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 [68]
 Họ Glycohydrolase 20
Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi
khuẩn, Streptomyces và người.
Ngồi ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide
nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm:
Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc
tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu
cystein có vai trị quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt
động xúc tác.
Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu
cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase ở nhóm I.
Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn.
Nhóm III: trình tự amino acid hồn tồn khác với chitinase nhóm I và II

Luận văn thạc só

Cao học K18

Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự
amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu
cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I.
Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu
cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong q trình tiến hóa ở thực vật bậc cao.
1.1.2.2. Cơ chế hoạt động của enzyme chitinase [11]
Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-- chitobiosidase, N-acetyl- D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase.
Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn
olygosaccharides, đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma
harzianum (2 loại endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 (± 0,2) và M2 = 40kDa, pI2 = 3,9),
Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8).
Chitin 1,4- - chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các
dimer chitobiose, cụ thể enzyme này được thu từ Trichoderma harzianum (M = 36kDa, pI = 4,4 ±
0,2).
N-acetyl –  - D - glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho
sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine.
Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D-glucosamine.

Hình 1.3. Vị trí phân cắt enzyme chitinase [69]
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo
thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các
diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinase khơng thể phân cắt thêm được nữa.

Luận văn thạc só

Cao học K18

Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của enzyme chitinase ở Trichoderma [11]
Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay
bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầu khơng khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2.
β –N- acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên tục từ đầu
khơng khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc).
Ngồi ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chito-oligosaccharide làm
cơ chất. Các oligsaccharide thường được thủy phân bên trong trên một vài vị trí xác định hoặc một
cách ngẫu nhiên. Một số enyme chitinase có khả năng thủy phân trisaccharid, một số khác thì
khơng. Có hai dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharid và
trisaccharid; một phân cắt bên ngồi tạo các monosaccharid và tetrasaccharid. Tóm lại chitinase
thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên.
Endochitinase, chitobiosidase và β –N- acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ chất
là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin thô thu
từ vỏ tôm. Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp cho endochitinase hơn
là chitobiosidase và -N-acetylhexosaminidase. Chitooligomer (GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi
chitin đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưng -N-acetylhexosaminidase thì hoạt động chậm
hơn trong việc làm giảm độ đục của huyền phù chitin. (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của -Nacetylhexosaminidase nhưng không là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase. Chính vì thế có
thể sử dụng để phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase và -N- acetylhexosaminidase.
Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine.

Luận văn thạc só

Cao học K18


1.1.2.3. Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase [11]
* Trọng lượng phân tử
Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng
30kDa (kilodalton). Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng cư, thú), một số
chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40-90 kDa hoặc cao hơn cả là khoảng 120kDa. Trọng

lượng phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng, từ 30
đến 120 kDa.
* Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis
Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng, từ 3- 10 ở thực vật bậc cao và
tảo; pI từ 4,7-9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá; pI từ 3,5 – 8,8 ở vi sinh vật. Hằng số
Michaelis : 0,010 – 0,011 (g/100ml)
* Ảnh hưởng của nhiệt độ [32, 62]
Theo nhiều nghiên cứu, chitinase hoạt động ở giới hạn nhiệt độ từ 20 – 500C (Frandberg và
Schnure, 1994; Huang và cộng sự, 1996; Bhushan và Hoondal, 1998; Wiwat và cộng sự, 1999;
Bendt và cộng sự, 2001).
Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là 400C, ngoại
trừ chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có nhiệt độ tối thích là
50OC (Jeuniaux, 1963). Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các enzyme chitinase có thể có
những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau. Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III và
chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nóng cho thấy khả năng chịu đựng nhiệt độ
cao đến 800C. Bendt và cộng sự (2001) phát hiện hoạt tính thủy phân chitin mạnh nhất của chitinase
từ Vibrio sp. Từ 30-450C và chitinase chịu nhiệt từ chủng Bacillus sp. BG-11 hoạt tính cao nhất ở
40-600C.
Lorito (1998) đã khảo sát hoạt tính enzyme chitinase từ chủng Trichoderma harzianum
Rifai nhận thấy enzyme này có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ rộng từ 25-600C, nhiệt độ
tối ưu là 400C.
* Ảnh hưởng của pH [32]
Giá trị pH tối thích (pHop) của hệ enzyme chitinase từ 4-9 đối với các enzyme chitinase ở
thực vật bậc cao và tảo; hệ enzyme chitinase ở động vật là 4,8- 7,5 và ở vi sinh vật là 3,5- 8,0.
Theo các nhà khoa học, pHop của enzyme chitinase có thể có sự phụ thuộc vào cơ chất được
sử dụng. Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên cứu có pHop khoảng 5,0 khi cơ chất là glucol
chitin nằm trong khoảng pH kiềm yếu.

