Nghiên cứu cấu trúc tâm hoạt động enzyme polysaccharide monooxygenase bằng tính toán lượng tử

NTTU-NCKH-04

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

--------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2019

Tên đề tài: Nghiên cứu cầu trúc tâm hoạt động enzyme polysaccharide monooxygenase bằng
tính toán lượng tử
Số hợp đồng:

Chủ nhiệm đề tài: Lê Ngọc Chính
Đơn vị cơng tác: Viên kỹ thuật cơng nghệ cao Ntt
Thời gian thực hiện: 1 năm

TP. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 2 năm 2019


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
-----------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2019

Tên đề tài: Nghiên cứu cấu trúc tâm hoạt động enzyme polysaccharide
monooxygenase bằng tính toán lượng tử.
Số hợp đồng :
Chủ nhiệm đề tài: Lê Ngọc Chính
Đơn vị cơng tác: Viện kỹ thuật cơng nghệ cao Ntt
Thời gian thực hiện: 1 năm

Các thành viên phối hợp và cộng tác:
STT

Họ và tên

Chuyên ngành

Cơ quan công tác

1

Vũ Bảo Khánh

Hóa học

Viện KT-CNC TNT

2

Lê Ngọc Chính

Vật lý

Viện KT-CNC NTT

Ký tên


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PMO - Polisaccharide monooxygenases
Q166 – Glutamine 166
Q166A - Dạng đột biến glutamine 166 thành alanine
A – Alanine
F – Phenylalanine
T – Tyrosine
E – Glutamic acid


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.0 – trang 1
Hình 1.2 – trang 4

Hình 2.2 – trang 5
Hình 3.1 – trang 10
Hình 3.2 – trang 11
Hình 3.3 – trang 12
Hình 3.4 – trang 12
Hình 3.5 – trang 13
Bảng 1 – trang 7
Bảng 2 – trang 7
Bảng 3 – trang 8


TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Sản phẩm thực đạt được

Sán phẩn đăng ký tại thuyết minh

Cấu trúc tối ưu hóa của các dạng tự

Cấu trúc tối ưu hóa của các dạng tự

nhiên và dạng đột biến của tâm hoạt

nhiên và dạng đột biến của tâm hoạt

động hai protein MtPMO3* (PDB ID

động hai protein MtPMO3* (PDB ID

5UFV) và CelS2 (PDB ID 4OY7)

5UFV) và CelS2 (PDB ID 4OY7)

Một bài báo cấp trường

Một bài báo cấp trường

Thời gian đăng ký : từ tháng 3/2018
đến tháng 3/2019
Thời

gian

28/3/201

nộp

báo

cáo:

ngày



1

MỞ ĐẦU
Nghiên cứu này sử dụng cơng cụ tính tốn lượng tử nhằm mục đích thực hiện tính
tốn tối ưu hóa cấu trúc khơng gian và cấu trúc electron của tâm hoạt động protein
CelS2 và MtPMO3* dưới các dạng tự nhiên và đột biến. CelS2 và MtPMO3* là các

enzyme thuộc họ enzyme polysaccharide monooxygenase, họ enzyme này có khả
năng làm tăng mạnh hoạt tính thủy phân cellulose và do đó có đóng vai trị rất lớn
trong cơng nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học. Qua tính tốn, chúng tơi thu được
thành cơng các cấu trúc tối ưu hóa ở dạng đột biến và dạng tự nhiên của cả hai
enzyme kể trên và đưa ra các kết luận sau: Thứ nhất, cấu trúc dạng tự nhiên của
CelS2 có khả năng nhận thêm một phân tử nước để tạo thành dạng phối trí lưỡng
chóp tam giác; các cấu trúc ở dạng đột biến gợi ý rằng số phối trí tối đa mà CelS2
có thể nhận được chỉ là 5. Thứ hai, cấu trúc dạng tự nhiên và đột biến cho thấy sự
quan trọng của phối tử Q166 trong việc ổn định cấu trúc của mạng lưới liên kết
hidro của tâm hoạt động MtPMO3*. Thứ ba, kết quả tính tốn cấu trúc CelS2 đưa ra
giả thuyết mối tương quan giữa cấu trúc và bức tranh tiến hóa của PMO, giả thuyết
mới cần được làm rõ thêm trong các nghiên cứu kế tiếp.

