Nghiên cứu tạo mạch máu nhân tạo từ giá thể động mạch vô bào và tế bào tiền thân nội mô người hướng tới ứng dụng điều trị bệnh tim mạch

i

MỤC LỤC
MỤC LỤC ............................................................................................................................ i
TÓM TẮT............................................................................................................................. i
ABSTRACT ........................................................................................................................ ii
DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ ..................................................................................... vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH.......................................................................................................... viii
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................... vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................................... 1
MỤC TIÊU .......................................................................................................................... 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................................... 3
1.1.

Cấu tạo mạch máu .................................................................................................. 3

1.2.

Căn bệnh xơ vữa mạch máu ................................................................................... 4

1.3.

Các phương pháp chữa trị hiện nay ....................................................................... 6

1.4.

Giá thể mạch máu .................................................................................................. 8

1.5.

Các phương pháp tạo giá thể mạch máu vô bào .................................................... 9

1.6.

Tế bào tiền thân nội mơ (EPC) ............................................................................ 11

1.6.1.

Đặc điểm hình thái tế bào EPC được nuôi cấy ............................................. 11

1.6.2.

Đặc điểm kháng nguyên bề mặt của tế bào EPC .......................................... 14

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP ......................................................................................... 17
2.1.

Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 17

2.1.1.

Động mạch vành heo ..................................................................................... 17

2.1.2.

Máu cuống rốn người .................................................................................... 17

2.2.

Sơ đồ thí nghiệm tổng quát .................................................................................. 18

ii

2.3.

Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 18

2.3.1.

Phương pháp thu nhận tế bào tiền thân nội mô ............................................. 18

2.3.2.

Phương pháp tách tế bào EPC khỏi đĩa nuôi cấy và cấy chuyền .................. 19

2.3.3.

Phương pháp đánh giá tế bào EPC ................................................................ 19

2.3.4.

Phương pháp xử lý động mạch vành heo ...................................................... 22

2.3.5.

Phương pháp đánh giá hiệu quả khử tế bào .................................................. 25

2.3.6.

Phương pháp khử trùng mạch máu vô bào.................................................... 27

2.3.7.

Phương pháp đánh giá độc tính của giá thể mạch máu vơ bào. .................... 28

2.3.8.

Phương pháp cấy tế bào EPC lên giá thể mạch máu vơ bào ......................... 28

2.3.9.

Phương pháp đánh giá sự bám dính của tế bào EPC trên khung nâng đỡ .... 29

2.3.10. Phương pháp đánh giá sự tăng sinh của EPC trên khung nâng đỡ ............... 29
KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN ................................................................................................. 31
3.1.

Kết quả nuôi cấy tế bào tiền thân nội mô (EPC) ................................................. 31

3.2.

Kết quả đánh giá tế bào tiền thân nội mô (EPC) ................................................. 33

3.2.1.

Kết quả nhuộm Giemsa ................................................................................. 33

3.2.2.

Kết quả kiểm tra marker bề mặt bằng phương pháp flow cytometry ........... 34

3.2.3.

Kết quả kiểm tra marker bằng phương pháp RT-PCR .................................. 34

3.2.4.

Kết quả đánh giá sự tăng sinh tế bào............................................................. 35

3.3.

Kết quả tạo giá thể mạch máu vô bào .................................................................. 39

3.3.1.

Kết quả thu nhận động mạch vành ................................................................ 39

3.3.2.

Kết quả đánh giá mơ mạch máu bình thường ............................................... 39

3.3.3.

Kết quả khử tế bào mạch máu bằng NaOH 0,5M ......................................... 41

3.3.4.

Kết quả khử tế bào mạch máu bằng Triton X100 0,1% ................................ 43

3.3.5.

Kết quả khử tế bào mạch máu bằng nước cất ............................................... 44


iii

3.3.6.

Kết quả khử tế bào mạch máu bằng SDS 0,5% ............................................ 45

3.3.7.

Kết quả khử tế bào mạch máu bằng cách kết hợp xử lý SDS 0,5% 24 giờ và

nước cất 18 giờ ........................................................................................................... 46
3.3.8.

Kết quả khử tế bào mạch máu bằng cách kết hợp xử lý SDS 0,5% 24 giờ và

nước cất 24 giờ ........................................................................................................... 48
3.4.

Kết quả khử trùng khung nâng đỡ ....................................................................... 50

3.5.

Kết quả đánh giá độc tính của giá thể mạch máu vô bào..................................... 52

Bàn luận: ........................................................................................................................ 53

3.6.

Kết quả đánh giá sự tăng sinh EPC lên giá thể mạch máu vô bào ....................... 59

KẾT LUẬN ....................................................................................................................... 65
KIẾN NGHỊ ....................................................................................................................... 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 66


i

TĨM TẮT
Giá thể mạch máu vơ bào (dVG) được tạo từ mạch máu tự nhiên bằng phương pháp khử
tế bào. Giá thể mạch máu vơ bào có cấu trúc, thành phần tương tự như mạch máu tự
nhiên. Tế bào tiền thân nội mơ (EPC) là nguồn tế bào có thể được thu nhận từ máu cuống
rốn hoặc tự thân, EPC mang nhiều tính chất của tế bào nội mơ: biểu hiện các marker đặc
trưng của tế bào nội mô, khả năng chống đông máu. Sự kết hợp giá thể mạch máu khử tế
bào và tế bào EPC có thể tạo ra mạch máu kỹ nghệ hướng tới thay thế hoàn toàn hoặc bắc
cầu qua đoạn mạch tự nhiên. Trong đề tài này, tế bào EPC được thu nhận từ máu cuống
rốn, giá thể động mạch được thu từ động mạch vành tim heo. Động mạch vành tim heo
được khử tế bào bằng NaOH 0.5 M trong 6 giờ hoặc nước cất 24 giờ hoặc Triton X100
0,1% trong 24 giờ hoặc SDS 0,5% trong 24 giờ. Hiệu quả khử tế bào được đánh giá bằng
phương pháp nhuộm HE, Trichrome, Verhoeff – Van Gieson. dVG được khử trùng với
cồn 70o trong 12 giờ/18 giờ/24 giờ hoặc với hỗn hợp kháng sinh/kháng nấm (penicillin,
streptomycin, amphotericin B). Tiếp theo, độc tính giá thể vơ bào được đánh giá theo tiêu
chuẩn ISO 10993-5. Máu cuống rốn được ly tâm đẳng tỷ trọng với Histopaque để thu tế
bào đơn nhân. Lớp tế bào đơn nhân được nuôi trong môi trường EGM-2 bổ sung 10%
FBS, nuôi ở 37oC, 5% CO2. Tế bào thế hệ P3 được đánh giá marker CD14, CD45,
CD105 bằng flow cytometry và KDR, Ve-cadherin, Thrombomodulin, vWF, CD146
bằng RT-PCR. Tế bào EPC được đưa lên lịng giá thể mạch máu vơ bào bằng phương