Luận văn thạc só

Cao hoïc K18


Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng chitinase hoạt động được trong khoảng pH từ 4,0-8,5
(Morrisey và cộng sự, 1976; Wiwat và cộng sự, 1999; Bendt và cộng sự, 2001). Chitinase của nấm
hoạt tính cao nhất ở pH = 5, trong khi ở vi khuẩn pH tối thích là 8,0. Theo Bhushan và Hoondal
(1998), hoạt tính của chitinase từ Bacillus sp. BG-11 cao nhất ở pH = 8,5.
1.1.2.4. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase [11, 27]
Enzyme chitinase hiện diện ở hầu hết các sinh vật.
Enzyme chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn như Chromobacterium, Klebsiella,
Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes. Vi khuẩn tổng hợp
enzyme chitinase nhằm phân giải chitin trong môi trường nhằm sử dụng nguồn cacbon cho sự sinh
trưởng và phát triển.
Chitinase cũng được tạo ra bởi các loài nấm sợi thuộc các chi Trichoderma, Aspergillus,
Gliocladium, Calvatia ... và cả ở các nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus ...
Enzyme chitinase được thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại các nấm kí sinh gây
bệnh cho cây trồng. Những thực vật bậc cao có khả năng tạo chitinase như thuốc lá (Nicotiana sp.),
cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) ... và đặc biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp
enzyme chitinase.
Từ một số động vật nguyên sinh, từ các mô và tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều
lồi động vật khơng xương như ruột khoang, giun trịn, thân mềm, chân đốt ... có thể thu nhận được
enzyme chitinase. Đối với động vật có xương sống, enzyme chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và
dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những loài chim, thú
ăn sâu bọ.
Ngoài ra, enzyme chitinase cịn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun trịn trong suốt q
trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các lồi chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da. Enzyme
chitinase giúp cơn trùng tiêu hóa màng ngồi (cuticun) của chúng trong q trình biến thái hay lột
xác.
1.1.3. Chitin (cơ chất của chitinase)
1.1.3.1. Lịch sử nghiên cứu chitin [55]

Chitin được mô tả lần đầu tiên bởi Braconnot vào năm 1811, khi nghiên cứu loài nấm
Agaricus volvaceus và một vài loài nấm khác xử lý với dung dịch kiềm, ông thu được sản phẩm và
đặt tên là chitin (chitin có nguồn gốc từ Hy Lạp là “tunnic” nghĩa là lớp vỏ bọc).
Hai năm sau Odier bắt đầu chú ý đến bản chất, cấu trúc của chitin.
Năm 1843, Lassaige chứng minh rằng trong chitin có sự có mặt của nitrogen.

Luận văn thạc só

Cao học K18


1.1.3.2. Chitin trong tự nhiên [30, 56, 57]
Chitin là một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, là một polyme sinh học được tổng hợp
với số lượng lớn từ sinh vật. Lượng chitin được sản xuất hàng năm trên thế giới chỉ đứng sau
cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g trong 1 năm/1m2 bề mặt trái đất. Trong tự nhiên chitin
tồn tại ở cả động vật và thực vật.
Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong lớp vỏ của một số
động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun trịn. Trong giới thực vật,
chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae.
Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đó là cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với
nhau bằng các liên kết hydro tạo thành một hệ thống sợi. Trong tự nhiên, chitin hiếm khi tồn tại ở
trạng thái tự do mà gần như luôn luôn liên kết dưới dạng phức hợp chitin- protein. Điều này dẫn đến
sự đề kháng với các hóa chất và các enzyme thủy phân, gây nhiều khó khăn cho việc chiết tách, tinh
chế chúng. Tùy thuộc vào các đặc tính cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng
một lồi có thể thấy sự thay đổi về lượng và chất của chitin.
Trong động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực, hàm lượng chitin
chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khơ. Vì vậy vỏ tơm, cua ghẹ, mai mực là nguồn
ngun liệu chính để sản xuất chitin và các sản phẩm từ chúng.
Chitin được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lượng khác nhau [45,51]
Bọ cánh cứng

37%

Nhện

38%

Bị cạp

30%

Sâu

20-38%

Nấm

5-20%

Tơm

33%

Cua

70%

Mực

3-20%

Mặc dù chúng được phổ biến rộng rãi nhưng cho đến nay nguồn thu nhận chính của chitin là
từ vỏ cua và tơm. Trong cơng nghệ chế biến, do chitin tồn tại ở dạng phức hợp với một số chất như:
CaCO3, protein, lipid, các chất hữu cơ … nên việc tách chiết cịn khó khăn vì phải đảm bảo cả hai
yếu tố cùng một lúc là vừa loại hết tạp chất đồng thời không làm biến đổi tính chất của chitin.

Luận văn thạc só

Cao học K18


1.1.3.3. Cấu trúc phân tử và tính chất của chitin
 Cấu trúc phân tử [57, 58]
Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng
chitin là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-β-D-Glucosamine liên kết với nhau bởi
liên kết 1-4 glucoside.

Hình 1.5. Cấu trúc chitin [61]
Chitin có cấu trúc lạp thể gồm 3 dạng như : α, β và γ, sự khác nhau này thể hiện ở sự sắp xếp
các chuỗi. Các chuỗi α–chitin xếp xuôi, ngược xen kẽ nhau, tuy nhiên, chúng có một cặp xếp cùng
chiều, ở chuỗi β – chitin các chuỗi sắp xếp theo một chiều nhất định, còn ở chuỗi γ – chitin có các
cặp chuỗi xếp cùng chiều so le với một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc.