`
Hình 1.0: A: Mơ hình phân hủy cellulose bởi PMOs và các enzyme cellulase. B: Cấu trúc
PMO và tâm hoạt động đơn nhân đồng trên bề mặt cellulose. C: Phân cắt lien kết
glycosidic
do
phản
ứng
oxi
hóa
xúc
tác
bởi
PMO


2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Nhiên liệu sinh học sản suất từ sinh khối (biomass) đang được phát triển mạnh mẽ
trên thế giới. Theo báo cáo của bộ Năng lượng Hoa Kì, 1.3 tỉ tấn sinh khối thực vật
có thể được sản xuất và cung cấp được cho khoảng 30% nhu cầu nhiên liệu của Hoa
Kì [1], các sản phẩm năng lượng sinh học và hóa học có xuất xứ từ thực vật cũng
cho tỉ suất lợi nhuận cao hơn dầu mỏ.
Thanh phần chính trong sinh khối dùng để sản xuất nhiên liệu sinh học là cellulose.
Thủy phân cellulose thành các loại đường lên men là giai đoạn chậm và có chi phí
cao trong q trình sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối [2]. Trong cơng nghiệp,
để hóa lỏng cellulose, người ta sử dụng phối hợp nhiều loại enzyme cellulase khác
nhau, bao gồm cellobiohydrolase I (CBHI), cellobiohydrolase I (CBHII),
endoglucanase, beta-glucosidase. [3]. Các liên kết hydro phức tạp giữa các phân tử
cellulose cản trở các enzyme tách các chuỗi cellulose ra khỏi cơ chất, qua đó làm
chậm phản ứng thủy phân [4].
Gần đây, polysaccharide monooxygenase (PMO) được phát hiện có khả năng làm
tăng mạnh hoạt tính thủy phân cellulose của các cellulose. PMO bẻ gãy các lien kết
trên bề mặt cơ chất cellulose, tạ ra các đầu chuỗi mới dễ dàng bị thủy phân bởi các
celullase (Hình 1A). Phối trộn PMO với cellulose có thể làm tăng hoạt tính thủy
phân lên 2 hoặc 3 ần, qua đó giúp làm giảm phần lớn chi phí của giai đoạn này.
Tâm hoạt động đơn nhân đồng được phối trí bởi 3 nguyên tử nitrogen của 2 đơn
phân histidine, trong đó His1 (ở đầu N) phối trí ở dạng 2 càng (Hình 1B). Các liên
kết Cu-Nε2 và Cu-Nδ1 có độ dài ~2.00 Å) và ngắn hơn so với liên kết Cu-Nam
(~2.2 Å). Ngoài các phối tử N, ở trạng thái oxy hóa, trung tâm Cu(II) cịn được phối
trí bởi các phối tử O từ các phân tử nước (O aq1 và Oaq2). Trong nhiều PMOs, đơn
phân tyrosine (Y168) cũng tham gia phối trí với trung tâm Cu(II) thông qua nguyên
tử OTyr. Tạo ra cấu trút bát diện kéo dài. Tâm hoạt động hoạt hóa O2 và bẻ gẫy liên
kết glycosidic thơng qua phản ứng hydroxy hóa liên kết C-H (Hình 1C).
Cấu trúc và tính chất điện tử của tâm hoạt động được vi chỉnh bởi các amino acid
nằm trong vịng bán kính 5-6 Å tính từ tâm đồng. Các amino acid này cùng với một
số phân tử nước tạo thành một hệ thống liên kết hidro với các phối tử của trung tâm

Cu(II). Các liên kết hydro này làm thay đổi mật độ electron trên các phối tử, qua đó
làm thay đổi tính chất điện tử của ion Cu(II). Hơn nữa, các liên kết hydro này cũng
góp phần vi chỉnh vị trí của các phối tử Oaq1 và Oaq2.