pháp tiêm trực tiếp và nuôi cấy tĩnh 11 ngày. Sự tăng trưởng được đánh giá bằng kính
hiển vi điện tử quét, nhuộm HE và MTT. Kết quả cho thấy: phương pháp khử tế bào tốt
là kết hợp SDS 0,5% trong 24 giờ và nước cất 18 giờ. Phương pháp khử trùng tốt nhất là
sử dụng cồn 70o. Giá thể mạch máu không gây độc tế bào. Tế bào EPC được thu nhận
thành công, biểu hiện các marker CD 105, KDR, Ve-cadherin, Thrombomodulin, vWF,
CD146 và không biểu hiện CD14, CD45. Tế bào EPC bám dính và tăng sinh trên lịng
mạch máu từ ngày 1 đến ngày 7.


ii

ABSTRACT
Decellularized vascular grafts can overcome some current challenges in vascular tissue
engineering such as: morphology, structure and structural, functional protein are similar
to the native. Endothelial progenitor cells (EPCs) could be isolated from autologous
blood and have some characteristics similar to endothelial cells: express endothelial cell
markers, antithrombotic. The combination of decellularized vascular tissue and EPCs can
make the suitable tissue-engineered vessels to replace or bypass injured vessels. In this
project, and coronary arteries (CAs) were decellularized to make the vascular grafts. CAs
were treated with NaOH 0.5 M for 6 hours or distilled water for 24 hours or Triton X100
0,1% for 24 hours or SDS 0,5% for 24 hours. Decellularization efficiency was
determined by HE, Trichrome, Verhoeff – Van Gieson staining. Acellular vascular grafts
(aVGs) were disinfected by ethanol 70o for 12/18/24 hours or antibiotic/antifungal
solution (penicillin, streptomycin, amphotericin B). Cytotoxic of aVGs was tested
according to ISO 10993-5 Standard. EPCs were isolated from umbilical cord blood.
Mononuclear cells were separated from umbilical blood by using Histopaque.
Mononuclear cells were cultured in EGM-2 medium supplemented with 10% FBS, 37oC,
5% CO2. P3 cultured cells were determined by flow cytometry for CD14, CD45, CD105
and by RT-PCR for KDR, Ve-cadherin, Thrombomodulin, vWF, CD146. EPCs were
seeded on lumen of aVGs by direct injection method and cultured for 11 days in static

culture. Cell growth was determined by SEM, HE staining and MTT assay. The results
show that: the combination of SDS 0,5% for 18 hours and distilled water for 24 hours is
the best decllularizing method for CAs. The best disinfection method is ethanol 70o for
12 hours. aVGs are not toxic to fibroblast. Umbilical blood derived EPCs were
successfully

isolated.

EPCs

express

marker

CD105,

KDR,

Ve-cadherin,

Thrombomodulin, vWF, CD146 and don’t express CD14, CD45. EPCs were adhered and
growth on lumen of acellular vascular grafts from day 1 to day 7.


vi

DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ
Bảng 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát ........................................................................... 18
Bảng 2.2. Thông tin các cặp mồi được sử dụng trong phương pháp RT-PCR ............. 21
Bảng 3.1. Tổng kết hiệu quả loại tế bào của các chất thí nghiệm ................................ 49

vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
dVG:

Giá thể mạch máu khử tế bào

ddVG:

Giá thể mạch máu khử tế bào đã khử trùng

EC:

Tế bào nội mô

ECM:

Khuôn nền ngoại bào

EPC:

Tế bào tiền thân nội mô


viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc ba lớp của mạch máu ..................................................................... 3