Hình 1.6. Cấu trúc của alpha-chitin [61]
 Tính chất của chitin [27, 31]
Chitin ở thể rắn, có cấu trúc bền vững nhờ các liên kết hydro trong và giữa các mạch. Chitin
không tan trong nước, trong dung dịch acid và kiềm loãng, trong cồn và trong các dung mơi thơng
thường. Nó chỉ tan được trong một số acid vơ cơ đặc (HCl, H2SO4, H3PO4…).

Luận văn thạc só

Cao học K18


1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme của nấm sợi trên môi trường lên men
bán rắn [14, 35, 36]
1.1.4.1 Thành phần môi trường nuôi cấy nấm sợi sinh chitinase [4, 11, 29]
 Nguồn dinh dưỡng cacbon
Nấm sợi có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác nhau, trong đó nguồn
cacbonhydrat là dễ hấp thu nhất, trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng
trong ba chu trình chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff.
Do chitinase vừa là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng nên trong môi trường ni
cấy nấm sợi sinh chitinase, cần có nguồn chitin là chất cảm ứng và là nguồn cacbon nhằm tăng khả
năng sinh tổng hợp enzyme chitinase. Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh enzyme chitinase là
chitin (có thể dạng huyền phù, dạng bột hay dạng thô) và các dẫn xuất của chitin. Nghiên cứu của
Jesús de la Cruz và cộng sự (1922) chỉ ra rằng Trichoderma harzianum chỉ tạo ra chitinase khi có
nguồn cacbon từ chitin chứ khơng từ nguồn khác như cellulose hay chitosan.
 Nguồn dinh dưỡng nitơ
Nguồn nitrogen có ý nghĩa lớn đến q trình sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi. Theo
Kapat và cộng sự (1996), khi loại ure ra khỏi môi trường nuôi cấy sẽ làm tăng khả năng tổng hợp
chitinase. Takashi và cộng sự (2002) nghiên cứu khả năng sinh chitinase từ nấm sợi Aspergillus sp.
đã chỉ ra rằng hoạt tính chitinase cao khi sử dụng nguồn nitơ từ (NH4)2SO4. Theo Nampoothiri và
cộng sự (2003), khi bổ sung 2,0% (w/w) cao nấm men vào mơi trường ni cấy bán rắn thì khả
năng tạo chitinase ở Trichoderma harzianum tăng đáng kể. Tuy nhiên, theo Kovacs và cộng sự
(2003), trong nuôi cấy bán rắn, nguồn nitrogen bổ sung vào môi trường cám gạo-chitin không ảnh
hưởng đến khả năng tạo chitinase. Suresh và Chandrasekharan (1999) cũng ghi nhận sự gia tăng sản
lượng enzyme này khi môi trường nuôi cấy Trichoderma harzianum được cung cấp muối amonium
phosphat và cao nấm men. N. N. Nawani và B. P. Kapadnis trong q trình nghiên cứu tối ưu hóa
bằng phương pháp thiết kế thí nghiệm dựa trên tốn thống kê cho thấy đối với Streptomyces sp. NK
1057 khi cung cấp nguồn nitơ từ cả hai nguồn là cao nấm men và (NH4)2SO4 thì sản lượng chitinase

tăng từ 4 – 10% so với dùng riêng lẻ các nguồn này. [33]
 Nguồn dinh dưỡng khoáng
Các chất khoáng như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu ... có vai trị quan trọng như tham gia vào q
trình chuyển hóa vật chất qua màng và thành tế bào nấm sợi, tham gia thành phần cấu tạo protein,
enzyme, điều hịa pH mơi trường ni cấy nên ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme nói
chung, chitinase nói riêng.

Luận văn thạc só

Cao học K18


1.1.4.2. Yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme chitinase của nấm sợi
- Ảnh hưởng của độ ẩm
Độ ẩm có ý nghĩa trong ni cấy bán rắn. Theo Matsumoto và cộng sự (2001), với độ ẩm
75%, chủng Verticillium lecanii ATCC 26854 sinh chitinase có hoạt tính cao nhất. Đối với
Trichoderma harzianum, hoạt tính chitinase cao nhất ở độ ẩm môi trường là 65% (Nampoothiri và
cộng sự, 2003). Takashi và cộng sự (2002) chỉ ra rằng nấm sợi Aspergillus sp. tổng hợp chitinase
có hoạt tính cao ở điều kiện độ ẩm môi trường 57%.
- Ảnh hưởng của pH
Giá trị pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase
của các chủng nấm sợi. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH mơi trường ban đầu thích hợp
là acid, trung tính hay kiềm. Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện pH
= 5-6 (Takashi và cộng sự, 2002). Nhiều nghiên cứu trên Trichoderma harzianum chỉ ra rằng pH
thích hợp cho nấm này sinh trưởng tạo chitinase có hoạt tính cao khoảng pH = 4-6 (Nguyễn Thị
Hồng Thương và các đồng tác giả, 2003).
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của nấm sợi. Nhiệt
độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ 28-320C, tối đa dưới 500C. Nhiệt độ quá cao hoặc
q thấp có thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậm chí có thể giết chết sợi nấm, q trình tổng hợp