3

PMO sử dụng trung tâm hoạt động đơn nhân đồng để hoạt hóa oxy. Cấu trúc và tính
hất điện tử của trung tâm hoạt động này đóng vai trị quyết định đến hoạt tính của
enzyme. Những thay đổi nhỏ về cấu trúc của trung tâm hoạt động có thể dẫn tới
việc giảm mạnh hoạt tính của PMO [5,7]. Cấu trúc trung tâm Cu(II) thường bị
quang khử (photoreducted) một phần hoặc toàn bộ thành Cu(I) bởi chùm tia X-ray
cường độ cao sử dụng trong thí nghiệm nhiễu xạ đơn tinh thể protein. Các cấu trúc
tinh thể thường không phản ánh đúng bản chất của trung tâm Cu(II) trong các PMO,
qua đó làm cản trở hiểu biết về cơ chế hoạt động của PMO và hạn chế việc phát
triển ứng dụng của các enzyme này. Do đó, việc nghiên cứu cấu trúc trung tâm
Cu(II) của PMO bằng phương pháp tính tốn lượng tử là hết sức cần thiết.
Trong PMO MtPMO3* có nguồn gốc từ nấm sợi Myceliophthora thermophile (PDB
ID 5ufv), khi glutamine Q166 được thay thế bởi các alanine (A166), liên kết hydro
giữa Q166 và OTyr và Oaq1 (Hình 2A) bị phá vỡ. Dạng tự nhiên và thể đột biến
Q166A (Q166A-MtPMO3*) đã được nghiên cứu bằng phổ cộng hưởng từ electron
(EPR), loại phổ cho thông tin trực tiếp về cấu trúc electron của các trung tâm thuận
từ như Cu(II). Tín hiệu EPR Q166A-MtPMO3* thay đổi đáng kể so với dạng tự
nhiên, dẫn tới giả thuyết OTyr liên kết yếu hơn với ion Cu(II) [5]. Tuy nhiên, giả
thuyết này chưa được kiểm chứng bằng các nghiên cứu cấu trúc hay tính tốn lượng
tử
Trong dạng tự nhiên của PMO CelS2 có nguồn gốc từ Streptomyces coelicolor
(PDB ID 4oy7), Y168 được thay thế bởi amino acid phenylalanine (F168).
Phenylalanine có cấu trúc tương tự như tyrosine nhưn khơng chứa nhóm OTyr, do
đó khơng phối trí được với trung tâm Cu(II) (Hình 2B). Hệ liên kết hydro của CelS2

cũng khác biệt đáng kể so với hệ liên kết hydro của MtPMO3*. Sự hiện diện của
A142 ở vị trí axial có thể gây cản trở cho việc tham gia phối trí của Oaq2 dẫn tới
việc phối tử này không được quan sát thấy trong cấu trúc tinh thể của CelS2. Như
vậy cấu trúc quan sát được của trung tâm Cu(II) trong CelS2 có dạng gần vng
phẳng như trong Hình 2B [6]. Tuy nhiên, sự vắng mặt của Oaq2 cũng có thể gây ra
bởi sự quang khử (photoreduction) ion Cu(II) thành Cu(I) bởi tia X-ray có cường độ
cao sử dụng trong thí nghiệm nhiễu xạ đơn tinh thể cho protein. Ngoài ra, khi F168
trong CelS2 được thay thế bởi tyrosine hoặc alanine, tín hiệu EPR của nó thay đổi
tương tự như đã quan sát được trong trường hợp MtPMO3*. Sự thay đổi này có thể
là do việc sắp xếp lại vị trí của Oaq1 hoặc sự tham gia phối trí của một phối tử mới
[7]. Như vậy, các tính toán lượng tử cần được thực hiện để hiểu rõ được bản chất
của trung tâm Cu(II) trong CelS2.


4

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để thực hiện nghiên cứu, các cấu trúc đầu vào được chọn từ cấu trúc X-ray đơn tinh
thể của các enzyme và được chỉnh sửa lại với phần mềm Pymol. Các cấu trúc tối ưu
hóa được chọn trong khoảng cách 5-6 angstrom tính từ tâm đồng. Các phối tử được
chọn sẽ bị cap bởi các nhóm NME (-CH3-NH) và các nhóm ACE(CO-CH3). Một
số nguyên tử được cố định để làm giảm thời gian tính tốn. Một số phân tử nước sẽ
được đưa vào cấu trúc ở một số các vị trí để xem xét khả năng nhận thêm nước tạo
phối trí với tâm hoạt động đồng.
Tính tốn lượng tử sử dụng hệ máy tính được trang bị với CPU Dual Xenon
E52670 16core/32theards, RAM DDR3 EEC 32GB. Tồn bộ tính tốn sẽ được thực
hiện bằng phần mềm Gaussian 09 với phiếm hàm B3LYP và bassic set 6-31g(d).
Mỗi loại cấu trúc sẽ được tối ưu hóa trong các mơ hình chất điện mơi bao gồm
nước, diethylether và chân khơng. Tối ưu hóa trong mơi trường chất điện mơi thay
đổi giúp cho chúng ta có được mối tương quan giữa sự thay đổi hằng số điện môi và