Hình 1.2. Động mạch xơ vữa ........................................................................................ 4
Hình 1.3. Cấu tạo mảng xơ vữa .................................................................................... 5
Hình 1.4. Xơ vữa động mạch vành ............................................................................... 6
Hình 1.5. Các phương pháp chữa trị xơ vữa động mạch ............................................. 7
Hình 1.6. Mảnh ghép Dacron (giá thể mạch máu không phân hủy) ............................ 8
Hình 1.7. Phương pháp loại tế bào (A: Cấu trúc bình thường của mơ, B: Mơ loại tế bào)
....................................................................................................................................... 10
Hình 1.8. Mảnh ghép SIS .............................................................................................. 11
Hình 1.9. Các phương pháp nuôi cấy EPC từ tế bào đơn nhân trong máu người ....... 13
Hình 1.10. Con đường phát triển của tế bào máu – nội mô và sự biểu hiện CD45 ..... 15
Hình 3.1. Kêt quả ly tâm thu tế bào đơn nhân bằng Histopaque ................................. 31
Hình 3.2. Kết quả ni cấy sơ cấp tế bào EPC trên bề mặt nuôi cấy (x100) ............... 32
Hình 3.3. Kết quả ni cấy tế bào EPC thế hệ P3 (x100) ............................................ 33
Hình 3.4. Kết quả nhuộm Giemsa tế bào EPC thế hệ P3 (x100) .................................. 33
Hình 3.5. Kết quả đánh giá các marker bề mặt bằng phương pháp flow cytometry .... 34
Hình 3.6. Kết quả đánh giá các marker bằng phương pháp RT-PCR ......................... 34
Hình 3.7. Biểu đồ biểu thị đường cong tăng trưởng tế bào EPC ở thế hệ P3 .............. 35
Hình 3.8. Động mạch vành ........................................................................................... 39
Hình 3.9. Kết quả nhuộm HE mẫu chứng ..................................................................... 40
Hình 3.10. Kết quả nhuộm collagen và elastin mẫu chứng .......................................... 41
Hình 3.11. Kết quả nhuộm mơ học mạch máu xử lý với NaOH 0,5M trong 6 giờ ....... 42
Hình 3.12. Kết quả nhuộm mơ học mạch máu xử lý với Triton X100 trong 24 giờ ..... 43
Hình 3.13. Kết quả nhuộm mơ học mẫu xử lý với nước cất 2 lần trong 24 giờ ........... 44
Hình 3.14. Kết quả nhuộm mô học mẫu mạch máu xử lý với SDS trong 24 giờ .......... 46
Hình 3.15. Kết quả nhuộm mô học mẫu xử lý với SDS 24 giờ và nước cất 18 giờ ...... 47
Hình 3.16. Kết quả nhuộm mô học mẫu xử lý với SDS 24 giờ và nước cất 24 giờ ...... 48


ix

Hình 3.17. Kết quả quan sát mẫu dVG chưa khử trùng trên đĩa agar sau 7 ngày ....... 50
Hình 3.18. Kết quả khử trùng dVG với chất kháng khuẩn và kháng nấm .................... 51
Hình 3.19. Kết quả khử trùng mạch máu vô bào với cồn 70o ở các mốc thời gian ...... 51
Hình 3.20. Giá thể mạch máu vơ bào đặt trực tiếp lên lớp tế bào nguyên bào sợi (x100)
....................................................................................................................................... 52
Hình 3.21. Kết quả nhuộm Giemsa tế bào nguyên bào sợi sau 1 ngày đánh giá độc tính
....................................................................................................................................... 52
Hình 3.22. Biểu đồ biểu thị kết quả đánh giá MTT độc tính giá thể mạch máu vơ bào
....................................................................................................................................... 53
Hình 3.23. Kết quả nhuộm mô học giá thể mạch máu vô bào đã khử trùng bằng cồn 70o
trong 12 giờ ................................................................................................................... 56
Hình 3.24. Kết quả chụp SEM mẫu mạch máu xử lý kết hợp SDS 0,5% trong 24 giờ và
nước cất 18 giờ ( x150).................................................................................................. 57
Hình 3.25. Kết quả chụp SEM mẫu mạch máu xử lý kết hợp SDS 0,5% trong 18 giờ và
nước cất 24 giờ (x500)................................................................................................... 58
Hình 3.26. Kết quả chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) tế bào EPC trên bề mặt giá thể
mạch máu vô bào ........................................................................................................... 59
Hình 3.27. Kết quả nhuộm HE mẫu mạch máu vô bào cấy tế bào EPC sau các mốc thời
gian ................................................................................................................................ 60
Hình 3.28. Biểu đồ biểu thị sự tăng sinh tế bào EPC trên giá thể mạch máu vô bào .. 61
Hình 3.29. Kết quả chụp SEM tế bào EPC trên bề mặt giá thể mạch máu (x800) ...... 64


vii

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn đến với gia đình tơi: ba, mẹ và em trai. Gia đình ln là
chỗ dựa vững chắc cho tơi bước trên đường đời.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Trần Lê Bảo Hà. Cô luôn tạo động lực để tơi bước

tiếp con đường của mình.
Tơi xin gửi lời cám ơn đến thầy Phan Kim Ngọc. Thầy luôn là tấm gương về lịng nhiệt
tình, sự tận tâm cho các học trị.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến các đồng nghiệp bộ môn Sinh lý học và Công nghệ Sinh học
Động vật. Nhờ có các em mà khơng khí làm việc lúc nào cũng vui vẻ, nhẹ nhàng.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới bác sĩ Phạm Thọ Tuấn Anh, bác sĩ Bùi Quốc Thắng khoa Phẫu
Thuật Tim, bệnh viện Chợ Rẫy. Kiến thức lâm sàng sâu rộng của các bác sĩ đã giúp tơi
hồn thiện đề tài.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến Đại học Quốc gia. Cám ơn Đại học Quốc gia đã
giúp tơi hồn thành đề tài này.


viii


Trang 1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hằng năm, các căn bệnh mạch máu như xơ vữa hoặc phình mạch đang gây ra hàng triệu
cái chết tại các quốc gia trên toàn thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) năm 2004, hơn bảy triệu người qua đời do bệnh xơ vữa mạch vành (chiếm 9,6%
số ca tử vong trên toàn thế giới). Theo thống kê của Hiệp hội Tim mạch Hoa kỳ năm
2011, trung bình, trong bảy người Mỹ qua đời sẽ có một người qua đời do bệnh động
mạch vành. Năm 2011, khoảng 375295 người Mỹ qua đời vì bệnh động mạch vành. Mỗi
năm, thêm khoảng 635000 người Mỹ bị bệnh mạch vành. Nguy hiểm hơn, những căn
bệnh này xuất hiện ngày càng phổ biến với triệu chứng ngày càng nặng và độ tuổi mắc
bệnh ngày càng trẻ. Tại Việt Nam, mặc dù chưa có nghiên cứu chính thức thống kê số
lượng bệnh nhân mắc bệnh mạch máu nhưng theo ghi nhận của nhiều bệnh viện, lượng
bệnh nhân mắc bệnh mạch máu đang ngày càng gia tăng. Theo thống kê của Viện Tim
Mạch Trung Ương, năm 2003 tỉ lệ bệnh nhân nhập viện do bệnh động mạch vành chiếm