enzyme sẽ bị ức chế. Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất ở điều kiện nhiệt độ
370C (Takashi và cộng sự, 2002)
- Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng
Chitinase có thể là enzyme cảm ứng hoặc enzyme cấu trúc. Tuy nhiên trong các môi trường
nuôi cấy vi sinh vật người ta đều bổ sung thêm cơ chất chitin nhằm tăng khả năng tạo chitinase.
Nhìn chung sự hiện diện của chitin trong mơi trường ni cấy hữu ích cho việc tạo chitinase
(Monreal và Reese, 1969; Ulhoa và Peberdy, 1993). Trong số các cơ chất, chitin huyền phù có khả
năng kích thích tạo chitinase cao nhất (Bhushan, 2000; Nampoothiri và cộng sự, 2003). Trong hầu
hết các trường hợp, khi nồng độ chitin khoảng 1-1,5% là vi sinh vật có khả năng tạo chitinase (Felse
và Panda, 2000).
Năm 2003, Binod và cộng sự đã sử dụng nhiều cơ chất khác nhau (như vách tế bào nấm, vỏ
tôm, cua ...) để tạo chitinase từ nấm sợi nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Việc tận dụng phế liệu
này vừa đem lại hiệu quả kinh tế, vừa góp phần giảm thiểu ơ nhiễm môi trường.
Nghiên cứu của Đinh Minh Hiệp và các đồng tác giả (2003) chỉ ra rằng hệ enzym chitinase
của Trichoderma sp. có thể được cảm ứng bởi vách tế bào vi nấm (Curvularia oryzae, Phytophthora

Luận văn thạc só

Cao học K18


primulae), vách tế bào nấm lớn (Schizophyllum commune, Trametes versicolor) hoặc chitin vỏ tơm,
trong đó vách tế bào nấm cảm ứng quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của Trichoderma tốt
hơn chitin vỏ tôm.
1.1.5. Những ứng dụng của enzyme chitinase [30, 33]
1.1.5.1. Ứng dụng trong việc thu nhận tế bào trần (thể nguyên sinh)
Thể nguyên sinh của tế bào nấm đã được sử dụng như một cơng cụ thí nghiệm có hiệu quả
trong việc nghiên cứu q trình hình thành thành tế bào, quá trình tổng hợp enzyme, quá trình bài
tiết chất cũng như việc cải tiến các chủng nấm ứng dụng trong công nghệ sinh học. Do trong thành
tế bào nấm có chứa chitin, hệ enzyme thủy phân chitin là một trong những nhân tố có thể sử dụng

để phá vỡ thành tế bào, tạo tế bào trần từ tế bào nấm.
Dahiya và cộng sự (2005) đã mô tả hiệu quả của enzyme chitinase thu nhận từ chủng
Enterobacter sp. NRG 4 trong việc tạo tế bào trần từ nấm Trichoderma reesei, Aspergilllus niger,
Pleutotus florida ...
Mizuno và cộng sự (1997) tách tế bào trần từ Schizophyllum commune bằng cách sử dụng
dịch lọc môi trường nuôi Bacillus circulans KH – 304. Phức hợp enzyme từ Bacillus circulans WL
– 12 với hoạt tính chitinase cao đã rất hiệu quả trong việc thu nhận tế bào trần từ Phaffia rhozyme
(Johnson và cộng sự, 1979).
1.1.5.2. Ứng dụng trong việc sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine và N- acetyl
glucosamine
Chitooligosaccharides, glucosamine và N- acetyl glucosamine là chất có tiềm năng rộng lớn
trong y dược. Chitooligosaccharides có lợi ích tiềm năng đối với sản xuất thuốc cho người. Ví dụ,
chitohexaose và chitoheptaose được phát hiện có tính kháng các khối u.
Chitinase thu nhận từ Vibrio alginolyticus đã được sử dụng để sản xuất chitopentaose và
chitotriose từ cơ chất chitin huyền phù (Murao và cộng sự, 1992).
Sự kết hợp giữa các enzyme thủy phân chitin cần thiết để thu nhận những oligomer có chiều
dài chuỗi mong muốn. Ví dụ, để tạo chitooligosaccharides cần tỉ lệ endochitinase, tỉ lệ thấp N-acetyl
glucosamindase và exochitinase; trong khi để tạo N- acetyl glucosamine thì cần tỉ lệ cao
exochitinase và N-acetyl glucosamindase. (Aloise và cộng sự, 1996) nhận thấy khi ủ enzyme
chitinase với tetramer hoặc pentamer thu nhận từ Nocardia oritentalis thì thấy có sự hình thành các
hexamer.
Sashiwa và cộng sự (2002) đã sản xuất N- acetyl glucosamine từ α-chitin bằng cách sử dụng
dịch enzym thơ từ Aeromonas hydrophila H-2330.