cấu trúc của tâm hoạt động. Các cấu trúc tâm hoạt động dạng đột biến được tối ưu
hóa để so sánh với dạng tự nhiên của chúng:
Trong các họ của PMO, tyrosine thường là phối tử nằm ở trục dọc ở đa số các cấu
trúc tâm hoạt động, trong khi đó với AA10, tyrosine bị thay thế thành
phenylalanine. Ở CelS2, việc tạo đột biến cho phối tử phenylalanine thành tyrosine
hoặc alanine nhằm nêu bật lên vai trò của các phối tử này đến cấu trúc tâm hoạt
động.
Ở enzyme MtPMO3*, phối tử glutamine bị thay thế thành glutamic acid và alanine.
Glutamine là một phối tử phân cực, glutamic acid là một phối tử có điện tích và
alanine là một phối tử không mang điện. Sự thay đổi các phối tử nhằm mục đích
quan sát sự biến đổi của mạng lưới các liên kết hidro. Mạng lưới các liên kết này có
vai trị rất quan trọng trong chuỗi phản ứng và trong việc ổn định cấu trúc.

Hình 1.2: A: Cấu trúc điển hình của tâm hoạt động PMO ở dạng oxi hóa Cu(II) với
tyrosine và một phân tử nước ở hai đầu trục dọc của cấu trúc bát diện. Các nguyên tử Cu,


5

C, O, N, và H lần lượt được hiển thị bằng các màu cam, xanh ghi, đỏ, xanh dương, và
trắng. Các đường nét đứt màu vàng hiển thị các liên kết hydro. B: Cấu trúc của CelS2
(PDB ID 4oy7). Các nguyên tử Cu, C, O, N, và H lần lượt được hiển thị bằng các màu
cam, xanh nhạt, đỏ, xanh dương, và trắng. Các đường nét đứt hiển thị các liên kết hydro.

Hình 2.2: A: cấu trúc input của mơ hình CelS2 dạng tự nhiên, B: cấu trúc input của mơ
hình 4oy7 dạng đột biến F168Y, C: cấu trúc input của mơ hình 4oy7 dạng đột biến F168A.
D: cấu trúc input của mơ hình MtPMO3* dạng tự nhiên, E: cấu trúc input của mơ hình
5ufv dạng đột biến từ Q166E, F: cấu trúc input của mơ hình 5ufv dạng đột biến Q166A.

6

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ

CelS2 (PDB id: 4oy7)

Cũng như cấu trúc toàn thể của tâm hoạt động, phối tử Phenylalanine không cho
thấy sự thay đổi lớn nào trong q trình tính tốn. Thêm nữa, với cùng một phương
pháp tính tốn cho các trường hợp của 4opb và 5tki, kết quả lý thuyết và thực
nghiệm thu được là trùng khớp. Từ đó, ta có một cơ sở để tự tin vào phương pháp
mơ hình hóa và kết quả tính tốn cho các phối tử bị đột biến.
Bởi vì cấu trúc của trường hợp đột biến phenylalanine thành tyrosine (F166Y) là
chưa được xác định, cho nên tyrosine chỉ được cố định ở alpha carbon và được thả
tự do trong q trình tối ưu hóa. Cấu trúc tối ưu hóa của các trường hợp đột biến
tyrosine cho thấy sự vặn xoắn trong cấu trúc của ligand tyrosine, tyrosine bị xoay đi
trong cả ba trường hợp chất điện môi. Điều này cho thấy cấu trúc không gian của
CelS2 là rất hạn chế dẫn đến việc khoảng không cho tyrosine là không đủ để phối tử
này cố định một cách bình thường trong cấu trúc active-site.
Trong khi đó, kết quả của trường hợp đột biếnvới alanine là không ngạc nhiên, sự
thay thế một phối tử chiếm khoảng không lớn thành một phối tử chiếm không gian
nhỏ hơn giúp cho các phân tử nước có thể di chuyển vào và phối trí với đồng thành
dạng chóp phẳng.
`
Bảng 1: Các thơng số cấu trúc tâm hoạt động chọn lọc từ kết quả tính tốn của các mơ
hình enzyme CelS2 (4oy7). Với Phe kí hiệu cho mơ hình dạng tự nhiên, Tyr kí hiệu cho mơ
hình dạng đột biến từ phenylalanine thành tyrosine(F166Y), Ala kí hiệu cho mơ hình dạng
đột biến từ phenylalanine thành alanine(F166A). vac kí hiệu cho chất điện mơi là chân
khơng, sol kí hiệu cho chất điện mơi là diethylether và wat kí hiệu cho chất điện mơi là
nước. Cu- Nδ là chiều dài từ Cu đến Nδ, tương tự như vậy cho các cột khác. Các cột chiều