11,2%, đến năm 2008 tỉ lệ này đã tăng lên 24%.
Một số phương pháp chữa trị bệnh mạch máu được áp dụng như: sử dụng một mạch máu
khác làm cầu nối qua đoạn bị tổn thương hoặc đặt một khung kim loại (stent) để nong
lòng mạch bị hẹp do xơ vữa. Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn chưa chữa trị được
hoàn toàn căn bệnh mạch máu, khoảng 1/3 bệnh nhân khơng có mạch máu phù hợp, chi
phí phẫu thuật cao, hiện tượng tái hẹp vẫn có khả năng xảy ra. Do đó, kỹ nghệ mạch máu
ra đời nhằm tạo ra giá thể mạch máu nhân tạo phù hợp được sử dụng làm đoạn mạch bắc
cầu qua vị trí bị tổn thương hoặc được sử dụng để thay thế mạch máu bị tổn thương. Một
phương pháp đang được nghiên cứu nhiều hiện nay để tạo giá thể mạch máu nhân tạo là
khừ tế bào động mạch tự nhiên để tạo giá thể mạch máu vơ bào. Phương pháp này có
những ưu điểm như cấu trúc, hình dạng, thành phần của giá thể mạch máu vô bào tương
tự với mạch máu tự nhiên, nguồn thu nhận mẫu dồi dào và chi phí sản xuất tương đối
thấp hơn. Do đó, giá thể mạch máu vô bào hứa hẹn đem đến nhiều hy vọng cho các
nghiên cứu trong kỹ nghệ mạch máu.

Nghiên cứu tạo mạch máu…


Trang 2

Tuy nhiên, hạn chế chung của các loại giá thể mạch máu là hiện tượng đơng máu trong
lịng mạch sau khi ghép. Hiện tượng đơng máu trong lịng mạch có thể diễn ra ngay lập
tức khi dVG tiếp xúc với dòng máu. Giải pháp đang được sử dụng hiện nay để khắc phục
tình trạng này là sử dụng chất chống đơng (như heparin) để hạn chế tình trạng trên. Tuy
nhiên, để giải quyết triệt để khó khăn này, hỗ trợ nhanh chóng q trình tái cấu trúc của
mơ và hạn chế sự xâm nhập của tế bào viêm của cơ thể chủ, dịng tế bào nội mơ thường
được cấy trên lòng mạch máu để tạo thành một lớp nội mơ chống đơng tự nhiên. Dịng tế
bào nội mơ thường được sử dụng là tế bào nội mô và tế bào tiền thân nội mô. Tế bào nội
mô là thành phần quan trọng của lớp trong mạch máu, chức năng của tế bào nội mô là
chống đông máu. Tuy nhiên, nguồn thu nhận tế bào nội mô tự thân bị giới hạn (do phải

thu nhận mạch máu mới thu nhận được tế bào nộ mô) nên tiềm năng ứng dụng của tế bào
này bị hạn chế. Hiện nay, tế bào tiền thân nội mô là một ứng viên quan trọng trong lĩnh
vực này. Dịng tế bào này có thể được thu nhận tự thân từ trong máu người bệnh.
Trên thế giới, kỹ nghệ mạch máu đã phát triển mạnh trong nhiều thập kỷ nhưng tại Việt
Nam, chưa có bất kỳ nghiên cứu nào trong lĩnh vực kỹ nghệ mạch máu được công bố
trong nhiều năm qua. Nhận thấy rõ tầm quan trọng của tế bào nội mô, giá thể mạch máu
vơ bào và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài
“Nghiên cứu tạo mạch máu nhân tạo từ giá thể động mạch vô bào và tế bào tiền thân nội
mô người hướng tới ứng dụng điều trị bệnh tim mạch”.
MỤC TIÊU
-

Tạo được giá thể mạch máu vô bào từ động mạch vành heo

-

Nuôi cấy thành công tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người

-

Đánh giá được sự tăng trưởng tế bào tiền thân nội mô đối với giá thể mạch máu vô
bào.

Nghiên cứu tạo mạch máu…


Trang 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cấu tạo mạch máu

Phần lớn các động mạch, tĩnh mạch trong cơ thể được được cấu tạo bởi 3 lớp: lớp ngoài,
lớp giữa và lớp trong.
-

Lớp ngồi là lớp mơ liên kết được cấu thành từ các nguyên bào sợi, dây thần kinh và
những mạch máu nhỏ. Thành phần ECM (ExtraCellular Matrix) chủ yếu lớp ngoài
là sợi collagen và elastin. Những sợi collagen lớp ngoài được định hướng theo chiều
dọc. Nhờ đó, động mạch có độ bền cần thiết để ngăn chặn hiện tượng giãn mạch
máu quá mức khi cơ thể vận động [52].

-

Lớp giữa bao gồm các tế bào cơ trơn và những sợi protein như collagen, elastin. Tế
bào cơ trơn và các sợi protein được tổ chức thành những vòng tròn đồng tâm xoay
quanh trục mạch máu. Ranh giới giữa lớp giữa và lớp ngoài là phiến đàn hồi ngoài
được cấu tạo từ các sợi elastin [15, 36].