Luận văn thạc só

Cao học K18


1.1.5.3. Ứng dụng trong việc nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học

Chitin có mặt trong lớp vỏ ngồi và ống tiêu hóa của cơn trùng. Villagomez-Castro và
Lopez-Romero (1996) đã chỉ ra rằng các sự sự kiện thuộc về hình thái học ở nấm ln có sự tham
gia của enzyme chitinase. Allosamidin, một chất ức chế mạnh của enzyme chitinase, được nhận
thấy có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của các loài như ve bét, ấu trùng nhặng sau khi chúng ăn
vào (Sakuda và cộng sự, 1987).
1.1.5.4. Ứng dụng trong việc ước tính sinh khối nấm
Các nhà nghiên cứu đã mơ tả một loại phương pháp khác để ước tính lượng nấm có trong
đất. Kỹ thuật bao gồm việc quan sát dưới kính hiển vi và ly trích những chất chỉ thị đặc trưng cho
nấm như glucosamine ergosterol.
Có sự liên quan chặt chẽ giữa hoạt tính của chitinase và lượng nấm có trong đất. Sự liên quan
như thế khơng thấy xuất hiện với vi khuẩn và xạ khuẩn. Chính vì thế, chitinase trở thành yếu tố chỉ
thị thích hợp cho mức sinh trưởng của nấm trong đất (Miller và cộng sự,1998). Tương tự, chitinase
và protein gắn kết với chitin có thể được sử dụng để dự báo sự lây nhiễm nấm trên con người (Laine
và Lo, 1996).
1.1.5.5. Ứng dụng trong việc kiểm sốt muỗi
Chitinase đóng vai trị quan trọng đối với hình thái nấm men, cơn trùng. Kuranda và Robbins
(1991) chỉ ra vai trò của chitinase trong sự phân chia tế bào trong suất quá trình sinh trưởng của
nấm men Sacharomyces cerevisiae.
Người ta chỉ ra rằng ấu trùng muỗi Aedes aegypti có thể bị giết trong vịng 48 giờ với sự tác
động của chế phẩm thô từ nấm Myrothecium verrucaria. Nấm gây bệnh cơn trùng như Beauveria
bassiana có thể gây nhiễm trứng của muỗi Aedes aegypti. Điều này mở ra tiềm năng trong việc sản
xuất chất kiểm sốt cơn trùng truyền bệnh như muỗi.
1.1.5.6. Ứng dụng trong y học
Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu sử dụng enzyme chitinase trong việc chẩn đoán
các bệnh truyền nhiễm do nấm gây ra. Chitin hiện diện trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất
là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm. Hay ở nấm men thì chitin hiện diện trong những vết
chồi. Do đó có thể dùng phương pháp nhuộm chitin đặc hiệu cho nấm, tạo cơ sở xây dựng một
phương pháp chẩn đốn nhanh các lồi nấm gây bệnh. Các nhà khao học đã đề xuất một phương
pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng chitinase đã được phân lập tạo dòng
từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên chitinase VP1), enzyme này kết hợp chặt chẽ với chitin và có thể

Luận văn thạc só

Cao hoïc K18


sử dụng như một mẫu dị trong việc chẩn đốn với độ nhạy cao để nhận diện một cách đặc hiệu các
vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mơ bệnh. [32]
Ngồi ra, chitinase có tiềm năng trong việc sản xuất các loại kem hay thuốc bơi ngồi da
chứa chất chống nấm bệnh thường xảy ra các nước vùng nhiệt đới bởi khả năng phân hủy vách tế
bào vi nấm của chúng.
1.1.5.7. Ứng dụng trong việc kiểm soát nấm gây bệnh trên cây trồng
Nhiều lồi cơn trùng và nấm mốc có hại cho cây trồng và vật nuôi do gây ra nhiều loại dịch
bệnh, ảnh hưởng trực tiếp đến sản xuất nông nghiệp. Vì chitin khơng phải là thành phần phổ biến ở
thực vật và động vật có xương nên người ta sử dụng các tác nhân kìm hãm sự sinh tổng hợp chitin
trong các nấm và côn trùng như 1-(2,6-dichlorobenzoyl)-3-(3,4-dichlorophenol), nikkomycin,
polyoxin D ...Khi áp dụng trên cây cảnh, cây lương thực và trên động vật, những tác nhân trên
chứng tỏ có nhiều ưu thế trong việc tiêu diệt nấm mốc, côn trùng có hại mà khơng gây hại đáng kể
cho thực vật hoặc động vật có xương sống.
Theo Hirohi Ihui, enzyme chitinase ln có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây
không chứa chitin. Chitinase và β-1,3-glucanase được tạo ra trong mơ thực vật khi tế bào bị kích
thích bởi nấm gây bệnh chứa chitin, xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển
của bệnh. Chitinase sản xuất bởi Enterobacter sp. NRG4 có hoạt tính cao đối với Fusarium
moniliforme, Aspergillus niger, Mucor rouxii và Rhizopus nigricans (Dahiya và cộng sự, 2005).
Bhushan và Hoodal (1998) nghiên cứu về tính tương thích của những chitinase chịu nhiệt từ
Bacillus sp. BG-11 với thuốc diệt côn trùng và thuốc diệt nấm thường được sử dụng. Chitinase từ
Bacillus cereus YQ308 ức chế sự phát triển của nấm bệnh thực vật như Fusarium oxyporum, F.
Solani, Penicillium ultimum (Change và cộng sự, 2003). CHIT42, CHIT40 và CHIT72 từ
Trichoderma harzianum P1 và Trichoderma virens 41 có thể tác động trên sự nảy mầm và sự kéo
dài của sợi nấm của nhiều nấm gây bệnh thực vật như Fusarium spp., Alternaria spp., Ustilago

avenae, ... khi chúng được ủ với dịch enzyme.
1.1.5.8. Ứng dụng trong sản xuất protein đơn bào
Chất thải rắn từ quá trình chế biến tơm chứa chủ yếu là chitin, CaCO3 và protein. RevahMoiseev và Carrod (1981) đã đề nghị sử dụng loại chất thải này để chuyển đổi bằng phương pháp
sinh học chitin thành protein đơn bào nhờ sử dụng enzyme thủy phân chitin. Họ sử dụng enzyme
chitinase thu nhận từ Saccharomyces marcescens để thủy phân chitin và Pichia Kudriavazevii để
sản xuất protein đơn bào (với 45% protein và 8-11% acid nucleic). Những nấm thường được dùng