dài có đơn vị là angstrom. Cột cuối cùng là góc hợp bởi vector Cu- Nδ và vector Cu- Nε,
có đơn vị là độ. Chỉ có ở mơ hình Tyr_vac, Tyr_sol và Tyr_wat là có chiều dài khoảng
cách giữa Cu và nguyên tử oxi của tyrosine.AA13 kí hiệu cho các mơ hình tối ưu hóa của
protein NCU08746thuộc họ AA13 và AA9 kí hiệu cho các mơ hình tối ưu hóa của protein
NCU01050thuộc họ AA9.Phần bôi đen thuộc về khoảng cách giữa đồng và nguyên tử oxi
của tất cả các mơ hình có tyrosine. Tất cả các dữ liệu tính tốn về AA13 và AA9 đều chưa
được công bố [8].


7

Cu-Nδ

Cu-Nε

Cu-Nam Cu-Ow/Otyr Cu-Ow

Theta

Phe_vac 2.15

2.24

2.087

2.495

1.894

8.0

Phe_sol

2.127

2.263

2.077

2.497

1.907

8.0

Phe_wat 2.118

2.275

2.074

2.493

1.914

8.1

Tyr_vac 2.117

2.357

2.059

2.183

1.961

20.7

Tyr_sol

2.403

2.046

2.199

1.963

20.5

Tyr_wat 2.061

2.46

2.037

2.184

1.962

22.3

Ala_vac

2.075

2.081

2.096

2.2

1.977

8.1

Ala_sol

2.051

2.098

2.09

2.21

1.99

8.1

Ala_wat 2.043

2.105

2.091

2.21

1.992

8.1

AA13_vac 1.951

1.977

2.065

2.326

2.098

25.3

AA13_sol

1.946

1.975

2.069

2.379

2.081

24.0

AA13_wat 1.945

1.977

2.072

2.413

2.061

23.6

AA9_vac

1.918

1.914

2.048

2.356

2.079 3.238 19.2

AA9_sol

1.91

1.91

2.044

2.591

2.067 2.653 10.8

AA9_wat

1.905

1.91

2.044

2.875

2.067 2.438 4.7

2.086

Bảng 2: Natural spin density ở một số nguyên tử chọn lọc. Đơn vị là a.u – atomic unit.

Cu

Nδ

Nε

Nam

Ow

Ow2

Phe_vac

0.634

0.087

0.081

0.068

0.127

0

Phe_sol

0.637

0.095

0.077

0.076

0.115

-0.001

Phe_wat

0.639

0.098

0.075

0.08

0.108

-0.001

Tyr_vac

0.652

0.085

0.057

0.111

0.077

0.002

0.012

Tyr_sol

0.652

0.093

0.05

0.116

0.073

0.01

0.012

Tyr_wat

0.653

0.096

0.043

0.119

0.073

0.01

0.014

Tyr_vac

0.651

0.088

0.1

0.095

0.068

0.01

0

Tyr_sol

0.65

0.096

0.09

0.102

0.066

0.01

0

Tyr_wat

0.65

0.1

0.86

0.102

0.066

0

0.01

Otyr/Ow3

Mật độ spin của từng cấu trúc được đưa ra trong bảng 2. Ta thấy có sự thay đổi lẫn
nhau của mật độ spin khi tăng hằng số điện mơi lên. Giữa các mơ hình đột biến và


8

dạng tự nhiên, có sự thay đổi lớn về mật độ spin ở phối tử nước planar. Trong đó,
mật độ spin của phối tử nước planar bị sụt giảm ở các dạng đột biến so với dạng tự
nhiên. Điều này có thể chỉ ra rằng khả năng trao nhận electron của phối tử ở axial
của protein bị suy giảm đáng kể và có thể làm ảnh hưởng đến khả năng phản ứng.

MtPMO3* (PDB id: 5ufv)

Bảng 3: Cấu trúc tối ưu hóa của các mơ hình MtPMO3* với các kí hiệu tương tự
với các mơ hình CelS2. Cu-Ow1 là chiều dài giữa Cu và oxi của phối tử nước ở vị
trí axial, Cu-Ow2 là chiều dài giữa Cu và oxi của phối tử nước ở vị trí planar. Đơn
vị của chiều dài là angstrom và đơn vị của góc là độ.