-

Lớp trong (còn gọi là lớp nội mô hay lớp nội mạc) bao gồm một lớp tế bào nội mơ.
Tế bào nội mơ bao phủ hồn tồn lịng trong của tất cả mạch máu trong cơ thể. Ranh
giới giữa lớp trong và lớp giữa là phiến đàn hồi trong được cấu tạo từ các phân tử
elastin [15, 36].
Lớp giữa

Lớp trong Phiến đàn
hồi trong

Phiến đàn
hồi ngoài

Tế bào nội mơ

Lớp ngồi

Tế bào cơ trơn

Hình 1.1. Cấu trúc ba lớp của mạch máu ()

Nghiên cứu tạo mạch máu…


Trang 4

1.2. Căn bệnh xơ vữa mạch máu
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế Giới (WHO) năm 2012, khoảng 17,5 triệu người
qua đời vì bệnh tim mạch trên toàn thế giới (chiếm 31% số ca tử vong trên tồn thế giới).
Trong số những bệnh nhân qua đời vì bệnh tim mạch, hơn 7,4 triệu người qua đời do
bệnh mạch vành. Theo dự đoán, đến năm 2030, hai mươi ba triệu người qua đời vì bệnh
tim mạch. Theo thống kê của Hiệp hội Tim mạch Hoa kỳ năm 2011, số ca tử vong do
bệnh mạch vành chiếm 1/7 tổng số ca tử vong trên toàn nước Mỹ. Nguy hiểm hơn, những
căn bệnh này xuất hiện ngày càng phổ biến với triệu chứng ngày càng nặng và độ tuổi
mắc bệnh ngày càng trẻ. Hiện nay, số lượng người mắc bệnh tim mạch đang gia tăng
mạnh trong những nước có thu nhập thấp và trung bình do sự thay đổi lối sống và sự
thiếu thốn về điều kiện kinh tế.
Nhiều căn bệnh liên quan đến mạch máu được biết đến trong xã hội hiện tại như xơ vữa
mạch máu, phình mạch và những trường hợp mạch máu bị tổn thương do tai nạn, bệnh lý.
Trong đó, căn bệnh thường xãy ra nhất và đưa đến những hậu quả thảm khốc là xơ vữa
mạch máu. Xơ vữa mạch máu là hiện tượng các phân tử lipid lắng đọng vào thành mạch
dẫn đến thành mạch trở nên xơ và cứng hơn.

Động mạch thường

Động mạch xơ vữa

Thành mạch
Khối máu đơng

Mãng xơ vữa

Hình 1.2. Động mạch xơ vữa ()
Nguyên nhân:
Xơ vữa mạch máu xãy ra do sự tích lũy những phân tử lipoprotein có mật độ thấp (LowDensity Lipoprotein, LDL) trong lòng mạch. Trong điều kiện sinh lý, tế bào nội mô ngăn

Nghiên cứu tạo mạch máu…


Trang 5

cản sự lắng tụ LDL vào thành mạch. Tuy nhiên, khi tế bào nội mô bị suy chức năng, khe
hở được hình thành giữa các tế bào nội mơ. Các phân tử LDL xâm nhập vào lớp cận nội
mô thông qua những khe hở giữa các tế bào. Đồng thời, các tế bào bạch cầu như
monocyte, lympho T cũng xâm nhập vào lớp cận nội mô theo con đường tương tự LDL.
Nguyên nhân thường gặp đối với hiện tượng suy chức năng nội mô bao gồm bệnh cao
huyết áp, bệnh tiểu đường, chứng nghiện thuốc lá, nồng độ các phân tử LDL bị oxi hóa
cao, nhiễm vi sinh vật như virus herpes [26].
Trong lớp cận nội mô, các hạt LDL bị oxi hóa (LDLox) bởi các sản phẩm được sản xuất
bởi tế bào nội mô và tế bào cơ trơn và bị hấp thu bởi các đại thực bào. Đại thực bào dung
hợp một lượng lớn các phân tử LDLox tạo thành tế bào foam. Các tế bào foam tích lũy
theo thời gian tạo thành những mảng mỡ lấn vào lịng mạch máu. Ngồi ra, LDLox tác
động mạnh lên tế bào nội mô, gây suy giảm chức năng tế bào nội mô trên diện rộng [2, 16].

Tế bào foam

Lõi vữa

Màng bao xơ

Hình 1.3. Cấu tạo mảng xơ vữa [26]
Sau đó, tế bào nội mơ tiết ra các chất cảm ứng q trình hoạt hóa và di cư tế bào cơ trơn.
Tiếp theo, tế bào cơ trơn trải qua quá trình hoạt hóa, di cư, tăng sinh và tổng hợp ECM
(chủ yếu là collagen, proteoglycan) trong lớp cận nội mô. Sau đó, tế bào cơ trơn, nguyên
bào sợi tạo nên lớp vỏ xơ bao bọc bên ngoài mãng xơ vữa và các tế bào, các phân tử lipid
bên trong mãng mỡ bị phân hủy hình thành phần lõi vữa bên trong mãng xơ vữa [16].

Nghiên cứu tạo mạch máu…


Trang 6

Tác hại của xơ vữa mạch máu
Khi tiếp xúc với LDLox, tế bào nội mô chuyển sang khả năng cảm ứng đơng máu thay vì
chống đơng máu. Những khối máu đơng có thể hình thành trên bề mặt mảng xơ vữa gây
tắc mạch máu.
Nguy hiểm nhất, màng bao ngoài mãng xơ vữa có thể bị phá vỡ bởi các enzyme do tế bào
bạch cầu sản xuất hoặc do áp lực dịng máu. Ngay tức thời, khối máu đơng sẽ được hình
thành tại vị trí mảng xơ vữa dẫn đến tắc một phần hoặc tắc hoàn toàn mạch máu. Mảng
xơ vữa bị bong khỏi mạch sẽ di chuyển theo dòng máu và có thể gây tắc những mạch nhỏ
hơn.
Sự nguy hiểm của xơ vữa mạch máu phụ thuộc nhiều vào vị trí mạch máu. Xơ vữa động
mạch vành có thể dẫn tới bị nhồi máu cơ tim, xỡ vữa động mạch não có thể dẫn tới tai

biến mạch máu não, xơ vữa tại động mạch chi có thể dẫn tới liệt chi. Tóm lại, bệnh xơ
vữa mạch máu có thể gây ra những tổn thương nghiêm trọng đến bệnh nhân như bị bại
liệt, sống đời sống thực vật… và thường xuyên dẫn đến tử vong.