Luận văn thạc só

Cao hoïc K18


để sản xuất protein đơn bào là Hansenula polymorpha, Candida tropicalis, Sacharomyces
cerevisiae và Myrothecium verrucaria.
Vyas và Deshpande (1991) đã dùng enzyme thủy phân chitin thu nhận từ Myrothecium
verrucaria và dùng Sacharomyces cerevisiae để sản xuất protein đơn bào từ chất thải chứa chitin.
Tổng hàm lượng protein thu được là 61%, với tỉ lệ rất thấp acid nucleic (3,1%). Các nghiên cứu chỉ
ra rằng Sacharomyces cerevisiae là chủng tốt nhất để sản xuất protein đơn bào (60% protein và chỉ
1-3% acid nucleic).

1.2.

ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI NGHIÊN CỨU

1.2.1. Các chủng thuộc chi nấm Aspergillus [7,8, 60]
1.2.1.1. Vị trí phân loại
Giới: Nấm
Ngành: Ascomycota
Lớp: Eurotiomycetes
Bộ: Eurotiales

Họ: Trichocomaceae
Giống: Aspergillus
1.2.1.2. Đặc điểm hình thái
Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, khơng màu, màu nhạt, một số trường hợp trở nên nâu
hay màu sẫm khác ở một vùng nhất định của khuẩn lạc.
Aspergillus niger khi nuôi cấy trên môi trường thạch-khoai tây-dextrose ở 250C cho khuẩn
lạc ban đầu màu trắng, sau nhanh chóng chuyển sang màu đen với việc tạo vơ số bào tử đính, mặt
trái khuẩn lạc màu hơi vàng nhạt và khi trưởng thành có thể tạo đường rãnh phóng xạ trên bề mặt
thạch. Aspergillus awamori khi nuôi cấy trên mơi trường Czapek cho khuẩn lạc đạt kích thước 4,55,0cm sau 7 ngày ở nhiệt độ 250C, cịn trên mơi trường MEA (cao malt) cho kích thước khuẩn lạc
lớn hơn. Khuẩn lạc có màu nâu nhạt, dần chuyển sang đậm. Hệ sợi trắng dần ngả vàng sậm.
Cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn, các chuổi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp
mọi hướng. Bào tử trần khơng có vách ngăn, khác nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc ... ở các
loài khác nhau.
Theo Bùi Xuân Đồng, Aspergillus niger có bào tử đính trưởng thành hình cầu, phần lớn 4,05,0µm, xù xì khơng đều với những gờ rõ và gai không sắp xếp thành vạch kẻ dọc theo chiều dài.

Luận văn thạc só

Cao học K18


Aspergillus awamori có bơng mau chóng chuyển màu nâu hơi đỏ, mặt trái khuẩn lạc màu tương tự,
cuống bào tử đính phần lớn phát triển dài 1,0-1,5mm, bào tử đính phần lớn đường kính 4,0 đến 4,5
µm.

A

B

Hình 1.7. Hình thái nấm Aspergillus niger [62, 63]
(A): bào tử, (B): Khuẩn lạc trên mơi trường PGA

Hình 1.8. Hình thái nấm Aspergillus awamori [63]
(A): Khuẩn lạc trên MT Czapek; (B): Khuẩn lạc trên MT MEA
(C), (D), (E): hình thái bào tử
1.2.1.3. Đặc điểm sinh lý, hóa sinh
Nấm Aspergillus có mặt khắp nơi trong tự nhiên, chúng phân bố rộng và dễ thích nghi vì
chúng có thể hình thành khuẩn lạc trên nhiều nguồn cơ chất khác nhau.

Luận văn thạc só

Cao học K18


Nghiên cứu của Andrea Astoreca và cộng sự cho thấy nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng
của Aspergillus niger, Aspergillus awamori khoảng 25 - 300C. Theo Takashi và cộng sự (2002),
nhiệt độ thích hợp để Aspergillus sp. tổng hợp chitinase có hoạt tính cao nhất là 370C.
Wainwright và cộng sự đã chỉ ra rằng, pH thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm Aspergillus
awamori là khoảng 5.0-7.0. Độ pH quá acid (khoảng 2-3) sẽ ngăn cản sự tạo thành bào tử, dẫn đến
hệ sợi bị phân tán khi nuôi cấy chìm.
Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về enzyme của nấm Aspergillus niger, gồm amylase,
amyloglucosidase, cellulase, lactase, invertase, pectinase ... Ngoài ra chitinase của nấm này cũng
được đề cập đến trong Hội nghị Quốc tế về Aspergillus tại Nertheland vào tháng 3 năm 2010 [60].
Vấn đề độc tố của Aspergillus niger cũng được đề cập đến, phần lớn chúng khơng có hại,
nhưng một số có thể tạo độc tố gây hại đến động vật và con người. Sự an toàn của Aspergillus niger
được đề cập đến trong nhiều bài báo của các tác giả Schuster và cộng sự (2002), Van Dijck và cộng
sự (2003), Blumenthal (2004), Olemspka-Beer và cộng sự (2006) [41]. Theo thơng tin tóm tắt từ
những bài báo của các tác giả này, khoảng 3-10% các chủng Aspergillus niger có khả năng sinh ra
độc tố trong những điều kiện nuôi cấy xác định như ochratoxin A.