Cu-Nδ

Cu-Nε

Cu-Nam Cu-Otyr Cu-Ow1 Cu-Ow2 theta3

glu_vac 1.987

1.939

2.05

2.683

2.415

2.019

8.6

glu_sol

1.94

2.05

3.06

2.33

2.023

4.4

glu_wat 1.9799

1.946

2.05

3.308

2.32

2.021

2.9

agl_vac

1.984

1.954

2.045

2.76

2.492

1.944

10.2

agl_sol

1.981

1.953

2.045

2.837

2.413

1.97

6.0

agl_wat 1.977

1.954

2.041

2.833

2.401

1.99

5.2

ala_vac

1.975

1.935

2.055

3.771

2.287

2.018

6.9

ala_sol

1.971

1.94

2.052

3.785

2.289

2.025

6.6

1.945

2.049

3.771

2.298

2.029

6.4

1.98

ala_wat 1.971

Trong mơ hình cấu trúc tối ưu hóa dạng tự nhiên, ngồi hai phối tử nước phối trí với
tâm hoạt động đồng, cịn có một phối tử nước gây phối trí tạo thành mạng liên kết
hidro cho tâm hoạt động. Kết quả tối ưu hóa cấu trúc cho thấy sự khác biệt rất lớn
của cấu trúc khi gây đột biến phối tử glutamine. Khi gây đột biến glutamine thành
acid glutamic, mạng lưới liên kết hidro bị thay đổi. Ở trường hợp dạng tự nhiên,
phối tử nước thứ 3 không tạo được liên kết với phối tử glutamine trong khi đó ở
trường hợp dạng đột biến, phối tử nước thứ 3 tạo thành liên kết với acid glutamic.
Tuy nhiên khi so sánh cấu trúc giữa hai trường hợp này, cấu trúc của vùng phối trí
với ngun tử đồng hầu như khơng thay đổi khi so sánh với trường hợp đột biến
glutamine thành alanine.
Đột biến glutamine thành alanine gây ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc tâm hoạt động
đồng. Trong đó, phối tử tyrosine khơng cịn phối trí với tâm hoạt đồng như thường


9

thấy mà bị kéo ra ngoài tạo liên kết hidro với các phối tử nước. Trong trường hợp

này, số phối trí của nguyên tử đồng là 5 so với trong hai trường hợp còn lại là 6.
BÀN LUẬN
So sánh 4obp là đại diện của AA13 và 5tki là đại diện của AA9, hai phối tử
tyrosine có độ cơ động là khác nhau. 4opb có phối tử tyrosine khơng cơ động như ở
5tki. Ở 4oy7, phối tử phenylalanine thay thế cho phối tử tyrosine cho nên khơng thể
gây phối trí với tâm đồng,. Nhưng khi gây đột biến từ phenylalanine thành tyrosine,
tyrosine bị vặn xoắn và vị trí của cấu trúc vịng bị lệch đi so với phối tử
phenylalanine. Do đó, ta đưa ra giả thuyết rằng do tyrosine không đủ khoảng trống
để phối trí nên bị bẻ cong.
Trong bài viết gần đây chỉ ra sự liên hệ giữa cấu trúc phối trí tâm hoạt động của
PMO với bức tranh tiến hóa cho thấy cấu trúc của tâm hoạt động AA13 là trạng thái
trung gian của AA9 và AA10 [8]. Nếu giả thuyết trên của AA10 được chứng minh,
ta có thể đưa ra giả thuyết về một thành phần thứ hai đóng vai trị làm thay đổi cấu
trúc của tâm hoạt động của các PMO: Dưới áp lực tiến hóa, từ AA9 -> AA13 ->
AA10, khoảng trống cho tyrosine càng ngày bị co lại và đến AA10 thì tyrosine bị
thay thế bằng phenylalanine.
Tính tốn mật độ spin cho tâm hoạt động của CelS2 cho thấy sự ưu tiên phân bố
trên mặt phẳng của các vòng histidine nhưng cấu trúc của CelS2 lại có sự vặn xoắn
và trở thành dạng lưỡng chóp tam giác. Cấu trúc này có được là do hai điều kiện,
một là sự xuất hiện của phối tử acid glutamic, hai là phối tử alanine ở trục dọc. Phối
tử acid glutamic có điện tích và tạo lực hút đối với phối tử nước ở vùng mặt phẳng
trong khi đó phối tử alanine có vai trị như một thành phần che chắn và hạn chế việc
tạo thành liên kết với nước ở mặt dưới mặt phẳng.
Kết quả này xác định rằng số phối trí lớn nhất của CelS2 chỉ là 5. Bởi vì mật độ
spin tập trung chủ yếu trên mặt phẳng của các vòng histidine, cho nên sự truyền dẫn
của electron trong các phản ứng oxi hóa – khử cũng sẽ hoạt động trên mặt phẳng
này. Điều này là giống với các họ PMO khác như AA9 và AA10, tuy nhiên do cấu
trúc phối trí khác biệt nên hệ quả là chuỗi phản ứng sẽ có những khác biệt rất lớn.
Giả thuyết này cần được làm rõ hơn trong các nghiên cứu sắp tớĐối với trường hợp
của 5ufv, kết quả tính tốn bước đầu cho thấy sự thay đổi về cấu trúc hệ liên kết