Mạch vành xơ vữa

Vùng cơ tim tổn thương

Hình 1.4. Xơ vữa động mạch vành ()
1.3. Các phương pháp chữa trị hiện nay
Hiện nay, các phương pháp lâm sàng được áp dụng chữa trị xơ vữa mạch máu bao gồm:
phương pháp chữa trị bằng thuốc, phương pháp bắc cầu động mạch, phương pháp tạo
hình động mạch.

Nghiên cứu tạo mạch máu…


Trang 7

-

Phương pháp bắc cầu động mạch: Phương pháp này sử dụng một mạch máu làm cầu
nối ngang qua đoạn mạch bị xơ vữa. Cầu nối mạch máu giúp phục hồi dịng máu
đến các mơ, cơ quan nằm phía sau đoạn xơ vữa.

-

Phương pháp tạo hình động mạch: Phương pháp này sử dụng một khung kim loại
được gọi là stent. Stent được đưa vào cơ thể bằng phương pháp nội soi và di chuyển
theo tĩnh mạch đùi đến vị trí xơ vữa. Tại vị trí xơ vữa, stent được căng ra để nén

mãng xơ vữa vào thành mạch và cố định tại vị trí xơ vữa. Qua đó, mãng xơ vữa bị
hẹp lại, sự lưu thơng của dịng máu qua vị trí xơ vữa được phục hồi.

Mạch máu
bắc cầu

Phương pháp đặt stent

Phương pháp bắc cầu động
mạch

Hình 1.5. Các phương pháp chữa trị xơ vữa động mạch vành
()
Các phương pháp chữa trị xơ vữa mạch máu hiện nay đều có những ưu điểm và nhược
điểm riêng. Nhược điểm chung của các phương pháp này là vẫn chưa chữa trị hoàn toàn
căn bệnh xơ vữa (mãng xơ vữa vẫn tồn tại trong mạch máu và có khả năng bong ra khỏi
vị trí ban đầu), chi phí cho mỗi ca chữa trị cao, số lượng mạch máu tự thân phù hợp cho
phẫu thuật bắc cầu mạch máu khơng nhiều và vẫn có khả năng bị tái hiẹp.
Trong bối cảnh đó, kỹ nghệ mạch máu ra đời nhằm giải quyết những vấn đề vẫn tồn đọng
đến hiện tại của các phương pháp chữa trị truyền thống. Mạch máu nhân tạo được thiết kế
nhằm thay thế những mạch máu tổn thương hoặc dùng để làm cầu nối bắc qua đoạn mạch
xơ vữa. Mạch máu nhân tạo có thể được sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp với chi phí sản

Nghiên cứu tạo mạch máu…


Trang 8

xuất thấp. Do đó, mạch máu nhân tạo hồn tồn có khả năng đáp ứng được nhu cầu của
các bệnh nhân trên toàn thế giới [32].

1.4. Giá thể mạch máu
Giá thể mạch máu là một cấu trúc hình ống được tạo bởi vật liệu tự nhiên hoặc tổng hợp
có hoạt tính sinh học. Nhiều loại giá thể mạch máu sử dụng tạo mạch máu nhân tạo được
nghiên cứu từ nhiều thập kỷ trước. Về thành phần, giá thể mạch máu được chia thành các
nhóm sau: polymer tổng hợp khơng phân hủy, polymer tổng hợp có khả năng phân hủy,
protein và giá thể mạch máu vơ bào.

Hình 1.6. Mảnh ghép Dacron (giá thể mạch máu không phân hủy) [33]
Các loại giá thể mạch máu tổng hợp và protein được xem là những giá thể mạch máu
truyền thống trong kỹ nghệ mạch máu lẫn trong kỹ nghệ mơ bởi vì chúng xuất hiện khá
sớm và được nghiên cứu cặn kẽ từ nhiều thập kỷ trước đây. Hầu hết những mạch máu kỹ
nghệ hóa được tạo từ những polymer tổng hợp có khả năng phân hủy sinh học hoặc
polymer sinh học như collagen, fibrin… Bất lợi rõ ràng của 2 loại giá thể mạch máu trên
là thành phần và cấu trúc của giá thể mạch máu nhân tạo không giống với thành phần và
cấu trúc của mạch máu tự nhiên và khả năng hỗ trợ q trình tái cấu trúc mạch máu
khơng tốt. Thông thường, các loại giá thể mạch máu trên nhanh chóng bị phân hủy trong
cơ thể [25].

Nghiên cứu tạo mạch máu…


Trang 9

1.5. Các phương pháp tạo giá thể mạch máu vô bào
Các phương pháp tạo giá thể mạch máu truyền thống đều dựa trên một ý tưởng chung là
tạo ống ghép có cấu trúc tương tự cấu trúc mơ cần thay thế. Hình dạng, cấu trúc và thành
phần ống ghép càng giống với mơ tự nhiên càng tốt. Sau đó, một ý tưởng khác hình
thành: nếu các loại ống ghép được tạo ra bằng cách mơ phỏng cấu trúc, tính chất của cơ
quan tự nhiên cần thay thế, vậy tại sao chúng ta khơng sử dụng chính cơ quan tự nhiên để
làm ống ghép bởi vì bản thân mơ, cơ quan đã mang cấu trúc, tính chất của chính nó. Từ