1.2.2. Trichoderma harzianum [5, 12, 54]

1.2.2.1. Vị trí phân loại
Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong phân loại do các
đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chưa được biết đầy đủ.
Theo Rifai (1969), Barnett và Hunter (1972), Trichoderma thuộc lớp nấm, nấm bất toàn
Deuteromycetes (Fungi imperfect), chúng được phân loại như sau:
Giới:

Nấm

Nghành:

Ascomycota

Lớp:

Deuteromycetes

Bộ:

Moniliales

Họ:

Moniliceae

Giống:

Trichoderma

Một số tài liệu phân loại giống Trichoderma thuộc họ Moniliacae, bộ Moniliales, lớp nấm,

nấm bất tồn (Fungi imperfecti).

Luận văn thạc só

Cao hoïc K18


1.2.2.2. Đặc điểm hình thái [62, 63]
Khuẩn lạc Trichoderma harzianum ban đầu có màu lục trắng, sau dần dần chuyển sang màu
lục sẫm, mặt dưới khuẩn lạc không màu.
Bào tử áo hình cầu, nhẵn, khơng màu, đường kính 6-12 m, ở giữa sợi nấm hoặc đính ở các
nhánh.
Giá bào tử trần ngăn vách, phân nhánh 2-3 lần, đường kính 4 - 5 m, dài tới 250 m. Thể
bình có kích thước 3-4 x 5-7m, thường thành 2-5 cái ở đỉnh nhánh tận cùng, ở dọc các nhánh
thường đơn độc. Thể bình ở giữa thường dài tới 17 m và có đường kính nhỏ hơn, phần rộng nhất
khoảng 2-3 m. Bào tử trần hình gần cầu, hình trứng, phần gốc hơi bẹt, nhẵn, màu lục nhạt, khơng
vách ngăn, kích thước 2-3 x 3-3,5 m, nhày ở thể bình.

Hình 1.9. Hình thái bào tử và khuẩn lạc của Trichoderma harzianum [64]
1.2.2.3. Đặc điểm sinh lý, hóa sinh
Trichoderma harzianum được tìm thấy ở những vùng ấm áp. Theo nghiên cứu của Domsch
và cộng sự (1980), nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển của Trichoderma harzianum vào
khoảng 30C, tối đa khoảng 36C. Trichoderma harzianum cũng có thể phát triển ở nhiệt độ khoảng
5C, nhưng sinh trưởng rất chậm và yếu .
Trichoderma harzianum tổng hợp enzyme chitinase và các chất kháng sinh (Trichodermin,
glyotosin…).Vấn đề độc tố của Trichoderma harzianum chưa được biết đến.

1.3.

SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE

1.3.1. Trên thế giới
So với các enzyme khác như protease, amylase, pectinase ... thì hệ enzyme chitinase được
nghiên cứu chậm hơn và các công trình nghiên cứu về chúng cịn hạn chế. Đối tượng được nghiên
cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn Streptomyces (L.R. Berger và D.M. Renolds, 1958; R.
Grupta, R. K. Saxena, P. Chatuvedi và J. S. Windi, 1995). Những nghiên cứu trên đối tượng này
nhằm thu nhận chitinase ứng dụng chủ yếu vào việc phá vỡ vách tế bào nấm. Năm 1978, P.A.

Luận văn thạc só

Cao học K18


Carroad và R. A. Tom có cơng trình nghiên cứu việc sử dụng phương pháp sinh học trong xử lý
chất thải chứa chitin, và tiếp đó là nghiên cứu của I. G. Cosio, R. A. Fisher, P. A (1982) đề cập đến
quá trình sản xuất enzyme nhằm xử lý chất thải chứa chitin.
Về sau, trong những năm 1989, việc thu nhận chitinase được tiếp tục nghiên cứu trên các đối
tượng khác như Serratia liquefaciens (S. Joshi, Kozlowski), Myrothecium verrucaria (P. Vyas và
M. V. Deshpand) và vẫn chủ yếu tìm hiểu ứng dụng của chitinase trong việc phá vỡ vách tế bào
nấm.
Những năm gần đây, chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối tượng nấm sợi Trichoderma.
Năm 1991, C. J. Ulhoa, J. F. Peberdy nghiên cứu sự điều hịa q trình sinh tổng hợp chitinase của
Trichoderma harzianum. Năm 1999, P. A. Felse và T. Panda nghiên cứu tối ưu hóa q trình sinh
tổng hợp chitinase từ Trichoderma hazianum. Năm 2000, P. A. Felse và T. Panda nghiên cứu q
trình ni cấy chìm thu nhận chitinase từ Trichoderma harzianum trong bể lắc. Năm 2003, Ashok
Pandey và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa q trình tổng hợp chitinase có tính kháng nấm từ
Trichoderma harzianum nuôi cấy trên môi trường bán rắn. Dường như Trichoderma là chi nấm đến
nay được phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao, ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt trong
bảo vệ thực vật. Đối với chi nấm Aspergillus cũng đã có một số cơng trình nghiên cứu về khả năng
sinh chitinase của chúng trên môi trường bán rắn (Nopakarn Rattanakit và cộng sự, 2002). Những