hidro của các mơ hình tâm hoạt động. Trong khi đột biến từ glutamine thành acid
glutamic cho thấy sự thay đổi chỉ xảy ra ở vùng các liên kết hidro thì đột biến từ
glutamine thành alanine cho thấy sự thay đổi rất mạnh xảy ra cả ở vùng các liên kết


10

hidro và phối trí của trung tâm đồng. Sự thay đổi rất mạnh này về cơ bản gây thay
đổi các tương tác spin và hạt nhân, điều này là tương ứng với kết quả trong [5]. Một
đặc điểm dễ nhận ra trong active-stie của hai loại protein này chính là sự nhạy cảm
của cấu trúc tâm hoạt động khi thay đổi mơi trường điện mơi mà đặc biệt là góc hợp
theta. Ở CelS2, cấu trúc của tâm hoạt động ổn định hơn so với cấu trúc tâm hoạt
động của MtPMO3* và đây là một đặc điểm mới cần được xem xét và làm rõ trong
các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.1 : Cấu trúc của các mơ hình CelS2 đã tối ưu hóa với A là mơ hình ở dạng
tự nhiên với mơi trường chân khơng, B là mơ hình ở dạng tự nhiên với mơi trường
diethylether, C là mơ hình ở dạng tự nhiên với môi trường nước, D là mơ hình ở
dạng đột biến F168Y trong mơi trường chân khơng, E là mơ hình ở dạng đột biến
F168Y trong mơi trường diethylether, F là mơ hình ở dạng đột biến từ F168Y trong
mơi trường nước, G là mơ hình ở dạng đột biến từ F168A trong môi trường chân
không, H là mơ hình ở dạng đột biến F168A trong mơi trường diethylether, K là mơ
hình ở dạng đột biến F168A trong môi trường nước.


11

Hình3.2: Cấu trúc tối ưu hóa của các mơ hình MtPMO3* trong các mơi hình chất
điện mơi bao gồm, A là cấu trúc tâm hoạt động ở dạng tự nhiên trong môi trường
chân không, B là cấu trúc tâm hoạt động ở dạng tự nhiên trong môi trường

diethylether, C là cấu trúc tâm hoạt động ở dạng tự nhiên trong môi trường nước, D
là cấu trúc tâm hoạt động ở dạng đột biến Q166E trong môi trường chân không, E
là cấu trúc tâm hoạt động ở dạng đột biến Q166E trong môi trường diethylether, F
là cấu trúc tâm hoạt động ở dạng đột biến Q166E trong môi trường nước, G là cấu
trúc tâm hoạt động ở dạng đột biến Q166A trong môi trường chân không, H là cấu
trúc tâm hoạt động ở dạng đột biến Q166A trong môi trường diethylether, K là cấu
trúc tâm hoạt động ở dạng đột biến Q166A trong môi trường nước.


12

Hình 3.3: Cấu trúc align của mơ hình tâm hoạt động ở dạng tự nhiên (Màu đỏ/ tối
màu) và dạng đột biến F168Y (màu xanh/ sáng màu) của protein CelS2. Kết quả
tính tốn cho thấy sự hạn chế của vùng không gian dành cho phối tử tyrosine khiến
phối tử này vị vặn xoắn mạnh.

Hình 3.4: Cấu trúc của ba mơ hình tâm hoạt động của protein MtPMO3*được
align, ta thấy rằng ở dạng tự nhiên và dạng Q168E (màu đỏ/tối màu), cấu trúc có
sự tương đồng cao, phối trí xung quanh tâm hoạt động đồng hầu như khơng đổi
trong khi đó ở dạng Q168A(màu xanh/ sáng màu), trấu trúc bị biến đổi mạnh. Phối
tử nước ở dạng Q168A bị phối tử tyrosine kéo lênkhỏi mặt phẳng chứa các phối tử
hidtidine. Thay đổi này biến đổi sâu sắc tính chất của tâm hoạt động đồngvà dẫn
đến làm thay đổi tín hiệu EPR.