đó, ý tưởng tạo ống ghép từ mơ tự nhiên bằng phương pháp loại tế bào đã ra đời trong
những năm gần đây.
Tất cả các mô, cơ quan trong cơ thể đều được cấu thành từ hai thành phần chính là tế bào
và khung nâng đỡ ngoại bào (ECM). Giữa các mô và các cơ quan khác nhau, thành phần
tế bào và ECM sẽ không giống nhau. ECM là khung nâng đỡ protein của mô và cơ quan
do tế bào tổng hợp và tiết ra ngoài. Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của mô và cơ
quan. Đồng thời, tế bào cịn là mục tiêu tấn cơng của hệ miễn dịch cơ thể chủ đối với các
mảnh ghép đồng loại hoặc khác loại. Phương pháp loại tế bào được tiến hành với mục
đích loại bỏ hồn tồn các tế bào trong mô, cơ quan và thu nhận một cách tồn vẹn ECM
của mơ, cơ quan ban đầu. Sản phẩm của quá trình loại tế bào là một khung nâng đỡ
protein có thành phần, cấu trúc và hình dạng tương tự với mô tự nhiên và khả năng kích
thích đáp ứng miễn dịch cơ thể chủ trở nên yếu đi. Khung nâng đỡ protein sau xử lý được
gọi là giá thể vô bào (trong kỹ nghệ mạch máu, giá thể vơ bào cịn được gọi là ống ghép
mạch máu vơ bào). Khung nâng đỡ protein có thể được sử dụng trực tiếp cấy ghép thay
thế mô, cơ quan hoặc được cố định tế bào trước khi cấy ghép [8].

Nghiên cứu tạo mạch máu…


Trang 10

Tế bào

Tế bào

Các ion

Các ion

A

B

Hình 1.7. Phương pháp loại tế bào (A: Cấu trúc bình thường của mơ, B: Mô loại tế bào)
Phương pháp loại tế bào thường được tiến hành với mô, cơ quan dị loại. Trong cấy ghép
mạch máu, mạch tự thân luôn là “tiêu chuẩn vàng” để cấy ghép nhưng không phải mạch
tự nhân nào cũng thích hợp, số lượng mạch tự thân phù hợp rất ít. Mạch máu đồng loại có
số lượng nhiều hơn nhưng vẫn không đáp ứng đầy đủ nhu cầu của bệnh nhân và có khả
năng kích thích đáp ứng miễn dịch. Mạch máu dị loại hiếm được sử dụng vì chúng có khả
năng gây đáp ứng miễn dịch mạnh mặc dù số lượng mẫu rất dồi dào. Phương pháp loại tế
bào được nghiên cứu đối với các mạch dị loại bởi vì phương pháp loại tế bào có thể tận
dụng ưu điểm về số lượng dồi dào và hạn chế nhược điểm về tính kháng nguyên mạnh
của các mạch dị loại. Trong hai thành phần tế bào và ECM, tế bào là thành phần kháng
nguyên chính gây đáp ứng kích thích đáp ứng miễn dịch vật chủ [28]. Sau khi loại tế bào,
khả năng kích thích miễn dịch của mạch máu dị loại giảm mạnh. Sản phẩm quá trình khử
tế bào mạch máu là giá thể mạch máu vô bào [8].
Phương pháp khử tế bào mạch máu có những ưu điểm sau đây
-

Giá thể mạch máu vơ bào có cấu trúc, hình dạng và thành phần giống mạch máu tự
nhiên.

-

Đáp ứng miễn dịch của giá thể mạch máu vô bào yếu

-

Số lượng mẫu dồi dào.

-

Quy trình xử lý đơn giản, chi phí sản xuất thấp.

Nghiên cứu tạo mạch máu…


Trang 11

Nhiều nghiên cứu ghép giá thể mạch máu vô bào vào cơ thể động vật đã được tiến hành.
Giá thể mạch máu vô bào được sử dụng trực tiếp (Hiles và đồng nghiệp 1995, Martin và
đồng nghiệp 2005) hoặc được cố định tế bào mạch máu cơ thể chủ trước khi cấy ghép
(Hodde và đồng nghiệp 2002, Amiel và đồng nghiệp 2006). Sau 4 tuần, tỉ lệ thông máu
của những động mạch chuột được cấy tế bào với tế bào nội mơ là 89%, trong khi đó,
những mảnh ghép khơng được cấy tế bào nội mơ có tỉ lệ thơng máu là 29% [1].
Ngồi ra, giá thể mạch máu vơ bào có thể được thu nhận từ những mơ khác đã trải qua
quá trình xử lý tế bào như SIS (Small Intestial Submucosa), Alloderm. SIS là SIS và
Alloderm là những sản phẩm loại tế bào được thương mại hóa trên thị trường. SIS có bản
chất là lớp dưới niêm mạc ruột non. SIS được thu nhận bằng cách loại bỏ lớp niêm mạc,
lớp thanh mạc và lớp cơ ruột non và sau đó được cắt thành những tấm nhỏ. Sau đó, SIS
trải qua q trình loại tế bào, khử trùng để trở thành sản phẩm được thương mại hóa trên
thị trường. SIS được ứng dụng nhiều trong y học từ năm 1989. Trong kỹ nghệ mạch máu,
SIS được cuộn trịn quanh một lõi kim loại, sau đó được khâu lại để tạo dạng ống [32].

Hình 1.8. Mảnh ghép SIS ()
1.6. Tế bào tiền thân nội mô (EPC)
1.6.1. Đặc điểm hình thái tế bào EPC được ni cấy
Tế bào nội mơ bao phủ tồn bộ mặt trong của mạch máu vai trị giúp chống kết dính tiểu
cầu, bạch cầu, và sản sinh các yếu tố điều tiết quan trọng. Những tổn thương và rối loạn
chức năng tế bào nội mô làm cho thành mạch mất khả năng chống đông máu, tạo điều

kiện hình thành các mảng xơ vữa gây ra nhiều bệnh lý nguy hiểm. Quá trình tái tạo lớp
Nghiên cứu tạo mạch máu…


Trang 12

nội mơ có thể do sự di chuyển và tăng sinh của những tế bào nội mô xung quanh. Tuy
nhiên, tế bào nội mô là tế bào đã trưởng thành và tăng sinh thấp nên khả năng thay thế
lớp nội mô hư hỏng bị hạn chế. Trong tuỷ xương và máu ngoại vi người có một loại tế
bào có khả năng tăng sinh cao, mang đặc điểm của tế bào nội mô và được gọi là tế bào
tiền thân nội mô (Endothelial Progenitor Cell - EPC).
Năm 1997, Asahara và cộng sự thu nhận và nuôi tế bào đơn nhân CD34+ từ máu của
người trưởng thành trên đĩa có tráng fibronectin