chủng thuộc chi nấm này được nghiên cứu thu nhận chitinase là Aspergillus carneus (A. A. Sherief,
1990); A. Fumigatus (Jin-Ian Xia và Jing Xiong, 2009). A. A. Shubakow và P. S. Kucheryavykh
(2003) đã nghiên cứu nuôi cấy nhiều chủng nấm khác nhau trong đó có các chủng thuộc các chi
nấm Aspergillus và Trichoderma... Tuy nhiên những nghiên cứu về chitinase từ nấm sợi phần lớn
thực hiện trên môi trường nuôi cấy lỏng.
Vi khuẩn cũng là một đối tượng được nghiên cứu về việc sinh tổng hợp chitinase. Năm 1998,
B. Bhushan, G. S. Hoondal nghiên cứu enzyme chitinase chịu nhiệt từ Bacillus sp G-1. Và gần đây
nhất, năm 2009, S. M. Akhir và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa mơi trường ni cấy thu nhận
enzyme chitinase từ Bacillus licheniformis bằng phương pháp nghiên cứu bề mặt đáp ứng (RSM).
Ưu điểm của chitinase thu nhận từ vi khuẩn này là tính bền nhiệt của chúng.
Trên đối tượng thực vật, cũng có một vài nghiên cứu thu nhận chitinase. Năm 2004, Isabela
S. Santos và cộng sự có cơng trình nghiên cứu về chitinase thu nhận trên đối tượng thực vật (hạt cây
Adenanthera pavonina L.), cây họ đậu Phaseolumungo. Kết quả cho thấy chitinase từ hạt cây
Adenanthera pavonina L. là loại enzyme bền nhiệt. Tác giả Wen-Chi Hou, Yaw-Huei Lin, YingChou Chen (1998) nghiên cứu thu nhận chitinase chiết rút từ lá khoai lang.

Luận văn thạc só

Cao học K18


1.3.2. Trong nước
Nhìn chung những nghiên cứu về enzyme chitinase trong nước còn rất hạn chế cho dù tiềm
năng ứng dụng rộng rãi của enzyme này là không thể phủ nhận. Năm 2001, tác giả Đinh Minh Hiệp
có cơng trình nghiên cứu đặc tính của enzyme chitinase thu nhận từ nấm mật Coprinus fimentarius
và một số ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và y dược.
Năm 2003, các tác giả Nguyễn Thị Hồng Thương, Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu có
cơng trình nghiên cứu khảo sát một số yếu tố tác động lên quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme
chitinase của các chủng nấm mốc Trichodrema sp. Năm 2004, tác giả Tô Duy Khương thực hiện đề
tài khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp. và khả năng đối kháng với một số nấm
gây bệnh. Năm 2008, tác giả Nguyễn Đình Nga và cộng sự khảo sát khả năng tác động lên nấm

Candida albicans của enzyme chitinase thu nhận từ thực vật và từ nấm Trichoderma.
Trên đối tượng thực vật, năm 2008, tác giả Đặng Trung Thành đã nghiên cứu quá trình thu
nhận enzyme chitinase từ cây khoai lang Ipomoea batatas, thu enzyme chitinase có hoạt tính khá
cao (hoạt độ đạt 192 UI/ml)
Nhìn chung, những nghiên cứu về chitinase trong nước chưa nhiều, chủ yếu vẫn trên nấm
Trichoderma, ứng dụng chủ yếu mới đề cập đến trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và khởi đầu trong
lĩnh vực y dược.

Luận văn thạc só

Cao học K18


Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1

NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Giống vi sinh vật
Các chủng nấm sợi Aspergillus niger và Aspergillus awamori, Aspergillus sp., Trichoderma
harzianum do phịng thí nghiệm, bộ mơn Sinh hóa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố
Hồ Chí Minh và bộ mơn Vi sinh, trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
2.1.2 Các mơi trường sử dụng trong thí nghiệm
2.1.2.1. Mơi trường nuôi cấy và giữ giống nấm sợi
MT 1: Cao nấm men agar – Yeast Extract Agar (YEA) [1, 12]
Cao nấm men

4g

Agar

20g

Glucose

20g

Nước

1000ml

pH = 5,5 – 6,0
Khử trùng 1atm/30 phút
MT 2: Thạch khoai tây Dextrose (PDA) [6, 10, 26]
Nước chiết khoai tây

200ml

Agar

20g

Glucose

20g

Nước

1000ml

pH = 5,5 – 6,0
Khử trùng 1atm/30 phút
MT 3: Malt Extract Agar (YEA) [11,26]
Cao Malt

20g

Pepton

1g

Agar

20g

Glucose

20g

Nước

1000ml

pH = 5,5 – 6,0
Khử trùng 1atm/30 phút
2.1.2.2. Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym chitinase [12, 13, 29]

Luận văn thạc só

Cao học K18