13

Hình 3.5: A là hình ảnh cây sinh lồi của các họ PMO đi từ AA9 đến AA10, B là
tương quan cấu trúc giữa đại diện các họ AA9, AA13 đến AA10.Hình ảnh được lấy
từ [8]

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Tất cả cấu trúc tâm hoạt động của protein PMO đều xuất hiện cấu trúc các vòng
histidine bao quanh, sự khác biệt giữa cấu trúc tâm hoạt động chủ yếu đến từ cấu
trúc của các phối tử ở trục dọc và các phối tử ở phân lớp thứ hai tính từ tâm đồng.
Trong [8], vai trò của phối tử ở vùng trục dọc dưới mặt phẳng tâm được nhấn mạnh:
ở AA13 NCU08746 là glycine 89 và ở AA10 CelS2 là alanine 107. Ở NCU08746,
glycine đóng vai trị như một chốt chặn để ngăn cản hình thành phối trí của tâm
đồng với nước trong khi đó với kết quả với CelS2 cũng cho thấy vai trò của A107
cũng giống với G89 (1). Trong nghiên cứu này, tập trung chủ yếu vào liên kết của


14

tâm hoạt động đồng và phối tử ở mặt bên trên mặt phẳng vùng trục dọc và xác
định được thêm một yếu tố ảnh hưởng tới cấu trúc tâm hoạt động (2). Cả hai yếu tố
này (1 và 2) đều cho thấy mối tương quan của cấu trúc đến bức tranh tiến hóa từ họ
AA9 đến họ AA10 với họ AA13 là cấu trúc trung gian.
Mặc dù đưa ra được các mối tương quan, nhưng kết luận của nghiên cứu này vẫn
chỉ dừng lại ở mức đưa ra giả thuyết, một số giả thuyết cần phải được làm rõ trong
các nghiên cứu sắp tới bằng các phương pháp khác như mô phỏng động học phân
tử.

Chủ nhiệm đề tài
(Ký và ghi rõ họ tên)


15

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Perlack RD, Wright L, Turhollow A, Graham R, Stokes B, Erbach D. 2005.
Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry: the technical
feasibility of a billion-ton annual supply. Report DOE/GO- 102005-2135. US Dep.
Energy, Oak Ridge Natl. Lab., Oak Ridge, TN
[2] Beeson, W. T., Vu, V. V., Span, E. A., Phillips, C. M., & Marletta, M. A.
Cellulose degradation by polysaccharide monooxygenases. Annu. Rev. Biochem.
2015, 84, 923-946.
[3] Harris, P. V., Xu, F., Kreel, N. E., Kang, C., & Fukuyama, S. New enzyme
insights drive advances in commercial ethanol production Curr. Opin. Chem.
Biol. 2014, 19, 162-170.
[4] Himmel ME, Ding S-Y, Johnson DK, Adney WS, Nimlos MR, et al.. Biomass
recalcitrance:engineering plants and enzymes for biofuels production Science 2007,
315, 804–807.
[5] Span, E. A.; Suess, D. L. M.; Deller, M. C.; Britt, R. D.; Marletta, M. A., The
Role of the Secondary Coordination Sphere in a Fungal Polysaccharide
Monooxygenase. ACS Chem. Biol. 2017, 12, 1095-1103.
[6] Forsberg, Z.; Mackenzie, A. K.; Sorlie, M.; Rohr, A. K.; Helland, R.; Arvai, A.
S.; Vaaje-Kolstad, G.; Eijsink, V. G., Structural and functional characterization of a
conserved pair of bacterial cellulose-oxidizing lytic polysaccharide
monooxygenases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2014, 111, 8446-8451.
[7] Forsberg, Z.; Røhr, Å. K.; Mekasha, S.; Andersson, K. K.; Eijsink, V. G. H.;
Vaaje-Kolstad, G.; Sørlie, M., Comparative Study of Two Chitin-Active and Two
Cellulose-Active AA10-Type Lytic Polysaccharide Monooxygenases. Biochemistry
2014, 53, 1647-1656.
[8] Kết quả chưa công bố


16

PHỤ LỤC 3: DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ

1- Danh mục bài báo, báo cáo khoa học của tác giả liên quan đến đề tài (đính kèm
các bài báo, báo cáo).
+ Báo cáo hội nghị
+ Báo cáo khoa học
2- Quyết định liên quan đến hướng dẫn sinh viên làm luận văn (nếu có).


17

PHỤ LỤC 4: (hợp đồng, thuyết minh đề cương)
1- Thuyết minh đề tài. (photo bản đã ký với Trường)
2- Hợp đồng thực hiện đề tài NCKH (photo bản đã ký với Trường)