[45]

. Sau năm ngày, thấy xuất hiện các

cụm tế bào với tế bào hình trịn ở giữa và xung quanh là tế bào dạng thon dài. Trong đó,
các tế bào hình thon dài biểu hiện kháng nguyên của tế bào nội mô như: CD31, TIE2,
VEGFR2, E-selectin. Khi được tiêm vào chuột suy giảm miễn dịch thiếu máu chi, các tế
bào này tập trung tại những vùng tạo mạch máu mới. Do đó, Asahara cho rằng những tế
bào hình thoi CD34+ là tế bào EPC.
Năm 2003, Hill và cộng sự nuôi cấy tế bào đơn nhân từ máu người trên đĩa tráng với
fibronectin. Sau 48 giờ, tiến hành thu các tế bào khơng bám dính và cấy lại trên đĩa tráng
fibronectin. Năm ngày sau, thấy xuất hiện các cụm tế bào tương tự như nghiên cứu của
Asahara, cụm tế bào này được Hill gọi là CFU-Hill [9]. Theo quy trình ni cấy của Hill,
các tế bào này xuất hiện sớm, khả năng tăng sinh thấp và được gọi là tế bào EPC sớm
(Early-Endothelial Progenitor Cell: e-EPC).

Nghiên cứu tạo mạch máu…


Trang 13

Hình 1.9. Các phương pháp ni cấy EPC từ tế bào đơn nhân trong máu người [10].
A: cụm tế bào CFU-Hill hình thành sau 5 ngày từ các tế bào khơng bám dính; B: tế bào
CAC là các tế bào bám dính sau 4-7 ngày ni cấy, CAC khơng hình thành cụm tế bào;
C: cụm tế bào EPC xuất hiện sau 6-21 ngày từ các tế bào bám dính.
Tuy nhiên, cụm tế bào phân lập theo phương pháp của Asahara và Hill được chứng minh
không phải là EPC thực sự mà là các tế bào có nguồn gốc từ dịng tạo máu. Trong đó, tế
bào hình thon dài là các đại thực bào, biểu hiện marker của tế bào nội mơ nhưng khơng
có khả năng hình thành cấu trúc mạch máu khi được cấy in vivo, còn tế bào hình trịn là
những tế bào tiền thân dịng tuỷ, tế bào đơn nhân và tế bào lympho T. Ngoài ra, cịn có
một quần thể tế bào có khả năng tăng sinh sớm khác gọi là tế bào tạo mạch tuần hoàn
(circulating angiogenic cells – CAC). Các tế bào CAC tham gia vào sự hình thành mạch
máu mới bằng cách tiết ra các cytokine tạo mạch, có vai trị điều hồ mạch máu ở trạng
thái cân bằng, kích thích tạo mạch mới ở vị trí có vết thương và mơ thiếu máu cục bộ.

Nghiên cứu tạo mạch máu…


Trang 14

Khác với quy trình của Hill, năm 2004, Ingram và cộng sự nuôi cấy tế bào đơn nhân trên
giếng có tráng collagen. Sau 24 giờ, tiến hành loại bỏ các tế bào khơng bám dính. Sau 2-3
tuần ni cấy, thấy xuất hiện một lớp tế bào có dạng viên sỏi (cobblestone). Các tế bào
này biểu hiện các marker của tế bào nội mô như: vascular endothelial grow factor
receptor-2 (VEGFR-2), von-Willebrand Factor (vWF), endothelial Nitric Oxide Synthase
(eNOS), Vascular Endothelial-cadherin (VE-cadherin), khả năng tạo thành cấu trúc dạng

mạch máu in vitro và khơng biểu hiện kháng ngun của tế bào dịng tạo máu là CD45
(kháng nguyên đặc trưng của tế bào bạch cầu), CD14 (kháng nguyên đặc trưng của tế bào
đơn nhân, đại thực bào). Những tế bào dạng sỏi được gọi là tế bào hình thành nội mơ
(endothelial colony forming cell - ECFC). Một số nghiên cứu cho thấy ECFC có nguồn
gốc từ tuỷ xương, tuần hồn trong máu ngoại vi và có khả năng sinh trưởng thành tế bào
nội mơ [13].
Như vậy, q trình ni cấy hình thành các loại tế bào có thời điểm xuất hiện và kiểu
hình khác nhau. Trong đó, ECFC là tế bào hình thành nội mô xuất hiện muộn sau khi
nuôi cấy từ 1 – 3 tuần, mang đặc điểm hình thái và đặc tính của EPC và được coi là EPC
thực sự.
1.6.2. Đặc điểm kháng nguyên bề mặt của tế bào EPC
Tế bào EPC mang những kháng nguyên của tế bào nội mô như: VEGFR-2, CD31,
CD146, VE-caherin, vWF, eNOS, E-selectin. Trong đó, CD34 là kháng ngun của tế
bào có nguồn gốc trung bì như máu, nội mô, nguyên bào sợi, tế bào biểu mơ và được coi
là kháng ngun chính để phân lập tế bào gốc tạo máu (Hematopoietic Stem Cell - HSC);
VEGFR-2 là thụ thể cho yếu tố phát triển nội mô có trên tế bào có nguồn gốc từ lớp trung
bì như máu, nội mô và mô cơ tim. Hai kháng nguyên này được Asahara dùng để xác định
tế bào EPC khi nuôi cấy tế bào đơn nhân CD34+VEGFR-2+ trên đĩa tráng fibronectin và
thấy xuất hiện các tế bào có đặc điểm của tế bào nội mô.

Nghiên cứu tạo mạch máu…